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Micobacterias biosíntesis de la pared celular: un objetivo antibiótico multifacético

Katherine A. ABRAHAMS y GURDYAL S. Besra*


Instituto de Microbiología e infección de la Facultad de Ciencias Biológicas, Universidad de Birmingham,
Edgbaston, Birmingham B15 2TT, Reino Unido

(Recibido el 7 de septiembre de de 2016; 2 revisada de noviembre de de 2016; aceptado 8 de noviembre de 2016)

RESUMEN

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), el agente etiológico de la tuberculosis (TB), es reconocido como una emergencia de salud
global promovida por la Organización Mundial de la Salud. Más de 1 millón de muertes por año, junto con la aparición de cepas
de múltiples y extensivamente resistentes a los medicamentos. Mtb, ha desencadenado una intensa investigación sobre la
patogenicidad y bioquímica de este microorganismo, guiando el desarrollo de agentes quimioterápicos antituberculosos. La
pared celular micobacteriana esencial, que comparte algunas características comunes con todas las bacterias, representa un
aparente "talón de Aquiles" que ha sido el objetivo de la quimioterapia contra la tuberculosis desde la aparición del tratamiento
contra la tuberculosis. Esta compleja estructura compuesta de tres capas distintas, peptidoglicano, arabinogalactano y ácidos
micólicos, es vital para apoyar el crecimiento celular, la virulencia y proporcionar una barrera a los antibióticos. La naturaleza
fundamental de la síntesis y el ensamblaje de la pared celular ha convertido a la pared celular micobacteriana como el objetivo
más ampliamente explotado de los medicamentos antituberculosos. Esta revisión proporciona una visión general de la biosíntesis
de los componentes prominentes de la pared celular, destacando los mecanismos inhibitorios de los fármacos clínicos existentes
e ilustrando el potencial de otras enzimas no explotadas como futuros objetivos farmacológicos.

Palabras clave: tuberculosis, la pared celular, peptidoglicano, arabinogalactano, ácidos micólicos, antibióticos.

