CAPITULO 3 MORFOLOGIA Y ESTRUCTURA BACTERIANA Ojetive El objetivo de este capitulo es ampliar is informacién sobre las principales estructuras de las células bacterianas, en base al planeo def eapitulo 2. Teniendo en evienta los ambientex tan diversos en tos ‘cuates se pueden encontrar las bacterias, eabe preguntarse ‘eémo logran mantenerse vivas y eémo logran desarrallarse ‘en cada uno de ellos. (Por qué una célula bacieriana sobrevive atemperatures extrema, en taaio que otras muezen a eausa de variaciones térmicas intermedias? Por qué algunas bacterias son capaces de desarrollarse a valores de pH extremos? Por qué un grupo de bacterias se puede rultiplicar en presencia de un antibistico, mientras que otro grupo experimenta una rip lisis? Qué caracteristicas de las bacterias les pemmiten causar enfermedades en humanos, plantas 0 animales? lamo1en poems inaagar sobre por Ue aigunas bacterias pueden ser utiizadas como fuente de sustancias dde uso industrial, 0 por qué las bacterias juegan un rol csencial en la ecologia de fa tierra, edmo fo hacen, Muchas de las respuestas a estas preguntas sc encuentran en fa arquitectura estructural y molecular de los diverses componentes de la eétula bacteriana. Estudiaremos en este capitulo dichas esuuceatus para instar de comprender posteriormente Ia intersecién de las bacierias con los distinios ambientes en los que son capaces de desarroliarse, Introducet Segiin la organizacién interna de las céluhe, podemos dofinir dos tipos celulares basicos: Ins eélulas procariéticas ‘yas células eucaridticas, Las células eucarioticas son mis ‘grandes y complejas que las procari6ticas. Si comparamos su tamafio, podemos observer que tn gidbulo rofo mide 7 Marta A. Santillan’ tira (7000 nm) de didmetro y tna Ievadura entre 6 y 10 yum ‘mientras que.ma célula procaristica como Escherichia coli ‘ide aproximadamente-0.5 x.{,5 lim (S00 x 1500 am) y €l tamao de una estructura Subceluar como el cloropiasto es de2x 5 im (fig. 21. > 019 f.000 Levadure as eucatidsicns t & 7 Fig. 3-1, Esqueima comparativo del tama de {lobusos jos, levaduras),procaiéieas Eucherichia coll y estuclaras subselulares Celoroplastos, mitecondrias y bosoms, Todas ts adidas estan expresadss en nanometros Las levaduras, hiongos miceliats, algas unicelulares, protozces y patésitos metazoarios son microorganismos Constituidos par edluias eucaridices.MONFOLOGIA Y ESTRUCTURA BAGTERIANA 35 Las eétulas procariéticas mantienen usa organizacién ceiuiar sitnple (fig. 3-2), no conticnen nicleo_ni otras organelas subcelulares odeadas de membranas, no llevan a cabo endocitosis y son ineapaces de ingerir particulas Dificren ademas de fas células eucariéticas en que sus ribosomas son 70 $ y en general son haplo des. Las bacterias (células procariéticas) son los organismos mas pequefios que contienen toda la maquinaria requerida para Is fisi6a binaria a expensas de nutrientes inanimades. Sin embargo, Chlamydia y Rickeusia (dos geupos de procariotas tipicos) aunque presentan prop edailes por las fcidos aucleicos y Jipidos.y_son_sensibles.a diversas sustancias antibacterianas) requizcen eélulas Vivas para st replicacién ‘Tamaiio y forma de las baeterias Las bucterias pueden presentar diversos tamnan formas, pero existen tes formas bisicas:esféricas W ove (cocos), bastoncillos o cilindricas.(bavilas) y bastones curves 6 heticoidales (espirlos) (ig. 3-3) Los coces libres apareven como células estéricas aisladas, pero, luego de la divisidn celular, muchas células dacterianas no se separan totalmente, originando asi distintos agrupamientos, Segin el plano de divisibn, se pueden distinguir los cocos en pares (diplocacos), en ‘eadenas, en tetradas y/o en racimos. ‘Los baciles pueden cer muy eortos o tener una longitud | de dos a diez veces su didmetzo, Sus exiremos pueden ser | redondeados, cuadrados o aguzados. Los bastones curvos pueden ser pequefios microorganismos en forma de coma 0 levemente helicoidates en una sola curvatura,o espiroquetas Jergas y sinuosas, Podemos reconocer bactetias con apéndices en forma de largos tubos o tallos y las bacterias filamentosas que producen largas y delgadas células o cadenas de o¢lulas. | Larmayor parte de las bacterias tiene una longitud media de 1 a5 im, aunque se debe teneren cuenta que la longitud que son consideradas.bacterias (coatienen DNA y RNA, poscen ribosomas 70 S, sintetizan_sus.propias projeinas, ransom we Mena de una eéhula bacteriane puede variar eonsiderablemente, segiin el estadio del erecimiento y el medio en el que se esti desarrollando. El pequefio tamafo de los prosariotas determina varias CONS) ClO e300 de sus propiedades biolégicas. Por ejemplo, el eitm con el ee que los nutrientes y las sustancias de desecho pasaa al Fig. 32. Diagram de umi celia bacteriana Upics Meal (iodss faz interior y al exterior de las células,respectivamente, es, en sloensionesestinexpresadas en rm) general, iaversamente proporcional al tamafic celular, ‘itsfones a0 ips cps beens Pais ios Pisses RECONOCIENDO LOS ENTREMOS Se han descubierto bacterfas mis pequetias, incluso que las del gnero Mycoplasma (de aproximadamente 0,3 zn do didmetro) que eran las ns pequefias que sc habia descripto: las nanobaeterias o ultramicrabacterias de alrededor de 0,2 um ¢ incluso algunas mas pequefas, con didmeteas de 0,05 jum. Unas pocas cepas han sido cultivadas y es necesario ain establecer el significado de estas especies En 1993 fue hallade en el jntestino de un pez de aguas caidas (el Acamthurus nigrofuscus) un maicroorganismo peculiar: Epulopiscium: fishelzoni, ol que aim no ha podida ser cultivado en et taboracorio, Debido a su tamagio y a su movitidad, fue consierado al principio como un protozoario, ya que mide entre 30 y 300 um pudiendo, en algunos casos, llegar a medir hasta 600 jim, Estucios posteriores de hibridizacién y secuenciaciéa de RNA ribosomal han | posibilitado ubicario como wna bacteria Gram positiva, relacionada filogeneiieamente con el género Clastridium. Cuatro afios mis tarde, en 1997, en las cestas do Namibia (Arica), Heide Schulz de! Instituto Max Planck (Bremen, Alemania) encontré una bacteria que puede alcanzar 1002750 tum de diémetto. A esta bacteria, con brillo similar a una perla, a llamaron Thiomargarita namibiens, La "perla de Namibia", como la Llamé Sthutz, presenta un enorme saco Heno de Mido o vacuala que ocupa el 98% del interior de la bacteria; alli es donde alrazcena nitratos, El resto del interior de la bacteria consiste en glibulos de sulfueos dispersos en la pequefia capa de cioplasma que rodea ia vacuola, Esta nueva especie parece estar refacionada con los generos Beggiatca y Thioplaca, que incluyen bacterias marinas, con capacidad de oxidar sulthidrico y acumular nitratos. fovstos decir entonees, que sol detemiacién de Js medidas de una elu no nos perm realizar inferencas sobre su uitraesteuciann,36 S8CCION spatologia, A: Cooom mao prometio de pr (1000 money. Basil: C: Basteras eurvas (virial: Coco-bacla, Bste fjo, afeeta fos ritmos metabdtions y de crecimiento de los inicroorganisines, ‘Técnicas microsedpicas como base de los est morfoligicos La gran mayotia de las e6lutas eucaridticas mide entre 7 y 30 pm, y la mayoria de las célutas procariétieas, como hemos visto antes, soa ain menores. De abi que sea necesaria la utiizacton det microscopio para la obscrvacin de las bacterias, porque el ojo humano no permite resolucién de objetos menores de 0,1 a 0.2 mm Es deci ‘que es capaz de distinguir objetos que estan separados, como minima, unos {00 micrones. Esta capacidad se denomina poder de resolucidn. La deteecisa de las bactecas depende, entonces, del poder de resoluci6n del micrascorio, 0 sea, de Ia capacidad de distinguir entre dos puntos adyacentes. Hay diferentes tipos de miccescopios que, en general utilizan una fuente de luz que atraviesa 0 impaea sobre el objeto y esta imagenes sometida a un sistema de ampliacidn. {La excepcidn es ef mieroscopio electednico, en el cusl haces de electrones, en lugar de un haz de luz, generan la imagen del objeto ea estudio. Casi todos los mieroscopios witizados en microbiologia ton micrascopios de luz transmitida, que utilizan una serie Je lentes para amplificar los objetos (microscopios sompuestos). Las lentes de aurnento son el objetivo (lente primaria de umenio cercana af material u objeto que se va.a ver, que rma una imagéen real del objeto observado) y el ocular GENERAUIDADES lente cereana al ojo del observador que produce un aumento secundario de Ia imagen creada por el objetivo). Micrascopio de campo claro: Es cl avis utilizado en microbfologla. En la microscopia de sampo claro, bactetias aparecen como abjetos oscufos en un campo fuertemente iluminado, Las diferencias de contraste se producen porque las células absorben o cispersan ta luz ea distinto grado. Debido a que el indice de refraccién (n) de las bacterias cs similar a la mayoria ce los medios de suspensién acuosos, hay falta de contrast entre las células yy el medio que Jas rodea. Por eso, jas eélulas no se ven bien. a menos que estén tetidas. El objetivo de I00X del microscopio de campo cl ct llamado lence de inmersién, quees el mis frecuemtenvente ‘usado por el micrabidlogo, Utilizando aceite de iamersién (a: 1,52), para que no exista aire entre Is preparacién y et objetivo, se increments el poder de resolucién del microscopio debido a que el aceite genera una mayor apertiva numérica, por un mayor indice ée refraecién. Microscopio de contraste de fase: Este microscopio aumenta las diferencias de refraccién prevocadas por las subestructuras bacterianas, padiendo observarse dichas estructuras (pared celular, cépstila, endospora y particulas citoplasmatteas) en las eéiulas vivas, sin necesidad de fincién. Las ondas fuminosas que pasan 3 través de las elutas emergen en fases diferentes, dependiendo de las propiedades de las estructuras que atravieson, Un sistema Sptico especial, convierte esta diferencia de fases en diferencia de intensidad, apareciendo de esta forma lungs estructaras mis ascucis que las otras, Microsenpio de campo oscuro: Seutitizaun condensador ‘que bloquec fa uminacidn directa y que dirige fa luz en un Angulo tal que eingiin rayo lumninoso penetra directamente en el objetivo; solo Hegan indirectamerte fuego de ser refleiados. refinctados 0 difractados nor ef objeto. Los objeto se’ ven en forma brillante sobre un fondo negro. Esta tdenea permite fa visualizacién de peeparaciones en fresco y es un méiode muy apropiado para estudiae la ‘motilidad de los microorganisms dado que los penachos de flageios suelen poder resolverse por esta técnica. ‘Adenuis, es un método de eleccién para bscar reponemas cen formna directa en lesiones uleeradas frete a ia sospecha de sifitis, Mieroscopio de Muorescencta: Emplea una fuente de luz ultravioleta, Se aplica el principio de que ciertos complejos quimiens fluorescentes tienen la propiedad de absorber la luz UV 0 emisiones de luz de baja longitud de ‘onda (luz de fimpuras de halégenos) y emitirrayos de luz visible, Se pueden tratar los microorgonismes con un colorante fluoresente © con un complejo colorante= anticuerpe tluoreszenie que permite distinguirlos en una poblacién mixta. Est técnica es de uilidad en citologla y en el diagndstico nicrobiologico, Microscopio dectrénica: Se ha cosvertide en unMore’ elemento esencial en distintos eampos de irvestigacign de Ins ciencias biologicas. El poder de resolucién del microscopio de luz esta jtado por Ia longitud de onda de la ixz visible. El inicroscopio electrénico tiene un poder de resolucién de aproximadamente 0,001 jum. Bn lugar de una fuente Jumsinosa wilizn una fuente de cleetrones (generalmente un cétodo de filamento de tungsteno), y electromagnetos en verde lentes paca diriyir y enfocar el haz deelectrones. La imagen se observa en una pantalla fluorescette o se registra ‘en una placa fotografica La técnica de sombreado de metsles pesados en forma de vapor en alto vacio y depasitado en éagulo sobre ta preparacién data de 1946, La placa metiliea es opaca a los elecirones y Ja microgeafia electronica resutante tiene un aspecto brillante, en tres téenica de uneidn negativa con rosfomungstato, que ha resultado muy util para aclarar la estructura de los viras, pues permite ver estructuras finas que no pueden verse en Cortes de particulas incluidas en cid ésmice-metijacrilato, El vacio es parte relevante del micrascopia electrénico, ya que los electrones pueden ser desvindos po" las moléculas Gel aie, y por lo tanto se debe tener en cuenta ue el material observado vat expusalo a deformaciones inhcrentes al vacio y tla desecacién El desarrollo del microseopio ciectronico de baerido (MEB 0 scanning electron microscopy), permite ver las estructucas en tres dimensiones, no siendo necesario cortar el objeto a observar en capas. La muestra se reeubre con una fina capa de metal pesado como el o10, Un haz de elvctrones muy conecntrado barre la superficie de la restr; los eleetrones son recogidos y proyectados sobre una pantalla para produeir una imagen. Con el MEB sélo puede verse la superticie de los objetos. E] microscopio electeénico de transm sién (MET), permite la observaciSn de muestris en cortesultrafinos de no més de un par de miles de angstroms. La miceoscopia electronica ha permitido observar detalles de estructura situadas en los limites dla resolucién ‘ptica y determinar directamente la forma y dirnension de virus pequetios, 1 Microscopio hiser confocal: Permite verla morfologia y dinimica de las eslulas y tefidos aun cuando éstos sean Bruesos, logréndose imagenes de alta catidad. ba microscopia laser confocal de barrido puzde producir verdaderas imigenes tridimensionales. Con la microscopia confocal, s6f0 una fiaccién de luz emitida eo el plano focal es detectada. Esto se logra utilizando una fuente de luz que produzca un punto pequelio y geomé:ricamente bien definido en el plane focal: fa luz intensa de un lser (el mas empieado es el de augsn-lsiptsn) Permite que sélo observemos el plano que ext situado en el punto de faco det sistema éptico eliminanio, de forma Optica 3 teavés de un diafragma o "pinfole”, ta luz _proveniente de los planos que estén fuera de foco. La luz de todos fos planos es refiactada por ta lente, pero s6lo la que procede del plano central. que est en foco. es capaz de pasar 0 través del pinhole dando lugar & una LOGIA Y ESTRUCTURA BACTERIANA 37 imagen nitida y perfectamente definida de las estructuras situadas en ei plano focal, sin ioterferencia de la luz procedente del resto dei objeto. El objeto se visualiza punto por punto a través del objetivo por un haz. que se mueve, productendo una serie de puntos Tuminosos.o imsigenes de apertura, cada unade las imagenes procedentes de distintos planos focales, se las denomina seceidn dptica, porque equivale a la imagen obtcuida al seccionar la muestra con ua microtomo. Con sistemas informiticos adecuados es posible realizar une reconstruccién tridimensional del objeto a partir de las distintas secciones dpticas. Este sistema puede operar por visvalizacién diresta con luc visible o por visuatizaci6n con fuorescencia por UV, Dado que no es nevesario-colocar el objeto a observar en una eémmara de vacio,ef mango y procesamicnto de las muestras equlere menos tiempo y ademis presenta la ventaja de ser tuna técnica no invasiva ai destructiva, Secuencia racional ea cl estudio morfolbxico Examen en fresco (fig. 3-4) Se puede realizar el examen microseopico di ‘hese Tass deseo ve Mirocopa de casi de Mieeoepa de emp sto tlie Cad arp ‘team | | | an oh | | Fhe preator 4 Noierensiaie Ditecninee + -Sk SECCION 1% GENERALIDADES Jas estrus sie tineién eealizande un mowaje directo en theo, donde las muestras se extiencien sobre la superficie dle um portaodjeta para se observacién. Si el material es muy espeso para pecmitir Ia dliferewciacion de sus elementos, puede diluirse con solucion fisioldgica estéril, Luego se deposita un cubreobjeto sobre lasuperticie del material Este tipo de preparuefones sin tehir se emplean también para detectar trofozoitos méviles de parasibs intestinales como Giardia 0 entoamebas y huevas y quistes de otros risitos, y, wemnds Trichomonas y Koger. Las bacierias también pueden ser examinadas micros- ‘edpicamente en “estado vivo” por medio del método de ta, gota pendiente a partir de una suspensién Para ello, se coloca una gota de suspensién bacteriana en el centro de un ‘eubreobjeto que luego, se coloca sobre «| portuobjeto ‘exeavado, pero invirtiéndolo, de modo quo la eusponcion bacteriana quede en a excavacion (fig. 3-5), Las bacterias, suspendidas en la excavacisn del portaobjeto se mueven ibremente. La motilidad se determina observando e! movimiento bacteriano con el mayor aumento del micxoscopio. EXAMEN EN FRI Es una de las téenieas de mayor y Ineoncenteaci6n relati dc bacterias méviles, células wuis, e&hela vaginalis y evaluar la calidad y cantiad de tevaduras, vvoginales mis frecuentes, Examen directo posfijacin Ademds de Is posibilidad de estudiar una muesiea mediunte el examer en fresco, uno de los piimeras pasos en la exploracin microbiolégica de In mayoria de las muestras es Ia observacion de las bucteras mediante La tincién se debe realizar sobre un extendido. Consiste en distribuir lo mas homogeneamente posibl tuna gota de una suspension del material a estudiar sobre Ja superficie de un portaobjato (eserupalosanente limpio) con un ansa, Dajer secar el extendido al airey Inego fjar las célalas por ealor. Se procede posteriormente a la fineién apropiads, con el objeto de incrementar el contrast. Las técniéas de tineidn, partirdel proceso de fjacién (que incluye calor), présentan el inconveniente de rmodificar las estructuras e iacluso deformarlas, SCO DEL EXUDADO VAGINAL HUMANO | Este informe, basudo exclusivamente en ia microscopia en freseo, es de gran valor pronéstico para las patoloyias También es posible reatizar el examen en fresco con un microscopio de contraste de fise o con ua microseopio de rnicas, adenxis de permitir observar la motilidad, proporcionan una visi6n no distorsionada de la morfologia y el agrupamiento de tas eélulas baeterianas, Suipesion ‘acer Cube obetos ~ Pontobjee exeavads Fig. 3-5. Examen en trseo, Mitodo de la gota pendent ilizacién y de gran valor prediciivo en Ia atencidn primaris de la salud de la -uujer, en la que se busca la imagen global d! halntee del contenido vaginal (BACOVA), en especial la caracterizacién face los morfotipo: mierobianas caracteristicos (bacilos, eocos, bustones vu1yus), lx existencia ce la respuesta inflamatoria y, eventualmente, la presencia de Trichomonas Los eolorantes mtilizados soa compuestes orginicos, con Trecuencia cargados positivanente, que sé combinan fuertemente con eomponentes celulares cargados negativamente, como los acidos nuclei¢os y los polisncaridos acidos. Ejemplos ée estos colorantés son el azul de metileno, el cristal violeta y Ia, safranina. Ejemplos de colorantes aniénicos son Ja fucsina acida y Ia eosina Existe una gran variedad de técnicas de tincién, muchas de ellas tien a todas las bacterias con la misma nes con azul de metileno o azul de as que otras, las denominadas tinciones diferenciates, las titten de diferente modo, petmitiendo distingnir, asi, diferentes tipos cefulares. Las dos tcnicas de tinciones més utilizadas son te desarrollada por Gram y_la tineién de bacterias Acido- alcohol resistentes, desarroliada por Eltrlich y luego por Ziehl-Neelsen. Ambes son tinciones diferenciales.MONFOLOGIA Y ESTRUCTURA BACTERIANA 9 Tineidn de Gram Este método fue desarrollado, en forma empirica por el patdlogo danés Hans Christian Gram en 1884 (ver cap. 1). Es uno de los métodos de tineién mis importantes en el laboratorio mnicrobiolégico y su utilidsd praetica es indiscutibie Las células fijadas al portuobjeto por ealor son tefidas eon un colorante basivo (cristal violets o violeta de zgenciana), €] que es captado en fume simile por sodas tas bacierias. A continuacida, son tratadas con una mezcla de 11K (lugol) queactia como mordiente (tijacida) del primer Colocance. Posteriormente soa tratadas con una me7cla de alcobol-acetona (70:30), a este paso se lo denomina devoloracién, Finalmente se aplica xin segundo coloranse de contraste (safeanina.o fucsina) (fig. 3-6), Al examinar miccoscopicamente un extendido que contetya una flora bacteriana mixta, coloreado por el método de Gram, se observan las ceracteristicas diferenciales del mismo, Cas bacterias Gram _positivas, retienen el colocante violet. nici, mientras que aguellas ‘gue son decoforadas, por el disolvente orginicy .tilizado, toman el segundo colorante (se observan dk color rosado) ¥y son consideradiss Gram negaulvas, De este modo, con este procedimiento no s6lo se hacen visibles Ia Forma, agrupacién, el tamafo y otros detalles estructurales, sino |e et, Cc mc } =a bw | Fig, 36, Esquema de los pasos a seguir eu bs fncin de Gree. aque las bacterias pueden agrupacse segiia renccionen frente ala tincién de Gram, en Grace positivas y Gram negati lo que resulta hasta hoy de una ayuda importunte en la orientacién diagndstica Debe considerarse que existen algunas células Dacterianas que reacciouan frente a Ja coloracion de Gram en forma variable y otras que no Toman fa eoloracion de Gram. Ademas, cultivos viejos, de mis de 24 horas de incubacién. pueden gerder su habilidad para retener el complejo eristal violeta-haol {La reaccida frente a la coloracién de Gram dependeria del espesor y Ia estructura fisiea de la pared celular y de las propiedadles de permeabilidad de ls envottura celular intact ‘También los levaduras reaceionan frente a fa colocacién de Gram, observandose al micrascopio de color violeta, alingue poseen una pared con estructura y composicion, (quimica distinta de la de las bueterias Gram positivas, Tineida de Zivhl-Neelsen 0 de mieroor alcohol resistentes ismos fietdo~ Los microorganismos pertenecientes al_género Mycobacterium paseen una eavaluca de lipidos complejos y coras, som lipolilicas y dificiles de destenic. La propiedad Ge Acido resistencia de las micobacterias (bacilos aleohol resistentes © BAAR) es de importancie en fa ‘deniticaeibo de los bacilos de asuberatosis (Afpeobuterium suberculasis) y de la lepra (dswebaererinm leprae) Elextendido de un esputo ode nn eultivo de micobacterias realizado sobre un portasbjeto y fijado, se tie con una rmezcta de fuesina bisiea y fenol. Se caients el portaobieto sobre Ia llama, el tiempo suficiente hasta la ebullicion del ayua (la presencia del fenol ayuda a la penetracién del colomnte), Pasteriormente se realiza ta decoloraciéin con una mezcla de alcoholcido (3% de HCt coneentrado en ctanol 95%), Una vezeoloreadas algunos micraorganismos resisten al tratamiento con aleakolaeido (los que tiewen poredes con mayor proporcién de ipidos)y retienen el color rosado, mientras que la mayoria de las bacterias pierden su eoloracion, Paa la visualizacién de aquellos miero- ‘onganismnes que se decoloran, se aplica un segundo colorant (aul de metiteno) (Hig. 3-7), De este modo se observan fos BAAR de color rosada y el vesto de los miceoorganismes, tefides de azul ‘Ademas de ins micobacterias, slo algunas especies de Actinomycetes, Corynebueterias y Nocandias son seido~ ‘aleohol eesistentes - Usa modificackin de la tinci6n de Zieh|-Neelsen ha sido utilizada como tineién de referencia para demostear ta presencia, en otis de materia fecal, de Craptosportdlin Cou decutorante se empiea dcido elorhidrico en concentraciones entre el 19% y el 3% (en etanol al 70%) durante 15-20 seg. Dadi que algunes ooquistes no presentan lancarseteristica de deido-vleohol resistencia, se suele tatar fas heces con agua oxigenada (concentracién final de 5 voliimenes) para hacer que todos fos ooquistes sean fcido~ alcool resistentas ¢ inerementar la sensibilidad de la iseo SERCION F4 Existen métodos de deteccién de antigenos de Cryptosporidium en heces por inunofuorescencia, hemaglutinacion, y ELISA, que presentaa buenos resultados, incluso superiors a Ios métodos tralicionales. Sin embergo, la inci sigue siendoutlizada murdialments comoscreening en el dingnéstico clinica. Cryptosporidium ‘Myerosporidium son frecuentes patSgenes oporunisas en pacientes con SIDA (ver cap. 93). Observacibn de edpsulas En Ia presentacion preliminar de ta estructura bacteriana ({ig, 3-2), heros indicado la presencia de una envoltura externa de las bacterias, 2 fa. que llamamos eapsula, Su observacién con microscopio dptico en freseo es dificil, ya que su indice de cefraccién es simler at del medio Las cipsulas bacterianas no.tiencn la misms afinidad por los colorantes que otros componenies eelalares, de alli que se utilizan métodos de tincién negativa. Enesta técnica se agrega una suspensién de tnta china o nigrosina a una suspensida bacteriana, luego extiende sobre un portaobjeto, se seca y se observe micros amente, De este modo se ven las capsul halo claro sobre un fondo oscuro Al ser una esincetura muy hidratada (99% de agua), suobservacién von Ins tgenicas babituales de microscopic electrénica de transmision (MET) y de barrieo (MEB) revela une notable contraccién de Su estructura, => Ce (estendido} | "Up | | | } Ss Y _ kD nao om inkatmente | tie fee | | ‘icido-alcoho! ‘cido-alcoho! Fig. 37. Esquema de los pasos a sepa en a tnsiba de Ziel Nelsen, CENERALIDADES Para investigar mis sobre le estructura de la capsula ‘se puede recurrir a difraceisn de rayos Xdel potisucarido capsular. Coloracién de lagelos Dado gue los flagelos se hallan fuera del poder de resolucién del microscopio dptico comin, para poder visualizarios es necesario aurmentarsu tamafo. Esto se logra cubriendi el extendio con um precipitado é2 una suspen colvidal inestable, el mordiente (por ejemplo, alumbre potisico, écido tinico y cloniro de mercuris) luego se aplica el colorante adecuado (carbolfuesina de Ziebl-Neelsen) y s¢ visualiza el flagelo con objetivo de innersién (anétodo de Gray). Los flagelos pueden también ser detectados serolé- sgicamonte. Las células que los poseen retccionan con los anticuempos especificos para dar una aglitinacién taxa y foculenta tipica, Estas pruebas son sumemente dtiles en diagndstico, poc ejemplo, en Ia serotipificacion de ‘Salmonella spp. cuyas especies producen altersativamente 2 antigenos flagelares Coloracién de esporas Las esporas son estracturas bacteriams relativamente resistentes g los agentes fisicos y auimigosy no se colorean ‘con facifidad. Bn ia tincién de Gram aparecen como cuerpos, refrctiles no coloreados. Por lo general, en los métodos de coloracién se requiere el calor para permitr la penetractén, del colorante en las esporas. Uno de les métodos mis, empleados es el que utiliza una solucién xcuosa de verde de malaquita para coforear las esporas y Satanina © fuestoa como contracoler (método de Wirt-Conklin), Estudios de deteceién de antigenos Sobre un extendido, es frecuente ver bacterias morfol6- gicamente idéaticas, inclusive utilizando por ejemplo ta lincién de Gram. Una manera de diferenciarias, cuando se trata de especies diferentes es utilizar un suero (con antieuerpos especificos contra un antigeso especifico) y asociarlos (antfcuerpos conjugados) con un marcador fluoreseente. Mediante distintos tipos de técnicas, puede identificerse una especie a través de [a mieroscopia de fluorescencia. Este grupo de procedimicatos es de granimportancia en el diagndstico e identificacién de agentes microbianos. Composicioa quinica bacteriana En Ja mayor pate de jas bacterias cl agso representa el 70-80% del peso d> la eeluta. Su contenido prateico es de ete el 40-60% desu peso seco y el de hidtatos de carbono de entre el 4-20%, También 3¢ haan lipidos, acide desoviribonucteico (DNA). dcido riboructeico (RNA).y otros componentes de bajo peso molecular (cuadro 3-1),MORFOLOGIA ¥ BSTRUCTURA BACTERIANA, 6 Candro 3-1. Comes quimics genera Je una calla de ‘Escherichia coll “Tipo de componente ) rowing 0.60 ‘Acido rbonucleco (RNA) 020 Ribosomal, de transfezencia y rmengajero ‘Acido desoxiribonueteien (DNA) 23 Lipidos os spopousseseno 4 Pepuidoelicane 23 Pequetss moléculas orgénicas Tones inorgiucos 19 composicise quimica y el porcenlaje de cds componente estén In‘iuior por a eompasitan del medio Wo cultivo y at condiciones de ineubacion. Ultraestructura bacteriana Aunque en su interior las bacterias son mas simples que lac eélulas cucaristicas, ya que no pooten organelas rodeadas por membranas, su estructura superficial es mis compieja y comprende una serie de envoiturss externas que rodean el citoplasma, donde se hatlan ¢ genoma, los ribosomas y las inclusiones. Las bacterias, adem, poscen apéndices 0 profongaciones, que se extienden por fuera de la célula Algunas de las esteucturas que forman peete de la eélul bacteriana, tales como membrana plasmatics, ribosomas, material genético “eromosGmico”, son imprescindibles para su viabilidad, bajo cualquier condictén de crecimiento. La pérdida de otras estructuras, como cépsulas, Nlagelos, pills y plismidos, 0 de la informacion genetica necesaria para su formacién. 