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Resumen
La variabilidad genética y epigenética puede influir en la eficacia y seguridad de las terapias
antiplaquetarias, incluido el clopidogrel. Por lo tanto, las interacciones miARN-ARNm y la
toxicidad del fármaco se investigaron en silico utilizando los datos disponibles de
microarrays. Los perfiles de expresión de miARN de plaquetas (GSE59488) de síndrome
coronario agudo y ARNm en células de sangre periférica (GSE32226) de pacientes con
enfermedad de la arteria coronaria se utilizaron para el análisis integrado de ARNm miRNA-
objetivo por el software Ingenuity Pathways Analysis 6 (IPA). Los resultados mostraron que
el ARNm de ST13 está regulado por hsa-miR-107 (miR-103-3p); Los ARNm de BTNL3 y
CFD están regulados por hsa-miR-4701-3p (miR-1262); SLC7A8 está regulado por hsa-
miR-145-5p (miR-145-5p); y el ARNm de SENP5 está regulado por hsa-miR-15b-5p (miR-
16-5p) y hsa-miR-26a-5p (miR-26a-5p). La herramienta IPA sobre toxicidad farmacológica
mostró que estos miARN / ARNm están asociados con lesiones hepáticas y renales
relacionadas con clopidogrel. En conclusión, estos resultados demuestran que la expresión
diferencial de miARN en las plaquetas y las interacciones con sus ARNm objetivo están
asociadas con la variabilidad en la reactividad plaquetaria, la respuesta al clopidogrel y la
toxicidad inducida por fármacos.
1. Introducción
Los microARN (miARN) son ARN monocatenarios, cortos y no codificantes que desempeñan
importantes funciones reguladoras de genes al emparejarse con los ARNm dirigidos para dirigir
su represión (Guo et al., 2010; Sondermeijer et al., 2011). Se ha sugerido que los miRNA son
biomarcadores novedosos potenciales para controlar la progresión y la respuesta al tratamiento
de una amplia gama de enfermedades, incluida la susceptibilidad, el pronóstico o el tratamiento
de la enfermedad cardiovascular (CVD) (Guo et al., 2010; McManus y Freedman, 2015;
Sondermeijer et al., 2011). Se ha demostrado que los miARN participan en la función
plaquetaria, la homeostasis vascular y la inflamación. Además, los niveles de miARN de
plaquetas en la circulación están asociados con el riesgo de ECV, lo que sugiere que los miARN
derivados de plaquetas podrían tener papeles importantes como biomarcadores de
susceptibilidad, pronóstico o tratamiento de ECV (McManus y Freedman, 2015).
los miRNA regulan simultáneamente múltiples ARNm objetivo, así como múltiples miRNA
pueden regular un solo gen objetivo (Nunez et al., 2013). El estudio de las interacciones miARN-
ARNm puede ser laborioso y lento porque los modelos experimentales son difíciles de configurar
(Li et al., 2014). El análisis in silico de miRNA puede usarse para predecir objetivos de ARNm
basados en información sobre secuencia complementaria, conservación evolutiva, energía libre
y / o accesibilidad al sitio objetivo. Además, los análisis in silico pueden ayudar a desarrollar una
nueva estrategia para estudiar las interacciones miRNAs-mRNA en pacientes con ECV utilizando
la terapia antiplaquetaria e identificar posibles biomarcadores de la respuesta al fármaco (Liu et
al., 2014).
Las plaquetas contienen una gran variedad de especies de ARN biológicamente importantes,
incluidos los ARNm y los microARN reguladores de ARNm. Heredado de sus precursores
megacariocíticos (Osman et al., 2015). Además, estudios anteriores han demostrado que los
miARN derivados de plaquetas desempeñan un papel en varias funciones reguladoras, incluida
la expresión de ARNm en otras células sanguíneas periféricas, como los leucocitos que circulan
(Pan et al., 2014). Por lo tanto, los resultados actuales pueden ayudar a aclarar la influencia de
los miARN derivados de plaquetas en la regulación de la expresión de ARNm en PBC, así como
la asociación de ellos con la toxicidad del clopidogrel.
Por lo tanto, en este estudio, las interacciones entre los miARN y los ARNm y la toxicidad
relacionada con los medicamentos en respuesta al tratamiento con clopidogrel se investigaron
mediante herramientas bioinformáticas utilizando datos de microarrays disponibles de
plaquetas y PBC de pacientes con SCA y CAD, respectivamente. Hasta donde sabemos, este es
el primer estudio que intenta identificar la posible interacción entre los miRNAs y los efectos de
mRNAs en pacientes con SCA y CAD a través de un análisis in silico.
