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DETERMINACIÓN DE AZUCARES VERSIÓN: No 01

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1. OBJETIVO

Determinar el porcentaje de azucares reductores en una muestra por medio del

método de DNS (ácido 3,5-dinitrosalicilico).

2. INTRODUCCIÓN

Los azúcares reductores son los carbohidratos que poseen su grupo carbonílico
libre, capaces de oxidarse en presencia de agentes oxidantes en solución alcalina.
Esta oxidación ocurre sólo con el monosacárido en su forma lineal – que está en
equilibrio con su estructura cíclica. Así, el carbono carbónico, denominado
anomérico cuando en la estructura cíclica, se oxida a un grupo carboxílico. Por otra
parte, los carbohidratos cuyos carbonos anoméricos están involucrados en las
conexiones glicosídicas, siendo incapaces de asumir de forma lineal y, por lo tanto,
de oxidarse en solución alcalina.

Entre los azúcares reductores, dos hexosas particularmente importantes para la

industria, especialmente la de alimentos son la glucosa y la fructosa. La glucosa y
la fructosa son monosacáridos de seis carbonos (hexosas) que se diferencian por
la forma cíclica y por la posición del grupo carbonilo presente en sus estructuras.

El ácido 3,5-dinitrosalicílico (agente oxidante presente en el reactivo DNS), bajo

condiciones alcalinas, reacciona con el carbón carbónico de los azúcares
reductores y reduce el ácido 3-amino-5-nitrosalicílico, un compuesto colorado cuya
absorción máxima de luz se da a 540 nm (Miller, 1959; Santos et al., 2017).

3. ALCANCE

El ensayo DNS puede ser utilizado como un método analítico preciso para la
evaluación de azúcares reductores tanto en solución pura como en sobrenadantes
de sacarificaciones enzimáticas de productos celulósicos purificados si la glucosa
es el único producto.
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4. LIMITACIONES

Análisis de sacáridos producidos de la hidrólisis de materiales lignocelulósicos puros

o pretratados ya que el análisis de DNS es susceptible a interferencias y por lo tanto
resulta en análisis inexactos.

5. RESPONSABLES

Aprendices Sena CBI, serán responsables por la ejecución de la experimentación.

Instructor(a) y/o Investigador a cargo del experimento, debe asegurar que el método
se ejecute de acuerdo a la instrucción de este documento, como también de aclarar
cualquier duda que el aprendiz se le presente en el transcurso.

Laboratorista: Se debe encargar de proveer los recursos necesarios en cuanto a

materiales y reactivos, como también apoyar al instructor y/o investigador en la
supervisión.

Todo el personal apto para realizar este procedimiento, la persona a cargo debe
tener en su poder el conocimiento del procedimiento, así pues, como el protocolo y
la habilidad del manejo de los equipos utilizados en este, incluyendo así, los
respectivos EPP como medida de seguridad debido a ser un procedimiento con
ácidos corrosivos y liberación de gases.

6. DEFINICIONES

MONOSACÁRIDO: Los monosacáridos o azúcares simples son los glúcidos más

sencillos, no se hidrolizan, es decir, no se descomponen en otros compuestos más
simples. Poseen de tres a siete átomos de carbono y su fórmula empírica es
(CH2O)n, donde n ≥ 3.

SOBRENADANTE: Dilución que permanece tras la formación de un precipitado.

EPP: Equipo de protección personal.

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7. RECURSOS NECESARIOS

7.1. Materiales:
Tubos de ensayo con tapa rosca de 10 ml
Gradilla
Baño de hielo
Beaker de 600 ml
Termómetro

7.2. Equipos:
Balanza analítica
Plancha de calentamiento
Espectrofotómetro UV-VIS

7.3. Reactivos:

Reactivo % Pureza Cantidad (g)

Glucosa anhídrida 1
Ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS) 5
Tartrato de sodio y potasio
150
tetrahidratado

7.4. Soluciones:

Solución de ácido dinitrosalicílico (DNS) al 1%: Disolver con

agitación 5 g de DNS en 200 mL de agua destilada y adicionar
8 g de NaOH disueltos en 75 mL de agua destilada. Llevar a
baño de agua a 50ºC por 20 minutos. Adicionar 150 g de
Tartrato de sodio y potasio y agitar hasta disolución completa.
Transferir a balón de 500 mL y aforar con agua destilada.
Almacenar en frasco ámbar en refrigeración.

Solución Madre: Disolver 2g de glucosa en 200 ml de agua

destilada (5 g/L), seguidamente se realizara una segunda
dilución de 20/100 (2000 mg/L).
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Diluciones Patrón: establecer una curva estándar de 200 a

2000 mg/L.

8. REQUISITOS CLAVES

a) Si se trata de un líquido, o una sustancia con consistencia pastosa o

semisólida se debe realizar agitación vigorosa y tomar una muestra
compuesta.

b) Si la muestra sólida, tomar una muestra representativa por método de

cuarteo.

c) Todo procedimiento incluido la curva de calibración debe realizarse por

triplicado, bajo oscuridad, sin incidencia directa de la luz sobre la solución.

d) Encender el espectrofotómetro 20 minutos antes.