10 les impide a las bactetias dividirse y dar lugar a una poblacion en condiciones fivorabies, por ejemplo, en un cultive en et laboratorio. Algunas de estas estructuras les pueden ser imprescindibles pava establecerse y/o reproducirse en tun medio ambiente diferente 0 que n0 tes es propicio. La pérdida de estas estructuras, debido a condiciones ambientales o inclusive por sérdida de la capacidad genética de sintetizarlas, podsfa impediles, en. este caso, dividirse y desarrollarse. Envolturas celutares Las envolturas de la estula bacteriana, se presentan en una serie de estructuras que varian su complejidad y composicién quimica, segan distintos grupos evolutivos, procaridticos. Entre otros, podemos distinguirlas envolturas, de bacterias Gram negstivas, bacterias Grim positivas, bacterias écido-alcohol resistentes, archibacterias y. ta de interior, podemos encontrar la cépaula (facultativa), ia membrafia externa (en bacterias Gram negativas), ja pared y la membrana plasmatica (fig. 3-8). _sintetizados por div Capsula y capa mucosa (glicozatis) ‘Numerosas bacterias tanto Gram negativas como Gram positivas fabrican y exportan polimeros de alto peso molecular que se odiiieren al exterior celular formando una ‘capa por fuera de los polimeros de la pared. ‘Cuando esta capa es{d bien organizada y noes ficilmente elimninada, se la denomina capsula. Cuando se deforma con facilidad, y es mas dificil de obset var, se fa designa como capa mucosa (slime). Sin embago, habitualment= sc habla de efpsula para definir cualquiera de las capas por encima de la pared celular (Gram positivas) ©. membrana externa (Gram negativas) (lig. 3-2). El glicocalis es una red de polisacéridos que. se extiende. desde la superficie de. una bacteria a otras células. -Existen bacteria en las que no se ha podido demostrar la sxisteneia de ta eipsula, y deny de una misma especie su cexpresién depende del estado fisiolégico del microorganismo. Las eépsulas estin compurstas por polimeros que forman una capa mas 0 menos yruesa y mds rigida o mas flexible, dependiendo de su nattraleza auimica. Segtin el organismo y.segiin iz composicién del medio nutritive en el que desarrolla la bacteria, ls cépsitlas pueden estar compuestas por: -polisacdrides: polimeros de. galactosa, rammosa o de glucosa (dextrano) y fructose (levano), por ejemplo, 5 cepas de estreptococos; ~complejos de polisscdridos con diversos polipéptidos; ~polipéptidos: formados, por_una.o dos clases de aminoacids, por ejemplo, Bacillus anthracis produce wna cépsula formada por un polipéptido de D-glutémico, mientras que los de especies no paldgenas contienen D- glutimico y también Bacillus st isémero natural, en una proporeién del 20%, = \ ASE ie Fig. 3-8, Diagrama que vests la diireaca prveipal ene Ut pared de sacterias Gram negativas. a) Con una fnacapa de mureina ) Se rauesta Ip escustura de bactriag Gran posivas emia ques espa de mursina > ‘auch mis grucsa y compacca|ol SECCION ¥ Ja cipsula puede ser visualizada micrescopicamente, eomo ya se lit Uescripto, por tineidn neyatva o mediante 11 condiciones genéticas y fisioligeas de forma iginara un.tipo de colonia, que se conoce como 2 0 nuucoide. Cuando en iguales condiciones fisiologicas cer una bacteria de la misma «specie que ha pene Ia eapacidad genétiea de formar cipsula, la colonia (que se desarroliaes una colonia rugosa. Le pirdida genética de la capacidad de formar.cépsula no impidea las bavterias dividirse ai formar colonias. Aunque 1us expsuias no son ‘requeridas para el erecimiento bacteriano ea fos cultives en el Inboratorio, les confieren aumerosas ventajas a las bacterias cuando éstas se desarrolan en sus habitat naturales. ‘La cipsula es nna estructura laxa, que.ne interfere con la permeabilidad y generalmente su_despolimerizacton cozimsitica no lesiona lu pared cefutarni atcck Ia viabilidad Sin embargo. en el caso de ios Bacillus spp., lt despolimerizacion del polipéptido de glusmilo origina algunos trasiomos en la pared. A las cipsulas se les pueden asigner nunerosas Aumciones, incluso para una bacteria eh Farticular. Las cépsulas son. estracturas.fuertements_hidmtadas 1o_que prevendria la desecacién bacteriana. Tienen, ademas, [a capacidad de pear iones metélicas y aminodidos cargados positivamente. Estas prapiedades pueden permitit el smanlenimiento de nutrientes en zonas cereanss alas eds. Excluyen virus bacterianos_y la mayoria de los t6xicas hidrotdbicos como detergentes Las edpsulas bacteriaias tienen un papel importante ea ‘el mecanismo de patogenia, en la fijacion o adhereneta de alguitos misroorganisines patégeuos a sus hespedadores, y cen fa respuesta immune de los organismos que infectan. La cepas formadoras de cépsula son aliamente viralentas, Las bacteriaa (Siremocoveus pneumoniae. por eianpio) pietden su virulencia si [a capsulaestéauseate. Los mnierorganismos eapsulados son virulentos, pongue son eapaces de resistir la fagocitosis no siendo degradados por Ia aceida lisesoml de los macréfagos (por ejemplo. las enzinas no puedes atacarla edpsula de Duglutamato de B. anthiacis): ademits reducen la activacién del complemento. En cigunos cases, la preseneia de la cApsula permite al microorganism escapar de la respucsta inmune, porque en se composicién presenta polisaesridos sitnilares.a los del hospedader (por ejemplo, fcido hialurénico). El material de la ccipsula es eapaz de estimular la formacion de anticuerpos especttieas cuando se inyecta en animales apropiados, 0 sea, e6 antigénico. Una especie bacteriana dada puede incluir cepas de distinto tipo antigénico, con eipsulas inmunolégicamente ui feeuts. En le formacion de kas caries denisles se ta implicado la formacion de biofilms mediados por beeterias de fa cavidad bucal, entre otras, Sireptocaceus mutans. La eapacidad de esta especie parn Fijarse a tendiduras y pequefias Rurasde los dientes es resultado dele produceidn de un polisacdride de devtrano, el qne s* produne exclusivamente cuando existe snearosa en el medio, GENERALIDADES. Copa s ‘Algunas bacterias Gram positivas y algunas Gram negativas tienen en sw superficie uaa capa. compuesta ageneralimente por ut dnico tipo de subunidad proisica 0 alicoproteica que se dispone en espas monomoleculares 0 bimoleculazes de anos pocos nanimetcos de espesor, denominada capa S. Esta estructura es comin en las atchibacterias, donde guele ser la nied capa por encima de {a membrana plasmativa, La capa § protege a Ja céluta de fos eamdios de pH, cambios iGnices. presencia We enzimas; promueve in adhesin de los ofas a las supertcies y previenea lacelula de Is fagocitass, contibuyendo ala virutencia Muchas tacterios Gram negativas producen capa S. Tat es cl caso de teromonas salmoniciaa, de gran importancia econémica debido a ta devastncién que puede producir en criaderos de salmones. La formacisa de la capa $ depend, emeste caso de la presencia de LPS intueto en la membrana externa, Dado que [a capa S 28 um potonaiat faotar di virutencia, se estudia la posibilidad de utilizar las subunicades peptidieas para eluborar vacuras, ‘Las bacterias Gram neyativas presentan po membrana plasmética dos caps de envoliuras, dispuestas de manera taxa. Estas envoltucas iyeluyen.ta membrana externay una zo1a intermedia periolasma, donde: se halla a pared ipeptidogticumo) (fig. 3-2). Membrana externa: Bs una doble capa asimétrica focmuda por lipopnctisncdividos (LPS) y fosfolipides, de aproximadamente 7 a 8 min de espesor. La capa externa de esta. bieapa preset una_mayor proporciéa de lipopotisacaridos_y algunas protetnas. La porcién Kipolisuedrida (fig, 3-10) de fn membrana, externa esti Eoinpuesia por tres segmentos unidos covalentemente: 1) una region polisacarida variable: polisacérido O especitico o rexién I, Hamado tombién antigeno somiiticn (0 que se extiende desde la membrana hacia el exterior, ') la regién del polisacsirido del eentro o region I, localizada en la superficie de la membrana; y ‘©)stn fipido complejo, el lipida A o region ltl, embebido en [a membrana EL_antigeno Q (regi6n ais externa del LPS) esta compiiesto por unidades repetitivas de ol + residuos, dando lugara la formacién de una larga eadena de hidiios de cabo de hasta 40 aaticares de longitu’. Stas cadens hdres eubren fs sperticie bacteria exeluyendo los vomy ‘antigens. ya gue las adenashideocarbonadas varian en n de especie a especie, Cada una de estas ine una especie o subespecie de bacterias Gram negativas.MORFOLOGIA Y ESTRUCTURA BACTERIANA 63 Wid 1 My, Lipoproteina de Brion Periptasens y gel peripliseo Memabrana, plasmin Sig, 3-9. Bovolturas de bactarias Gram negativas adeptalo de Prescott etal). AntigenoO_}—{Polisasirido Cented--—{____LipidoA Regiéa | Region Il Regién 11 LON OS | ! 1 © Unidades repetitivas de Oligosseiridos 23 -Rexlin exams ds Pina Cental (ga gk NAC HHep-2D0 Regi intern el Poise Cental Hep sHeptosen KDO seide 2-ssto-d-dessictnico Actos grasos Fig. 3-10. Diagrams simplifcedo de is estructura de un lipopolisacieido de membrana exiersa de hactsias Gram negatives,64 En Is regién del polissesrido de} centro (region 11) podemos difecenciarun érea interna y otrt extra. La regién extema est compuesta por ghucosa, gaiactosa y N-acetil- glucosamina. El érea interna conticne Acido 2-ccto-3- desoxioctuldnico (KDO), compuesto exclusiva de [as bacterias y heptosa. El KDO esti unido a fy glucosamina del lipido A. + El lipido A consiste en unidades de disacaride, ‘compuesto por N-Ac-glucosamina fostato, tnidas a varios dcidos grasos de cadena larga mediante uniones de ésicr amina. Siempre se encuentra presente el Acido P-Oll- tmiristico, que es exclusive de este lipido; ks otros scidos gcasos (caproico, Idurico, miristico), isi como los sustituyentes en los grupos fosfatos, varfan seg [a especie tacteriana, Los lipopotisacérisios bacterianos son.téxicas. paca las animales. Cuando se iaycctan en poyiefas cantidades, se activan los macrOfagos, se activa la cascada decomplemento causando inflamacion y se activa la enscada ve coagulacion pudiendo producirse una coagulacion ntravascular dlseminada-y-hensogiy 3 induce a roduenin de interferdn, Siben clink ‘es.c1 componente tbxica del dos, también contribuyen 3 fa virulent de las bacterias Gram negativas. Cas endotoxinas juexan tun rot sumamente importante en la infeccién por cuatauier bacteria Gram negotiva. Le capa intertor de la membrana exteraa lado celular presenta fosfolipidos cualitativamenie dististos de los de la membrana plasmética. Los fosfolipidos presentes en esis capa interna son fosfatdile:anolamina, fosfaidilglicerol y cardiolipina, En esta capa interna, en bacterias Gran negativas, se encuentra La porcidn lipidien de una lipoproteina qué sirve de anclaje de la membrana externa a ta pared. ‘La membrana externa, como ya dijimos, presenta también protelaas: proteinas de membraea externa 0 Outer membrane protein (Omp). ‘Algunas protefnas 0 porinas forman canales de difusién transmembrana y actian como canales no specificos de entrada y salida de sustancias hidrofilicas de bajo PM, Son ejemplos de ellas las porinas de matriz Omp C, D y F de Escherichia colt y de Salmonella enterica, serovariedad ‘Typhimnariur. Las porinas de distintas especies pueden tener diferentes limites de exclusién, que van de 600 2 més de 3000 Ca, Algunas protefnas de membrana externa también actian como receptores especiticos denutrientes ysiven, ademas, como sitios receptores de figos. Por ejemplo, Lam B, proteina de Escherichia coll, es necepiora del baci lambda (2) y ademas «s responsable de! pase de maltose ymaltodexirina a través de fa membrana, Otra porita, Tsx, es receptora para el bacteristago T,, y ex responsable de la ifusién ransmembrana de nucledsides y algunosaminodcidos. Oiras proteinas lamadas menores son las responsables eporar resistente, de las células animales infectadas. _.Como Jos micoplasmas carecen de pared, son resistentes ala accion de los antibidticos que bloguean Ie sintesis de la misma y tampoco son afectados por ia accién de a lisozima, Lafalta de pared, ademas, determina que scan pleomérficos, © sea, que puedan presentar distintos tipos morfolégicos (cocos, coeos en cadenas, cocos con tibilos, células filamentosas con estructurasterminales, célulasflamentosas con ramifieaciones y eélulas en forma de per). Los micoplesmas constituyen un grupo importante de bacterinz asneindas =] eur humana y existen variadas opiniones sobre su capacidad de indueie patclogte, Formas L. Son bucterias que ham perdido la capacidac de sintetizar paredes_celulares completas y se denominai asi porqui fueron descriptas en el Lister Instinue de Locdres. Se pueden observar formas L de baccerias Gram negativas y de bacterias Gram positivas, cuando crecen én tejidos animales infectacos..Algunas ‘formas L sintetizan parciaimente pared celular, mientras que folras carecen totalmente de ella. Protoplastes y esferoplastos ‘Som bacterias sin pared producidas de manera combinade (lisezim, E ¥ peptidasns) se logra eliminar la rigidez. de Ia pared de una bacterin sable la Hila nun tai, ipednico de socarosa al 20% o sales (CIK_0,5 M), se libea un cuerpo cesfitico, sm pared que sconce con einemine ve protoplasto. Los protoplastos adquicren una forma esférica porque la cenvoltura es la capa superficial parac GENERALIDADES presién osmética interna impulsa en todas direcciones de Ja superficie interna de la membrana plasmitica, El protoplusto puede, cumplir en estas condiciones casi todas las funciones bioldgicas: sintesis de enzimas, esporuacion (si el proceso se ha iniciadoen la calla imtacta) © soportar ia muitipficacion de bacteriofagos cuando la eélula ha sido previamente infeciada, Se han detectado algunas difereavias metabélicas sagrin esté la pared © n0, indicando que, ademas, de su funci6n fisica de contencin, la pared condiciona algunos aspectos del metabolismo. ‘Sila célula ha adguirido una forma esférica por naptura de la pared, pero todavia retiene restos de ésta, se habla de esferoplastos. El sérmino protoplastos es usado en general para bacterias Gram positivas, y el de esferoplastos, para las Gram megativas, ya que éstas inevitablemente retienen algunos componentes de la membrana externa. Los esteroplastos también son osméticerente sensibles, aun cuando presenten “pedazos” de pared asociados a fn membrana plasnyitica Pared celular de archibacterias Las archibacterins se pueden dividir en 5 grandes as eaiemas y las termilas f acters pueden wi negativas 0, Gram positives, sus pare lares son, distintas de las de las eubscterias. Tienen diferentes. tipos de pared, pero ninguna de allas tigre come hase esteicniral al écido murdmico ni posecn estructuras que contengan D- aminoacidos. Las Gram positives ticnen una gran Yariedad de polimeros complejos en sus parcdles, mientras que las Gram negativas, generalmente tienen wma capa de proteinas © glicoproteinas por fuera de su membrana plasmsticu. ‘Las pansies le ka Merhonoscinna.spp..(archibacteria ‘meta dgena)estin Formadas por polisaedridos no sulfatactos en base le glucosa, decide. glicurinico, gulactosamina y certo, Las archibscterias halls extremas (por ejemplo, Halocoris spp.) fabrican paredes similares que contienen, abundantes residuos de sulfate. ‘Algunas metanobacterias tienen paredes formadas por “seudomureina”, aniloga al peptidoglicano de eubacterias. La seudomureing contiene dcido N-a-cetiltalosaminurénico: unido a N-acctil-glicosamina mediante uniones B (1-3) y, por lo tanto, ¢s insensible a la lisozima. Los aminodcidos Ge la seudorsureina som sivenpre deconfigeraciéa L. Es frecnente encontrar, ademas, como la envoltura mas. externa, una estructura proteiea cuisi-cristalina que se ha identificado en cientos de diferentes especies de arehibacterias mediante microseopia clectrdnica, Esta istalina.o eapa S, realmente compuesta por un ico tipo de subumidad ‘proteica o glicoproteica, Tal como ocurte en las bacterias, Ja pared colular de las archibacierias imide lalisisosmstica y es responsable de la forma celular. Thermuplusina, como ya dij, 3 8 Gnica archibasteria que carece de pared coluia.MORFOLOGIA ¥ ESTRUCTURA BACTERIANA Pared celular de micobacterias La propiedad tintorial de Scido resistencia xe corretaciona con la presencia de didlos mieéliegs (hidroxilipidos con ramificaciones laterales complejas) presentes en las cevoliuras de las micobacterias y bacterias relxcionadas (fz ciados ala menabrana plasmatica es posible hallar inositol mandsidos y lipoarabinon:ananos. Estos liposrabinomananos serian extensiones poliglicosiladas de Jos inositolmanésidos y se comportan como s. fuesen écidos lipowievieu, formundy un puro o inwerfase para permitir el pasaje de ciertos matrientes hacia la célula. Ademas,serion responsables de le interaccién del patdgeno con las eéfulas oo fagociticas del hospedador. Corynebacterias, nocardias y tmicobacterias coraparten una esicuetuta similar de pared, tun patrén similar de uniones cruzadas y, ademds, un arabinogalactano unido al glicopéptido covalentemente, Las micobacterias estin sete _ademés, de gran fficos de_ especie slicopeptidotipigos (GPLs), Rpooligosacériday trehalosa (LOSs) y glicolipidos fendlicos (PGLs). Formando una superficie antigsnica podemos encontrar GPLLOLOS, los que se excluyen mutuamente, y que pueden ser considerados como factores de aviruleacia, ya que neutralizan el rol del lipearabinomanano en la interaceién centre el patdgena y el hospedador. Menbeasa Piosmates Foxtons tins - a ‘i Hon ' R-C~ C—cooHt M 1 | Y Bae aa B-| oe M ; Re CegOally [ Anbinogalaeiao Acidos tet a = visions R= Cully i Pee aon ne IEE | I eA Pepidogicano M M ea y v I i i | a o Lipeusbioomanene Fost nosol licolipiosepeiios de eecie i "LAN Manse (ets. tosa rou Fig. 3417, Eaquema de las envoltuas de Mpcobucterium tuberculosis (aaplado de Brennan. al).0 SECCION 1 ‘Los PGL, en cambio, serian un verdadero producto de exerecidn y pueden ser considerados verdadstos Factores de virulencia. Esta pared, formada por peptidoglicano, rolisaciridos, lipides y Scidos micSiicos, permite que fos micioorganismos resistan a la accion de muchas sustancias quimicas y es responsable, al menos en parte, de que estos micicorganismos se desarrolien con lentitud, por el earécter hidrofobico de | superficie celular y, en consecuencia, le menor tase de captacién de nutrientes. Membrana phasmitica Es nny astnchier de tips hieapa prot deaita eee tone faestractura de membrana biol6gica: dos capas densas timitondo una capa central transpareate, Xa membrana sane un sinesor de. 7. S98 nm. Esti siguteatva et aa prveariotes (excepto oxitotobactorias, ciettas bi iltrofas y molticutes) y las de cucaciontes..En ct tase.de los micoplasmas (gue éarecen de pal in incorpo de esteroles (mofeculas rigidas y pl Gila einbrana, haciendo menos exible ye Muchas membranas baeterianas conticnen mo cnominudas hopanoides (.iterpeavides pentaziclicos) que son sintetizados a partir de Tos mismos precursices ie los cesteroides (Fig. 3-18). La sintesis de hopauoides a diferencia de la sintesis de esteroles, no requiere oxidacsn y, por lo tanto, no necesita oxigeno molecular bacteria hopenctetsa! -diplopteno Fig. 3-18. Bstesctura de distinios hopanoides (teiterpanoides penaciclics) GENERALIDADES Los lipidos cuantitativamente mis importantes que fosfolipidos (ostatidiletanolamina_y fosfatidilglicerol). Rara vez se encuentra en rovariotes fosfatidilcotina, moléeula presente en euoariotas. No existen en 1as_bacterias cides. grasps poliinsaturados, con excepeion de algunas bacterias fotosiniéticas. Las bacterias pueden modificar la je dcidos zrasos insaturados y saturados con el objeto de mantener nn adecunda fhusiez de fa membrana, como adaptaciin alos cambios de temperatura, E} contenido en lipidos de la membrana de un microorganisino esta influenciado, al menos en parte, por la temperatura de crecimiento. por ejemplo, las bacteriassicrOfilas presentan casi todas sts icidos grasae de tipo iosaturado, Los extremos hidrofébicos, (écidos grasos ye alcoholes) interactian en. el. centro. de. la ‘membrana, mientras que los exirentos hdroflicas (aeupos fosfatos caryadns), estin en ambes superticies (interns y con el citosol y e La estructura de bieapa de fas membrar representa la organizncién mis estable cue pueden alcanzar Jus molgeutas tipidicas en vn entorno scu0so. Las proteinas estructurales pueden estar asociadas tanto com la sitperfiie intema como von la externa de la metnbrs plasnvitiea, Ga kt superficie extema se encuentran enzimas celular y_proteinas_ que fijan_sustratos tales como aiinosicidas y eatboRldraws, En ta siperfieie intemia 0 cipalivente proteinas in de enevght“Adeinds existen proven ave atraviesan esta membrana de lado a lle denorainadis, permeasas implicacas en el iransporie sctivo de pequeriog sustsatos. La membrana acta como una barra fisica entre el citoplasma y ei medio ambiente y jerce su control sclectivo Gol movimiento de diversas sustancias desde y hacia Ia cella. Exist tes procses pr lo cals as moles es deingresaren la célula bactriana atravesando simple, dustin failtada progesos metablicos: respiracién, fotosintesis, sintesis de lipidos y constiuyentes de la pared cellar, La membrana p! sitio donde se ubiean Jos citocromos y donde se tea altise encuentran fos cromforos Zotosiatéticos y se realiza la fosforilacién oxidativa y la fotofosfrilacisa. También ‘sel hugacdoade se ubicanias proteinas macientes destinadas a la exereci6n {por ejemplo, exotoxinas y otros factores de vieulenciay, La capacidadde la membrana plasinitica como barrera ‘smética est denosirada, entre otras cosas, por ia eapacidad de ls bocterias ie concentrar ciertas sustancias en contra del gradiente d: concentracidn. Sustancias tales como fostitos, ésteres de fostitos, purinas, pirimidinas y otras sustancits solubes pueden estar dentro de Ia céluta en alta concenteacién. Muchas de as bacterias requie crecimiento1 otros tejidos, de alli que les bacterias que infectan un corgunismo excreten compucstos quelantes (sideriforos) que ‘se unen al hierro con alta afinidad. Luego, el cumplejo Fe- sideréforo se asocin a un receptor en la superficie bacteriana y, una vez internalizado, se libera el hierro dentro de la bacteria. Las bacteria han desarrollado miltiptes siderdforos y sistemas de caplacién. Cada complejo es to bastante inico pare no ser atilizade por otos micro organisms, Membranas de archibacterias Los lipidos presentes en las membraras de las ‘rchibactering son dnicos desde el punto de visa quimico. los lipidos de tas archibacterias poseen enlaces éter, responsabies de Ja unién entre el glicerol y hs eadenas Jateraies hidrofébicas hidrocarbonadas. Estis cadenas Interales se haflan en lugar de los écidos grasos. Los ipales tipos de lipidos presentes son los disteres y tetradteres de gfcerol, ao existiendo estructuras comparables en los otros dominios, Las archibacterias terméfilas (que desarrollan en ‘ambientes con temperaturas muy altas) presentan nonocapas, ioas mis estables y resisientes a la disgregncion. En estas monocapas, Jas cadenas laterales de cadt moiécula de glierol, se unen covalentemente entre si. Mesosomas Su presencia se