INTRODUCCIÓN membrana interna contiene glucolípidos que se extienden hacia


Mycobacterium tuberculosis (Mtb), el agente causante de la el espacio periplásmico. La estructura esencial de la pared
tuberculosis (TB), es considerado como el patógeno más celular central está compuesta por tres componentes principales:
exitoso del mundo (Hingley-Wilson et al. 2003). un polímero reticulado de peptidoglicano, un polisacárido de
Responsable de aproximadamente 1 · 4 millones de muertes arabinogalactano altamente ramificado y ácidos micólicos de
y 10 · 4 millones de nuevos casos de TB, incluidos 480 000 cadena larga. Intercalados en la capa de mycolate se encuentran
nuevos casos de TB-resistente a múltiples fármacos (MDR) lípidos extraíbles con solventes que incluyen glicofosfolípidos
en 2015 (Organización Mundial de la Salud, 2016), Mtb unidos de forma no covalente y ceras inertes, formando la
sigue siendo una emergencia sanitaria mundial según lo membrana externa. La cápsula forma la capa más externa y está
declarado por la Organización Mundial de la Salud (OMS) compuesta principalmente de proteínas y polisacáridos. Las
(Organización Mundial de la Salud, 2014). Se necesitan capas ricas en lípidos y carbohidratos de la pared celular sirven
urgentemente nuevos agentes quimioterapéuticos para no solo como barrera de permeabilidad, proporcionando
complementar o reemplazar los regímenes de tratamiento de protección contra compuestos hidrofílicos, sino que también son
primera línea existentes para reducir el tiempo de tratamiento críticas en la patogénesis y supervivencia. Son estos rasgos los
(actualmente curso de 6 meses) y combatir la creciente que hacen que la biosíntesis y el ensamblaje de los componentes
amenaza de este microorganismo. La característica distintiva de la pared celular sean objetivos farmacológicos atractivos. Esta
de las micobacterias, la pared celular compleja, es un revisión se centra en la síntesis de los componentes clave de la
objetivo farmacológico bien reconocido. La pared celular es pared celular, destacando objetivos previamente validados y los
común a todas las bacterias, tanto Grampositivas como Gram esfuerzos de descubrimiento de fármacos en curso para inhibir
negativas, pero puede tener grandes diferencias en términos otras enzimas esenciales en la biosíntesis de la pared celular
de las características bioquímicas y estructurales. Durante la micobacteriana.
última década, una extensa investigación sobre el ensamblaje
de la pared celular, ayudado por la secuenciación del genoma Peptidoglicano
completo, ha llevado a una mayor comprensión de la
biosíntesis de la pared celular micobacteriana. Esto ha El peptidoglucano es un componente principal de la pared
promovido una mayor exploración en el descubrimiento y celular de las bacterias Gram positivas y Gram negativas
desarrollo de agentes quimioterapéuticos (desde una (Vollmer et al. 2008). Es un polímero de residuos alternos de N-
perspectiva enzimática y fenotípica) dirigidos contra la acetilglucosamina y ácido N-acetilmurámico a través de enlaces
síntesis de esta estructura única de macromoléculas en Mtb. β (1 → 4) con cadenas laterales de aminoácidos entrecruzadas
La envoltura celular Mtb es una estructura expansiva y se por puentes transpeptídicos (Brennan y Nikaido, 1995).
resume en la Fig. 1. La bicapa de fosfolípidos de la
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Fig. 1. La pared celular micobacteriana. Una representación esquemática de la pared celular micobacteriana, que representa las
características prominentes, incluidos los glucolípidos (PIM, fosfatidil-mio-inositol manósidos; LM, lipomanano; LAM,
lipoarabinomanano; ManLAM, lipoarabinomanano mannosilado), peptidoglicano, ácidos arabinogalactanos y micolácido ácido.
Intercalados en la capa de mycolate están los lípidos de acilo (incluidos TMM, trehalose monomycolate; TDM, trehalose dimycolate;
DAT, diacyltrehalose; PAT, polyacyltrehalose; PDIM, phthiocerol dimycocerosate; SGL, sulfoglycolipid). El material capsular no se
ilustra.

