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Determinación del calcio

RESUMEN

El calcio en los organismos vivos viene principalmente de los alimentos y del agua,
la leche de vaca entre otros alimentos es una fuente rica en calcio. Para la
comercialización de la leche de vaca en México, la norma NOM-051-SCFI/SSA1-
2010 exige que se informe al consumidor el contenido nutrimental. Por otra parte
para demostrar su competencia técnica, para la acreditación por esta norma los
laboratorios analíticos que miden calcio, requieren participar en ensayos de aptitud
técnica y hacer uso de materiales de referencia certificados en el control de calidad
de sus mediciones. La incertidumbre del resultado de la medición de Ca++ que se
realizan por métodos convencionales en los laboratorios es adecuada para su
propósito, pero no para la certificación de un material de referencia (MR), por lo que
se desarrolló un método de mayor jerarquía metrológica para la cuantificación de
Ca++ en el candidato a MR DMR-274f de leche entera en polvo y se validó
parcialmente empleando como control el material de referencia certificado (MRC)
SRM-1849a, aplicando espectrometría de masas con fuente de plasma acoplada
inductivamente (ICP-MS) con celda de colisión o mediante el uso de espectroscopia
de absorción atómica, los resultados demostraron ser adecuados para el proceso de
certificación del candidato a MR.

Introducción

El calcio es el mineral más abundante en el cuerpo humano. Un adulto por término


medio tiene alrededor de 1 kg, 99% de él en el esqueleto en forma de sales de
fosfato de calcio. El fluido extracelular contiene alrededor de 22,5 mmol, de los
cuales alrededor de 9 mmol están en el suero. Aproximadamente 500 mmol de
calcio son intercambiados entre el hueso y el líquido extracelular en un día.
Alrededor de 25 mmol de calcio entra en el organismo en una dieta normal. Puede
estar disminuida si la dieta es escasa en derivados lácteos. De estos, alrededor del
40% (10 mmol) es absorbido por el intestino, 5 mmol son excretados a través de las
heces, quedando una cantidad neta de 5 mmol de calcio al día. La vitamina D es
una importante co-factor en la absorción intestinal de calcio. El calcio y el
metabolismo mineral representan un delicado y complejo proceso biológico que
comprende muchos componentes interrelacionados. El metabolismo homeostático
normal depende de la disponibilidad de los substratos minerales y de las
interacciones de los tejidos como los del hueso, el riñón y el tracto gastrointestinal
con las hormonas calciotrópicas HPT, calcitonina (CT). El calcio es el quinto
elemento más abundante en el cuerpo humano. El cuerpo humano contiene cerca
de 1200 g de calcio en las personas adultas y aproximadamente 28 g en los
neonatos (recién nacidos a término). Casi todo el calcio del cuerpo (99%) reside en
el hueso. El remanente reside en los fluidos del cuerpo y tiene un papel crítico muy
importante en un sin número de procesos fisiológicos incluyendo la contracción
muscular, la neurotransmisión, el transporte de membrana, las reacciones
enzimáticas, la secreción hormonal y la coagulación sanguínea. En la circulación, el
calcio existe en tres formas: 45% del calcio sérico total es la forma biológicamente
activa de calcio iónico, 45% está unido a la proteína principalmente albúmina y 10%
está unido a complejos aniónicos (fosfato, lactato, citrato). La acidez gástrica, la
aportación suficiente de vitamina D, son factores que regulan la absorción y
retención del calcio. En el adulto, el calcio dietético es absorbido por el intestino
mediante proteínas específicas unidas al calcio. Este proceso está bajo el control
activo de la vitamina D. La mayoría del calcio que se absorbe se deposita en los
huesos. La principal ruta de excreción de calcio en el cuerpo es a través de los
riñones(18) Se encuentran valores altos de calcio en el hiperparatiroidismo, lesiones
osteolíticas, acidosis tubular renal y se encuentra disminuido en el
hipoparatiroidismo, raquitismo, insuficiencia renal.1

OBJETIVOS:

Determinar la concentración de calcio en una muestra biológica mediante los


métodos de espectrometría de masas, por el método analítico colorimétrico
cresolftaleína complexona y espectroscopia de absorción atómica.

Conocer la importancia del calcio en el metabolismo humano y su relación con


diversas patologías.