demuestra més ficilmente e1 bacterias Gram positwvas que en Gram negativas. Se observan como, invaginuciones de membrana con distintos grados de complejidad que conticnen estmeturas Jaminares, tubulares 0 vesiculares (fig. 3-2). Diversos estudios han demostrado diferencias en los constituyentes proteicos y enzimsticos de wembranas plasméticas y mesosomas. En estos diltimes, labria una concenteacién de enzimas respiratorias, Su fomacién y contcol estarian regulados por mecanismos infuenciados, por el medio ambiente, principalmente cambiosiGnicos, ¥ no parecen estar asoviados a un control genética directo. Aunque se han sugerido muchas funciones reucfonadas con los mescsomas, ninguna se ha esteblecido ean firmeza, Organizaciones fotosintéticas En las bacterias el aparato fotosintético es mucho més simple qm an los edlulay evearigticns (en Ine apym astin prosontes los clorophistos) Las bacteras verdes fotosintética as que son estructutas especislizadas de rica que se encuentran debajo de la mernbrana mutica a fa que estin adheridas. Estas vesiculas estén ‘enieérradas en una membrana fina que no tiene el aspecto tipico de doble capa. En ellas se alojan los pigmentos fotosintéticos (bacterioclorofilas y carotenoides que actiian cn la absorciéa de I energia lurninica), mientras que los somponentes de los transportadores de electrones, rocedentes de la fotosintesis, y Is bacterioelorofila def n centro de reaceién se lovalizan en la menbrana plasmitica Como difimos, en procarfotas no existen por regia general organelns citoplismicas rodeadas por unidad de membrana sin embargo, la mayoria de las ciunobacterias (cxifotobacterias), comtienen un sistems de citomembranas de sacos aptanados, que son independiertes de la membrana citoplasinatica:tilacoides, por ejemplo, ca Syriechorysts spp. Apéndices bacterinnos Son estructuras variadas, con fimeiones diferentes, gue emergen fuera dela céivla bacteriana, Las més importantes son, flagelos, fimbrias o pilis,pilis senuales y Clamentos Son largos filamentos proteicos que suelen medir hasta LO 4m, 0 sea, varias veces el largo de les bacilos, ac como apéndices responsables de la locomocién de las -bacterias, Se extienden por fuera de ta membrana y la pared ‘celular. No todas las bacterias son flagsladas. Las cacas, por ejemplo, no son flagelados y alrededor del 50% de los bacilos tampoco poseen flagelos. Ademds, las bacterias pueden presentar distinto niimero do Magelos (desde uno hasta eientos por célula), los que pueéen distribuirse de distinta manera (en un polo, en ambos polos o distribuidos por toda la superticie bactlar), La microscopia de transmisién electiinica muestra que cl flagelo. esta compuesto por tres partes: el filamento (externo con respecto ala eéiula),el ganeho (en la superficie )y el cuerpo basal (anclado en la membrana plasmatica) (fig. 3-19). EI filamento es un cilindro bueco. Quimicamente esta constituido por suibunidades proteicas de ®M aproximado de 30.000 2 60.000 Da, Laestructura de esta proteina (la flagelina) es practicamente especifica de especie en Io relativo a su composicién de aminodcidos (eisteina y triptofano, por ‘ejemplo, estan siempre ausentes), siendo ce gran importancia esta composicién en la estructura y funcioratidad del fagelo La flogelina es sintetizada en las cercanias del botin flagelar citoplasmatico, mediante un proceso denominado aute- ensamblaje: [2 informacién completa pura Ia estructura definitiva del flegeto reside en las propies subunidedes proteicas. £l creeinviento del flagelo ocurre por el agregado de subunidades de flagetina a la “punta” del mismo adoptendo tuna forma hexagonal que le permite dejar un centro altuecado, EL filamento termina en una proteina “caring”. El gancho esti aapstimidn por nna jiniea prnteina ce 30.000 a 45.000 Da. EE! cuerpo bast! esti formsdo por arillos que rodean al filamento. Escherichia coli y la maygrta de las Gram negativas poseen4 anillos conectados 4 vn cilindro central. El anillo M estd embebido en la membrana citoplasmitica, permiticndo la roacién de! flagelo, el anillo Sse encontsaria cnire la membrara plasmatica y la capa de peptidoglicano, cen ef gel periplismico. Los anillos exteriores de! cuerpo basal coinciden con la capa de péptidogicano (anifto P) y la membrana externa (anillo L). El cuerpo basal estin ——— 1) Flags de bates Geam neat ase oacho. Metra 1 ayade Pepto ste, == Menta aniios citeplivenien ZZ antl ) Flagelas de bacarss Gram posits Conde Pepto esse | rime | | | | Menbessa Pasties Fig. 3:19, Ultraestructra de Ios flageloe bacterianos constituide por 10 a 13 proteinas, una de las cuales se agregaria para dar lugar al gancho, La estructura de los flagelos en bacterias Gran positivas 2s similar, excepto que el exerpo basal contien: s6lo dos unillos: uno embebido en la membrana plasmetica y el otro ssocindo al peptidoglicano (fig. 3-19). La presencia de los flagelos es ficilmonte demostrable vor microscopia de campo escuro o de contraste de fase. jon de ancho uniforme, detgados (12.425 nrn), pero sélo eden visualizarse por microscopia éptica cusndo estén sfiidos especialmente. 1a presencia de flagelos tambign puede ser detcetada erol6gicamente. Los flagelos no. son csenciales para la viabilifad de las acterias. Estas pueden perderlos por simple agitacién con etlas de vidrio, quedando los botones basales dentro de 'seélulas, por lo que los flagelos pueden ser posteriormente sla gota pendiente) 0 porcrecimiento en medio semisblido gar blando at 0,3 0 0,5%). Los organismmos con Magelos ‘trios (0 sea, en toda le superficie) se mueven eralmente en linea recta debido a la rotacién de los we tienen flagelos ‘se muleven danilo giros, periédicamente, Los lagelos no som sélo drganos ds iocomt qué tambien intervienen.en la. adhesién,.coloni superficies y formacién de biotilms. La fuerza que mueve al fagelo para impulsar a las bacterias parece ser generada por el arillo M. Este anillo rota en el sentido de las agujas del reloj een sentido ioverso, obteniendo la energia necesaria para la rotacién de una vorriente proténica generada en Ia menbrana plasmitica, Asociado al cuerpo basal y proyectindose dentro del citoplusma, se encuentra un anitlo, que contiene las proteinas de.nwitch (proteinas Mot y Fli)y aetia como el eorazén det motor. Aqui es donde se produce el acaple entre e! pasaje de protones o de iones sodio a través det complejo Mot), con generacién de la 1 bien existen aumerosos modelos, tofavia no se conoce el mecaaismo preciso de cémo un gradiente transmembrana de protones o de ones sodio se convierte en trabajo mecénico, Cuando las baeterias se encuentran en ambientes sin gradientes, reatizan pequefios movirnentas en linea recta o carreras y Inego dan una voltereta, y a eélula cambia de direccian, Las bacterias tat aziicares y aminodci 0 ssustaneias, asi como pueden responder a otros. ambientales, por ejemplo, la luz (Fototaris).E! de atraccién_o repulsion hacia_sustancias quimieas se. denoming quimiotaxis. La existenck de un gradiente quimiotictico hace que tos movimientés direccionales en linea recta sean mis largos, El desplazamiento hacia auslante, en un movimiento en Iueu recta, se produce ‘cuando ef motor Magelor rota en sentido contrario a las agujas det reloj. Las sustanciss son detectadas por los quimiorreceptores, proteinas (presentes en el espacio perplismico 0 en la ‘membrana citoplasmética), que pegan sestancias quimicas y transmiten las sefiales a otros componentes del sistema, tits (MCPs)y estdin localizadas en [a membrana plastica, No actian directamente sobre a rotacidn flagelar, sino a través de Ia fesforilacion de una quiraiotaxi serie de proteinas, las que determinan que el [lagelo rote en sentido de fas agdjas del reloj o rote en sentido contratio. La sintesis y él funcionamiento de! flegeto y del sistema de quimiotaxis requieren de ia expresidn de mis de 50 genes distribuidos en, al menos, 17 operones. La expresion de estos genes esti regulada por una variedad de niveles de respuestas a distitos estimulos ambientales (presencia de sustancias atrayentes o repelentes) y de sefiales que estén acopladas al desurrolte del flagelo. Esta regulacida esta acompaiiada 9 dada por waa serie de reguladores ‘anseripcionales Los operones estén divididos en tres clases transcripcbnales que se expresan secuencialmente en el tiempo, y su expresion es sensitie a condicionesMORFOLOGIA Y ESTRUCTURA BACTERIANA 3 ambientales, la fisiologia de la eéluta y de tos sistemas de movilidad y quimiotaxis. Filamentos axiates ismos que integran los géncros Treponema, ospira (espiroquetss) poseen filamentos axiales semiejantes a flagelos, pero quo no estan libres, sino que la bacteria forme una hélice alrededor de los misinos. “Tanto los filamentos axiales como e! cilisdre proto- plesmitico se encuentran rodeades por una membrana denominada cubierta externa. Gencralmente a cubicrta ‘externa y los filamentos axiales no son visibles por microwspia de campo clare, pero son observables: an preparaciones con tincién negativa o en secciones delgadas ‘por microscopia electréniea. Los filamentos axiales de las espiroquetas st asemejan 1 tos flagelos en longitud, didmetso, presencia de cuerpo basal y gancho proximal en el sitio de insexcion. El flamento axial no es una estructura conti, sino que est formado por dos conjuntos de fibrillas anclulos en tos, polos opuestos de la eslula y que se superponen exe! centro. No hay unién evidente entre los extremos supempuestos. Los Glamentos axiales tienen un importante yapel en ta motilidad de las espiroquetas. Bl cilindro protoplasmatico es helicoidal, yen la mayoria de las espiroqueta: es rigido, La cubierta externa es flexible, y si ambos filamertos axiales rotan en [a misma direccidn, el eilindro protoplasmatico lo hard en forma opuesta y su estructura en forma de tirabuzén le permitiré avanzar en ese sentido. El ndmero de flamentos es varlableyexisten desde 2 hasta 100 fibrillas axiales por célula, segimn el tipo de espiroqueta. Fimbrias y pilis, Son apéndices més cortos_y finos que los flagelos, ro estin relacionados con {a motilidad. Podemos encontrar que en la bibliografin le adjudioan dlistintos nombres a los apéndices no flagelares: cilia, pis, filamentos, fimbrias, etcéiera, A aquellos apéndices no flagelares relacionados con la transferencia de material genético, tos Hamaremos pilis sexuales (mii: largos y generaimetite dé uno a dos por célula) y a aquelds que no ‘estn relacionados cor dicha funcidn, qué son muy mumcxesos yy tapizan la superficie celular, los amaremos fimbrias, ‘Los apéndices observados en bacterias Gramacgativas pueden corresponder a fimbrias oa pilis sexuales, segtin la fincisn que cumplen. Ambos pueden aparecer en forma fndependieiwe v simuliéuca eu he wisi eétula, En una Escherichia coli pueden. encontrarse 100-200 fimbrias distribuidas en su superficie celular, sélo existen 1 a4 pilis sexuales.ubteados al_azar. Los pilis sexuales estin genéticamente determinados por plasmides conjugativos y son requeridos para e! acercamiento y contacto directo entre bacterias. El numero de fimbrius puede ser muy variable, incluso en ua mismo cultivo. Ticnen de 3 a 10 nm de ancho y aproximadamente 500nm de longitud o sea, so sensibierente ifs cortas que fo flagelos, aunquueson mucho nis numerosas. que Fimbrias: Estin formiadas por subunidades proteieas hidrofSbicas de peso molecular aproximado de 16.000 Da, parecen contener una proteina mayorittia y otras protefnas menores que forman el sip especializado. Las | ° pilis se originan ea la membrana plasmatica y atraviesan it pared celular. Las célulus con fimbrias se adhieren a interfases. superficies hidréfobas y receptores especificos. La formacién de peliculas sobre medios tiquidos permite a las ceélulas fimbriadas acceder al oxigero. Las fimbrias ejercen funciones de lectina (proteinas que se fijan a una célula generalmente por un sitio de combinacién de aziicares especificos). La adherencia de Shigella flexneri y Fechorichio colt 9 eitrocites y tejides, mediada por fimbrias, es inhibids especialmente por la D- ‘manasa y alfa-metil-manésido. En Is intetacciOn hospedador-partsito, es de desiacar ‘que a especificidad de la adherencia condicionada por las fimnbeizs (adhesinas) puede en parte determninar la capacidad de tna bacteria de adkerirse y colonizar tejidas especificos el hospedadox. Por ejemplo, ts proteina estreptocsecica M, sirve como factor de edherencia (adhesina) en la coionizacion de la faringe y, a menos que sea nentralizada con el antisuero especifico, impide ia fagocitosis y es ademis leucocida, actuando én este easo como tna toxina, Pills sexuales: Parecen estar formados sas exctusivamente por una protein llamada pilina (fig, 3-20), Los pilis sexuales son disociados en monémeros por soluciones de detergentes (dodecil sulfato de sodio), pero n0 por reactivos que compan Pui Viste genera! del arreglo do tas subunidades | | Corte ieterno reagiucinal Fig 3-20, Estructura de pili"4 SECCION 1 GENERALIDADES pucntes de hidesgeno tales como urea 8 M, quest disgreya Fimbrias y Magelos Hay dos teorfas sobre la funcién det pili sewsal, que no se excluyen entre si 1) cl pili funcionaria como un tubo para el DNA que fluye a través de la cavidad ceatral entre las bscterias que estin realrzando conugacién; ') y/o podria ser un elemento de reconociniento que lucgo se reirae basta que se contacten ambas envoltsras ef DNA sea transferido entre ambas bacterias. Los plis sexuales acrian en la adherencia celia aeétula, en la conjugacién bacteriana,.y_adhieren bacteri6fagos RNA especifieos a lo largo de los mismos y fagos DNA filarnentasos en Ja punta, Organizacién citoplasmatiea Citoptasma _Contiene alrededor del 802% del agua presente en la bacteria. En €l se sa gran variedad de pequefias molécuias, tones inorgénicos, ribosomas y enzimas, involueradas en reacciones atabdlicas y citabolicas necesarias para el erecimiento colular y la reproduccién. Es en ef citoplasma donde se desarroilan las ctapas del ‘metabolismo celular y la sintesis proteica y de RNA y DNA. Estrueturas citoplasmétieas Regién “nuclear”: Los procariotas no poseen un verdadero nicleo, EI “cromosoma” bacteriano ena ini molfoula de DNA de doble cadena sireular, oovalentemente cerrado, que debido a str fongitud (aproximadarmente 1100, im) tiene que estar sumamente plegado. La estctara dei DNA debe disponerse en una forma compacta, odensda, al mismo tiempo que debe mantener su capacidad para sostener las funciones celulares, incluyendo, su propia replicacién, Posee alrededor de 4500 kilopares de bases, ‘(Kpb) y define de 2000 a 3000 genes. ELDNA bacteriano puede ser detectado enel microscopio Css PH | @ Css-Pp-fa] + Css-P-P-[p Hf a | | | (b) | Css-P> =NDP-| a | Css-PP-Fa] + NDP-[g] ——> Css-P-p-[a —> Cs5-PP-[s molécilas donantes de fos monesacéridos que formaran fa subunidad repetitiva Formaci6n de tay unidades repetitivas y polimerizacion Una vez formados los precursores tiene hugar la sintesis de las unidades repetitives de las cue constari el polisacdrido yyla posterior polimerizacién de étas. En el caso de bacterias, Gram negativas, se han descripto dos mecanismos de sintesis Ge polisacéridos que se diferencien biisicamente en la forme ‘en que se produce Is elongacin de la cadena potisacaridica, (fig. 4-1). En ambos mecanismos, 0s residtios glicosidicos Ge los distintos qucleétido-aziicares se unen mediante un ataque nucleofitico a un intermediario lipidico de la membrana (generalmente undesaprenolfosfato) también implicado en la biosintesis de peptidoglicano. ‘En el primer modelo, las distinias unidades repettivas se van incorporando a la cadena polisacaridica en crecimiento, luego de haberse unido a una molécula de lipido transportador. El crecimiento del oligémero se produce de manera tal que la tltima unidsd ineorporada ex la que queda unida al intermediario lipid En el segundo modelo, la incorporacién sucesiva de tos monosacéridos se produce ditectamente a partic de los muclestido, azticares a una cadena en crecimiento, que permanece anclada al intermediario lipidieo. En cuanto a los microorganismos Gram positivos, es mayor el desconocimiento de los mecanismos utilizados para la biosintesis de polisacérido capsular. in embargo, sc han descripto mecanismos de polimerizacién altemativos, independientes de! undeca- prenolfosfato. La produecién de alginato por Pseirfomonas aeruginosa ha sido objeto de extensivos estudios, dado el papel critico que posee dicho polisasarido extracelular en LB Las lets A, B,C sepresentan los monosaricids ote componen [a unided rpeiiva, NDP: nucleutdedifosat, C,-P-: undecaprenaitostat Wig. 41, Eaquera de los mecanisines de crecimiento dela cadena poisacaridea ea bacteras Gram negatives82 SECCION 1 la patogénesis de ta fibrosis quistica; su biosintes’ produce con Ja participacién de diferentes proteinas asociadas a la mentbrana citoplasmitica que participan en los procesos de polimerizacién y exportacién idependientemente de undecaprenolfostato. La produccion de -giucanos en diversas especies bucterianas también se produce sin participacién de dichos transportadores lipidicos, ‘Transporte del polisacarido capsular El paso siguiente corresponde al transporte del polisacdrido desde el citoplasma hacia el exterior de la célula, Hasta el presente se han descripto dos mecanismos que podrian estar involnerados en este proceso, En un caso, el lipido transportador es el que lteva a cabo esta translocacién, por ejemplo, en la sintesis del LPS y de alguaos polisacdridos capsulares de Salmonella enierica) En cambio, por ejemplo, en el caso de Escherichia cofi serotipo KI y K5, se ha deseripto la participacion de sistemas especializados que requtiexen energia denominados transportadores de tipo “ABC” (por ATP-Binding Cassette). Genética de la biosintesis de polisacarido capsular La organizacién de los genes capsulares descriptos en varias especies Gram negativas (entre ellas £. coli, Haemophilus influence, Neisseria meningitidis, Salmonella typhi) es similar. Se encuentran agrupados en un cluster, lo cual permite la regulacién coordinada de gene: en Ia biosintesis y en la exportacisn, GENERALIDADES pes | y 3 son regiones relativamente conservadas; en cambio, ta regién 2 es variable, ya que en clla estan, en general, localizados los genes serotipo- espevificos. En los ultimos afios se han descripto los clusters capsulares de varias bacterias Gram positivas entre las cuales se encuentran Streptococcus pneumoniae, Staphylococus aureus y los estreptococos grupo B. Sin eribargo, [a informacion generada en relacién con la bioquimiea y ia exportacién de los polisacdridos de estas bacterias es ain menos completa que la descripta en el caso de las bacierias Gram negativas. Biofilms Un biofilm puede definirse como una comunidad de microorganismas que se han fijado a una superficie y se encuentran insertados en tuna matriz polimérica autoproducids. Durante el desarrollo det biofilm, a partir de la forma ce vida planctonica, las bacterias experimentan una serie de cambios fenotipicos que permiten {a fijacién inicial a ura superficie, la formacion de mierocolonias y !a maduraciéa del biofilm, con sroduccién de exopotisacdridos involucrades en la formaciér. de matriz extracelular, BIBLIOGRAFIA. D, Muroz R, Mollerach M, Lopez R. Currents trends ia polysaccharide biosynthesis of Seprvcoceus prewnoniac. 51: 429-435. ity and Genetics of Capsular Polysaccharide Ann Rev Microbiot 1996; 50: 285-315. Garcia caps Res Mcrobio! 2008;CAPITULO 5 NUTRICION Y. CRECIMIENTO BACTERIANO En este capitulo intentaremos comprenier qué son ceapaces de hacer fas bacterias cuando se encuentran en medios aptos para sit desarrollo, respondiendo a tos siguientes interrogantes {Cuil es el objetive principal de las bactesias? OWS necesita las bacterias de su medio ambiente para Iogear su objetive? En capitulos posteriores se verd imo lograntias baeterias su objetivo Introduccion, El objetivo principal de una bacterie es duplica ciclo de vida comienza cumdo se origina una nus como resultado de la fisi6n binaria de la bacter: culmina con su propia divisién para originar dos nuevas bacterias “hijas”, semejantes entre si y ala que les dio origen, Durante ese ciclo |a bacteria debe duplicar todos los componenies cellares Para allo, eben chplinse na sre de requisites, que podemos resumice I. La célula bacteriana debe encontrarse en_un_ med aue te proves, compuesios quimicos, derominados: transporte que le permit 2. Los nit amatcra prima del metabolisma, debetn set transforms quimicamente mediante reacciones enzimaticas, que en sit conjunto. constituyen el, metabolisma.celular, de acuerdo ccon un pln detzrminado de distribucidn del fuj> de enengia y de materia, garontizado por mecanismos regulatorios. 2.1. La degradacién de nutrientes (catabolismo) deberd provecr los precursores biosintéicos, eventualmente, la energia y el poder recuctor necesarios para la biosin 2.2, Los precursores biosintsticns deberin {cansformarse en los monSmeros constiuyeates Mirta Franco 2.3. La polimerizacién de los monémeros deberd conducir a las espectivas macromoléeulas (proteinas, acidos nucleicos, polisacirides, lipids, ett.) 24, Las macromoléculas deberin onganizarse en Jas estracturas celulares. . E] metabolismo det de {a duplicacisr n_consecuencia, es dect, el crecimionto dete especies bacterians. ‘Aun aceptando que la multiplicacién de las bacterias es el objetivo principal det metabolismo bacteriano, no podemes desconocer que el mismo tiene otrar implicanciee. Muchos productos del_metabalisme.son.expiotadas industriaimente.(aleoholes, dcidos organicos, antivisticos, cenzimas,-ctc.). Otros productes. meiabSlicas san wiisadlos para ta tdentificacién de las especies. que.les producen (Geido lactico, butilenglicol, acide propidaico, etc.) Pox otra pasto, laa bacterias participan en los ciclos geoquimicas de los elementos. Los microorganisms, en 1 conjunto, pueden metabolizar tal diversidad de sustancias orginicas que se considera que todas las sustancias orgénieas naturales pueden ser degradadas por, al menos, algin microorganismo. Es decir, que todas fas sustancias orgénicas naturales son biodegradables. Puesto que esis capacidad ds loz misroorganismos es cousecuencia de la evolucién, no es sorprendente que muchos compuestos sintéticos (phisticos, insecticidas, etc.) no puedan set degradados por los microorganismos y se scurmulen ex ta naluraieza con conseevencias desfavorables para la continuidad de Ia vida En la figura S-1 se esquematizan las celaciones entre las funciones mencionadas, ‘Adems, el conocimiento del metabolismo bacteriano pertnite disefar y utilizar sustancias que interfieren con ese metabolismo. Esas sustancias, of controlar fa multiph bacteriana, actian como antibacterianos,84 SECCION I Medies de eutivo ¥ ‘Asrsaiacenad de adoro once ears (CRECIMIENTO [Rodin dai + | | mpm [set ‘ Perpetuacidn dl expecio \NUTRIENTES: “reasons gotuies ‘METABOLISMO Cielos g20a REGULACION de taj deena coeraia ttcefoon ion canoe saniiee ig. 5-1, Esquema integeatvo de las fuaiones bactedanas: euiicin, metabolism y eresimiento. El medio ambiente de Jas bacterins: requcrimientos autricionales Para que_las bacterins puedan. dupticarse,.su.medio ambiente tes debe: = Aportar los nutrientes, es decir, lo: compuestos quimicos que puedan originar los precursores, Ia energia y el poder reductor necesatios para la biosinesis de todos los componentes eeluiares - Brindar las condiciones fsicas y quimicas apropiadas para el mantenimiento de su viabilidad y el cumplimienta eficiente de sus funciones. El medio ambiente nutritivo adios los seres vivos utilizamos compuestos quimicos prescates en el ambiente para construir is moléculas necesarias para fabricar “células nuevas”. Las bacterias deben tomar de! medio externo los compuestos quimicos ccapaces de aportarles todos los elementos quimicos que las ‘ormponeny ast como los que les permitan generar la energia yl poder reductor necesario para llevar a cabo los procesos biosintéticos. Esos compuestos quimicos, denominacos rnutvientes, s6lo pueden ser incorporados. por 1as.células bacterianas cuando se hallan en solucion; aun aquellos ‘compuesto: que constituyen la fase gaseosa de wn cultivo son asimilados.en forma disuelta, y su solubiidad en agua esa menudo el factor limitante del crecimiens bacteriano. Los elementos quimicos que necesitan tod las bactariac son esencialmente fos rnismos. Aproximadamente ef 80% del peso de todas las células bacterianas es azua. El analisis, de lx composiciéit el dol material s6lido revelo que mis del 95% esta constimuido porno mas de 10 elementos carbono, oxigeno, hidrégeno, niltiygno, azulre, fSsFor0. potasio, calcio, magnesio.y_hiero. Estos.se denominan, macroclementos, pues se_requicten encantidadss relativamente grandes. Carhono, oxigeno, hidrégeno, eno, azutre y fosforo son constituyente: earbohidcatos, lipides, proteinas.y deidos.nucleicos restantes existen en Tas c¢lulas como cationes y son necesarios para ta actividad de diferentes enziznas. ‘Ademés de los macroelementos, tod les muy peat m re, manganese, molibdeno y cine, denominados microelementas.o.clementos. raza. 1.05 ‘elementos traza son necesarios silo para la actividad de ciertas enzimas y es dificil demostrar su presenciaen forma cconstante dentro de ta céluta, En el cvadro 5-1 se muestra la composicién elemental aproximiada de eétulas de Escherichia col y ls funciones zeaerales de los principales ‘elementos Si bien los constituyentes de proteinas, écidos aucleicos {y cocnzimas son caensialmente Ios rnismos en todas las ‘especies bacterianas. [a capacidad para sintetizar los, precursores biosintéticos depende ée la dotacién enzimatica 4e las edlulas de cads especie, Por ello, sungue los elementos quimicos que necesitan todas las bacterias son esencialmente los mismos, la adapraciéa avolutiva de los distiztes tipos biolégicos ha Nevado a las bacterias a diversificarse de manera[NUTRICION ¥ CRECIMIENTO BACTERIANO a ies elernen'or 1 extraordinaria con respecto a los compuesios orgénicos € inerginicos