2. Material y métodos.
La expresión de ARNm global en PBC (GSE32226) de pacientes con CAD tratados crónicamente
con clopidogrel (75 mg / día) se evaluó utilizando una plataforma de microarrays. Los pacientes
con CAD se agruparon como respondedores y no respondedores al clopidogrel en función de la
reactividad plaquetaria (Luchessi et al., 2013). La herramienta de bioinformática GEO2R también
se utilizó para seleccionar los 250 ARNm expresados diferencialmente en PBC. Se consideraron
diferencias significativas LogFC (FC N 2.0) y valor p <0.05.
IPA es una aplicación de software basada en web que permite a los investigadores analizar datos
derivados de microarrays de expresión y SNP, secuenciación de ARN, experimentos de
proteómica y metabolómica, y experimentos a pequeña escala (como PCR) que generan listas
de genes o proteínas. También permite la búsqueda de información específica sobre genes,
proteínas, productos químicos, enfermedades y medicamentos, así como la construcción de sus
propios modelos biológicos. El análisis de datos y el modelado experimental de IPA permiten
comprender la importancia de los datos o los objetivos de interés en relación con sistemas
biológicos o químicos más grandes (Krämer et al., 2014).
El ARNm expresado diferencialmente en PBC (20 ARNm) y el ARNm objetivo predicho por las
bases de datos de miARN (75 ARNm) se seleccionaron para identificar los objetivos de ARNm de
la descarga de 20 ARNm del conjunto de datos GSE59488, utilizando IPA. El análisis de IPA entre
todos los ARNm indicados anteriormente y los miARN reguladores en las plaquetas se realizó
para evaluar la interacción de miARN-ARN utilizando muchas bases de datos disponibles por el
software. Se consideraron interacciones significativas de miARN-ARN cuando LogFC (FC> 2.0) y
mirSVR puntúan entre 0 y -1.3.
2.6. Análisis de miARN y ARNm asociados con la toxicidad de la terapia antiplaquetaria
IPA-Tox® es una herramienta de IPA útil para detectar moléculas que se han asociado con la
toxicidad del tratamiento farmacológico (función de toxicidad). Esta herramienta analiza los
datos de toxicogenómica generados a partir de múltiples plataformas para comprender mejor
las funciones, las vías y los conjuntos de genes de respuesta a toxinas que probablemente estén
perturbados por el compuesto / medicamento bajo investigación. Los ARNm y miARN
expresados diferencialmente a partir de datos experimentales e in silico se seleccionaron
utilizando la herramienta IPA-Tox.
Fig. 1. Diseño del estudio para evaluar las interacciones de miARN y ARNm en pacientes con SCA.
SCA: síndrome coronario agudo; HPR: alta reactividad plaquetaria (≥300 unidades de reactividad
plaquetaria, PRU); LPR: baja reactividad plaquetaria (b170 PRU); IPA: Análisis de vías de ingenio.
PBC: células de sangre periférica.
El software GEO2R se utilizó para comparar los datos de expresión de miARN y ARNm entre
pacientes con PRL y HRP. GEO2R presenta una interfaz simple que permite a los usuarios realizar
análisis sofisticados basados en R de datos GEO para ayudar a identificar, visualizar y normalizar
la expresión diferencial de genes (Barrett et al., 2013b). El back-end GEO2R utiliza paquetes
establecidos de Bioconductor R para transformar y analizar datos GEO y presenta los resultados
como una tabla de genes ordenados por importancia y que se pueden visualizar con gráficos de
perfil GEO (Gentleman et al., 2004). Las diferencias se consideraron significativas para LogFC
(FC> 2.0) y p < 0.05 después de la prueba de ajuste de Benjamini y Hochberg (tasa de
descubrimiento falso) (Yoav Benjamini, 1995). La puntuación mirSVR es un método de regresión
para predecir la probabilidad de regulación negativa del ARNm objetivo a partir de las
características de la secuencia y la estructura en sitios objetivo-predichos por microARN / ARNm.
La puntuación mirSVR ≤ 1.0 se consideró significativa.