El peptidoglucano micobacteriano tiene una serie de (Peneff et al. 2001) hacen de este dominio un objetivo
características únicas que diversifican la pared celular de la farmacológico inadecuado (Rani y Khan, 2016). Sin
estructura típica, incluidos los residuos de ácido N-glicolil y N- embargo, la ausencia de GlcN-1-P en humanos hace que el
acetil-muramático (Mahapatra et al. 2005a), amidación de los dominio de la acetiltransferasa sea un objetivo potencial
ácidos carboxílicos en los tallos peptídicos (Mahapatra et al. (Mio et al. 1998). Se están realizando esfuerzos para
2005b) y residuos adicionales de glicina o serina (Vollmer et al. identificar inhibidores de este dominio (Tran et al. 2013). Se
2008). La función del peptidoglicano no es solo proporcionar ha diseñado un análogo de sustrato de GlcN-1-P y exhibe un
forma y rigidez, sino que es responsable de contrarrestar la efecto inhibidor contra GlmU, proporcionando un candidato
presión de turgencia y, por lo tanto, es esencial para el para una mayor optimización (Li et al. 2011).
crecimiento y la supervivencia (Vollmer et al. 2008). El El siguiente paso implica la generación del pentapéptido de
peptidoglucano es exclusivo de las células bacterianas, y es esta ácido nacetilmurámico (UDP-MurNAc), que se sintetiza en
propiedad la que ha llevado a numerosas enzimas involucradas una ruta secuencial catalizada por las Mur ligasas A-F
en su síntesis a ser atacadas por potentes antibióticos, y otras
(Barreteau et al. 2008), por el cual se han encontrado la
representan objetivos atractivos en el desarrollo de futuros
mayoría de los genes Mtb a través de la homología. MurA,
antibióticos.
una UDP-N-acetilglucosamina 1-carboxiviniltransferasa, y
BIOSINTESIS DEL PEPTIDOGLICANO MurB, una UDPN-acetilolpiruilglucosamina reductasa,
participan en la generación de UDP-MurNAc a partir de
La biosíntesis de peptidoglucano se resume en la Fig. 2. El UDPGlcNAc, primero agregando el resto enoilpiruvilo de
primer paso comprometido es la generación de uridina difosfato- PEP, seguido de la reducción a un resto de lactoiléter a través
N acetilglucosamina (UDPGlcNAc). Esto es catalizado por las de NADPH. En este punto, NamH, una hidroxilasa de ácido
actividades acetiltransferasa y uridiltransferasa de GlmU (Zhang UDP-N-acetilmurámico, hidroxila UDP-MurNAc a ácido
et al. 2009), donde primero se transfiere el grupo acetilo de UDP-N-glicolilmurámico (UDP-MurNGlyc),
acetil-CoA a glucosamina-1-fosfato (GlcN-1-P) para producir N proporcionando ambos tipos de sustratos UDP-muramilo;
acetilglucosamina-1- fosfato (GlcNAc-1-P). En segundo lugar, Las paredes celulares de Mtb están dominadas por este
se transfiere uridina-5'-monofosfato de UTP a GlcNAc-1-P para último (Mahapatra et al. 2005a).
producir UDP GlcNAc (Zhang et al. 2009). La abundancia de
GlcNAc-1-P en eucariotas (Mio et al. 1998) y la similitud
funcional de la uridiltransferasa GlmU con enzimas humanas
biosíntesis de la pared celular micobacteriana 3

Fig. 2. Inhibidores dirigidos a la biosíntesis de peptidoglucano. Se ilustran las funciones de las enzimas clave involucradas en la
biosíntesis de peptidoglucano. Los inhibidores informados se muestran en rojo.