que pueden utilizar come nutrientes, produciendo un alto grado de especializaciée, con respecto alas moléculas particuleres que permiten Ia astmtlacton de determinados elementos. Luego fas diferencias en los requerimienios mutricionales de las bacieries reflejan tas alferencias en su copacided para utilizar sna sustancia particular como fuente de los elementos quimicos ‘necesarias para sinietivar los componentes celulares, Estas ‘ssracteristivas nucticionaies, porst diversidad y, cn algauos ‘comronentes PRINCIPALES COMPUESTOS | %4 det FUNCIONES FISIOLOGICAS _ "QUE LOS PROVEEN. peso sev MACROFLEMENTOS Carbone Artsaes 0 Constinuyente de meraiesongiaicos | Coxigene alemental Compuesios orzinicos. Agua 0 Constivayente det sus cetuta, o¢ materiaiet orpicica. Acopor de eletrones cal respec serbia | witgeno Stles de amoais, Peptonas ry Consttuyente de proteinas, dsidos mucleieas, Hidrogene Aaa 5 CConstituyente del agua celular, de materstes orginicos Féstoro Ssles inorginion 3 | Constiuyente de ics nucleic, fosflipides, | cosnzimas) Ante Amines asufrados. Slfstos | Consituyente de proteiaas, de slgunascoenzimas | | dporejempto, coenzina Ab Potala Sales inorgnits 1 Cofactor enaimat Sodio ' Cofseior de reasciones Casio os Coftetor enzimitiea (por a. de proteinasas) Maxresio Sales inoegénies os Cotvetor inorpénico de reaceiones enrimatiess Constituyente de las elorfilas Clore Silesinorginics as (Cofactor de muches ¢ importanes reacelones Hier Stes inorainiss 02 Conituyente de eiocromos y otras protinas Cofactor enzimities MICROELEMENTOS Manganeso Cofactor inorgénien de reseciones encimiticas, a veces reemplazando al Me conan Consituyene cela vismins By coenzimas Cobre Imparezas D3. Zine CConstiuyente ioepinicoe de coepzimas cespeci Molibéene { casos, por su especiticidad, pueden utilizarse para Ja identificaciéa y clasificacién de las bactetias, Por otra parte, cuando.un microorganismo es incapaz de sintetizar un eompuesto organico particular 0 alguno de sus precursores, ese compuesto debe ser provisto por el medio, y constituye un factor de crecimiento. El medio debe proveer todos los mutrientes y factores de crecimiento necesarios en las cantidades apropiadas, para cubrir los requerimientas especificas de las células ‘becteriamas.86 SECCION |: GENERALIDADES Deacuerdo con las consideraciones anteriores, podemos affrmar que el disefio racional de un medio de cuitivo debe contemplar no sélo la composicién clemenal de ta céhula bacteriana, sino tambign las capacidades enzimiticas que determinan La calidad de los nuttientes requeridos para llevar cabo Ia generacidn de energia y de poder reductor, y la biosintesis de los componentes celulares. ‘Requerimientos nutrictonales y sustancias quisnicas que cumplen dicha funcién Requerimiento de carbono \lizan_¢}_CO, como_fuente ine. La conversion de CO, en inken opal omstiyente en el Pena aulionzes orgénicos. Merece destacarse la gran diversidau de compuestos organicos que pueden utitizarac como fuente de carbone. De hecho, suele decitse que no existe ningiin compuesto oryinico natural que no pueda ser degeadalo por algin mictoorgantismo. Aluunas bacterias, como Burkholderia cepaca, pueden si nds de 100 compnestos earbonados difereites, mieatras, que otras utilizan s6lo unos pocos, Las bactetias metil6trotas, metabotizai solamente moléculas de un itono tle earbono, (metano, moumol, mondxid de escbono, Acido fBrmica, l.), Lamayoria de los onganismos que dependen de fuentes de carbone orginico requieren tambign pequicias vantidades, de CO, que es utilizado conto cofietor en rcacciones bigsimétiens, Los sustrutos unginicns tienen generalmente tun doble papel natricional, ya que sirven a avez de fuente de carbon ¥ de fuente de enereia, equerinantn de avin sicher a eae pene pas a ra olla ne nun nice» CO, yen cadeeae ene el sea geo menor grado;del agua, A di ‘oXgéno elemental, no todas las bacter aumosférico 0 molecular (O,). | comportamiento fireive.al exigeno molecular, tas bacterias se clasifican en: bli ria (oot lest, bcilo la tuberculosis y algunos bacilos esporulados). Crecen sélo en presencia de oxigen ulad,,oues.dependende la Fespiracién_acrobica para cubrir sus necesidades snergéticas. én ellas el oxigeno molecular fingiona coro gente oxidante terminal (aceptor final de electrones). Algunas bacterias aerobiss, como las del. género Campylobacter, son mieraerdfilas, reqiicren niveles de O, lel 2% al 10%, infetiores al atmostérico. dz feicultativat (por sjsmanio, nariszosas “species de la familia de las entorobacteriag). No requieren oxfgeno molecular, pero cuando esti disponible, fo wtiizan como aceptor tinal de clectrones. En ausencia de ©, obtienen, cencrgia mediante reseviones de fermentacién o a través de cadenas respiratorias que no tienen ai O, como aceptor final de elecirones (respirucidn anaerébica) ces (por ejemplo, la mayoria oxigen, facultativas, ya que pueden crecer ea presenvia ven wuseuig pero su metabolisino es siempre de tipo fermentativo, inaeroblas cbligadas 0 estrictas {por ejemplo, especies de los Pi E iO, «Laval puede inhibir-o malar estas bacrerias. Obtienen energia por mediode fermentaciones 0 de respirucidn anaerdbica. El cumpousuniento difereuse de las bacterias frente all 0, se debe a varios factores. Entra ellos, fa inactivacién de proteinas (por ejemplo, oxiducidn de grupos sulfhidritos de la enzima nitroxenasa) y el efecto de derivades téxicos Gel O, (radical superSxido, peréxito de hidrézeno ¥ radical bidrakilo) que son oxidaates poderosos. Tanto es 385, que tos newtrdfMlosy macréagos utilizan estos productos toxicos del osigeno para destntir bacterias patégenas. Muchas bacterias poseen enzimas que los protegen de Jos productos toxicos del oxigeao, Las becterias aerobias y Jas anaerobias facuitativas generalmente contienen las cenzimas superéxido dismutasa y catalase, que catalizan Ja destruccidn del radical superdxide y de peréxido de hhidr6geno, respeetivamente. Las bacterias anaerobias ‘aerotolerantes pueden careeer de catalasa, pero casi siempre tGenen superéxido dismutasa. Todos los aaerobios estricios son deficientes © carecen de ambas enzimas, Requerimianto de nitrégeno Las formas de nittégeno asimilables por las bacterias también son may diversas. En Jas oélulos el nitrégeno se encuentra principalmente en forms reducida, como. grugos aminos, Por ello, la asimilacién de sales de NU," 0 compuestos orgénicos con grupos aminos (aminoacids 0 productos mas complejos de la degradacién de proteinas, tales como peptonas) no requier2 reacciones de dxido- redueciGn. La asimilacidn de nitrégeno en este estado de oxidacién mediante reacciones estalizadas por enzimss especificas da origen a tres amincacidos: dcido glutimico, sparigina y glulamina, Estos tres productos son precursores dircctos de proteinas. Ademis, ef deido glutémico y ta sotamina fatervienen en la transferencia de grupos amino y amido para las otras sustencias nitrogenadas precursoras de macromoléculas celulares. Las sustancias orgénicas nitrogenadas pueden cubrir simulténcamente tos requerimientos de nitrogen, de carbono y de energia, Elnitrogeno en estado inotgénico oxidado (por ejemplo, jones NO, } debe ser reducido antes de ser incorporado a fa materia viva. Este proceso de reduccién asimilatoria del nitrato requiere un complejo enzimstico constituide por nitrato y mitrito reductasas. Yarios grupos provaridtices también pueden utilizar el nitrégeno molecular, det que no pueden disponer losNUTRICION ¥ CRECIMIENTO BACTERIANO. 37 organismos eucariéticos. Este proceso se deromtina fijucién de N,, implica la reduecién preliminar a NH, por una nitrogenasa y es de gcon importancia ecoldgica y czondmica, Requerimiento de fésforo etc.) El fésforo en los medios de cultivo se encuettra como fosfatos inorgénicos y entra en la célula comoanién Iasfoto Cuando la fuente de fosforo es un fostato orginico, generalmente es necesario que enzimas bidro! extracelulares liberen el fosfato como paso previo a su captacién. El fosfato es e) nutriente limitarte en muckos habitat aeudticos, de mado que cuanto se vierten compuestos fosfatados (detergentes) se favorece el crecimiento de mictoorganismos y se produce el fendmeno de eutroticaciéa. Requerimiento de azufre El azufre se encuentra denteo \aa.en ducida, como, grupos sulfhidriles, Usualmente se entra en tos medios de cultivo bajo la forma de sulfatos, siendo necesaria su reduccioy previa a ta incorporaciéa en los compuesios orginites celulares {ammogeidos, XNA de transterencia. vitarinas). Menos frecuentemente puede ser suministrado por aminoécidos amutrados (cisiefna y metionina), en los que presenta el mismo estado de oxidacién que en el material celular. En ‘est08 casos, los compuestos orgénicos podrian actuar simuiténeamente como fuentes de azufre, de carbono, de energia y de nitrogeno. Requerimiento de elementos trava Las hacterias requieren coneentraviones muy bajas de algunos compuestos quimicos inorginicos gue aportan elementos esenciales gue forman parte de coenzimas 0 acttian como cofactores de reaccioues enzirnaticas, Estos lomentoe trasa, por bu bajo coquerimionte, genoralmente no constituyen factores limitantes del erecimiento bacteriano. En at laboratorio, suelen ser suficientes las conceniraciones presentes en ios medios de eultive como impurezas. Requerimiento de factores orginicos de crecimiento Hemos visto que las exigencias nutitivas de wn forganismo dado estén determinadas por su metabolism eneraético caracterstico y por sus facultades biosinestica Cuniquier compuesto orgéinivo que una bacteria no pueda sintetizer a partir de los auteientes principsles, debe ser administrade como tal. Debido a que estos compuestos deben enbrir necesidades biosintéticas particulares, se requieren en coneentcaciones raucho menozeaque la fuente de earbono principal. Se los denomica facvores orgiinicos de crecimiento ¢ inetuye 1. Aminoécidos: requeridos. como cons ituyentes. de protcinas. i -requeridos como constituyentes eines ea 3, Vitarmunas: compuestos orgénicos que foman parte de grupos prostéticns o centros activos de ciertas enzimmas, {porzjempio, el dcido nicotinico que forma parte del DNA), Categorias nutzicionales de los microorganisros __Los mictoorganismos se pueden agrupar en categorias niffneionales de acuerdo con los requerimientos de fuentes de energia, de electrones y de carbono. De acuerdo con la nueden ser: Fororrofes, los que usan minosa, ¥ guimioiryjos, los que obtienen eneraia or oxidaciéa de compuesios quimicos, orzdnicos o inorganicgs. De acuerdo con los dadores de electrones.o.de ‘tomos de hidrégeno,, pueden ser. Litoirofes,. los. que los btienen a partir de compyestos inorwinicos reducidos, y organotrojes, agucllos que lo hacen a partir dé compucstos corgjinicos. Ya hemos visto que de acuerdo con Is fuente de carbone, pueden ser autdirafes 0 hoterdirofes. ‘A posar de la gran diversidad metablica de los rmicroorganismos, ia mayoria de ellos puede incluirse en alguna de las 4 clases nutticionales sigs fotolitountdirofos, fotvorganoheterdirojos,. quimio- TMoawétrofas y.quimioorganoheterstrafos. En el cuadro 5-2 se presenian las caracteristicas de cada uno de los tipos nutricionales y ejemplos de microarganismos que pertenecen a cada uno de ellos. Medios de eultivo Un medio de cultivo cualquie debe ser una solucitin equilibrada de todos Fequeridos por las bacteria gue permitan_un_buen crecimiento de_tas.mismas. Poca conféecionar un medio de cultive, lo primero es preparat una base mineral que proporeione todos fos nutrientes que pueden suministrarse en forma inorgiiniea. Este medio basal puede suplementarse luego, si es #evesario, con sustancias ‘rgéinicas tales como fuerte de eartono y de energia,y algon factor de orvoimiento requerido. Eatos suplementos variarin, e acuerdo con las propiedades nutricionales particulares, el microorganismo que se desea cultivar. El agregado de agar-agar en concentraciones del 1,5% al 2,0% permite obiener medios gelificados, en los que ei erecimiente bacteriano puede originae colonias aisladas, Para promover el desarrollo baeteriano, tos medios de cutive cohen cumpli, admis eiertos requisites: condiciones osméticas favorables, une concentractén de iones bidrOgeni a ala tolerada por e! organismo en Lde oxidacién-reduceién epropindo. “Este iltimo depende en parte de la composicidn del medio de cultivo, y también de la fase gascosa en contacto con el medio (Fig. 5-2). La temperatura de incubacién es otro Factor ‘que condiciona el crecimiento bacteriano. La influencia de estos factores sobre el crecimiento bacteriano se verd tas adelante. Deacuerdo con su composicion en nutcientes, los medios de-cultivo.se.denominan: iéticos, Son aquellos de composicién gillmiica cualitativa y ouantitativamente defini88 SECCION 1%: GENERALIDADES Ins fuenes de ener, de cestones y de eartono Cuséro $2. Categorias miseionales us las bacteria, de severdo Puenies de Bacteria eepresentativas Categorts | Energia Electronesbidrigene Carbone . | Compeesios invrginicos Clorobactens, Foteticautdvofor Lie reducidos Bacerag sulfeas pirpurss y #0 we | HSS Fotcorpanotereirofos Le Conrpueson ganic | Compuestos onions) Baveriak pps no sitens Compustes iors | redacigos | H, Thiohacls thiooxtdans y oto. Quinitizomsofos sus Compoestos ioxgaaicos £0, THobaetlus ferrooxidans Fea reducidos ‘Narosomioma spp. HN Murobacser sp. NO; = t Baccarias del bidedgen, (Quimicorganoheteréwotes Compuestes orginices ‘Compuesis vrzinicos CCompusstcs orinicos | Mayors de hscteriae quimotrafa, ineluyord tas patgenas nutriefonales y para obtener resultados reproducibles en procesos de prod a acteriane, por ejemplo, para la produceién de vacunas. Bn el cuadro5-3 se muestra la composici6a de un medio sintético apto para el cultivo de E. coli Medios minimas, Son aquellos medios sintéticos cuya composicién representa fa base minima de nutrieates capaz de permitir el desarrollo de Tas bacterias en estudio, Medio de cultivo iquido 0 gelifcado / factores de execimicats | | > Fig. $2. Elementos fundamentates de un medio de cutive, contienen ingredientes riable. Algunos Medios complejos. Son los qve de compo: de los ingredi compleja y poco definida de materias primas que suministran todos Ios nutrientes esenciales para muchas especies bacterianas, por ejempie. extracts ds carne, extracto de levadura, triptona y casitona (hidrolizados de proteinas). Los medios complejos son, por Jo tant, para ct cultivo de una amplia gama de microorganisms, incluidos aquellos cuyos requesimientos de factores de que s6lo pueden acceder el espacio periplismico moléaalas cuyo temaio sea inferior al def limite de exclusidn de ia porina y ‘euya conventracion en el medio extemo sea supesiora le de dicho espacio. Una sustancia puede penetrar a través de la membrana pidsmvitica por uno de los siguientes mecanismox Difustén simple Las, moléculas. de nutcientes que atraviesan Abremente iftunden desce ef medio de mayor a. membsana_cehulae coneentracién al n de energia, haste igualat las de la membrana. Ca velocidad de difusiOn pasiva aumenta con ta diferencia de concentraciones del sustrab entre el exterior y al interior de la eélula (fig. 5-3), Ejemplos de sustancias que pueden difundi hacia el interior de la eélula cuando la concenteacida fuera de ella es mayor aule en su interior, es decir, cuando existé un gradiente de coneentracién, san snokéculas nequefas sin carga eLoxigeno et amoniaco y el “Gustancias no pueden concentrarse dentro de Ia cella, sino ue tienden « igualaese las concentraciones a ambos todos de la membeana. Difision facilitada Al igual-que ea la difuaida simple, tos austratos 2° mueven a favor dé gradientes de co pero parlieipan_proteinas.transpostadoras, llamada: a veces camente elnutricnte 6 ser concentraciones del striente transportado fueray dentro de la célula tienden a igualarse. La velocidad de difusion facilitada también aumenta con 1a diferencia de concentraciones del sustrato dentro y firera de a célula, pero lo hace mas rapidamente ya menores concerirationes ue Ia difusion pasiva, Cuando se saturan las groteloas sansportadoras, la velocidad de difusion se hace dependiente del gradiante de coneensracién (fig 5-3). Fn as bacterin, ta difisidn facititada os un meeanisno que se utiliza para transportar pocos tipos de nutrientes (. coll, Salmonelia typhimurium, Preudomonas spp y Bacillus sppy fcorporan glicerol por este meeanismo), Lransporte active El transpore activo permite Ia entrada y/o satida de. sutrightes contra gradientes de conseniracién, con gasto de" nergia, Esta cnergia puede ser obtenida por hidrdlisis de ATP 0.8 panir del gradiente de concentraciones de cierios dnes (protones), £1 transporte activo es saturable, ya que uuando en el interior de 1a oéfula se alcanza un cierto nivel, © se absorse mis sustancia, aunque In concentracién xterna aumente mucho. En estos mecanismos de.icansparte tivo partieipan proteinas transportadoras con wna marcads insite acing [a ‘Gradient ds concenieacidn Fig 5-3. Deion paiva y lactase velocidad do teanspotie uments rencia Je coneeniraciones del suseao ere el exterior y el Fnteroe deta cbs, tot ex le ditusiéa pasiva emo en fa failtada, pero en esta ditima el aumenta ex mis ripido y ocarre a menoces eoncentraciones. Ea Ia difusign faciitads, esnndo las proteinns ‘eansportadas esturin, ta volacdad de trmspurte hace independitte ‘sspecificidad, que actian conse bumabas etevando susteutos especificos a traves de_las_me incorporan la mayoria de los autri aminaacidos, vitaminas) por este mecanismo, ya que sus concentraciones suctea ger bajas en cl medio arabient, Una variedad de transporte activo, restringido a ciertas moléculas y quetiene lugar slo en bactetias sla runslocacién de grupo. Por este mecamismo el nulrien'e es modificado quimmicamente af mismo tiempo que es tansportado. Esta todificacién quimica requiere energia, peco impide que la ‘molécula modilicads vwelva solic dela bacteria, Pr ejemplo, Ia glucosaes fostortiada durantesu capractOn por las bacterias. La glucosa fosforilada, que ya no puede salir de ta célula, es sustrato de vias metabsiicas centrales La mayoris de los compuestos orgénivos de aio peso molecular (por ejemplo, polisacdridos y proteinas) no pds aac ar cree le sublets deca, en el melabolsmo celular, deben ser hidrolizados proviamente en compuestos mis pequefios. La ids ileva a cabo gor exoensimas especifieas (hidrolasas) gue Jas bacterins segregan hacia el medi a cerzima amilasa ranpe polimeros d= glarosa, almidén y sglucdgeno, en polineros mis pequenos, f 5 maleisa, qué posterios del medio. por las bacierigs. Owras exoenzmas producidas por las bacterias son: celulasa {hideoliza Ia celulosa), Quitinasa (hidrolizala quitina), lipasas (hidiplizan las grasas ¥ otros &steres) Captacién de hers ‘Como ya hemosdicho, casi todas las bacterias requieremNUIRICION ¥ CRECIMIENTO BACTERIANO 91 hriesro, que forma parte de los citocromos y de muchas ernimas. 1 eapiavion del his diets, pues os sputestosf muy iasolubles. ‘and ge enouenran et metios oon poct hiro disponible, secretan moléculas_d& Bajo. peso molseutar denomii sideréforos, que forman compiejos transportan al interior de [a célula a través de su unidn 0 receplores en la superficie de las bacterias. Uua vez en el interior de ls bacterins, lion fsrico sereduoe a on. erro. En los tejidos vivos, el hierro disponible puede ser insuficiente para cubrir los requerimientes ee especies acterianas patégenas, cuya sobrevivencia depende de [a apacitad para producir sideroforo. . Crecimiente bacteriano En bacterias, como en otros sistemas siokégicos, ef crecimiento puede definirse como el auments ordenade de todos. sus componentes quimicos i poblacion bacteriana se halla enum medio adecuado, al que esti totaimente adaptada, en_un estado de crecimivato balaneeado o exponencial, la duplicacion dela biomasa es duplicacién de otras propiedades de ia Sn que pueden medirse (RNA. DNA, protsinas, ete). fbn estas condiciones, la biosinicsis de todos os, componentes celulares ¢s coordina y regulada. Owras veces el aumento de ia_biomasa_no refieja realmente el crecimienio de la poblaciéa, ya que puede deberse solo al aumento de productas de. aimacenamiento, tales como lacdgeno. pol-hidroxibutiato, et., que no vr aeompanado por el aumento de los dems componentes ezlutaces, En general, multiplicacién. y_co_e! (organismesicelulars) ia duplteacionporel maeanism> de fision.binaria, a lugar, aun aumento exronencial det niimero de individuos en la pobl Digan eh ‘ahipRain clr de individuos Organismos ___ gg, Aumentodel tamatio sulpleacibe celular multicelutares de los indviduos | De acuerdo con to dicko anteriormente, cuando una éluta bacteriana se eneventra en un medio encl que puctle sintetizar en forma regulada todos sus componentes. se observa primero un erecimiento individual, es decir, un aumento de su biomasa y de st tamafio, y luego un crecimiento de la poblacidn, debido a sucesiws divisiones celulares por fisién binaria. Le biomasa aumenta contiuamente, mientras que fa divisién celular ocuere @ intervalos de tiempo regulares. {Cime se visualiza el crecimiento? Si el medio de cultivo 5 liquido, ef aumento det niimero de bacterias se visualize ‘como aumento de la turbidez y/o formacién de sedimento o pelicula (fig, 5-4). Ea cambio, en un medio agarizado el aumento det numero de bacterias produce colonias macroscépicamente visibles, que pueden presentar diferentes tama.ios, bordes, consistencia, color, elevacién, ete, (Bg, 5-5). Fig, Sl. Cutivos de becterias en medion liquids 2. 55. Colonias bacterianas macroscopicaments diferentes, Cultivos puros diferentes especies. La caracterizacion de las especies, como asf también cualquier tipo de estudio microbiolégi sea fisiol6gico, bioquimico, genstice o ecvldgico, tiene ‘como punto de partida la obtencién de eultives puros de cada una de las especies involucradas, Existen varias tenicas pare obtener cultives puros, pero92 SECCION |': GENERALIDADES cen bacteriologia las mas utilizadas son aquellas quese basan. cn In obtenciOn de una poblacién bacteviara derivada de ung solu eélula. Bn la prictica esto se consigne sembrando ls poblaciones que contienen la especie a aslar en medios sélidos. de manera que una eélula origine una colonia macroscépicamente visible. De acuerdo con el concept enunciado, cada colonia constituird un eultive puro. La formacidn de coloninsaisladasen medios ge ivieadus puede lograrse de varias maneras: 1. Por agotuniente sobre superficie. Contin asa cargada ‘con una suspension bacteriana se realizan irazas sobre la superficie de un medio de cultivo adecuade, contenido en una placa de Petri. Se comienza por uno de bbs bordes se extiende a toda fa placa, siguiendo un dibijo como, por ejemplo, el de la figura 5-6 A. Se genera ur gradience de concentracién de bacterias 2 lo largo de los diferentes trazoe y. en algunos do ellos, se obtionen 2 individuates que, Iwego ce fa ineubacion, daria lugar a colonias aisladas. 2. Por diseminucion sobre superficée. St siembra con pipeta un volumen determinado de ana dilucidn de ta suspensién sobre ef centro Ia superticie de un medio adecuado, contenido en una placa de Petri. Luego se = disemina por toda la snperfieie del medio con la ayuda de tuna espitula triangular de vidrio, hasta que el liquido sea absorbido por el medio. Si el nimero de bacterias en la dilucion es lo suficientemente bajo como para que todas las bacterias queden separadas, luego de la ineubacion cada tuna de ellas formard una colonia (iy. 56 B), Esta teenica se usa corrieatemente para contar las bacterias viables preseates en le suspenston, Para mas detalles, ver eémo Se realiza una curva de crecimiento. 