3. Resultados
Seis miRNAs se expresaron diferencialmente en plaquetas entre pacientes HPR y LPR con SCA
(FC> 2.0, p <0.05) (Tabla 1). El miR-145-5p y miR-26a-5p mostraron valores de expresión más
altos en pacientes con HPR en comparación con LPR (p <0.05). Por otro lado, miR-107, miR15b-
5p, miR-4701-3p y miR-598 se expresaron menos en el grupo HPR (p <0.05). El análisis in silico
de 75 ARNm diana de los seis miARN expresados diferencialmente se muestra en la Tabla S2
(Material complementario).
Los datos obtenidos por el análisis GEO2R del conjunto de datos GSE59488 y la selección según
el valor p ajustado por Benjamini & Hochberg (tasa de descubrimiento falso). LogFC, cambio
Log2 veces entre dos condiciones experimentales: pacientes con alta reactividad plaquetaria
(HPR) y baja reactividad plaquetaria (LPR) con síndromes coronarios agudos (SCA)
Los perfiles gráficos de los 250 principales ARNm expresados diferencialmente en PBC entre
respondedores y no respondedores al clopidogrel se muestran en la Tabla S3 (Material
complementario). Veinte ARNm mostraron resultados significativos (Tabla 2). Diez ARNm
(ADIPOR1, CYS1, FAM20B, GLMP, LGALS2, MKRN9P, NFXL1, SENP5, ST13 y UBE2F) se expresaron
más en no respondedores que en respondedores (p <0.05). Mientras que diez ARNm se
expresaron menos (ABO, BTNL3, CFD, CHMP4B, GK3P, INSL3, PEX11A, SLC7A8, SPRR1A y
SULT1A1) en el grupo de no respondedores (p <0.05).Tabla 2 Expresión de los veinte genes
principales: ARNm expresados diferencialmente en leucocitos de sangre periférica de pacientes
que responden y no responden al clopidogrel.
Los datos de GSE32226 obtenidos del análisis GEO2R se seleccionaron de acuerdo con el valor
p ajustado por Benjamini & Hochberg (tasa de descubrimiento falso). Chr, cromosoma; LogFC,
cambio Log2 veces entre dos condiciones experimentales: respondedores y no respondedores
a clopidogrel.
3.3. Interacciones de miARN y ARNm utilizando IPA
El análisis de IPA mostró que 13 genes diana expresados diferencialmente (ADIPOR1, BTNL3,
CFD, CHMP4B, CYS1, FAM20B, GLMP, INSL3, NFXL1, SENP5, SLC7A8, ST13, UBE2F) están
regulados por 13 miRNAs diferentes [hsa-miR-107 (miR -103-3p), hsa-miR-4701-3p (miR-1262),
hsa-miR939-5p (miR-1343-5p), hsa-miR-143-3p (miR-143-3p), hsa miR- 145-5p (miR-145-5p),
hsa-miR-15b-5p (miR-16-5p), hsa-miR 106b-5p (miR-17-5p), hsa-miR-182-5p (miR- 182-5p), hsa-
miR-26a-5p (miR26a-5p), hsa-miR-30c-5p (miR-30c-5p), hsa-miR-5581-5p (miR4297), hsa-miR-
4690- 5p (miR-4690-5p) y hsa-miR-4713-3p (miR4713-3p)] como se muestra en la Fig. 2. Estos
ARNm son responsables de la codificación de proteínas que han desarrollado diversas funciones,
como actuar como un receptor, alto expresión en grasa, transcripción nuclear, transportador y
supresión de tumorigénesis.
El análisis Tox-IPA puede detectar varias complicaciones de la terapia con clopidogrel, como el
aumento de los niveles de lactato deshidrogenasa (LDH); daño hepático, inflamación (hepatitis),
fibrosis, cirrosis e hiperplasia / hiperproliferación; carcinoma hepatocelular; inflamación renal y
nefritis; arritmia cardíaca, estenosis y arteriopatía; insuficiencia cardíaca e hipertensión
pulmonar.
El presente estudio in silico mostró que los miRNAs miR-145-5p y miR-26a-5p estaban regulados
por incremento, mientras que miR-107, miR-15b-5p, miR-4701- 3p y miR-598 estaban regulados
negativamente en plaquetas muestras de pacientes con HPR ACS. Los microARN tienen un papel
importante en la regulación de la expresión génica a nivel postranscripcional, además, también
pueden reducir o inhibir los niveles de ARNm cuando se regulan al alza y la expresión disminuida
de un miARN específico puede aumentar los niveles de ARNm. Por lo tanto, los genes objetivo
de un miRNA altamente expresado pueden expresarse a un nivel más bajo que los de un miRNA
poco expresado (Arora y Simpson, 2008).