MATERIALES Y MÉTODOS- 1:

La espectrometría de masas (MS)

1
TRESELER Kathleen Morrison; Laboratorio clínico y pruebas de diagnóstico; 3ª ed; trad. Dr. Jorge Mérigo; ed.
El manual moderno; México, D.F, 1998.
Es una herramienta espectroscópica analítica enfocada principalmente a la
separación de especies moleculares y atómicas de acuerdo a su masa. La
espectrometría de masas puede ser usada para el análisis de muchos tipos de
muestras, desde unidades elementales hasta grandes proteínas y polímeros.

La Espectrometría de Masas nos puede decir:

• Una medición precisa de masa puede ser usada para comprobar/validar fórmulas
empíricas.

• La fragmentación, que muchas veces resulta en sitios específicos o en grupos


particulares puede ser usada para identificar muestras por cotejo con bases de
datos de fragmentos.

• La fragmentación controlada puede ser usada para la elucidación de compuestos


novedosos.

• La observación de picos comunes en un espectro puede proporcionar información


útil respecto a grupos funcionales.

• La abundancia relativa de isótopos es usada para obtener información de los


elementos que forman un compuesto.

• Las mezclas complejas pueden ser analizadas mediante combinaciones de


técnicas como Cromatografía de Gases-Espectrometría de Masas o
HPLC-Espectrometría de Masa y evitando, en consecuencia, las largas tareas de
purificación de muestras.

Se utilizó nitrato de calcio como calibrante (Lote #J30336; J. T. Baker) y materiales


de referencia certificado en disoluciones espectrometrías de calcio (SRM-309a) de
una concentración de 9900 mg/kg ± 30 mg/kg e itrio (SRM-3167a) de una
concentración de 9990 mg/kg ± 20 mg/kg, para todas las preparaciones se usó agua
tipo 1 con una resistividad de 18 MΩ. Para las mediciones se utilizó un
espectrómetro de masas con fuente de plasma acoplado inductivamente con celda
de colisión (ICP-MS marca Thermo Scientific, modelo iCAP Q).El funcionamiento del
equipo fue verificado con la solución “tunning B” ICAP Q, que contiene Ba, Bi, Ce,
Co, In, Li, U en una concentración 1.00 µg/L ± 0.05 µg/L. Para la digestión se
empleó un horno de microondas (marca CEM, modelo MARS 6). Para la
cuantificación se preparó una curva de calibración de 5 disoluciones independientes
de Ca en un intervalo de (800 a 3000) μg/kg, empleando Y como estándar interno.
La digestión de la muestra se realizó por horno de microondas y las mediciones se
realizaron por ICP-MS. Se pesaron 0.2 g de muestra y 1.2 g de Y como estándar
interno de una concentración 1031.44 µg/kg, y se utilizó el material de referencia
certificado SRM1849 como control, enseguida se llevó a cabo una predigestión a 45
°C en una parrilla durante toda la noche. La digestión de la muestra se realizó en
dos etapas en el horno de microondas a 160 °C y a 220 °C. El producto de la
digestión se diluyo a un peso de 50 g con agua tipo 1, posteriormente se llevó a
cabo una segunda dilución para obtener 1 % de HNO3 en 50 g de agua tipo 1, las
mediciones de cada unidad del candidato DMR-274f se realizó por triplicado.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

El uso de estándar interno es recomendado para el análisis de rutina por ICP-MS,


esto para compensar las posibles desviaciones de los largos tiempo de análisis
(Nardi, et al., 2009). Para la cuantificación de Ca2+ se evaluaron tres elementos
como estándar interno Rh, Sc e I. El itrio fue el que mejor respuesta dio para el
análisis de Ca2+. Todas las muestras fueron preparadas con una concentración de
1031.44 µg/kg y los estándares con una concentración de 107.77 µg/kg de itrio. Por
otra parte se evaluaron tres velocidades de flujo de He a 4.525 mL/min, 4.526
mL/min y 4.528 mL/min en la celda de colisión. La velocidad de flujo de 4.525
mL/min, fue la adecuada para el análisis de Ca2+ en leche entera en polvo.