53. Bin profuadided, Se siemibra von pipets un volumen determinado de ura dilucion de la suspensin en un tubo deensayo con medio findido y enfrindo a aproximadamente 45°C, Se agita para homogeneizary se vaeleaasépticamente en una plaea de Petri estéril. Se deja gelificar y se incuba. Luego de la ineubacion se observarin colonias en el iterior del medio de cultiv, Si ia dilucioa es adecuads, también se pusden contar lus solonie (Fig. 5-6 C). Medicién det crecimiento poblacional De acuerdo con su objetivo, existen diterentes maneras de medir el crecimiento de una poblacién bacteriana, ya {Big S, Fechicas de siaanicnig inceriano. ATagoamiewo en sapeTinie) Br Usemimaeioa ei sopetTisg, C= ca profandidadNUTRICION ¥ CRECIMIENTO BACTERIANO 93 8a por el aumento del nimero de miervorganistmos o de le ‘masa celular (cuadro 5-6), Medicién det nimero de bacterias Las téenicas para medir el nimero de bacterias presentes euna poblacion pueden cuantificar el nimero de bacterias viables, es decir, de aquellas que sen capaces de smultiplicarse, o el nimero de bacterias totaes, que inclaye bacteras viables y no viabies, Recuento de bacterias viables ‘Las técnicas corrientemente empleadas para cl recuento de bacterias viables se basen en su capacicad para formar colonias en medios agarizados aptos para su crecimiento, Actualmente, existen en ef mercado Lies someiviules de reactivos Nuorescentes que colorean de manera diferente células vivas y muertas, que luego pueden contarse sobre una membrana filtrante de policarbonato tefida de negro, ccon la ayuda de un microscopio de epifluerescencia. Esta técnica permite el recuento directo de las bicterias vivas y ‘muertas presentes en una mucstra, Recuento de unidades formadoras de eolenias (UFC) La cuantificacion de bacterias vinbles, basads eM la capacidad que cada una de ellas tiene para multiplicarse y formar una colonia, s¢ puede realizar por “plagueo™ en medios agarizados 0 por retencién en una membrana filtrate. Las técnicas de “plaqueo” son simples, seusibles y muy uusadas para recuentos de bacterias viable: en alimentos. agua, medicamentos, elcétera. Dado que re siempre un isicek Bina wi Gloom wae —— 7 “| Rueuento | Niimero de bacterias| Control de vitidad de vaeunsss cee | eee ae [ac | aesiue |e al] | Se eae Estandarizarion de cullives | nia de pA en Tmwal assur” [eosin ane cia] wee nce ee | Ensayos microbioligicos 6¢ cece sitter | colonia se origina « pactir de una sola bacteria, los resultados Se expresan como unidades formadoras de cotonias, La forma eorriente de realizar un recuento de unidades formadoras de colonias esta siguiente: Se realizan diferentes diluciones 1/10 del cultive © suspensién bavteriana y se siembran volimenes medidos do varias de ellas en medios agarizados adecuados, La siemabra del medio de cultivo puede hocerse: 4) por ciseminacién sobre Is supesticie uct medio ya soliditicado, contenido en una placa de Pei; 0 og 2 La velocidad de erecimniento se puede expresar tambié como Ia constante de veloctdad de crecimiento (k), que representa ol nlimera de generaciones por vnidad de Gempo, usualmente por hora, Fase estacionaria maxima, J! execimisnte bacteriane ‘en un cultivo cerrado, en el que no hay aporte de nuevos hutsientes ni_cemocién de_productos det metabolisto, es autolimitado. Luego de varias generaciones, diversos factores, entre elios, I disminucin 0 et agotamiento de los mutrientes disponibles, Ja acumulacién de productos 1netabélios tOxicos y la disminucién del espacio vita, hacen ‘que la multiplicacién bacteriana cese © que su velocidad de crecimiento dizminuye a niveles que se equilibran eon la velocidad de muerte, La coneentracién de células en esta fase se denomina cosecha maxima y depende de! tipo de microorganismo, de la composicién det medio y de las coodiciones de incubacién, Fase de muerte, Desde un punto de vista bioligico la mierte. celular representa Ja_pérdida de su capacidad de ‘mulliplicacion, aunque no significa, neceseriamente, pécdida absoluta ¢ inmediata de todas las funciones celulares. El {inico criterio valido de muerte bacteriana es la pérdida imeversible de la capacidad de reproducirse en_cuaiquicr medio adecuado para ello. Queds asi definide un concepta fundamental, la Viabilidad, que permite diferenciar en una poblacién das clases de baclerias: a) las bacterias viables (© vivas) que som aquellas que conservan su capacidad reproductora y b) les bacterias n> viables (0 muertas) que son las que kan perdido esa eapacidad, Por lo tanto, fa observacién de la fase de muerte S6lo es posible cuando se analiza la evolucién del nimero de bacterias viables presentes en la poblacion, La muerte bacteriana responds a ‘una cinética exponencial, es decir, que en periodos de tiempo iguales se mueren poresntajes constantes de la poblacién. En algunos casos, fa muerte bacteriana va ecompaiada de isis celular, observindose no solo disminucion del inimero de bacterias viables, sino tambien de la masa celtse Sin embargo, ¢3 conveniente destacar que esta disminucién ‘de masa celular refleja Ia lisis de bacterins muertas y no, necesariamente, se corresponde exaetaimente con Ia fase de muerte. En capitulos posteriores se veri que ta muerte de las bacterias puede provocarse por el uso de agentes amtimierobianos con activided bactericida. Factores que modifican el crecimiento baeteriang De acuerdo con fo qus hemos visto, 1a multiplicacién bacteriana requiere el aporte ée susiancias quinicas {nutrientes) y condiciones fisicas y quimicas adecuadss. El conocimiento de los faetores que modifican el crecimiento bacteriano nos permitiré: 1) establecer condiciones de laboratorio en las cuales una o mas especies bacterianas puedan desarrollarse satisfactoriamente, de modo de poder evideretar y cuamtficar su presencia en cualquier muestra:96 SECCION I GENERALIDADES 2) controlar ls proliferacién bacteriana impidiendo 0 desfavoreciendo su multiplicacién. ‘Veremos a continuacion cudles son los principaies fnctores qule inciden sobre el crecimiento bacterinno. \ctores de crecimiento Concentracién de nutrientes y Entre los principales Factores que modifies ta velocidad de erecimiento, debemos considerar la calidid y cantidad de tos nutrientes disuclios en el medic de cultivo. Cualitativamenie estos ruirlonivs dabien proveer totes los elementos quimicos que necesitan las baeterias para biosintetizar sus componentes (carbuno, nittOceno, oxixeno, hhidrégeno, fSsfore, azafte, tones inorgiciens) y li energia necesacia para llevar a cabo sus fiucioues. Ds seuerdo con las capacidades metablicas de crius, formas, quimicas diferentes de an mismo clem:nto pueden determinar velocidades de erceimiento diferentes. Pur ot parte, lz concent quimicos también influye sobre li velocidad de creeimmicnte (lig. 5-9). En general, puede del Sptima para cada uutriente, que es aqiella que proxluce la velocidad de crecimiento maxima en d2terminadas condiciones. Concentraciones inferiores ala éptima se denominan concentraciones limitantes. En el rango de | concentraciones limitantes, un aumento dela woncentacicn del nutriente se traduce en un aumento de la velocinse de crecimiento, de acuerdo con uaa funeidn hiperbélica probablemente debido a ka saturve! lransporte, Por ecima ile In concentracion dptinia pucden darse dos efectos, que ei aumento de lt coneentraicidn del nutriente no modifique La velocidad de ereetniento 0 gue la disminuya, por efectos ixicos debides a altas concentraciones det mismo, Al ighal que lo que oeurry Low la velocidad de crecimiento, cuaude el erecinienty, bacteriano es limitado por kt cemtmeidn de wn nutriente requerido, ef erecimiemta neta fim o coscets maxinia tambien guments con kt cunldd inielal des autrienie limitamte, Ademas de los autrie Curva que relaciona la velocidad de crecimiento con ta coeceatracion dei nutiene bocterias requieren factores onginicus de crecimiento, es decir, sustancias que no pueden sintetizar a partir de tos nutrientes generates y que deben ser agregadas a los medios de cultivo para cubrir requerimieatos especiticos. Existe una diferencia sustancial en lo que se refiere a los tangos de concentraciones, queen el caso de los factores de crecimiento es del orden de nano © picogeamos, muy inferior al de los nutrientes, Las bacterias que requieren uno 0 més factores de crecimiento se denominan axcxonofas. A diferencia de le que ocurre con Tos nutrientes generales, para cultivar ‘bacterias auxotrofas no se puede reemplazar in factor de crecimiento tequerida por otro compuesto quimice, excepto que se trate de un precursor del inismo. En cambio, el efecto de Ia varineion de la concentraciénde! factor de crecimiento sobre la velocidad de crecimiento y el rendimiento de masa ular es andlogo al descripto para los nutrientes. Esta es lahase de los ensayos microbiolégicos de vituminas y otros Tactores de erceimiento. El rondimiento de conversién de autciontes.y_factores «de crecimiento cn masa celular se conace como rendimiento de crecimiento (¥), y se expresa (ume yranary Jo. ectalas fivrmadas por granio 0 por mot de sustrato consuimido: y mess ramos de sustrato consumo | En medios rivos. las bacterias aerobias pueden asimitar centee el 20% y el 50% det earbohidrato fuente de carbono, mientras que las bacterias fermentadoras usan cl earbohidrato Termtentable slo come facats de enersta y otras sustancias (por ejemplo. aminodcidos) como procunsures diosintétic La eficiencia del uso de ATP es prieticamente constante la mayoria de las bacterias, exando crecen en medios ins concemtraciones de aztec: Gens de as oernadas —— 5 105 gmat Mob de ATP produio Ensayos microhioligicos Ba ef pony antciios sefalanies que ef aumento de ls conventracién de un factor de crecimiento, en ef rango de concentraciones lintitantes, da lugar a tin ineremento del observacion permiti6 disefae ensayos jeos «que permiten cuantifiear sustancias hidrosolubles que actdan como factores de crecimiento de diferentes bacterias, Estos ensayos se basan en determinar, un tiempo dado, sf crecimiento de una bacteria de ensayo auxotrofa frente a distintas concentraciones de una prepsracidn de referencia de la sustancia a ensayar y compurar este crecimiento con el que produce una muestra que conticne la misma sustancia, cuya actividad se quiere Por ejemplo, si deseamos determinar la concentracién de vitamins B,, en una solucién polivitaminica, debemosNUTRICION ¥ CRECIMIENTO BACTERIANO 7 isin de bacterias auxotrofas para ic que no bs sinteticen), é un medio de ccultivo basal que no contenge vitamina B,,y de un patron de vitamineB,, de concentracién conovida(preparacida de roferencia).’Se prepara una serie de medibs de cultivos que comtienen diferentes concentraciones de vitamina B,, agregando diferentes diluciones de la preparacion de referencia al medio de cultivo basal. Se sembran esos medios, previamente esterilizados, con la saspension det auxolrofo. A un tiempo dado, se detiene el eesimiento, se uide lo absorbancia de los cultivar y se constaiye una curva de absorbancia versus la concemtracién de vitamina B,, ‘originalmente presente en los medios. Panielamente se realiza el mismo procedimiento reemplazando la preparacién de referencia por la muestra a amlizar. De esta ‘manera se obtienen dos curvas que, si satisfacen los requisitos de regresién, linealidad y similiud, permiten cealcular la concentracion de vitamina B,, en la muestra. Concentrac an de oxigeno molceular Hemos visto que las baeterins se clasifican en aetobias y anaerobias, de acuerdo con su requerimiento de oxigeno ‘molecular. Las hacterias aerobias requieren C, para crecer, las anaerobias facultativas no requieren O,, pero cuando esti presente fo utilizan; las anaerobias aeretolerantes. no reqiicren ni wilizanO,_y las anaerobias estrictas no requtieten O, y tarnpoco to toleran. El crecimiento de las bacterias aerotias y de las anaerobias fheultitivas en presencia de O, cepende de ta concentracién de oxigeno en solucién. Dado cue el oxigeno es relativamente insoluble (<10 mg), sit coreentracion en los cultivos disminuye rapidamente. En med y sOlidos, las bacterias aerobias pueden crecer féciimente sobre [2 superficie del medio. En los cultivos liquidos estiticos, el erecimiento aerdbivo generalmente ocurre cerca de la superficie en contacto con ef aire, pues igjos de ella las Conuticfones se Nacen anacrobias y se tmplac | ereeitntento, Para objener grandes poblaciones bacterianss en cultivos liquidos es necesario aumentar la superficie de contscto entre la fase Hquida del cultivo y el aire, por ejempio por agitacién mecanica o por burbujeo de aire estéil Para el cultivo y manejo adecuado de Ics anacrobios obligados, debe evitacse su exposicidn al oxigeno del ai para excluir los efectos téxicos del mismo. Elvulive de las boeterias anaerobias también puede realizane en medios sélidos o en medios liquidos. En medios slides, pueden ccultivarse ya sea sobre la superticie de plazas con agar nutritive, iocubadas en une atméstera libre ce oxigeno, 0 bien dentro de un medio agarizado desoxigenado y solidifieado. Para la incubacién anaerébica de los cultivos cen placa se usan vasijas de distintos tipos, en toe euateo oe puede evacuar el aire y lHenartas con nitrégeno puro, con bidrégeno 0 con una mezcla de cualquiera de estos dos gases ¥ CO, Bl cultivo de bacterias anaerobias de importancia oliniéa se realiza usualmente dentro de jarras de ‘anaerobiosis, Dentro de ella se coloea un indieador de 6xido- reduccién (a7ul de metilenn) y un sobre.con biearhonate de sodio, borohidruro de sodio y unos mililitros de agua y se sierra herméticamente; la reaceién quimica produce hiidrégeno y didxido de carbono, Un eatalizador de paladio smite eliqtinar el O, presente en la jarra, que se combina ton ef hidrégeno preducido y fore agua. Por otra parte, cl didxido de carbone producido favorece el crecimiento de muchas bacterias anaerobias. Hn medios liguidos, las, bacterias anaerobias pueden ser protegidas de les efectos tixicos del oxigeno mediante la ineorporavion al medio de un agente reductor fuerte. La inelusién de ascorbato. tioglicolato sédico, cisteina o teazas de sulfto sédico ev el medio de eultivo, permite manejar anzerobios que no requieren condiciones rigurosas de exclusion det O,. El medio puede liberarse del oxigeno disuelto por ebuilicion y luego protegerse cubriendo su superficie con une capa de aceite mineral. A toles medios se les suele incorporar una Pequefia centidad de agar para aumentar su viscosidad y disminuir la disolueidn del O, del aire. La manera mds itil para medir el grado de anaerobiosis de un medio de cultivo es el fotencial de oxidacign- reduccidn 0 potencial redox (Eh). En medios corriences, {a ‘mayoria de las bacterias anaerobias son inhibidas a valores de Eh mayores que 100 mY, y algunes suv inivia su crecimiento con potenciales superiores a ~330 mV. Actividad de agua y presién osmética Los mictoorganis tan disponer de agua en el medio para poder erecer. La cantidad de agus disponible ‘en ua medio 0 actividad de agua (a,) depende del efecto cosmético, es decir, de su interaccion con las moléculas de solutos, ¥ de la posibilidad de adsorcién sobre superficies de sdlidos. La actividad de agua de uu wedio es igual a la relacidn entre la presin de vapor de la solucién y la del ‘agua pura: P, Pw Puede caleutarsea partir de la humedad relativa en una ceimora sellada en la que se ha aleanzado el equilibrio entre el medio de cultivo y el aire (por ejemplo, sila humnedad es del 95%, ia actividad de agua del medio es 0,95). La actividad de agua esta inversamente relacionada ae }, a Mayor presion osmética met donde 2 esta sonetante gaseos Tes ena, sapere absolut; y Fexel votumen de | mol de sg. desecacién 0 el agreyado de grandes cantidades de sales 0 ariicares son méodes muy efectivos para preservar, los ‘alimentos de la contaminaciéa mierobiana. Es bien conociloGION 98 que los jarabes y las jaleas son poco suszeptibles a la ccontaminacién bacteriana, Los microorganismos denominados osmovlerantes, que pueden retener agua y mantener uns alta concentracion interna de solutos, son eapaces de erecer en ur amplio rango de actividad de agua o presin osmética. Por ejemplo, Staphylococcus aureus puede cultivarse €9 medios que Contienen coneeniraciones de eloruro de sodio de hesta 3 mbles por lio y algunas levaduras, como Suecharomyces cerevisiae, en soluciones de sziicares de a, = 0.6. Algumas bavterios haléfilas crecen mejor en aitas Goncentraciones de cloruro de sodio y 2, = 0,80, pil ‘Aunque algunas bacterias pueden crecer apti 1,0 otras ‘pH 11,0, la mayoria de las especies bacterisnas crecen en tun rango estrecho de pH, que en la mayoris de los casos esti cercano a Ja neutralidad. Cada especie crece en un rang definido de pH y posee un pH éptimo de crecimiento: Las acidéfilas entre 0 y 5,5, las neutrofilas entre 5,5-¥ 8,0 y as alealifilas entre 8,5 y 11,5. En general, una disminuciéa del pH produce una disminucién de ta vel multiplicaeién bacteriana. Este fendmeao es uilizado desde hace muchisimo tiempo para aumentar la vida util de alimentos licteos (leches acidificadas, yogur etc.) Los cambios de pH det medio pueden modifiear la ionizacién de los nuttientes y reducir su asimilacién por los microorganismos. pesér de tas ampliss variaciones «de pH del medio, el pH intemno de la mayoria d> las bacterias se mantiene préximo a la neutralidad. Se han propuesto diferentes mecanismos para explicario: impermeabiliiad de la membrana 2 protones, intercambio de iones soclio 0 polasio por protones, etcétera, Sin embarge, variaciones rdstices de pH pueden inhibir la actividad de enzimas y proteinas transportadoras de membrana y, sil pH interno de las eétulas disminuye mucho, las bacterias mueren. Muy foewenteireve, lus uiciuorgastisuies provocan el cambio del pH de su propio habitat, pues producen y liberan, ‘metabolites dcidos 0 bisicos. Por ejemplo, es tiea conovido ‘que ia fermentacién de hidratos de earbono produce dciios ongénicas y que Ia degradaciin de aminodcidos genera amonio. Et pif de los cultivos se contcola uswalmente incorporando al medio soluciones buffers (por ejeraplo, fosfato moncdcido mds fosfato didcido}, aunque au potencial regulador es limitado; para un control mas eficiente,ea especial en grandes volmenes de culliva, se debe recurric a Ia adicién automatica de deidos 0 bases. ‘Temperatura _Adeen 5 ios decultivn, an factor muy importante que alters la velocidad de crecimiento e/a lemperatura de incubacion (Fig. 5-10). Del misino modo que para los nutrientes, puede definirse una temperatura Spa a ta que posibilta la mayor velocidad de crecimiento niximo. Por debajo de la temperatura Optima existe un “uno mas 0 menos extendido de temperaturas en las que as bacterias creven, aunque con velocidades maiximas eada GENERALIDADES vex menores a medidu que se alejan de la temperatura Sptima, debido a que disminuyen las velocidades de las reacciones enzimaticas. Este es el fundamento de! alargamiento de la vide stil de ue producto conservado & temperanuras de refrigeraciGn. Porencima de a temperatura éptima la velocidad también disminuye, pero el rango de teinperaturas compatibles con ef erccimiento es muy estrecho, pues temperaturas ats producen desnaturalizacion protsica, Deesta manera, a temperatura mxirna esté mucho inds cerca de la Optima de lo qus to esté la temperatura rnfrima, $i bien en su conjunte fas acterias son capaces de ‘oultiplicarse en un amplio rango de temperatuiras, no todas las especies tienen ia misma temperatura dptina nie] mismo rango de.temperaturas compatibles con el crecimiento, Existen especies eapaces de, desarrollarse a temperaturas superiores a 40°C (lermésilas), otras que to kacen entre 20°C. y 40°C (meséjiles) y otras a eempersturas inferiores a 20°C, incluso a temperaturas de refrigeracin (psicrdtos). Ei conocimiento de! comportamjento de las especies, bacterianas frente a fa cemperatura cs importante, pues nos orienta, por ejemplo, en ¢i anilisis microbioldgico de alimentos reftigerados y nos permite optimiza lax condiviones de conservacion en fio, La aceién de temperaturas elevadas como agent inte se vera en ef capitulo 6 Otcos factotes fisicos que pueden afectar el crecimiento, son, la presion hidrostitica y las radbaciones, prineipalmente fonizantes y ultravioleta, En cuanto a ia presién, s6lo es, importante cn bacterias capaces de crever en las profundidades, de tos océanos. Las radiaciones ionizantes son deitinas para las bacterias, ya que en bajos niveles producen mutaciones, gue pueden serletales, pero en altas dosis son directamente Ietales; a tal punto que seutizan contd agentes esterilizantes. Cultivo continuo Cuando las bacterias se cultivan en un ambiente cuya composicidn se mantiene constante, porque continuamente [Varad Ae crecioieate (dnpiteesy se resiaiente balesan,NUTRICION ¥ CRECIMIENTO BACTERLANO 99 se leagregun nurrientes y se eliminan productos de desecho, Ta poblacién bacteriana se mantiene en fase de crecimiento exponencial y la concentracién de masa.es constante. Estas condiciones se slearzan en el laboratorio 4 través de un sistema de cultivo continuo, siendo los is usados: 1) quimiostatos y 2) turbidostatos. En un quimiostato se eliminan.alicuotas de medio de cultivo que son reemplazadas con ta misma velocidad por ‘medio de cutivo fresco que posee un nutiente (por ejemplo, 1un aminoicida) en concentracién limitante ‘fig, $-11). Le velocidad de crecimiento esti detecminads por la velocidad de incorporacion do! autriente fimitante y laconcentracion celular, por ia concentracién de dicho nutrient. Un turbidostato tiene una fotocélula que mide la turbidez del cultivo, regulando la velocidad de flujo del medio para mantener tina turbidez predeterminada. Los sistemas de cultivos continuos son muy tiles para realizar estudios en condiciones que simulas las presentes ‘en ambientes naturales. Five dere Reservario de Vite seysadore eee clmaca de etivo ig. 5-11, Diagroma simplifieade de un quimiostao. Log. Neo. de bocterias | viablesnl Trego. Fig. $12, Curva de erecimieno tipes de un eultive sineronizado Cultivo sinerontzado Hemos dicho que, si bien las bacterias se dividen a intervatos de tiempo regutares, la velocidad de crecimiento de un cultivo en la fase exponencial aparece corcientemente como una funcién continua. Esto se debe a que todas las bacterins no se dividen simulténeamente. Se pueden obtener cultivas sincronizados, en los que précticamente todas las ‘bacterins se dividen al mismo tiempo (fig. 5-12), al modificar propiedades fisicas del ambiente © In compo- siciOn quimica det medio de cultivo. Por ejemplo, si la temperatura 0 la concentractén de un nutriente esencial son muy inferiores alos valores dptimuos, Ia actividad metabética seré muy baja y las cétulas no 3¢ Sividirén, Cuando se aumente répidamente la temperatura de incubacién o la conecntracién def mutriente esenecial, las bacterias se dividirin sincronizadamente. También se pueden sincronizar cultivos seieccionando células por tamaiio 0 por edad. Lameniablemente, el estado de sineronizacién dura muy poces generaciones, pues los ciclos celulares individuates no tienen ta misma duracién, Los cultivos sincronizados permiten estudiar etapas particulores del ciclo colular, que por razones técnicas 10, es posible realizar sobre eélulas individuales. BIBLIOGRAFIA, Cote RI, Gherna RL. Nutrition aed media in methods for generat ond ‘molecular bacteriology, 24, 0. V, Gecharc, editor, Arnerican Soutely tor Misroowiogy, Wastegten, DC, 1999:185-178 NBidhardt FC. Bacteral Growth: Consanc Obsession with aN/dt. J Bacteriology 1999; 181(28). 7408-7408. SawarsG The aerabiclanssrobieinterfice. Carr Opin Microbiol 1999; 2 QylAl-187 (Review)CAPITULO 7 METABOLISMO MICROBIANO Los nutrientes, provistos por los medios d por los abientes aaturales, en condiciones edecuad sustrato de una serie de reacciones enzimat conjunto constituyen el metabolismo bacteria. Criterios de division del metabolismo Si bien el metabotismo es una actividad totalmente coordinada dentro de la célula, para faciitar su comprensién se lo suele clasificar agrupanco cadenas de reaceiones 0 vias metabélicas de acuerdo a diferentes criterios. Los criterios de divisién del metabolismo mds eominmente empleados son: ~Segiin los cambios de energia libre. Se distinguen cadenas de reacciones que producen energia (caiabolismo) ¥y.olras que la utilizan (biosintesis © anabolisino).. “Seguin ta fuente prineipal de carbono. Se distinguen ‘cadenas de reacciones que originan todos los componentes, earbonados a partir de CU, ( ‘autotrotico) ¥ otras que requieren compuestos orginicos (metabolismo heterotr6fico). -Segiin la utilizacién del oxigeno melecutar, Se inguen cadenas de reacciones gue utilizan ei oxigen molecular (metabolismo aerébico) y otras que se efectian auseneia de él (metabolisrmo anacrébico) “Segtin ef susira‘o. Segiin la naturaleza quimica det strato modifieado por las nelabolisino de hidratos de carbons, deproveinas, de {pidos, etc, Xclucién entre metabolismo productor de energia y dosintesis. Transferencia de Energia El metabolisme productar de energie uellis anstormsiciones. que producen enewi provevhable ya sen por: Mirta Franco a) movilizacion de la energfa sontenida en compuestos quimicos a través del catabolism, como ocurre en los organismos quimiotcofos, © 'b) transformaciGn de la enempia caciante (Im) en encase qiltmica a través de la forosincests, como ovurre en los organisms fototrofos, La biosintesis, también denominada metabolismo ntético, annbelismo o metabolismo asimilatorio, “comprende las transformaciones quimieas que conducen & {a sintesis de los componentes celulares, y eventualmente de productos exocelulares, a partir de los outrieates presentes en el medio. “Aunque muchas vias biosintéticas siguen rutas diferentes de las catabétieas, hay otras que pueden cunipiic winbars fanciones, A estas vias melabdticas que cumplen une dobie funcion (catabolica y anabélica) selas Genomina an ibSlicas © anfibolismo, Das ejemplos muy conoeidos de vias anfibdlicas son Ia glucélisis y el ciclo de tos acidos ‘tricarboxilicos. La mayoria ¢e las reacciones que constituyca estas vias son reversibles y pueden degradar y sintetizar compuestos quimicos. Unas pocas enzimas degradativas son irceversibles y deben ser reemplazadas por otra reaccidn en la via biosintétice, por ejemplo fa encima fosfofructoquinasa acta en el sentido degradativo y la ‘encima fructosa bisfosfacasa, en el sentido biosimtético. La presencia de estas dos enzimas diferentes permite regular independientemente las funciones catabdlicas y biosintéticas, de la via anfibstica La produccién de energia esté asociada a reacciones de oxidaciéa y se acumula en compucstos quimicos con enlaces de aita energia, de los cuales el principal es el adenosinirifosfato (ATP), No toda Ja energfa contenida en las denominadas fuentes de energia es tansformada ea ATP, ya que una fracetén delSIETABOLISMO MICKOBLANO cambio de evergia libre total se libera en ‘orma de calor ‘Cuanto mayor es dicha fraccién, menor es ly eficiencia del proceso producior de energie. En este sentieo, las bacterias ‘con une alta velocidad de crecimiento son enos eficientes gue las células de on ELATP se sintetiza a partir de ADP y fosfato inocgénico mediante reacciones enzimiatieas de transferencia del grupo fosfato. La posicion intermedia det AT? en la scala termodindmica de la energia del entac: fosfato y Ia especificidad de las enzimas que intervienen en ta trunsfereucia de fost entre ADP y ATP hace que ef sistema ADP-ATP sea el intermediario comin entre las reaceiones que producen energia y las que la consumen (lig. 7-1) EI ATP es el principal responsable del bresursores eintermedarios, algunos de ls cuales sx formados durant la dxpradacion de Compucsos quiieas. Alenos productos de desecho {Et caabutisna y bivpolineras export som de tues industnal v9 peer sor utrenios oss Rewiseacanupos hacteriancs.124 SECCION I | Cuado 71, Prodectos dol extibotsme que atian com GENERALIDADES intermediasios en caminos blosintétiens. Catabolism Intermediary Bioslacesis Ditidroxiasewan-? Lipidos . Parnas : | Aminadeidor familia sina Chess osfogicenso ‘Seriaa imioden Mayerhoft Paroass) | Ciena Gein Piravato ‘Amingdsidos Fora picks ‘Alaina ation Levciea Fostocnolpicwate “Aminedsidos fanilia wowsticn Acido N-scetil earrimica (Cele de haxosas monorosiato hucora6-P Pentosas Polisctridoe de reserva Ribose? Nuctedtides Hisiging ‘Aminacivos familie