Fraccionamiento celular

BIO141C-2017
Bruno Tesser
Fraccionamiento celular
 Stomacher

Licuadora

Para la obtención de un lisado u homogeneizado

Homogenizador de émbolo
y tubo
Prensa de French
Disruptor ultrasónico o sonicador
Mortero y pistilo

Recipiente con nitrógeno

líquido
 F= mƜ 2 r
F es fuerza centrífuga
m es la masa de la partícula
Ɯ es la velocidad angular
r es el radio de giro
Esquema de una centrífuga
 TIPOS DE CENTRÍFUGAS

MICRÓFUGA

DE BAJA VELOCIDAD

ULTRACENTRÍFUGA
Hasta 500.000 g
 TIPOS DE ROTORES

ROTORES FLOTANTES

centrífuga baja velocidad Ultracentrífuga

ROTORES DE ÁNGULO FIJO Ó ANGULARES

ROTOR VERTICAL
 ROTORES FLOTANTES

Centrifugación diferencial:

HOMOGENEIZADO SOBRENADANTE

CENTRIFUGACIÓN
PELLET

ANTES DESPUÉS

En gradiente de densidad:
Fraccionamiento celular
Fraccionamiento celular
 Cromatografía

Resupendemos nuestros pellets

en buffer, pero éstos siguen
siendo mezclas complejas…
En una cromatografía los componentes de una
mezcla se separan por su diferente afinidad por la
fase estacionaria.
Tipos de columnas
cromatográficas
 TIPOS DE CROMATOGRAFIAs

-por carga eléctrica: intercambio iónico

-por tamaño: exclusión molecular

- por especificidad: afinidad entre proteína-proteína

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO
Fase
estacionaria
proteínas con
tiene carga carga positiva se
negativa unen a la fase
estacionaria que
tiene carga
negativa

las proteínas con

carga negativa
pasan de largo
Cromatografía de Intercambio Ionico
 CM-agarosa CARGA NEGATIVA
carboximetil-agarosa
 DEAE-columna CARGA POSITIVA
Dietilaminoetil
CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO

Intercambio iónico

- intercambiador cationico
(tiene carga negativa, ej.carboximetil CM-)
proteínas con más carga neta negativa pasan más rápido por la columna

-intercambiador aniónico
(tiene carga positiva, ej. DEAE+)
proteínas con más carga neta positiva pasan más rápido por la columna
Cromatografía de filtración en gel o exclusión
molecular
Proteína retenido por
interacción con ligando

Elusión por adición de

exceso de ligando
Perfil del aumento de la actividad especifica de una
proteína durante la purificación
 bolsa de
diálisis
solución
concentrada

tampón

al principio de la diálisis en equilibrio

 ELECTROFORESIS
foresis; del griego, estar llevado

Las proteínas se separan por

- carga eléctrica
- tamaño y forma
el  -mercaptoetanol va a “romper” los enlaces –S–S– (puentes
disúlfuro) tanto inter- como intramoleculares mediante una
reacción redox
( -mercaptoetanol reduce los enlaces disulfuro)

A2
-mercaptoetanol
HS
S
S +
SH
A1
A1 A2

El DTT funciona del mismo modo que el -mercaptoetanol

Carga de los aminoácidos y proteínas con los cambios de pH

a pH alcalino la mayoría de las

proteínas va estar cargada
negativamente
 El SDS se va unir a las proteínas dotándolas de una alta carga
eléctrica negativa, la cual por repulsión va a provocar el
desplegamiento de las mismas
SDS

SH
– – –– –– – – – –
–
– ––– – – – – – – –

La cantidad de SDS unido a la proteína es proporcional a su tamaño,

de tal forma que la relación carga/tamaño entre todas las proteínas va
a ser aproximadamente la misma (1.4gSDS/gproteina)
 CÁTODO
Fuente de poder

reservorio de
Electrodo de platinum

tampón superior
e inferior
única conexión
eléctrica vía el gel

+
ÁNODO

electrodo de platinum
 SDS-PAGE
condiciones denaturantes
fraccionamiento por tamaño
comparación con estándar de tamaño molecular
 Proteína
purificada
 Tinción con
Tinción inespecífica de anticuerpos
proteínas Western blot
Elesctroforesis de DNA
 Termina esta clase
• Link de autoevaluación:
http://www.daypo.com/test-bio141c-
fraccionamiento-celular.html