Esta modificación estructural es exclusiva de las hipersensible a los antibióticos βlactámicos y a la lisozima y, por
micobacterias (y géneros estrechamente relacionados) y se lo tanto, los inhibidores de NamH podrían potenciar el efecto de
considera que aumenta la fuerza intrínseca del los β-lactámicos (Raymond et al. 2005).
peptidoglucano, aliviando potencialmente la La cadena pentapéptida se incorpora en los sustratos UDP-
susceptibilidad a la lisozima y proporcionando sitios para MurNAc / Glyc mediante la adición sucesiva de residuos de
enlaces de hidrógeno adicionales (Raymond et al. 2005). aminoácidos L alanina, D-isoglutamato, meso-diaminopimelato
Los inhibidores de Mtb MurA y MurB aún no se han (m-DAP) y D-alanilD-alanina [generada por el D-Ala: D-Ala
descubierto. Mientras que el producto natural, el antibiótico ligasa (Ddl)] por el ATP dependiente Mur ligasas CF
de amplio espectro, fosfomicina, se dirige a MurA respectivamente (Munshi et al. 2013). Esto da como resultado el
gramnegativo, el residuo crítico para la inhibición está producto muramil-pentapéptido, UDP-MurNAc / Glyc-L-Ala-D-
ausente en Mtb, proporcionando resistencia intrínseca isoGlu-m-DAP-D-Ala-D-Ala, también conocido como el
contra este antibiótico (Kim et al. 1996). En consecuencia, nucleótido de Park (Kurosu et al. 2007). A pesar de las diferentes
se requiere un inhibidor con un nuevo modo de acción para especificidades de aminoácidos, las cuatro ligasas comparten
apuntar a Mtb MurA. Se ha informado un número limitado propiedades comunes: el mecanismo de reacción; seis residuos
de inhibidores contra MurB. La dinámica molecular y los invariantes "Mur"; un consenso vinculante de ATP; dominios
estudios de acoplamiento de los inhibidores existentes de estructurales tridimensionales (Barreteau et al. 2008). Debido a
MurB (derivados de 3,5-dioxopirazolidina) en la estructura estas similitudes, es plausible que un solo inhibidor pueda apuntar
de Mtb MurB revelan la potente actividad potencial de a más de una Mur ligasa y tales inhibidores han sido reportados en
estos compuestos, que pueden usarse para guiar el diseño la literatura (Tomasic et al. 2010).
de fármacos basado en la estructura futura (Kumar et al. Se han descubierto numerosos inhibidores de moléculas pequeñas
2011). Los inhibidores de NamH no han sido de las ligasas Mur y son objeto de una extensa revisión (Hrast et
documentados; namH no es esencial en Mycobacterium al. 2014).
smegmatis y, por lo tanto, no es propicio para una
propiedad objetivo característica. Sin embargo, la
eliminación de genes da como resultado una cepa
Katherine A. Abrahams y Gurdyal S. Besra bloques de construcción de disacárido del lípido II a las
cadenas de glucano preexistentes (con la liberación
En la mayoría de los casos, los inhibidores se identificaron a concomitante de decaprenil pirofosfato), mientras que el
partir de campañas de cribado de alto rendimiento (HTS) de último dominio cataliza la formación de los enlaces
bibliotecas de compuestos que emplean ensayos cinéticos in cruzados clásicos (3 → 4), entre m -DAP y D-Ala de las
vitro. Estos tipos de métodos de detección in vitro tienen un cadenas pentapéptidas adyacentes, con la escisión de la
uso limitado contra Mtb Mur ligasas dado que solo MurC y terminal D-Ala. D, D-transpeptidation y D, D-
MurE se han caracterizado bioquímicamente (Mahapatra et al. carboxypeptidation es realizada por las PBP
2000; Li et al. 2011). Esto dicta el siguiente paso racional monofuncionales, ambas resultando en la escisión del
hacia el descubrimiento basado en el objetivo de los terminal D-Ala del tallo del péptido (Goffin y Ghuysen,
inhibidores de la ligasa de Mur. Ddl es el objetivo de la D- 2002).
cicloserina (Bruning et al. 2011), un medicamento de segunda
línea utilizado en el tratamiento de la TB, y es la piedra Solo el 20% de los enlaces cruzados en el peptidoglicano
angular del tratamiento para la MDR y la TB-TDR Mtb son (3 → 4) (Kumar et al. 2012). La mayoría son
ampliamente resistente a los medicamentos. La D-cicloserina enlaces (3 → 3) entre dos tallos de tetrapéptidos, con la
actúa como un análogo estructural de DAla, inhibiendo la liberación de la cuarta posición D-Ala (Lavollay et al.
unión de D-Ala a Ddl (Prosser y de Carvalho, 2013a, b). El 2008). Esta reacción es catalizada por las L,
primer precursor de peptidoglucano anclado a la membrana se Dtranspeptidasas, con D, D-carboxipeptidación como