sromitica eeetoglunacay el deide wicarboxtlico Oxslaceiato Aminaicides fis expanico ‘Arminoieidos fmitiaglatiaice ‘Acido glatiesico Glutamina Proline Arginina Lisina (via AAA) ‘Acido aspéctien Lisina Metionica | ‘Treonina Piriidinas Secciail-$.Co. Deearboxiacién de pirwvato | Acetl-S-CoA ‘Onidacién de fides graroe Degiadacién de pisiniinas Ello indica que a pesar de la gran diversidad de ‘ompuestos organicos que puedan actvar como fuentes le energfa en bacteries quimioorganohetératenfas, las fag metabolicas a teavés de las cuales ésta ve transforma, ‘nenergia quimica aprovechable son relativamente pocas ; ademis, en muchos aspectos semejantes a las que curren en otros organismos heterotrofos. A continnacién se describiran las caracteristicas enerales de los procesos catabélicos de fermentacién y sspiracion, y de la fotosintesis. ‘Metionina Porfiinas ‘Acidas grasos sina (2C) Bererobe Leucina (20) Fermentacibn Sa donominem formentociones edie ele ty ee toe piruvato y las transjormaciones posteriores de ste, en ‘anaerobiosis (fig. 7-3), Luego, la capacidad de fermentar distiatos compuestos depende de Ix posibilidad de serincorporado alla glucélisis, a través de un intermediario comin. Los productos finales, que generaimente dan u nombre aMETABOLISMO MICROBLANO 125 QuIMOORGANOTROFOS QUIMIOLITOTROFOS) Compuestos quimicas Compuesior quimicos Orsinicos RESPIRACION FERMENTACION Compuestos smorginiens Metabolites orgiicos Fig. 72. iag catabsticas generadoras de AVP en acters qui organotrofas y quimiolitotrofes. Ex Iorginios reduces are RESPIRACION {ss bacteria quimioorganitotas los Stustiatosoxidibles (dudores primaries de cletragcs) son compuesionorgacieosy ls agepiores Finals de sletsones von compucstosoxpinicos mst ‘oxiedos derivados del mismo sustrato, en la fermestaidn, 0. compacstas inorgicos onidados en fa rspiraion, En ls buctriss viralvtrtes Tos sutras oxidables per respieacion 4on compuesios imorginicos reducidos y os sceploes, compucstos inrpinicos onidedos la fermentacion, varian de acuerdo a las diferentes transtormaciones que puede sultir ef piruvato. La bioquimica de los procesos fermentativos se deseribird mis adelante, cuando se deseriban los mecanismos bioquimicos de generacién de ATP cn hacterias quimio- organoheterbtrofas, Durante la fermentaciin se producen “eacclones deoxidacién-rednecién entre diterentes compuestos orginicos derivados del mismo sustrato fermentable, une de los cuales actua como dador de eleetrones (se oxida) ¥ olfo como aceptor de electrones (se reduce). De esta manera el balance de oxidacismreducrion se imantiene, es decir el nivel de oxidacion de os productos finales es similar al del sustrato. Para que «sto ocurra el sustrato fermentable debe ser un compuesto con sm nivel de oxidacién intermedio (ni muy oxidado ni uy reducido), lo que limita la calidad de sustancias fermentables, Los sustratos formentables tipicos son los hidratos de carbono, aunque algunos microorganismos pueden fermentar Setdox ‘orginicos, aminodcidos, purinas y pieimidines Los productos finales conservan gran parts dela energgian del sustrato, por ello Ta fermentacién es poco eficiente como proceso generador de ATP, que se obtiene por fostorilaciones | a nivel de sustrato, En las fosforilaciones a nivel ée sustrato una parte de la cenergia liberada se conserva en compuestos ricos en ener formados por ta accién de deshidrogenasas, y luego st transfiere al sistema ADP/ATP pet la accién de quinasas. jones no requieren oxigeno molecular Pueden Hlevarse a eabo en condiciones de anuerobiosis estrictas. Por ello, pueden obtener energia por fermentacién las bacterias anavrobias esirietas, las anacrobias acrotolerantes y tas anuerobias faculativas cuando no dispouen de oxigeno mole Respiracién Larrespiracién es un proceso de oxidacién-reduecién en el que ef dador de electrones puede ser un compuesto orgénico 0 un compuesto inorgdnico reducido y el aceptor final de electrones es un compuesto inorganico. Lanaturaleza del aceplor final deelectrones varia segin que la resptracion se_produzta en aerobiosis © en anaerobiosis. En el primer caso el aceptor final de electrones es ef origeno molecular y el proceso se denomina respiracion ‘aerébica. En el segundo caso el aceptor final de electrones es otro compuesto inorgénico (nitrate, sulfato, sufito, tivsulfato, carbonato 0 Fe (IID) y el proceso se denomina respiraciin anaerébica.SECCION 1 (COMPUESTOS ORGANICOS HEXOSAS PIRLVATO | Durante ta respiracién, los compuestos orginicos pueden ser oxidades campletamente a CO, por lo tanto} cualquier compuesto con un nivel de oxidieion menor | adel CO, puede ser degradado por respinacién Esto explica lo biodegradabilidad de todos los compucstos orgénicos nsturales a que nos referimos anteriormente. St bien la respiracign permite ina oxidacion completa del sustrato respirable, algunos microorganismos producen sélo oxidaciones parciales, como en el caso de las bacterias acéticas, ‘Acorde con la capacidad de oxidacién total de los sustratos, ¢! rendimicnto energstico de [2 vespiracién, esmucho mayor que el de la fermentacior. ts Dicho en otras palabras, las b as quellevan a cat tun proceso respiratorio sintetizan mucho mas material celular por unidad de sustrato, Mas adelante se describira con algin detalle la bieguimica de las vias respiratorias. < el mecanistro por el que avrobias y las anaerobias obticnen energia fas bacter ~ faculiativas en aerobiosis. La respingairin anaerébica puede ser el camino de btoncién de energia en las bacterias anaerobias vbligadas, ¥ en las anaerobias facultativas (en anaerobiosis); las GENERALIDADES tana! Lacie Propioaaio Butanol y otros sompuestes de Cd Mezela de decider engtnicos (Gemensacionseido-mixts) Bulenglicol > oe | | ig 7-3. Fermentacipnes. Regeneraciin de NAD por tanformaciones anierdbicos del pinaaes y alunos do los podcvs Finals de dite primeras pueden utilizar carbonatos y sulfatos como aceptores finales de electrones y las itis nitratos. En la respirscian se genera ATP como consecuencia del pasaje de electrones desde el dudor primario.si | aceptor final, a través de una cadena de transporte de electrones. El mecanismo se denomina fosforilacién | oxidativa, Teansporte de elecirones “Toda oxidacién consiste en una pérdida de electrones, esto puede ocurrir por ganancia de oxigeno o por perdida de hidrégen0s. Las oxidnoiones biolégicas son eshidrogenaciones llovadas a cabo enziméticamente por enzimas denominadas deshidrogcnasas, cuyas coenzimas actian como transportadores de esos electrones. Las principales coenzirmas transportadomas de hidrogeno soa dos nucleétidos de piridina:nicotinamida adenina dinuclestido, (NAD) y nicotinamida adenina dinuclestidofosfata (NADP). Ambas cocnzimas suften reductiones y oxidaciontes reversibles de acuerdo con ta siguiente ecuaci6n: 40H => NK +H NAD(Py +2H NAD@)H +H Los electrones transferidos desde diversos dadores al NADH 0 ¢ una flavoproteina son transportados en un sistema asociado a membranas (plasmatica en procariotas¥y mitoconérial en eucariotas). Los sistemas ¢ eadenas de transporte de electrones estin conslituidos por cocazimas de potencial de oxidacion-reduccidn creciente. De esta manera pueden curnplir dos funcfones bisicas: a) aceptar clectrones del dador y transferirios al ceptor yb) conservar como ATP parte de la energia liberada durante la transferencia electténica que gevera gradienter de protones y eléctrice, En varios puntos de la cadena de transporte de ‘loctrones, la expulsion de protones de la célula genera un sgradiente de pli y una diferencia de potencial elécirico (fuerza impulsora de protones) a ambos lados de la membrana. El ingreso de los protones a fa edula a través de una ATPasa que atraviesa la membrana provee Is energia para la fosforiiacion oxidativa. debida a ia actividad de la ATPasa como sintetasa, Debido a que hay ana serie de ‘oxidaciones por eada par de hidrégenos que pasin al aczptor final, e5 posible generar més de un enlace fosfato de alta energia por cada atomo de oxigeno consumido. En ‘mitocondrias el cociente P/O (consumo de fosfitolcansums de oxigeno), cuando e| NADH es el dador de elgctrones, ¢s de sproximadamente 3. Es decir, se sintetizan 3 moléculas de ATP por cada étomo.de_oxigeno consumido y cada molécula de NADH oxidada, Con otros dadores de clectrones el cociente P/O puede ser difeceote. En bacterias, ‘no hay datos concluyentes, pero el mecanismo purece menos eficiente y estos cocientes menores, ey En [a fosforilaciSn oxidativa la sintesis de ATP eaté | acoplada con el transporte de electrones. Lugo, ¢s un | medio para obtener enezgia de la oxidacién cel NADH. | EERE ROY ASC Sees] Transportadiores de electrones En las bacterias, que_son_eélulas_procaristicas. los transportadores de elecrones y Ins enzimas involueradas estin localizados en la memorina eitopiasmatica, Mientras, que en los eucariotas Ins enzimas respiratorias, localizadas, en las. mitocondrias presentaa cierta uniformidad, en Dacterias existen varias cadenas de transporte que. si bien pposcen los mismos tipos bisicos de transportadores, tienen mayor grado de diversidad. especialmente en el numero y las propiedades de los citocromos, Los principales componentes que | transporte de elecirones desde un susirato organic a) deshidrogenasas que contiencn nu piridina (NAD y NADP) o de flavina (FMN y FAD). La coenzima que participa mas frecuentenente en la oxidacion de In gincosa es el NAD’, migntras que las, deshidrogenasas asociadas 2 NAUP~ usualmente transtigren electrones de intermediarios del catabolismo intermediarios biosintéticos. Los nucieétidos de piridina dan cuenta de casi todo el hidrogeno transferido en condiciones anaerdbicas, aunque algunas reacciones especificas reguieren la participacién de favoproteinas reducidas, Otras deshidrogenasas son flavoproteinas, cuya coenzima es ia riboflaviea. Son més oxidadas que los nucledtidos de pirimidina y aceptaw hidrégeno de ellos. Un uticipan_en el ejemplo de ellas es Is NADH deshidrogenasa, que calalizn la transferencia de electrones del NADH #l préximo componente de fa cadena de transporte, Otras tlavoproteinas son activas en deshidrogenasas piimarias (sueciaico deshidrogenasa) y ottas son reoxidasas por el O,(favia oxidasa). Estas ditimes af entrar en contacto con et 0, Ie transfieren directamente el hidrSgeno originando peroxido Ge hidrégeno. En ausencia de catalasa el perdxido de bbidr6geno se acurmala en la célula y esuna de las causas de toxicidad del ©, para las bacterias anaerobias Ademés, estas oxidaciones (y posiblemente ciras oxigenaciones) producen pequefias cantidades de superéxido (03), radieal atin més txico que el H,O,, Las bacterias acrobies y las anacrobias actotolerantes posec! upertxido disenutasa que impide la acummulacién letal de supesdxido ‘catalizando la siguiente resccics 20; 42H» 0,+H,0, _Muchas de estas bacterias poscen ademés wna enzima catalasa que descompone el H,0,. Ot%is poseen fay que Catalizan la oxidacin de compuestos “orgintieos a expensas de ta reducciéa de H,0,a H,0. _8) _proteinas con hierro y azure. Contienen Fe y 90a cimttdad equimolecular de S scidolabil Suften tansiciones reversibles Fe (II) < Pe (Ill). Por ejemplo, tu ferredoxina de bacterias anderobias estrietes (Clostridium) es una pivieiaa Ue bajo pesu mivlevular cuyo potencial redox estindares muy bajo, similaral del elestrodo de hidrogeno, ylepermite usar i, como agente reductor ex el meiabolisma ‘anaerdbico outotréfico, asi como también ta Hberacién de Hi, Las ferrodoxinaa participan en la fotosimtesis y en la Fijacion de N, ¢) quinonas. En mitocondrias ta principal es la ubiqijinona, pero en bactertas partieipan otras quinons. Alguoas bactecias fienen ubiguinonas (coenzima Q). oria de las bacterias grampositivas i ida_por la menaquinona y €n muchas enterobacterias estan Fresentes ambas Generalmente 200 transportadores ittermediarios entre favoproteinas y citocromos ¢) citperomos. Son compuestos, porfirinicos qué cgatienen Fe,.capaces.de sufrir cambios reversibles Ee {U1) & Fe (Ill). Se han identificado gren variedsd de ellos, ‘contrastindo on Ia relativa uniformidad observada ea mitocondrias. Muchas bacterias anaecobias fecultativas, como F. coli, carecen de citocromo ¢, cuya presencia 0 “ausencia puede ser detectada por la pnivba de la oxidasa, de gran ulilidad en diagnéstico. Pseudomonas aeruginosa presenla un sisiema de crtocromes compteja que, ademés, depende de las condiciones de cultivo. En condiciones anaerébicas y presencia de nitrato se aislaron cinco citocromos de P. aeruginosa, algunos funcionalmente equivalentes alos citoeromos animales, zunque na idénticos, que también actian en fa reduccién de niteato a nitrite. La citocromo oxidasa que contiene citrocromo a, acria tambiéa como nitritorrecuctass, transficiendo Ios efectrisey wsko al oxigeno come al nitrto, Muchas bacterias anacrobicas y todas las bacteris del dio lictico carecen de citocrotes128 SECCION 1 y de citocromooxidase, Aungue en general las bueterias danaerobias no tienen citocromos, las que ustn nitratos 0 sulfatos como aceptores finales de elecitones, poseen estos wransportadores. En bactcrias nitriicantes y bacterias que otien azfie, Jos eleetrones entran a la cadena a nivel del ctocrome e. | También panticipan en la fotosintesis. Biolurainiscencia ayoria de las bacterias lueninosas (Phetohacterium) son microorganismos anaerobios facultativos aistados det mar y de aguas salobres. Enellas, tanto ei crecimiento como a luminiscencia estin fuertemente influidos por las condiciones de cultivo..La luminiscencia se sroduce soto ‘en presencia de oxigeno, por lo que Ia production de luz se consider un proceso oxidative acrdbico en el quc se produce ls oxidacién de uns flavoproteina:(lucferina) por el Q.,en presencia de la enzima luciferasa, Parece ser una via lateral de la respiracién que no determina fe produceién de ATP sino que provoca la exeitacién de ur compuesto intermediario que emite luz. La produccién xuminiea por ins bacterias luminiscentes es un método muy sensible para detectar O, en solucivn, va que responden a coreentraciones de O, atin’ muy bajas. Fotosintesis no slo por oxidacion de compuestos gui por fotosintesis, es devi, iransformatndo la enerzialuminosa en ATP y NADH o NADPH. La fotosintesis comprende una fase luminosa, durante to cual la energie iuminosa es atrapada y convertida en cnergia quimica y NAD(P)H y la fase oscura, en la que la energia quimicay et poder reductor obtenidos s¢ usa paratype CO2y sisetizar Ios components cela, | La fotosintesis responde a la eouncién general: 2AH, +CO, ——» (CH, 0)+24+H,0 donde A puede ser oxigeno (plantas, algas, ciamobaeterias) co azufte (bacterias del azufre y bacterias pirpuras no sulfurosas). La ecuaciéa de In fotosintesis ctrresponde & una reaccidn biosintética, con Bjacion de CO,a través del Gicio de Calvin. También participan en la cbtencisn de carbono celular las carboxilaciones reductoras éependientes de ferredoxina o NAD (P). En la fase luminosa, fa energia radiante e absorbida por el sistema de pigmientos fotosintéticos {clozotila y igmentos accesorios) y es transterida a los centros de reaccién en los que produce lx activecién de las clorofilas, ‘que ceden electrones. Los elecirones son transportados a través de un sistema de transporte generando ATP por el mecanismo de fotofosforilacién, andlogo a la fysforilacién oxidative. Las bacterias fotosiniéticas requieren generacién de {ERALIDADES. poder reductor neto pues usen CO, come fuente principal de carbono, HA+NAD@Y +nADP +n Pip A+ NADO)H +H + AAT En Ia fase oscura se requieren varias moléculas de ATP y de NADPH para reducir una molécula de CO2: (COs 3ATP-+2NADPH +24"+ HO-F(CHLOv+ JADP + 3 + 2NADP” En las cianobacterias, el sisters. folosintético ¢s similar al de las eélulas evearidticas (alazs y plantas superiores). La generacién de ATP y NADPH requicre Ia actividad de dos tipos de centros de reaccién que contienen clorofilas, os fotosistemas I y IT, localizados en la membrana tilacoides. El mecanismo podria resumirse como sigue: a) Las moléculas de clorofila del fotosistema | son excitadas por la luz y emiten electrojes. La clorotila queda cargada positivamente (oxidada) y los clectrones se usan para reducit NADP a NADPH. b) Simultineamente, las moléculas de clorofila del fotosistema Tt también gon excitacas y emiten electrones, ‘que pasan a través de una cadena de transporte y reducen la, clorofita oxidada del fotosistema L. Como resultado se genera tuna Fuerza motora de protones que da lugar la sintesis de ATP. por un proceso conocido como fotofasforilacién 10 ciclica. ¢) La clorofila oxidada del fotosistema Il es un agente fuertemente oxidante que toma electrones de molécwas de 10, generando O. * Se eree queel O, generado por ls cianobecterias origins hace millones de ais ol cambio dea ¥ permitid la evolucién de los organisms aerobios. {Las bacteria fotosinséticas verdes 9 plirpivas se diferencian de las cinobacterias en varios aspectos. Las principales diterencras se deben a ta carencia del fotos a) Producen ATP s6lo por tototosforila b) La fotosintesis es anoxigéniea, ya que al nwo existir transporte de elecirones no efclieo no utilizan H,O como dador de electrones y no producen O,. ©) Para sintetizar NADH y NADP! usan como dadores de electrones H,, H,S, 50 y compuestos organicos con potencial de oxidacién més negativo que el agua. d) Poseen los pigmentos fotosintéticos denominados bacterioclorofilas ay b La fotosintesis anoxigénica es carscteristica de bacterias anaerobias obligadas » algunas anaerobias facultativas que ‘en presencia de O, la eemplazan por la respiracion aerdbica, MECANISMOS BIOQUIMICOS DE La. GENERACION DE ATP Dado que ts diversidad metabdlica de las bacteria es enorme y que los objetivo y destinatarios de este texto se relacionan con el area biomédica, nos referiremos fundamentalmente a las bacterias quimiorganoheterotrofas,METABOLISMO MICROBIANO que comprenden a las bacterias patégenas, y en mucho menor grado a otras categorias nntricionales Bacterias quimioorganoheterotrofas. Compuestos orginicos como fuente de energia, de earbono y de electrones. Las bacterias quimioheterotrofas pueden asar una ample gama de compuestes orgénicos como fuentes de energia, El catabolismo de Jos compuestos orgiaices, que implica su oxidacién, conduve también a la formacién de muchos ompuestos que Se incorporan a las vias biesintéticas, Usaremos como ejemplo fa glucosa por varius razones: 2) esta ampliamente distribuida en ta naturaleza, ya que es monémero de polimeros naturales, 2) es uilizada por un emplio espectro de bacterias y 3) a eapacided de usar otros hidratos de carbono, y ain otros compuestos diferentes, depende no uélo de disponcr de les sistemas de transporte sino también de poder convertirlos en intermediarios comunes ¢ los de la degradacién de la glucosa Se conocen varias vias metabslicas para a degradacién de la glucosa, en todas ellas el piravato ocupa una posicidn central. Por ello cofisideraremnos las siguientes etapas: 1, Formacion de piruvate (ocurze en fernentacién y en 4m) estino del piruvato (es diferenie en la fermentacién que en la respiracidn) Formacion de piruvato La formacién de piruvato a partir de ta gluco proceso anverSbico, En las bacterias existen.al menos, tres vins metabolicas para transformar la glucosa en piruvato, Bills son la via glucoiltica (o de Embden-Meyerhof-Pamas), ia via del fostogluconato (de los fosfatos Je pentosas 0 in del monofostito de hexose } y la via del Scido 2. ceto-Idesux-6-fosfoplucénico (0 de Botner Doadorof, La via glucolitics (EMP) y Ia del fosfogluconato {HMP) ‘oourren en una gran varied d= microorzantsinns procaciouicos y enwariéticos, aunque las propiedades de algunas de las éenzimas pueden diferir de acuerdo ala especie, Gluediisis Ep {a figura 7-4 se muestra la serde de maceiones que ‘ransforman glucosa en pinzvato por esta vi La fosforilacién de D-fructosa a fructosa 1,6-difusfato ‘ecupa una posicién estratégica: Fructosa 6-fosfuto+ ATP Go fuctosa ,6-fbsfato + ADP fosfofructoquinasa Esta reaccién, caracteristica de la glucdlisis, esta sujeta 2 regulacién y constituye uno de los puntos de vantrol del metabolismo, ya que la fosfofeuctoquinasa «5 una enzima alostérica que responde a cambios en el nivel de nuclestidos de adenina (ver més adelante), £1 conttol en este punto ‘segura que cuando abunda el ATP disponible, como oourre ‘cuando piruvato y lactato son oxidadas a CO, a través del ciclo de los aides iricarboxilieos, se bloquea Ta elu se favorece la sintesis de glucoss. A la inversa, cuando es 129 necesario generar energia por esta via, se favorece la degradacién de le glucosa y se bloguea la sintasis de carbohidrstos. La reaccidn caracteristica es la escision de la fructuose- L.6-difosfato por Ia aidolesa para dar una mezcla de tiosasfosfatos. Si bien cumplen la misma funcién, [as aldolasas de bacterias y hongos poseen propiedades diferentes « las de los animales. El ghiceraldchido 3-fosfato ormado on esta eaccién ¢s un inteimedtiaio clave de vatias vias metabdlicas, ya que también puede desviarse hacia la biosintesis de lipides a través de su transformacién en licero! fosfeto. En la glucdlisis el grupo aldehido del gliceraldehido 3-fosfato se oxida a carboxilo cediendo electrones que reducen NAD” a NADH, que sera reoxidado durante [as posteriores transformaciones del piravato. Luego, se transfiere un grupo fosfato del 1,3-difosfo licerato a ADP, pormitiend conservar la energia liberada de la oxidacién de un grupo aldehido en ia unidn fosfeto de alta energia det ATP. Estas reacciones constituyen un ejemplo de generacidn de ATP por fosforilneién a nivel de sustrato. A través de la via glucglitiea se generan 2 moles de ATP {por fosforilacién a nivel de sustrato) y 2 moles de NADFL por mol de gluecsa, La degradacién de glucoss a piruvato por esta via puede representarse por la Siguiente ectiacién: Este proceso es el principal movilizador de la energia quimica en la mayoria de los microorganismos quimio- heterotcofos. Para mas detalles consulrar un texto de bioguimiea, Via del fosfogluconato La via del fosfogiuconato permite fermentar hexosas, pentosas y olcos earbohidratos, Como proceso generador do ATP es menos eficiente que la glucélisis y s6to para algunos ticroorganismos, como los fermentadores heteroldeticos, es la principal via productora de energi Pura la mayoria de tos mnicroorganismos sus furiciones mis importantes son: 2) aportar NAPDH como dador de electrones para reaveiones biosintéticas, b) aportar precursores biosintéticos (ribosa-5-fostato pais la sintssis de cides mucleicos, eritrosa-4-fostato para la sintesis de aminodcidos aromiticos) ©) permitir degradar pentosas a avés de la via giucolitica y 4) formar glucosa a partir de CO, durante la fase oscura de la fowwsinesis, a través de una modificacion. Esta via se origina a patir de la zlucosa 6-fosfoto de la shiedlisie Ta direrrién del Naja ye camino tomado por le lucosa después de incorporarse 8 la via del fosfogluconato estéa determinadas, en gran medida, por las necesidades relativas de NADPH y de ribosa-5-fosfato en las célutes Sélo en micron que biosintetizan activaments lipidos prevalece Ia ruta oxicativa completa. Es de tnauroleza e(clica (fig. 7-5). Ba ell, la glucosa 6-fosfato oxida a 6-tosfo gluconato que luego se decarboxila y oxidaSECCION i+ GENERALIDADES 130 Navt | Ape Fig, 74. Conversion de glacoss en plewvato par Ia via rokdcals de piruvato, dos meiéeulas de ATP, por foster posterormente en arabicsis © en anaerobiosis fosfoelicasa tomerase fosfofrusopinasa + eos Sosfoslceroquinasa Fain } ans ———_ oe ewogquinasa Glucose 6 fostito oso A Fructose fructooa- I ifesfoase Fructos-t6alifose ume 8 «<— Dinidvoxiacstons- fete eal Domo a taettesoplcre i 2 fosfogliceta 2fostoyticerato own fl Fosfoeaoloirwvato Pirwvato Eabden-Meyerhot-Parnas (gtucsiss). Uan moléeuls fe glusoss erigina dos ‘Lolve! de sustat, y dos noléculas de NADU, que deberin se reoxtdadas,METABOLISMO MICROSIANO Bt 8 D-ribuloss S-fosfato. Las deshidrogenasas que aetian Tequieren NADP" como aceptor de electrones. : la D- ribulosa S-fostaco y Ja D-ribosa 5-fosfato (producida por jomerizavion reversible de la ribuloss) se Gansformian en xilulosa S-fostato, que es el punto de partids de wna serie de reaceienes catalizadas por transeetolasas y ransaldolasas gue llevan al compuesto iniciat de In via, la giucosa 6- fosiato. Por una serie de reacciones en ls gus 6 moléculas de glucosa 6-foslato se transforman en 6 moléculas de D- ‘bulosa S-fosfato y CO2, una molécula de gluzosa 6-tostato ts uxidada vounplctanenew CO. y 12 moléetlas de NADP? se reducen a NADPH, segin la Siguiente eexacion: Glucoss-6-fostito #12 NADP! +7 O——> 6COM2NADPHH2H' +P? Enalgonos microorganienos 0 virsunetaneiac onetabslions, ‘comp cuando e! requerimiento de ribosa-S-fosfato os mayor (que el de NADPIH. la vin se reduce a las primems reaccionies, ¥ responde a la eetiscién: Gtucosa 6-fosfato + 2 NADP! + H,0 ——> Deribosa 5.P + CO, +2 NADPH +2 Hag La coexistencia de esta via y Ia glucoliticaasegura a Ins cétulas aporte de energia, a través de In glicélisis y de intermediarins biosintéticos (peniosus-P) y coenzimas (NADPH) a través de la vis del fosfogluconato, Esto e3 asi en la mayoria de los microorgsnismos quimioorgano- hoterdtrofos. Sin embargo, us baeterias que producen Fermentacién heterolietiea pura obtener energia a partir de hexosas y pentosas utilizan esta via pues earecen de enzimas alucolitieas (fosfofiuctoquinasa, atdolasa y trinsafosfato isomerasa), pevo poseen ta encima fostnectolase que vompe la xilulosa S-fosfato ew acetillostato y gliceraklelida 3- fosfato, explicando kt produceiin de etanol en esas pacleriis, AlgunaS ofras pOeAS espectes bacietaas, CALE cllas Brricella aborms y dvetobacter spp, utilizar la vin det fostogluconato para obieser ATP. En extos eases se produce 1 mol de ATP por mol de glucosa degradada,y NADH en ugar de NADPH, Via de Entner-Doudoraff La vin de Entner Douforof (ED) diverge Ce la autesivn a pactir dei 6-Hosfo glucanato, que es