En este estudio, la expresión de miR-145-5p fue mayor en pacientes con HPR y su ARNm objetivo
SLC7A8 fue regulado negativamente en pacientes con CAD que no respondieron, lo que sugiere
que este ARNm también puede estar regulado negativamente en pacientes con HPR. Se ha
demostrado que miRNA-145-5p juega un papel importante en el desarrollo cardíaco y la
enfermedad cardiovascular mediante la regulación de genes diana antiapoptóticos, como
ANGPTL4, DPEP1, EGR1, EIF5A, TSC22D3, IRS2 y CEBPB (Boettger y Braun, 2012; Liu et al., 2015).
También se ha sugerido la participación de miRNA 145-5p en la respuesta al tratamiento con
mioblastos esqueléticos en la lesión miocárdica [28]. El SLC7A8 y otros transportadores de
membrana regulan la homeostasis de la glutamina, un aminoácido involucrado en muchos
procesos biosintéticos, reguladores y de producción de energía, que representan objetivos
potenciales para la intervención farmacológica (Pochini et al., 2014). Es probable que la
regulación negativa de SLC7A8 por miRNA-145-5p pueda contribuir a la baja respuesta tanto de
clopidogrel como de aspirina en pacientes con HPR.
ST13, objetivo de miR-107, codifica una proteína que interactúa con Hsc70 que controla la
actividad de proteínas reguladoras como reguladores de la proliferación o apoptosis, una
alteración funcional en ST13 puede generar pérdida de control apoptótico y puede conducir a
una proliferación incorrecta (Hou et al. ., 2012). La sobreexpresión de ST13 en pacientes que no
responden sugiere que el clopidogrel puede proteger contra la apoptosis de las células de sangre
periférica.
En este estudio, el miR-4701-3p estaba regulado negativamente en pacientes con HPR y sus
objetivos ARNm, BTNL3 y CFD, también estaban regulados negativamente en los pacientes que
no respondieron al clopidogrel, lo que sugiere que este miRNA tiene un efecto bajo en la
expresión de ARNm de BTNL3 y CFD. El gen BTNL3 está involucrado en la proliferación y el
desarrollo celular, además de ser probable que desempeñe un papel importante en la
inflamación y la respuesta inmune a través de un efecto inmunosupresor combinado (Aigner et
al., 2013). La proteína CFD se ha sugerido como un nuevo biomarcador para la enfermedad
coronaria y el riesgo de accidente cerebrovascular en mujeres posmenopáusicas (Prentice et al.,
2013).
Los resultados del análisis de toxicidad farmacológica del IPA revelaron que las interacciones
miRNAs-mRNAs están asociadas con el daño hepático y renal relacionado con la respuesta al
clopidogrel. Por lo tanto, el objetivo de ARNm y los miARN expresados de manera diferente
encontrados en este estudio pueden representar biomarcadores importantes para la respuesta
al clopidogrel, una vez que la hepatotoxicidad es una reacción adversa rara al clopidogrel
(Monteiro et al., 2011). Los miARN expresados de manera diferente encontrados en este estudio
pueden ayudar a dilucidar mejor las vías involucradas en la respuesta al clopidogrel y sus
posibles efectos adversos, una vez que se ha demostrado que estos miARN regulan los genes
involucrados en la hepatotoxicidad.
A pesar de los hallazgos interesantes, este estudio in silico tiene algunas limitaciones, como
diferentes poblaciones de muestras y muestras biológicas en los estudios de microarrays, un
número limitado de sujetos en cada estudio y los resultados se basan en datos públicos puros.
En conclusión, los resultados de este estudio in silico sugirieron que la expresión diferencial de
miRNAs en plaquetas y sus mRNAs objetivo en PBC puede estar asociada con la variabilidad en
la reactividad plaquetaria, la respuesta de clopidogrel y la toxicidad inducida por fármacos.
Aunque, se necesitan más estudios experimentales para confirmar la contribución de los miRNA
/ mRNA expresados diferencialmente como biomarcadores potenciales de respuesta al
clopidogrel.