genera por la translocación del nucleótido de Park a fosfato de actividad previa. Las transpeptidasas L, D no están
decaprenilo (C50-P), catalizado por MurX (también conocido relacionadas estructuralmente con las PBP, con diferentes
como MraY), formando el lípido I (Kurosu et al. 2007). Hay residuos de sitio activo (cisteína y serina, respectivamente)
una serie de productos naturales complejos basados en (Mainardi et al. 2005; Biarrotte Sorin et al. 2006). Los
nucleósidos que inhiben MurX, incluyendo muraymycin, antibióticos β-lactámicos se han utilizado en el tratamiento
liposidomicina, caprazamicina y capuramicina (Dini, 2005). La de infecciones bacterianas durante casi un siglo y dieron
capuramicina y sus derivados exhiben destrucción in vitro e in lugar al descubrimiento de su objetivo, los PBP. Las L, D-
vivo y, más significativamente, se ha demostrado que los transpeptidasas son resistentes a la mayoría de los
análogos de la capuramicina eliminan Mtb no replicante, una antibióticos βlactamas, excepto los carbapenems (Dubee et
característica no común en la mayoría de los inhibidores de la al. 2012). Hasta hace poco, no se consideraba el uso de β-
biosíntesis de la pared celular (Koga et al. 2004; Reddy et al. lactámicos en el tratamiento de la tuberculosis, debido a la
2008; Nikonenko et al.2009; Siricilla et al.2015). expresión de un β-lactamasa de amplio espectro, BlaC. Sin
Significativamente, el análogo SQ641 está en desarrollo embargo, se ha demostrado que BlaC está inactivado
preclínico (http://www.newtbdrugs.org). irreversiblemente por el ácido clavulánico, pero hidroliza
los carbapenémicos a una velocidad baja (Hugonnet et al.
El paso intracelular final de la síntesis de peptidoglucano es 2009). Se ha demostrado que el tratamiento combinado de
realizado por la glucosiltransferasa, MurG. Se forma un enlace la β-lactama con el inhibidor de la β-lactamasa es
β (1 → 4) entre GlcNAc (de UDP-GlcNAc) y MurNAc / Glyc bactericida contra las formas de Mtb tanto replicantes como
de Lipid I, lo que lleva a la generación de Lipid II, el bloque de no replicantes, y ahora se están explorando combinaciones
construcción monomérico de peptidoglycan (Mengin-Lecreulx en ensayos clínicos (Hugonnet et al. 2009; Rullas et al.
et al.1991). Se diseñó una biblioteca de imitadores de estado de 2015). Un inhibidor bien documentado de la
transición para Escherichia coli MurG, y se probó contra Mtb transglucosilasa de PBP, la moenomicina (van Heijenoort
MurG con éxito parcial, siendo uno el primer inhibidor et al. 1987), un producto natural glucolípido, aún no ha
identificado contra la enzima Mtb (Trunkfield et al. 2010). La demostrado su eficacia contra Mtb.
enzima que cataliza la translocación del lípido II a través de la
membrana plasmática ha sido objeto de mucho debate. Hasta la Los inhibidores discutidos hasta ahora se dirigen
fecha, hay evidencia de dos enzimas diferentes con actividad directamente a las enzimas involucradas en la biosíntesis de
de "flippasa": MurJ y FtsW (Ruiz, 2008, 2015; Mohammadi et peptidoglucano. Sin embargo, hay otros antibióticos que
al. 2011, 2014; Sham et al. 2014). Se requiere una actúan sobre los precursores de peptidoglucano. Por
caracterización bioquímica adicional para confirmar la ejemplo, los glucopéptidos, la vancomicina y la
identificación de la "flippasa". Se esperaría que los inhibidores teicoplanina, se unen al extremo D-Ala-D-Ala del tallo
contra esta enzima exhiban una actividad de amplio espectro, pentapéptido, evitando reacciones de polimerización
dirigida a una actividad vital en todas las bacterias. (Reynolds, 1989). Los miembros de la familia de
antibióticos lantibióticos, como la nisina, interactúan con el
Después de la translocación a través de la membrana resto pirofosfato del lípido II, formando un poro en la
plasmática, el Lípido II es polimerizado por las proteínas de membrana citoplasmática, pero también inhibiendo la
unión a la penicilina (PBP) monofuncionales y bifuncionales biosíntesis de peptidoglucano (Wiedemann et al. 2001). El
(Sauvage et al. 2008). Las PBP bifuncionales (PonA1 / PBP1 y ramoplanina de lipoglycodepsipeptide inhibe la acción de
PonA2 / PBP2) poseen dominios de transglicosilasa y MurG al unirse al lípido I. La ramoplanina también se une
transpeptidasa. El primer dominio es responsable de unir los al lípido II, evitando su polimerización (Lo et al. 2000).