deshidratedo y cortado para dar gliceraldehido 3-fosfato muis piruvato, Est tltimo, origina etanoi CO, a través de reactiones similares 2 las ‘que oeurren dtraate ia fermentacidn aleohdtica sn levaduras. Se caracteriza por la presencia de un intenmedirio, el acide 2nceto Iudesori,6-Fosfogluesnivo, y produce | mol de ATP, T mol de NADPH y | mol de NADH por met de glicoss (fig. 7-6) sta via es coracteristica de un grupo restringido de bacterias, entre las que se eventan especies de los géncros Pseudomonas, Rhizobium, Azotobacter, Agrobacterium ¥ otras pocas gramnegativas. También se fa ha reportado en Escherichia cult, pero slo cuando erece en presencia de luonato. Parece no existir en bacterias grampositivas, a excepeidn de Enterococcus faecatis. Aunque esta via s6lo ha sido establecida como sistema funcional en las bacterias rmencionadas, enzimascoractersticas de ella se han encontrado en otros mieroorganismos. Las tres vias estén interconeeiadas de acwerdo con el esquema presentado en la igure 7-7. Por ello, cuando mptantes de £. colé que no pueden llevar acabo la glucdlisis execen eit un medio glucosado, preducen energia por la via del fosfoghuconato y eeducen Su velocidad de crecimiento. Si las mutantes presentan un biogueo va Ie via dei fosFogtuconato obtienen energia por la gluedlisis y tos intermediarios a partir de otras vias metabdlicas, no observindose ningin efecto sobre la velocidad de crecimiento. Si lo mutacién afeca el ciclo de E-D y las ediulas erecen en un medio con gluconato, utilizan ta via Gel fostogluconato. Destino del piruvate EI metabolismo del pintvato sigue diferentes vias segiin se lleve a cabo en acrobiosis oen amerobiosis. En aerobiosis siffe una oxidacion eiclica conorida como ciclo de los Acidas tricarboxilicos (CAT) 0 ciclo de Kreds yen anaerobiosis sufte diferentes reaceiones especificas que constituyen las denominadas "fermentaciones'. La oxicacién ciclica, aerébica, del piruvato produce ‘energia por fosforilaciones oxidativas asociadas a l@ eadend de tansporte de electrones, en proporciones mucho mayores, que 1a originada durante la formacién del piruvato, La produceién de enorgia noes ta nica funeién del CAT puesto ‘aue es ademas una fuente importante de intermediarios biosintéticos. £1 mantenimiento del CAT requicre ua aporte continue de oxalacetato, que proviene de la carhoxliacion Ue los Seidos piravico 0 fosfoenolpitivico. La fanci6n principai dc las transfortnaciones anaerSbicas del piruvato (Termentaciones) es la de regenerar el NAD oxidaclo necesario para la formacion del piruvato, aunque también resultan de interés algunos de los metabolites que se produeen, Algunas fermentaciones, como las propidnica, yy butiriea, producen energia adicional bajo la forma de ATP. Mas adelante se deseribirén en detalle algunas ferinentaciones importantes desde e] punto de vista industrial y taxoudmico. Metabolismo aerébico det piruvato. Respiracién acréti El meeanismo més importante para la oxidacién terminal es elciclo de Krebs de los écidos tricarboxilicos que, junto con la gluedtisis puede oxidar totalmente la glucosa. Este ciclo constituye Ia principal via de obtencidn de energia en bacterias aerobias. No sélo provee energia metabdlica sino tambido el exquelete enrbonads para Ia sintesis de fos materiales celulares, tanto én baeterias aerobias come anaerobias. Si bien estas Gitimas carecen de algunas actividades enzimaticas que destruyen la naturaleza ciclica de las reacciones, la mayoria de elias estin presentes y dan lugor a intesmiediarios biosintéticos Decarbercilacién oxidativa det piruvato. En acrobiosis, ei piruvato obtenido por degradactin de [a glucosa sutie132 (cima siete << oe _ maces settee a _ worst sree eet 12 Xitulosa-S-fosfato 2a fan occa totulitéet iis 2Sakdgan oe eitoe seielentin ——2Fmatsie —— ema Tete te apy Ince ttnt—5> fn Dhibinbfn rete paee a ae: oon Fig. 7-5. Conversion de glucosa-6-fosfato en pinuvato por Ja vie del fosfouluconatoADP Nabe" NADIE << —————— are —— 6-forfogluconate desllrogenane acxoquinase Glucosa-é-fosfae ‘Sefosioglaconsto 133 incase ADP ‘ecto -desoni6-fosfogluconato (KOPG) XDPCatdolasa : SosogHeealdhido Proto NAO | ace NADIEHY ADP Ty — [ Ae arr Fig. 746. Conversion de glucosa en ato por a vinde Enmuer-Doudoroff Una molscula de glueoss origina uns molicula de pisvato y usa de 3-fostoliceraldchido, que es convertdo a pinnate po enmas comunes a In glass una decarboxiaciéa oxidativa y es transformad> en acetil- S-CoA por un complejo piruvato deshidcogenasa; los electrones son llevados como NADH a la cadena respiratoria Oxidacidn de la acetil-S-CoA. La acetil‘S-CoA es oxidada ciclicamente a través dei cielo de los CAT: Primeramente se condensa con oxalacerato pars dar dcido sitrica, que on ura vuelta del oiclo ca deacarbonileds 9 oxidado para regenera oxalacetato y liberar dos Stomos de ccarbono como CO, y cuatro pares de electrones, que son transferidos a NAD, NADP y FAD. Cualquier sustrato capaz de generar acetil-S-CoA puede ser oxidado por este ciclo, que es un punto de eneuentro entre el metabolismo de carbohidratos, lipidos y proteins. -Laoxidacisn compietadel grupo acetifo de une molécala de acetil-S-CoA a CO, através del CAT, genera 2 moléculas de NADH, | molécula de NADPH, | moléoula de GPT y | par de electrones que entra a la cadena de transporte independientemente de los nucle6tidos de piridina, Si la funci6n del CAT fuera solamente la oxidacién terminal de grupos acetilos, el oxalacstato actuaria como, catalizador y se regeneraria continwamente. Sin embargo, como ya se dijo, este ciclo genera intermediarios biosintéticos. Luego, en onganismos en crecimiento e! ciclo a 26 carrada y so requiare un aporte ueto de oxalacetato para reponer les intermediarios usaios en reacciones biosintéticas. La sfotesis de oxalacetaip puede Hlevarse & cabo por: 8) carboxilacion de piruvato 0 fosfoenolpiruvato, De esta manera el carbone entra al CAT pordos vies: via acetil- S-CoA y via oxilacetato, ') ciclo del glioxilato. Las bacteties que crrcen con Acidos grasos (icetato) como ‘nica fuente de carbono, producen acetil'SCoA sin intervencién del piruvato y, en consecuencia, ne se produce oxalacctato por carboxilacionSECION GLucosA GENERALIDALES Gtasgse® 6 + tasty —————— Aci 6 -Funtilucniso Frucigea = 6 = fost Fruaiiss 16 - difosieo Palddas fosfuo KoPe sets ° | | BRL oy Reae _--4 app —Act60 13 -etesogtvenco saitostiao | $ “Keido 3. fafoglictico t se we | ara os —- aunbee en Fig. 7-7, Hransfermactin de glacesa em ido plrvic. lato de piruvato o fosfoenolpiruvato. En estas corticiones se induce la sintesis de enzirnas que posibilitan un bypass en el ciclo de los dcidos tricarboxiticns, dando tugar ai ciclo del glioxitato, Metabolismo anaerébieo del piruvato En anaerobiosis, tas bacterias heterotrolas pueden obtener energia a partie del pinivato por oxidheién o por formentacin del mismo, La oxidacién del piruvato produce un mayor rendimiento energetico que las fernentaciones, por esta cazén es un mecanisme que se mantiene ‘evolutivamente. Respiracion anaerébica nas. bacterias quimioorganoheteratzofus_poscon cadenas.de.transporte de eiectrones cuyo aceptor fins! no ‘esel Q, sino otros compuestos inorgénicos oxidados, tales como aitrato, sulfato, CO, ete. En ausencia de O, tas cadenas respiratorias de ias bacterias anaerobias facultativas pueden acoplarse a un ceptor fival distinto del oxigeno. En bacterias anaerobias obligadas también se han demostrado sistemas de transporte de electrones. Se conocen varios sistemas en los que ta reduccion de compuestes inorgénicos esti asociada con la produccién ibn Vias EMP, IMP y KDPG (> EMP; > ED; —= SMM) de ATP por fosforilacién ovidativa, El sistema mejor caraeterizado es la reduccién de nitratys y nitritos, que se ha demostrado en una amplia variedad de especies bacterianas, inciuyendo baeterias aeobias y anaerobias Gacultativas y obligadas. La reducciénde nitrato a nitrito es catalizada por un sistema de transporte de electrones asoe1ado a membranas que incluye deshidrogenusa: transportadores de clectrones y nitrate reduetasa. ES una reduccidn desasimilatoria, también denominads respiracion de nitratos. Cuando el producto final de la resecién es nitrito, su propia toxicidad limita el ereci fe las bactecias. fin algunas bacterias, lamadas desnitrifiantes, la reduceién lege at nivel de nitrogeno motecutar. Esta desnitrificacién es lievada a cabo por algunas especies de Pseudomonas y Bacitlus, que pueden usar alternativamente la respiracién aerobic: en presencia de O, ¥ la respiracién anaerdbica en ausencia de él En suclos anzerdbicos, la desnitrficacién afecta la fentlidad. Bacterias anssrtibicas obligadas comm lag metanogénicas y las perteneciertes al género Destlfovitrio obteuen energin por respiracién ataersbica. Las primeras tsan CO, ocarbonato como aceptor fim de electrones, que se reduce'a melano, y tas itimas usen sulfato que se reduce 2 So HS. Ocras bacteras anaerobias, obligadas y facultativas, usan fumarato como aceptor final de electrones.METABOLISMO MICROBIANO La respiracién anaerébica es menos eficiente que ta respiracién aerdbica para generat ATP, debido a gue los aceptores finales de efectrones tienea potenciales de reduccién menos positives que ¢! O, Fermentaciones Como ya se ha seftalado, las fermestaviones son procesos en los que se mantiene el balance de oxideciin- rednccién, Durante Ia degradacién de hexosas # pinivato se produce NALH que debe ser reoxidado para mantener ese balance. En ausencia de aceptores externos la reoxidacién del NADH se acopla a redueciones del pimuvato 0 de sus derivados, Las vias a wavés de las cuales se proxlucen esas reacciones y los productos finales de las smismas, son caracteristicas de grupos de microorganismos ys por lo tanto, scrén analizadas en los capitulos cortespondientes. A tituto de ejemplo se deseriben algunas de las fermentaciones cuyos productos son itiles para et diagndstico bacteriolégico, como las fermemzeiones dcido ‘mixta y butileaglicdlica, 0 poseen interés dese ei punto de fa industrial, como las fermentaciones lictica, propidnica, Dotiriea, ete. Si bid nos un proceso bactariano se inchuye Ja fermentacién zlcobélica que ocurre en levaduras, por su gran aplicacién en panificacién y en la elaboracién de bebidas alcohélicas, Fermentaeién écido mixta Esta fermentacién es caracteristica de_muchas lentorobueterias y se usa como eriterio de ident Bi piravato se desdobla, con participacién ¢e la coenzirma A, en aeetil-SCoA y formato. Laacetil-SCoA se traasforma ‘en acetil-fostato , finaimente, en acido acético, E} formato puede acumularse o desdobiarse en CO, + H2, que se visualiza. como produccion de gas. Esto timo ocurre condiciones deidas por accion de uia higrogenilase formica, complejo enzimatico inducible que én aerobiosis se inhibe. Ademis de formato y acetato se producen icido Lictie por la via ghicolitic, y pequeiias eantidades de etanol. En Escherichia colt 2 gloat —y 7 ded Wetest Sida cheer een FCO, 1a acidez producida por esta fomentacion disminuye cl pH a menos de 4.5 y se revela con el indeador de pH rojo de metilo que vira del amarillo (neutra) a’ rojo (Bcido). Fermentacion butitenglieélica (butanodidt ca) Es otra de las fermentaciones més comunes que se usa como criterio de identificacién. A través de ella dos. molécuias de piruvato son decarboxiladas sara dar una molécula de acetoina, que luego sc reduce 2 2,3- butilenglicol. Esta Gltima reduccidn es lentamente reversible en medio fuertemente alcalino, ragenerando laaceteina. acetoina es révelada por la reaccién de Voges Proskauer, 135 otra pruebs diagnéstica que pecraive diferenciar, entre otros, distintos géneros de eaterobacterias. La menot acidez de los productos finales de esta fermentacién reduce 1 autolimitacién impuesta por la fermentaciéa dcida mixta y, por lo tanto, Ia producciin de gas suele ser mayor, Fermentaci6n Ui En bacterias se distinguen dos pus de ferimenvacluues gue producen lactato: la fermertacion homolactica y la heterobictic, En la fermentacién homolsctica el lactato es el nico 0 ei prineipal producto de la fermertacién. Es la mas simple de Jas fermeniaciones y es idéntica a 1a que ocuree en el tejido muscular de mamiferos, Es caracteristica de todas las especies de Pediococcus y de Sryptocaccus (entre ellos $. eremoris y todos ton estrepiocoeos. palégenos) y de muchas especies de Lactobacillus. Responde al siguiente rmecanismo: In glucosa es transformada en piruvato pot la via glucolitica, con la consabida froducciéa de 2 AT? y la reduecién de 2 NAD" por mol de giucosa. Luego el pinsvato es reducido a lactate por accion de una lictico deshidrogenasa y se regenera el NAD", Ex la fermentaciOn heteroléctica se produce una mezela de productos finales, enire los. que se encuentran lactato, acetato, etanol y CO, Es caractefstica de bacterias del enero Lericonastoc y de algunas especies de Lactobacitlus, La fermentacién heteroléctica se produce cuando fa ylucoss se transforma en piravato por une via constisuida por las primeras reacciones de la via del fosfogluconato, pero que Uutlizan NAD" en lugar de NADP*, El rendimiento energético es la mitad que et de la via giucolitica, se produce una sola molécula de piravato por mol de glucosay el resto de la molécula es transformado en acetsto (0 etanol) y CO, La fermentacidn lictca es aplicada cn Ia industria lictea yen la conservacién de alimentos Fermentacion propionica La fermentacién propiénica es caracteristica de bactrias anaerobias. La producen las especies del género Propionibacterium y algunos clostridios. Durante le fermentacién propiénica se produce une cantidad de enengia adicional a la obienida durante fa formacién de picuvato, equivalente a 1 rol ds ATP por eada 9 étomos de carbon0 G moléculas de piruvaio o lactato). Las bacterias que Hevan a cabo esta fermentacién tronsforman la ylucosa en piruvato por la via glucoltica, LLuego una parte del piruvato es transformada a propionsto a través de un ciclo que involucra su carboxilacién a oxslacetato, reduccién a succinato y una posterior carboxilacién paca originar ol propionato. En este ciclo Participan derivados acetil-SCoA capaces de trunsterr la energia adicional antes mencionads, Bl piravato que sufre las reacciones antedichas puede provenir de la glacosa, como ya se vio, pero lambicn puede formacse a partir de lactato, Es decir, que las bacterias gue Levan a cabo Ia fermeniactin propiéaica pueden crécer en un medio eon Tactato, ex lugar de glucosa, pero en este case cl ervcimiento136 SECCION 1: GENERALIDADES cs muy lento pues ol rendimiento energéticoes muy bajo. ‘Tambien puede producirse una fermentacior secundaria a una fermentacién léctica dela siguicate manera: la glucosa es convertida a factato por la fermentacién Iietien y exe lnctato sufée una segunda fermentacién a propionate, De cesta manera, te fergpentacién propiénica se usa en la indysteia quesera pafa elaborar los guess tipo sulzos. Fl CO, que se produce después de una fermertacién Lite de fa leche completade por otros microorgarismos origina los agujeros caraeteristicosy el écido propidrico fe confi saber Fermentacién alcohélica La fermentacién alcohdlica més difuneida, que fue utilizada empiricamente desie mucho antes de conocerse 2u moceniamo pars la fabricacién de bebidas alcobélices {vinos, cerveras) y del pan, es carscteristica de levaduces (Saccharomyces cerevisiae), de algunos mohos (género Pusorium) y de muy pocas especies bacterianas. En realidad, las bacterias que produeen etano! Jo hacen « través de lq fermentacidn heteroléctica. El mecaaismo de la fermentacién aicchdlica es ef sigtiente: a ghirasa es iraasformada en pirvvato por fa via glucolitica. Durante esas etapts se producen 2ATP por 210 de glucosa y se reducen 2 NAD" a NADH El piruvato formado se decarboxila 2 acetahdedido en una reaecion catalizada por una piruvato decarboxilasa (que requiere pirofosfeto de tiamina), Et acetalichide se tansforme e@ etanol por la accién de una alcohol deshicrogenasa, al tiempo que s€ reoxida el NADH originad> durante la formacién de! pinavato. Bacterias autotrofas Las bacterias autotrofas comparten Ia. propiedad de obtener a mayor parte del carbon para biosiitesis a partir de CO, o del metabolismo de compuestos de C,. La fuente de enereia puede ser ia luz foreautotrafas) 014 oxidacién de compuestos reducidos (gnimioeneotrofos). Las bacterin fotoautotcofas gerteran eneraia quimies aprovechiable » través de la fotosintesis, ya deseripta conceptialinente Bacterias quimioautotrofiae Las bactecias quimioautotofts geacean enersia por fosforilacién oxidativa (cespiracién), Compienden a las bacteriss que oxidan compuestos inorginicos reducidos, tales como H, 0, CO, sulfucos y otros compuesinsreduetdas deazufre, arionio, nitrite, Fe (If), etc., y compuesios de tales como metano, metitos, ete. Las primers suelen denominarse quimiolitotrofas y las fikimas metildtrofes Bacterias quimiolicétrofes El uso de compuestos inorginicos como sustratos de! metabolismo respiratorio esté restringido + baclerias. Aunque de escasa importaneis médica, las bacterias quimilitoautotrofes se encuentran may distribuidas en fa naturaleza, juegan un importante rol en cl mantenimiento de los ciclos del carbono. del nitrigeno y del azufre. Los diferentes sustratos inorginicos ya mencionados, son oxidados por diferentes complejos anzimsticos y diferentes vias. En este metabolisino respiratorio a tinica funcién de J oxidacion del susteato es proveer ATP, por fosforilacion oxidativa, y poder reductor. Las bacterias que oxidan compuestos nitrogenados, bociertas nitrificames, sou mayoritariamente anacrobias obligadas ¢ incepaces de utilizar compacstos orgénicos como fuente de carbone. Algunas oxidan amonio (Nitrosomonas) y otras nitrito (Nurobacter) Laoxidacién de H (Hydrogenononas) y de compuestos de azufve reducides (especies de Thiobocillus) transfiere elecirones directamenteal NAD” generandn poder reductor. Sin embargo, cuando los dadores de electrones son nitrito 0 Fe Ul. la reduecton del NAD® a partic de los miamoz es termodinimicamente desfavorable, En esos, easos Ia reduceién del NAD se Heva a cabo por medio de un transporte inverso de electrones con consumo de ATP. En Nitrobacter y en Thiobaciltus ferrooxidans se ha probado la existencia de tin transporte de electrones en sentide inverso, dependiente de ATP, acompatado de una reduccién del NAD’ Bacterias metitétrofas Obtienen energia por oxidaciin de grupos metilos unidos a un stomo distinto def carbono. Pueden ser facultativas w obligadas. A este grupo pertenecen las bacterias del metano, Conteot del metabolismo Para que las wctividades metabslicas de las bacterias se teaduzcan en un aumento ordenado de todos sus ‘componentes, que Jas leven a la division celular, el flujo de enerpia u través de todos y cada tino de los caminos mietabdlicos debe estar sujeto a mecanismos de regulaciéa. ‘esta rezulncion oper a distintos niveles: 1) regulacién de la sintesis de enzimas, 2) regulacién metabdliea general de ta actividad enzémética por los niveles de sustrate y productos. lacie de la sintesis de enzimas Regul Eu general, 1a dutuciéu genética de Ins bacterias es bastante mayor que la que se expresa en cada condicidn de ctltivo. De hecho, las bacterias poseen enzimas constitutivas que se expresah en cualquier condicién y otras, denominadas enzirsas inducibles, que sdio son detectables en presencia de sus sustratos o algunos andlogos. En otras condiciones, ‘enzimas que actlan en Vins metabslicas que conducen a un producto Gnal que no ee necesario sintetizar se allan reprimidas. Controtes de este tipo, induccién y represién, son muy comunes entre las bacteriay, En general, la induccién permite repular vies catabéticas de fuentes de carbono y energia. Fl ejemplo elisico es la ‘utilizacién del disacSrido lactosa por Escherichia coli La tepresién catabélica es otro mecanismo regulatorio, quié settia cuaniéo wna especie bacteriana es cultivada enMETABOLISMO MICROBIANO 137 presencia de dos fuentes de energia diferentes, un de las ‘cuales e3 de mids nipida disponibilided que ta otra (por ejemplo, glucosa y Iaciosa), En estos casos l metabotismo de la glucoss produce la represion de la sintesis de enzimas, inecesarjas para la asimilacién de Ia lactosa. El mecanismo parece operat através de Ja concentracién del AMP cielico (cAMP) intracelular. Dicho nivel es bajo cuando las, necesidades energéticas estén cubjertas por | metabolismo de la ghuicosa, y el sistema fi-galactosidasa est reprimido. E} agregado de cAMP al cultivo anula la represion otiinulaicly fe tauscripeigu de tus genes ue codifiean ia sintesis de las enzimas. Regulaciéa metabélica general Los nucleétidos de adenina (AMP, ADP. y ATP) son moduladarse metabslicos capaces do cegulse la economia general de In eélula, Las secuencias catabétieas contienen ‘enzimas regulatorias que son activadas por AMP 0 ADP € inhibidas por ATP. de manera que ls degradacién det sustrato responde a una necesidad de ATP. En cambio, cuando ls caren energética dela célula aumenta, las enziesasque responden a este mecanismo regulatorio disminuyen si actividad. Efecto Pasteur En bacterias anaerobias facultativas, la disponibilidad, de oxigeno molecular por ios cultivos hace que el metabolismo fermentativo sca reemplazade por Ia tespiracién acrébiea, Como la respiracién es un proceso de mayor rendimiento eneraético, se consame menes glueosa yse acnmula menos dcidos tietieo, Este fendmeno, conacio como efecto Pasteur, se debe a varios fartores, el més importante la inhibicién de In fosfofructoquinasg (enzima clave de la glucélisis) por uaa alta relacitin ATP/ADP. La inhibicién de la fosfofructoquinasa por ATPes wu ejemplo tipico de encima olostériea regilaca por un efector newativo, Biosintesis Avpestr de ladiversidad de mecanismos, toto los eaminos metabélieos vistoshasia aqui, tenen fa misma fineién comin, lade proveer precursoves e intermesiarios biosintéticos, ATP ¥y poder reduetor (cuando es necesario) para Usvar a cabo las Teacciones de biosintesis, En las bacterias, como en todas fas células tos principales productos de la biosintesis son los dcidos mcleicos y las proteinas. Las eacciones bioquimicas bacterianas que llevan tvs formacién presentan muy poes variacin con las del resto de les organismos vivos. Por este motivo, y dada la extension uc t Seovensis erin | 8) Horguitla de epliescioa Fig. #2, Duplicacidn del eromosoma bacteriano, SECCION 1+ GENERALIDADES la sintesis de las nuevas cadenas de DNA (incluyendo ta actividad comeciora). La DNA pol {elimina los cebadares y fellena los huecos en la sintesis de la cadena retrasada, ‘Ammbas enzimas participan tambien de los procesos de reparacién (rellenado de huecos por DNA pol 1) y recombinacién, Se desconoce le fencién de la DNA pol il. La velocidad de crecimiento de fa célula esté reguleda por lu frecuencia de iniciacién de la replicactén, que dependeria de la concentracién de las proteinas que ta inician, Cada vez que la concentricién de estas proteinas alcanza un determinado nivel, sein replicacién # partir del ori, aun f rio haya concluido. Entre estas proieinas iniciadoras estarian el producto del gen dnad (que se une al oriC), la RNA polimerasa, la DNA girasa y las proteinas codificadas por los genes dnaB y draC (que formen parte del primosoma} y ots proreinas no earactertzadas, Lactapa de iniciacidn es seguids nor otra de elangacién Cuando las horquitias han atravesado la mitad del cromesoma encuentran la secuencis terminadora que acta bloqueando el avance de Ins migmas. Como se ha mencionado, la DNA girasa interviene en Ia etapa de terminactén separando los eromosomas ligados, producto de la replicacida. Estrategias que intentan mantener Ia fidelidad de Ia replicacién del DNA La fidelidad de la replicacion del DNA esti preservada por tres sistemas. Dos de ellos actitan durante fa replicacién pari evilur errores. El primero involucra la seleccién del nucle6tido adecuado por la BNA pol mediante una reacctéa reversible. A pesar de que es posible insertar cualquier nuclestido, s6lo el complementarie es el energéeicamente favorecido, de manera que et muctedtido equivocado seria rechazado (reacci6n reversible). El segundo sistema ¢s el de Ia actividad correctora de la polimerasa. En realidad, la exonucieasa es capaz. de remover también nuclestidos complementarios. Sin embargo, s6lo tiene la oportunidad. de hacerlo eon los no complementarios, ya que los ‘nueieétidos mal apareados inhiben fuertemente Ia adieién del préxime nuclestido. Esa pausa en la polimerizacion permite Ia necidn de a exonucleasa. El torcer sistema aetia después de la replicacién para eomregir bases roa! apareadas que eseaparon a ta actividad correctora de la polimerasa. Por ejeruplo, en E.coli existe un sistema ezimitico conocido como mismatch repair (fig, 8-3). El sistema enzimatico esté codificado por los genes mutff, auth, mutS y mut. Un modelo propone que las proteinas MutS y Mati. reconoceri bases mal apareadas, la protefna MutH cliva el ONA de la cadena recign sintetizada et las secuentius GATC no metiladas que contienen el segmento erréneo que se descarta, y Ia proteina MuatU desenrolta esta porcién deta hélice. Las proteinas de unign a cadena simple protegen el templado que es copiado por la DNA pol. El DNA parental que sirve de templado esti protegido porque las adeninas de los sitios Dam, secuensiag GATC, astin matiladas. Este sistema corrector debe operar antes de que le nueva cadena de DNA seaGENETICA BACTERIANA en fore tere} | + ¢TaG -— T — craG F —{. leit wctae fe eraee tw ff = error = bases mal aparondas Feeanoeidss por MES 9 ML. t Mut! cori el segmesto de DNA | |, we conifene el enor { | | = | | ain | | | | eg sine banner | —GATEC — 4 — GATE | | — CTAG — T —-cTA | | {om ects atin — pst | a | Fig, 83, Sistema de eparacion mismeuch repair. ‘metilada por ia Dam metilasa, cuya funcién es identificarla como “vieja” cadena en la proxima repticacén, ‘Composicién de bases del genoma bacteriano La composicién de bases del DNA bacie determinada por métodos quimicos y fisieaquimicos, es