9. PROCEDIMIENTO

9.1. Determinación de la curva estándar de glucosa

a) A partir de la solución de glucosa al (2000 mg/L) (Tabla 1):

b) Tomar el volumen indicado en la tabla de la solución de 2000 mg/L y transferir

a tubo de ensayo.

c) Adicionar 1 mL del reactivo de DNS.

d) Llevar los tubos a baño de agua en ebullición por exactamente 10 minutos y

transferir inmediatamente a baño de hielo por 5 minutos.

e) Adicionar 3 mL de agua destilada.

f) Realizar este mismo procedimiento para las restantes diluciones de glucosa.

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g) Determinar absorbancia de las soluciones a 540 nm cuando estas se

encuentren a temperatura ambiente.

Tabla 1. Curva de calibración de glucosa

Solución Agua Destilada Concentración

Muestra
Estándar (ml) (ml) (mg/L)

0 0.0 1.00 0

1 0.10 0.90 200

2 0.20 0.80 400

3 0.30 0.70 600

4 0.40 0.60 800

5 0.50 0.50 1000

6 0.75 0.25 1500

7 1.00 0.00 2000

h) Realizar el procedimiento anterior con la muestra problema.

9.2. Determinación de azúcares reductores en la muestra problema

a) Se centrifuga la muestra problema, con el objetivo de separar el

sobrenadante de los sedimentos celulares.

b) A partir del sobrenadante de las muestras, procedemos a realizar diluciones,

con el objetivo de determinar cuál de estas nos dará una lectura que sea
legible dentro de la curva de calibración. Nota: Generalmente se trabaja con
tres diluciones para cada muestra problema (10-1 10-2 10-3). Se debe
encontrar la dilución adecuada para la lectura, en algunos casos se
necesitan más diluciones debido a que la concentración de azucares es
mucho mayor, ejemplo: melazas, mieles, etc.
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c) Tomar el 1 mL de la muestra a analizar

d) Adicionar 1 mL del reactivo de DNS.

e) Llevar los tubos a baño de agua en ebullición por exactamente 10 minutos y

transferir inmediatamente a baño de hielo por 5 minutos.

f) Adicionar 3 mL de agua destilada.

g) Se puede modificar el volumen de la reacción de manera proporcional,

ejemplo: Reacción del reactivo 0,5 mL de DNS, y 0,5 mL de la muestra a
analizar, después de que haya pasado por los baños, se adicionan 1,5 mL
de agua destillada.

Curva de calibración de azucares reductores

3,5
y = 0,0015x - 0,0527
3
R² = 0,9997
Absorbancia - ABS

2,5

1,5

0,5

0
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
Concentración mg/L

i) A partir de la ecuación de la curva, determinar la concentración de los

azucares de la muestra problema teniendo en cuenta la ecuación 1:

mg Absorbancia-0.0527
Concentración ( L ) = (Ec. 1)
0.0015
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10. INFORMACIÓN DE SEGURIDAD Y PRECAUCIONES

10.1. Equipo de protección requerido: gafas de seguridad, bata de

laboratorio, guantes de protección de nitrilo, guantes resistentes al calor,
botas antideslizantes, mascara con cartuchos adecuados.

10.2. Riesgos:

Pasos del Procedimientos de

Riesgos
procedimiento seguridad recomendados
Ventilación, extracción
localizada o protección
respiratoria.
Nocivo en caso de
ingestión. Provoca irritación
Pantalla facial o
Ácido 3,5- cutánea. Provoca irritación
protección ocular
dinitrosalicilico ocular grave.
combinada con
Puede irritar las vías
protección respiratoria
respiratorias.
No comer, ni beber, ni
fumar durante el trabajo.
Cantidades muy grandes
pueden causar vómitos,
Ventilación, extracción
diarrea y postración.
localizada o protección
Irritación del tracto
respiratoria.
gastrointestinal.
Tartrato de Pantalla facial o
Inhalación Irritación al
sodio y potasio protección ocular
sistema respiratorio, tos.
tetrahidratado combinada con
protección respiratoria
Piel (contacto y absorción)
Irritación.
No dejar que el producto
entre en el sistema de
Ojos Causa irritación
alcantarillado.
extrema, enrojecimiento,
dolor.
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Todos los sólidos

Combustible. Mantener orgánicos, el fuego es
Glucosa
alejado de fuentes de posible a temperaturas
anhidra
ignición. elevadas o por contacto con
una fuente de ignición.

11. REFERENCIAS

Santos, A. A. Dos et al. 2017. Dosagem de açúcares redutores com o reativo DNS
em microplaca. Brazilian Journal of Food Technology, v. 20, n. 0.

Miller, Gail Lorenz. 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of
reducing sugar. Analytical chemistry, 31, 3, 426-428.
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Nombre Cargo Fecha Firma

Estefania García Asistente de Marzo de

Autor
González investigación 2018

Ernesto Mendoza Instructor Marzo de

Revisión
Pérez SENA 2018

Constanza Montalvo Instructora Marzo de

Aprobación
Rodríguez SENNOVA 2018