Métodos de separación

y purificación de
proteínas
Departamente de Bioquímica Humana
Facultad de Medicina UBA

Autor: Paula Mariana Maloberti

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Cromatografía de filtración por gel.

Es un método de separación de proteínas en base a su

tamaño.
Se utiliza un material que es un polímero insoluble
hidratado que se compra comercialmente tal como
Sephadex. Este polímero forma una especie de bolitas
porosas cuyos poros tienen aproximadamente 0,1 mm.
Se venden de distinto tamaño de poro según la
separación que se quiera realizar.

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 Proteína
de mayor
tamaño

Proteína
de menor
tamaño

Sephadex

De esta manera las

proteínas mas pequeñas
pasan a través del poro del
polímero y se retrasan con
respecto a las proteínas de
mayor peso molecular que no
pueden entrar en los poros.
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 En esta animación podemos ver como se
separan las proteínas a medida que avanza
la cromatografía. VER.

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 Para realizar la
cromatografía se
utilizan columnas
donde se coloca en
este caso sephadex

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 Se coloca la muestra
conteniendo las
proteínas a separar.

Luego se abre la
columna para que
entre la muestra y se
inicia la separación.

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En esta animación veremos como se produce
la separación de las proteínas. VER.

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Una vez finalizada la cromatografía se logran
separar las dos proteínas de diferente tamaño.

6 5 4 3 2 1

En segundo lugar Primero eluye de la

eluye la de menor columna la proteína
tamaño de mayor tamaño

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Cromatografía de intercambio iónico

A través de cromatografía de intecambio iónico las proteínas

pueden ser separadas en función de su carga eléctrica. Para este
fin se utiliza un polímero como celulosa unido a grupos cargados
negativamente o positivamente.
Las proteínas con carga neta positiva pueden ser separadas
utilizando una columna de intercambio cargada negativamente como
por ejemplo carboximetilcelulosa (CM-celulosa). A este tipo de
columnas se las denomina también columnas de intercambio
catiónico ya que une partículas cargadas positivamente. Las
mismas quedarán retenidas a la columna separándolas de esta
manera de las cargadas negativamente.
Para separar proteínas con carga neta negativa se utilizan
columnas como por ejemplo de DEAE-celulosa cargadas
positivamente.

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 DEAE-celulosa

H C2H5
Celulosa -CH2-CH2-N+
C2H5

CM-celulosa
O
Celulosa -CH2-C
O-

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Para entender como se produce la separación de proteínas
mediante este método utilizaremos como ejemplo la
separación de dos proteínas de peso molecular similar pero
que al diferir en la composición de aminoácidos difieren en
la carga neta de la proteína y por lo tanto en el punto
isoeléctrico.

La proteína A tiene un punto

isoeléctrico de 3,1.
El PI de la proteína B es de 7,2

¿Cuál de las dos proteínas quedará

retenida en una columna de intercambio
aniónico utilizando un buffer de pH
cercano a 5?
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 En esta animación veremos como se produce la
separación de las proteínas. VER.

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 Para realizar la separación
se utiliza una columna de
forma similar a
cromatografía de filtración
por gel.

La columna se llena
con DEAE-celulosa.

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 Se coloca la muestra
conteniendo las
proteínas a separar y
se procede de
manera similar a la
columna anterior.

Luego se abre la
columna para que
entre la muestra y se
inicia la separación.

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 En esta animación veremos como se produce
la separación de las proteínas. VER.

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Cromatografía de afinidad

A través de cromatografía de afinidad separa a las

proteínas en función a la unión con un ligando específico.
Por ejemplo una proteína y un anticuerpo específico que
la reconoce, una enzima y su sustrato, etc. Estos son
ejemplos de unión entre dos sustancias en forma
específica.
En todos los casos la unión es de tipo no covalente y
reversible.
Este tipo de cromatografía utiliza la ventaja de esta
unión específica para lograr separar una proteína de una
muestra compleja.
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Para entender como se produce la separación de proteínas
mediante este método utilizaremos como ejemplo la
separación de tres proteínas de peso molecular similar de
las cuales una es una enzima que cataliza una reacción
química utilizando un sustrato específico.

Esta proteína es la
enzima glutatión-S
transferasa.

Este es el ligando
específico glutatión
reducido.
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 Agarosa

La columna de afinidad
se realiza con Agarosa
unida al ligando
específico, en este caso
Pulse el mouse para ver la próxima diapositiva será el glutatión
reducido.
En esta animación veremos como se produce
la separación de las proteínas. VER.