MATERIALES Y MÉTODOS- 2:

Método Colorimétrico o por Absorción Atómica (AAS):

Los métodos de espectrometría de absorción atómica para determinar la


concentración de calcio en suero son difíciles de mecanizar e inadecuados para
grandes series de determinaciones; con frecuencia su fiabilidad intrínseca está
comprometida por el procesamiento manual de los especímenes y por la
inestabilidad de la calibración. Entre los procedimientos espectrofotométricos para
determinar la concentración de calcio, dominan los basados en su reacción con la 0-
cresolftaleína complexona (I) a los que se atribuye dificultad de preparaci6n e
inestabilidad de los reactivos a causa de la captación de CO2+ del aire. Entre los
equipos de reactivos se prefieren aquellos con que la solución amortiguadora y la o-
cresolftaleína se mezclan en el momento del análisis. Se ha descrito un método en
que, para restar el color y la turbidez de los especímenes, tras la reacción calcio-o-
cresolftaleína se añade EDTA que rompe dicho complejo, y se ca1cula la
absorbancia diferencial antes y después de dicha adición.

El calcio con la cresolftaleína en un medio alcalino forma un complejo violeta, cuya


intensidad de color es directamente proporcional a la cantidad de calcio existente en
la muestra.2

MUESTRA CLÍNICA:

Suero: La muestra debe recolectarse en ayuno.

La muestra debe recolectarse en tubo colector de tapón rojo.

La muestra debe centrifugarse a 3500 rpm durante 5 min para separar el suero.3

El calcio en suero permanece estable durante: 10 días a 2-8°C ó durante 8 meses a


–20°C. 4

REACTIVOS:

REACTIVO 1:

Tampón etanolamina 500 mmol/L

REACTIVO 2: Cresolftaleína 0.62 mmol/L

Cromógeno 8-hidroxiquinoleína 69 mmol/L

STANDAR Sol. Calcio 10 mg/dL

CONTROL NORMAL Spinreact.

Preparación: Mezclar según la proporción: 50 vol. de R.1 y 1 vol. de R.2. La


estabilidad del reactivo es de 5 días a 2-8ºC.

DESARROLLO DE LA PRÁCTICA 1.

Pipetear en tubos de ensayo:

2
Reactivos para diagnostico clínico, Bioquímica Clínica, Productos. Internet: http://www.spinreact.com/
3
Reactivos para diagnostico clínico, Bioquímica Clínica, Productos. Internet: http://www.spinreact.com/
4
Reactivos para diagnostico clínico, Bioquímica Clínica, Productos. Internet: http://www.spinreact.com/
2. Mezclar y esperar 5 min. a temperatura ambiente.
3. Leer frente a blanco de reactivos.
4. Coloración estable 40 minutos.5
RESULTADOS:

LINEALIDAD DEL MÉTODO:

El método es lineal hasta valores de 15 mg/dL.

Si la concentración de calcio es superior, diluir la muestra a 1:2 con solución salina


0.9% y multiplicar el resultado por 2.6

VALORES DE REFERENCIA

Suero recién nacidos 8.0-13.0 mg/dL (2.00-3.25 mmol/L).

Niños 10.0-12.0 mg/dL (2.50-3.00 mmol/L).

Adultos 9.0-11.0 mg/dL (2.25-2.75 mmol/L).7

Referencias:

Fundamentos y Técnicas de Análisis de Alimentos


http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/FUNDAMENTOSYTECNICASDEANALI
SISDEALIMENTOS_12286.pdf

Manual de practicas de bioquimica


http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/MANUALBIOQUIMICACLINICA_10817.p
df

5
Reactivos para diagnostico clínico, Bioquímica Clínica, Productos. Internet: http://www.spinreact.com/
6
Reactivos para diagnostico clínico, Bioquímica Clínica, Productos. Internet: http://www.spinreact.com/
7
Calcio y fosforo
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/CALCIO,FOSFOROYMAGNESIO_11081
.pdf

Reactivos para diagnostico clínico, Bioquímica Clínica, Productos. Internet:


http://www.spinreact.com/

Espectometria de masas

https://www.iquimica.unam.mx/labserv/lab-cert?id=180

http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/4.1InstrumentacionEspectrometriadeMas
as_2462.pdf

MORÁN Villatoro Luis; Obtención de muestras sanguíneas de Calidad analítica; 1ª


ed; ed. Médica Panamericana S.A. de C.V; México D.F. 2001

Material de apoyo
http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/MATERIALAPOYOANTECEDENTES_22
427.pdf