constante y caracteristica para cada especie. Dicha composieiéa se expresa en iérminos de la fraceién molar (en porcentaje) de guaniaa mis citocina, es decir (G+ C]/ [G+C+A+T) x 100. La composicion mcluosidica de ls genomas procariotas varia enormemente:20 a 78 moles % de G + C, y esto esta telacionado con la composicién de los cadones. Las diferencias ocurren gencralmente en Ia tecera base del codén y reflejan el uso preférencial en una especie de uno 0 dos codones entre aquellos que codifican fal mismo aminoicide (redundancia del cédigo genetico). En cambio, los genomas dc todos los vertebrados, ineluyendo humanos, contienen aproximadamente 44 moles % de G + C. Debe recordarse que la similimd en el % de G+C no necesariamente sigcifica homotogia del DNA, es decir, no implies una similtud en la secuencia de bases. Namero de copias de un geu Un gen es la unidad de informaciin genética£s.J segmento de DNA, cuya-secuencia de bases determina la estructura de un polipéptido (aunque algunos genes 10 Coditican polipéptidos, sino, por ejemplo, RNA ribosomal ode wansierencia) Si erias generalmente tuna sola copia de cada gen, ef nimero de copias de un gen, cromosomal puede variar: a) segiin la posicién del locus respecto al oriC, dado que a replicacién de los eromosoxnas procariéticos circulares es generalmente bidireccionai desde el oriC, los loci eezeanes al mismo seran mas abundantes, ‘especialmente cuando el tiempo de generacion sea menor que el requerido pora la replicacign cromosomal, es decir, cuando cocxistan varias rondas de replicaciéu; ) por la presencia de una copia adicional del gen en tn elemento genético extracromiosomal come el fauior F, por ejenuplo en Ins céhulas F’; y¢) por la presenciade varias copias de cientos genes en el cromosoma, por ejemplo, existen 7 regiones altaments homloges enel eromosoms de E.coli que codifican RNA ribosomal 23S, 168 y 58 (er loci). La transcripeién de estos Joci provee 2 lus eélulas metabSticamente activas tuna gran concantracién de RNAr y, por eae, permnite aumentar el némmero de ribosomas involueradios en i sintesis de protefnas. Secuencias repetidas A diferencia de los genomas eucariotas, los genomas de las bacterias poseen pocas secuencias repetidas, y la rmayoria de la'infarmacién es codificacla por sectenctas tinleas (una inica copiu de cada gen). Sin embargo, existen [peguenas seevenctas repetidas a 0 largo de los eromasomas bacterianos que sizven de sitio de interuecion protcina-DNA. Por ejemplo, chi es una secuencia repetida de 8 pb que en E. coli y otfas enterobacterias permite Ia recombinacion homéloga. Esta secuencia seria reconocida y cortada por la endonucteasa RecBC para generar DNA de simple exdena, paso necesario para la revombinacién mediada por la ploteina Reva (vet cay. 9). Otros ejemplos son las secuencias repetidas distribuidas «lo largo del genoma, que serian reconocides por la girasa para establecer os dominios, y las secuencias de insereién (IS) que se deseriben enel item “Elententos moviles’ Estudio de genomas bucterianos Como hemos mencicnado, el andlisis de genomas bbacterianos nuestra una enorme vaciabilidad respecto al tamatig (cuadro 8-1) y al porcentaje de G + C, Diferentes, institutos de investigacién han emprendido el secucn- clamianto cornpleto de genomas becterianos. Las secuencias pparciales a totales son accesibles al dominio pablico en Sitios de [nternet como www.nebi.nim.nih.gov/Entren!142 SECCION 1 Genomielorg. html, hitp:/wwwtigrorg/tdblindex.shtmi, www.sanger.ac.uk/Projects/Microbes/, eteétera. Las renultados de la secuenciacion dei genomna completo de 30 especies bacterianas (hasta ef aio 2000) indican que no es posible asignar una funeién bfolégica deteninada a casi la tmitad de las regiones codilicantes predichnas. Porotra parte, aproximadameate un cuarto de dichas regiones codifieadoras sevign tinicas para una determinada especic bacteriana, ya que las protefoas que codificarian no presentan similitud con otras nroteinas bacterianas conocidas. Eo sugiere que noes vélide proponer un ndimero limitado de mivroorganismos como modelos bacterianos de estudio detido 3 Ia gran diversidad, Una de las ventajas de conocer fa secvencia del genome bacteciano es, por ejemplo, poder predecir ls capacidad de codificar proteinas de membrana involucradas en el transporte de nutrientes 0 en el fenomeno ce adhesion al hospedador. Las bacterias patogenas son heter6trofas y por ello necesitan sistemas de transporte de compuestos orginicos. El cultivo de un patégeno es esencial para comprender su fsiologia y para evaluar agentes terspenticos. El analisis de sccuencias codificadoras de tansportadores, en el genoma de Treaouema pallidum (agen: cause de In is. que ny oe hu pudidy ealtivas in vio) germite inferie et range de sustratos que podcia incorporar. conocimiento es un paso fundainental para dseftar medios ec cultivo y para desorrollar nuevos antimicrebianos contea este patégeno, Con respecto ai fendmeno de adhesién, ef anilisis de! genoma de patégenos he permiido proponer para muchos de ellos meeanismos de variacion éntigéniea de adhesinas, involwerades en la evasién de la respucste inmune. En muchos casos, el conocimiento de la sesvencia de un ‘gen permite predecir su funcién y es esencial para decidir €ltipo de experimento confirmatorio, La predceién se basa en comparar la secuencia en estudio cox secuencias copositadas en bases de datos que presente simititad (hitp// wnnw.nedi.nim ail. gov/BLAST). Sin embargo, no siempre dichas predicciones son fiables. Por ello, enol analisis de sgenomis también se utilizan datos estructurates obsevidos, or proiedmiea y por cristalografia de rayos ¥ de proteinas que presentan similitud con lahipotética proteins codificada por ef gen en estudio, incluyendo el plegndo y motivos esicuctutales conservados. Otros investigadores propoten, el estudio de relaciones evolativas, 0 sea, un entoque “filogendmico” El estudio del genoma ha dado paso a ctro, atin mas, ‘complicado, el de las proteinas. El término “protcoma” fie establecido en 1994 por Marck Wilkins pare designar el complemento de proteinas codificadas pore genoma. El objetivo, con respecio a las bacterias, es icemtificar las proteinas que puede sintetizar una célula bajo di Condiciones ambientales, determinar las inierrelac entre proieinas, y determivar Ia estructura trdimensional para encontrar “el talin de Aquiles® que pued: ser atacado, por nuevos antimierobianos. A nivel del “proteoma humano”, uno de jos objetives es el desarrollo de drogas contra el Gancer, qe actien Sobre proteinas praducidas por cdluias cumorales. GENERALIOADES Elementos genéticos extracromosomates Las bacterias pueden contener plismidos, profagos ‘elementos méviles (seouencias de insereion, transposones. y sistemas intearon-genes cassette), Estos elementos ‘genéticos extracromosomales no son esenciales para la Viabilidad de ias bicterias. Los profagos intervienen en a ‘ransferencia de genes por transduceién, y alguno de ellos codifiean las toxins de importantes pat6genos bacterianos, jendo responsables det ferdmeno de conversion génica (ver cap. 9). Plismidos y Episomas Los plésmiitos son mokiculas de DNA doble cadena, circulae. covatentemenie cerradas. con un peso molecular de 2-200 Bo, que llevanund pare mae pequer de le informacten genética de ta cétula. Esta intormacion en general nv es esencial pant la vida de fa bacteria, pero stele Fepresentar und ventaja bajo ciertas eandiciones de crecimiento, sto implica que ia céluta puede perder el plasmido. proceso conoeide como cura de phismido. y sobrevivie. La curs dg pltsmidlo es un.procese jimeversible {ue puede ocurrie en forma espontinea o ser provoeado ‘por agentes quimicos. como naranja de acridina. que interfieren en la replicac’in del plasmide. De esta manera, a! dividirse las eélulas el plismiddo se va “diluyendo” en ia poblaeién bacteriana hasta que casi niguna céhuia lo poses. ‘Los genes piasmidicos oodifican proteinas que son sintetizadas por la maguivaria de la vélats hospedadora, fa cual adquiere funcionesadicionates. Ejetiplos de finnciones ‘medidas por plésmides son: ta provuccivn ds factores de viruleneia (Sideroforos, (oxinas, athesings: fhetores de colonizacién), el metabolismo. d& ciertos compuestos Onginicos (degralacion de petréteo por ciertas vepas de Pseudomons son a formas de tumors. en plas, Ia fijacion biolégica de nitrogeno, la_produccién de bacteriocinas, Ia produccion de hemotisina, coagulasa, I resistencia a metales pesados divalentes (Cd, Hg. Pb, Co y Ni), ia luz UV ya fiyos especitics, y la produccida de EcoR|, ver cap. 9}, Muchos plisi mecanismos de resisiencia a autibioti intormacion ge encuentra generalmente transponibles.o tmasposones, los cuales también codificar la produceién de ciertas wxinas y enzimas de caminos metubdlieas, Los plismidos eripticos son aquellos a Jos que no se les ba podido adjudic fu kismidos se duplican en tor ‘controlan la duplicacisn dei eeomesorma bacteriano y nO son capaces de integrarse al mismo. Los episomas, e7 cambio, pueden duplicarse en forma auronoma, pero cainbién pueden invegrarse al cromosoma. bucteriano (por un fensnteno de recombinacién entre secuencius horw6logas) ¥y duplicarse junto con el resto de los genes eromosomicos. ‘Algunos tips de episomas son cazaces de promover [a transferencia de genes cromosomaies a cilulas compatiblesy, por lo tanto, conterir fertlidad sexual a las oéhulas que ics afojan (ver en cap. 9: “Conjugacién bacteriana”). El factor de fertilidsd o factor F es un episoma en E, col Dependiendo de Ia presencia o no de secuencias romélogas, sun mismo elemento genético puede existir cono episoms cen una especie bacteriana y como plismido en otea, Muchos plésmidos como el factor F (fig. 8-4) son conjugatives, es decir, pueden realizar el proceso de eonjugacién por si mismos, ya que poseen lor genes ira relacionados con Ja tansferencia (sintesis de pili, montaje del pili sexu ete.), mientras que otros se pueden transterir de bacteria a bacteria solamente si son movilizidos por un plismido conjugativo presente en Ia célila, Estos plismidos no conjugatives, pero movilizableren muchos esos, poseen regiones de DNA que contribuyes al proceso de movilizacién (origen de replicacién para la trnsferencia conjugativa) y en otros, solarnente se movilizan si se Cointegran can el plismido coajugativo (cointegracion es la union de dos plésmidos pura formar uno solo). Los plismidos que no son capaces de una trarsferencia ‘auténoms, Frecuentemente logran entrar en ous células por transduccién generalizada utilizando un vector fagico (ver en eap. 9: “TransduceiGn”), Clasiticacién Iniciatmente se intent6 elasiticar fos plismigos en base al niimero de eopias por bacteria 0 4 la fircién que codificaban, Sin embargo. estos erteriog no eran sdecuadas, ya que muchas lumciones no eran propiedad jatinseca de! plasmido, sino que eran codificadas por elementos transponibles, posibilitando que algunos plisruidos fas adquicean sin cambiar el resto de sus propietkides biologicas. Por otra part, el a‘imero de copias no aseyuraba que los genes de swanetbrencia (era) 16 ont ——s | pom Fig 84, Evqaems del mapa geastico del Inetor F. Genes ira imolicados ena sitesis de pling, ensamblaje del pli sexual ete 0717: origen de replicaciSn veyettiva el ‘Setoe F; oT origen de repliencign paca la tuansferenca coujegaivas inc: genes que goblemaa la incompatblidad: 1S: secuencias de inseridn (8, 183, 7-8) 143 pldsmidos ageupadas en una misma categoria estuvieran Suficientemente relacionados, Se denominan_pldsmidas relajados @ aquellos con miltipies copias por celuia, y dos restringides a tos que presentan una 0 pocas ‘Actualmente se utiliza el criteria de incompatidilitad: dos plsmidos son Incompatibles si no son capaces de coexissir en forma estable en una nisma célula. Los plismidos con propiedades bioldgicas semejantes no pueden coexistir en forma cstable y se los clasifica en un mismo, ‘grupo de incompatibilidad. Para explicar el fendmeno de incompatibilidad, es necesario analiza los mecanismos de replicacion, reguiacién de la replicacién y particién, que aseguran que ua plismide pueda ser hecedado en forma estable por las bacterias que se estin dividiendo. Replicacién: todos los plismidos utitizan sistemas codificados por ls eéluls hospedudora, ya que la informacién genética necesaria, par sy replitacion esta codificada por 2 pequefio replicin bésico ée 1-3 kb. En el caso del factor , este replicén bisico contiene: el origen de replicacién pura fa_translerencia conjugativa (ori7) y el origen de replicacion vegetativa (or?¥) (fig. 84) el gen repE, que codifica ta proteina E que interviene en la iniciacién de la replicacién y también aetia como represor; y los loci incB. e inc€ que le eonficren caracteristicas de incompatibilidad. Fstosiltimos loci poseen secuencias de19 pb que-se repiten 4 veces en incB y 5 veces en incC. El operador del gen rep posee una Secuencia de bases similar a ia secuencia repctida de 19 pb presente en 10s loci inc# € ine Regulacién: La regulacién de Ia replicacién.del factor F se basa en la concentraciin de ta preteina E disponible. Esta protefna es indispensable para la replicacion, aunque no se conoce su modo de accidn y, ademas, tiene afinidad por las secuencias mencionadas de 19 pb. Existen dos sistemas de regulacién de la concemtrasién de la proteina E: a) por unién de la proteina E que aetia como represoral perador del gen repE se inhibe la expresién del gen y por Io tanta, eu penpia hiosintesis (ver *Regulacién de la expresin génica”); y b) por unidn de fa proteina E a las secuercias afines en ineB e ireC dismiauye el ndimero de moléculas disponibles para ser utilizadas en la replicacién (tig. 8-5), Conociendo este sistema, se puede inferir su relacién con el fendmeno de incompatibilidad. La regulicién de la replicaeién tiene como consecuencia que unia especie dada ée plismides posea un nimero de copias constante. Si en una misma célula existen dos especies de plasmides que compurten un mismo sistema de replicacién, ef 0 tos regulatlores no dircrininanin cntre ellos y se regularcin como si fueran una especie tinica. 4 medida que las bacterias se dividao, se ird perdiendo ura u otra especie de plasmido hasta cue existan dos poblaciones de bacterias tuna con una espkcie y otra con la otra especie, “Mecanismes de particién de pldsmidos: La existencia de un mecanismo de particion de plésmidos, en especial para los de bajo nimero de copias, fue sizerida por sl hecho de que dichos pasmidos luego de la division celuler se jeren en forma estable a las célulss hijas, es decir se heredan, Exisien en la membrana plasmitica bacteriana144 SECCION P sitios especificos a los que se pueden unir determinada especie de plasmido antes del proceso de division celular. Estos sitios estint especialmente disiribuides de modo tal gue por lo menos una molécula de plastnide se transmita 9 cada céluia hija, En el fancionamiento de bbs sistemas de particiéa participan compooentes codificados por la célula y por el plismido, Proteinas codificadas por el plésmido ‘ctuarfan asociando la mofécula del phismidy con proteinas de‘tos sitios especificos de la membrana sitoplasmatiea bucteriana, Los mecanisimos de particidn estén relacionados con el fendieno de incompatibilidad. Si dos especies distintas de plésmidos compurten un mismo sistema de particéén, fos sitios de la membrana no diseriminarén las dos especies de plismidos, las que se particonardn como na especie tinica y, como consecuencia, a medida que las bacterias se dividen, se perderé una u ora especie de plasmido en cada bacierta Factores bacterioeinogénicos Una _variedad de hacterias alberga_element ‘cromesémicos (lactores bacteriocinogénicos' que producen protefnas bactericidas denominadas Aacteriociats Las bactesivciuas s¢ whist! a sitivs eseieoespecificos cn Ia superficie bacteriana, y la perturbaciin metabélica gue producen difiere enire los distintos tipos de bacieriocinas (cesacién de la sintesis de DNA, RNA y proteinas, cesaciOn de la respiracién celular 0 filtetén celular) {La eétula hugsped no es destruita por le bacteriocina, ya que el plismidy tambica codifica una poteina que ke ‘onliere iamunidad. Las bacteriocinas mis esmidiadas han sido las calicinas (producidas por £, colt), de his cuales existe una gran variedad. Algunos factores. bacterioe andiogos al factor F, codi propia transferencia por €0 wogénicos parecen ser sexual y promueven sit GENERALIDADES Algunos Tactores coticinogénicos son capaces de promover la tonsferencia de genes del huésped mientras que otros, incopaces de transferencia auténoe, necesitan la ayuda del factor E. Los factores bacteriocinogénicos representan una ventaja ext I supervivencia, impidiendo la colonizacién de nichos ccoldgicos por microorganismos inteuses Analisis de plésmidos con enzimas de restriccion La wlilizavién de_enzimas de restriectén de tipo It {endonucleasas de origen bacteriano que actiian sobre ‘determinadas secuencias de DNA con simetria bivalen ver cap. 9) ent digestion del DNA plasinfdico permite obtener fragmentos de DNA de diferente tamaio, que ppucten separirse por clectroforesis en geles de agarosa Pos tmgaientos, eargados negativarmente dcbido a 10s grupos fostaio, migran hacia ef elecicodo positive con una velocidad inverssmente proporeional al logarimo de su peso molecular. Los fragmtentos dol mismo peso molecular forman una banda estrecha que puede ser visualizada suumergiendo el gel ea un coloraite fuorescente, como el bromuro de etidio, y exponiéndalo « fa luz ultravioteta Urilizando diferentes enzimas do resirieeién, en forma separada y/o en combinacién, se generan distntes sets de Fagmentas que permiten deteriminar el mapa del piasmido, Resistencia transmisible a drogas. Factor R La resistencia a miéitiples antibidticos se produce, por ejemplo, por la adquisicidn de un elemento extra- cromosimive conocido como factor de resistencia (factor R). Muchos factores R de. bacterias Gram negatives son conjugatives. Existen, dos unidades foacionalmente distintas dentio dal factor R: uns ¢5.la unidad de, factor sexual 0 “factor de transferencia de resistencia” (RET), | mis | repo perder iin) prcvina E | Fig. $5, Reyulacisn deta replica del pismo F (se fexctip. lc Uni a seeuerelas tomfne al open dor = redaccion de ta conssiracién de resin E Lo 8GENETICA BACTERIANA que coatiene Ia informacién para la replicacién auténoma + la transferencia conyugal con formacién depilis sexuales, ¥ In otra es una unidad que especifica ta resisten antibiticos, denomineda “deverminante-r” y que general- mente se encuentra contenida en elementos genéticos conocidos como transposones. Estas cos unidades funcionales pueden asociarse o disociarse por rcombinacion 2 nivel de secuencias de insercién. Ours factores R de enterobacterias no son conjugativos y son movilizados por plsmidos conjugativos presentes cn la mista célula o por fransduccion, Muchos plasmidos que eonticten resistencia 2 bacterias Gram positivas no son conjugativos y se transfieren mediante un vector viral (teansducci6n), por ejemplo, los plismides de penicilinasa de Sphylococcus Elementos méviles Las secuencias de insercion (1S) y los tramposones (Tn) son unidades gencticas discretas que wlilizanel mecanismo de-recombinacién ilegitima para insertarse 2n numerosos sitios de diversos replicones: fagos, plésmidos 0 el cromosoma bacteriang, Su insercién en_un gen_aliera ss ‘2enersidn yan nlgunes.eatas {ale gonex distal. as, sé 8 de insercién poseen entre 800 y 1400 pb, presentan_secuenctas ferminales cortas (10-40 pb) repetidas e invertidas: IR, conocidas como ¢xtremos palit inverso en cl extremto opuesto de la misma caiena 3 S'); y poseen informacién para su propia tansposicién (fig. 8-7A) Los transposones posecn, adem's, un caricter asociude, por ejemplo, resistencia a antibidticos, por lo q) tambiéa se los denomina transposones corpuestos. Los transposones son fragmentos diseretos de DNA que tienen Ja propiedad de “saltar” de una posicion a our dentro de un mismo replicén o de un replicon a otto (de una especie plasmidica a ota o al cromosome bacterianoy viceverss) Fete proceso se produce por un evento de Reombinacton ilegitima (ver cap. 9) que iavoluera, para la mayaria de tos transposones bacterianos, una duplicavién demodo tal que el transposon no se pierde de su sitio orginal. Este mecanismo tiene una enorme importancia en ladiseminacion de la resistencia bacteriana a antibisticos. La relacién conjugativa promiscua que existe entre las erterobacterias es atenuada por la incapacidad de ciertos pldoridoo de establecerse en forma estable en células que alberguen plasmidos del mismo grupo de incompatibiliiad, y por la capacidad de las bacterias de‘hidrotizar ENA extrato mediante enzimas de restriceién, Estas bareras para la adquisicién de resistencia a antibiéticos pueden ser superadas por la translocacién de transposones desde el plasmido invasor al cromosoma o @ un replicén que se hubiera establecido previamente en la célula receptora. Este mecanismo de translocacion también puede superar barreras de rango de huésped como se ejemplificaen figura 8-6, donde se representan 3 especies bacterianas y 2 especies plasmidieas. Una de las bacterias posee un flismido que ‘clue en suestrucruraaur transpesén y, por :onjugacion, dicho plasmido es transterido a la segunda especie _replicarse, 5€.3 14s bacteriana, Sin embargo este plismido no es capaz de existir en Ia tervera especie (rango de hvésped). De todos modos esta ditima bacteria puede adquirirel trensposén siéste sala al cromosoma (fig, 8-6 A) si enalgin momento un segunda plismido, que st es capaz de existiren ella, se hace presente en la primera bacteria y mediante el’ mecanismo de trensposicién adquiere el transpossn (fig. 8-6 B). Como ejempio de transposén se esquematiza el Tn3 (Big. 8-7 B), que presenta en los exremos dus secuenvias pequeftas de DNA repetidas ¢ invertidas (IR), esenciales para la transposicién, posee dos genes que éodifican las enzimas: transposasa (Tnp A) y resolvasa (Tap R). ¥ otro gen (bla) que codifica la enzima S-lactamasa, capaz de destruir el anillo f-lectimico de la ampiciline y otras penicilinas inactivandolas. EL mecanismo de transposicida involucra.los siguientes. pasos. la transposasa.reconoce Iz sceucnete blanee del replied sceeptor y las IR del Th ¥ ‘efeesia cortes de cadena tinica, Este tipo de recombinacién se denomina ilegitima, porque ¢s especifiea de sitio sélo para la molécula dadora (IR) pero ocurre al szar en secuencias relativamente mo especificas en la molécula receptora (sectencia blanco). Los exiremos libres del Tn invaden el replica receptor ya partir de las cadenas parentales del Ta, que se exponen como cadenas tinicas, se sinttiaan nuevas eadenas de Tn3. La funcién de repicacién es provista por la eelula hospedadora (DINA pol y ligasa). Se forma un cointegrado en el que las moléculas Gadora y receptora se halla covalentemente enidas ligasa) con una molécula deTa en eada extremo de la unidn, La resolvasa teva acabo ta resolucién del ecointegrado mediante recombinacign entre las copias de Tn. La nxolvasa se une a Tas secuencias cortas, seettencias 7s, de arnbos Ta que # helm alineadas en el Jo, La resolvasa (Tp R) también actia como represor intesis de Tnp A, cumpliend una funcién ceguladora. La transposiciéa origina kt duplieaciSn de la secuencia blanco del receptor en la que: se inserta el Ta, En ta figura 8-8 se eiemplifica la transposiciéu replicativa de Ta3 desde un Plasmnico a cromesoma bacierlano, Otcos transposones confieren muldiresistencia, por ejemplo @ ampicilina, estreptomicina, tetracielina, cloran- enical y sulfonamidas, Los transposones tambien codifican toxinas (Tal68! codifica la toxina estable de £. coli) y cenzimas catabsiicas (To9S1 poseeel operdn tac y contiere Ia posibilidad de degradar lactosa a cepas de Yersinia enteracolitioa). Bxioton otros. transposones. como T310 (Coditica resistencia a tetraciclina) que “salian” sin cinden de un replicin para pasar a otro. ‘Otros transposones son con/ugatives. Esios filtimos pueden escindirse del cromosoma genersndo un intermediario circular no replicativo, ¢ indueir Is conjugacién entre dos bacterias y su propia transferencia, peromno se ha observado latransferencia de zenes cromosSmicos. Estos transposones, como Te916 (codifica resistencia atetraciclina), particjpan cen Ia transmisién de resistencia a antibisticos en los estrep- tococos. Algunas bacteriasutilizan elementos transponitles, gue provecan.rearregios en el DNA, para regular ciertos zenes: la variaciOn de fase de Salmonella typhimurizon, que puede expresar antigenos flagelares #41 0 H2, depende de la brientscion de un elemento transponible adyaceste al gen de146 SECCION 1 GENBRALIDADES Bastevia tt C4 — cromosomaplasmigo | ‘oon Ts Bacteria E Sips se pueda pliase EL Tr “sala” af cromosomna B paca 1 queadeatibelpimigo2 pacer clanranaTna] pie 2 pismido 1 con Tn ¥ El pldcmido 2 adquiee el Ta Qagelina, Ademis. como se discuticé mas adelante, Ia ‘ransposietén de elementos mBviles tienen yfertammengininn Se an detectado clementos transponibles en eucariotas be hecho, fueron descubiertos por Bérbara McClintock, quien al estudiar el maiz encontré que estos elementos a s ndviles eausaban cambios fenotipicos, ya que su inse | ‘en un gen producia ia inactivacién de! mismo, por ej. en el gen asociads al color. Este descubrimiento no fuc comprendide en su época, pero le valid un reconocimiento [etl prem Neha eles 1s renee Cs jos hia derecia’o ca levaduras (elementos Ty) y en el cromosoms de Drosophila. Por lo taxto se sospecha que estos elementostransponibles sean una caracteristiea general del DNA, Integrones y genes cassette Por iiltimo, ios genes cassette son pequefos elementos ig. 8-7 A) Secnoncia de inssreion cpscinacin del toniposse los gene = ‘Ti. ik’ socoenciar repens « Inve, ops couites in tiles (260-1500 pb) que geaeraleente se encuentran denico de inteapnes, muchos de los euales son fransposones Uansposasa; inp = cociica ia resolvasa: bla = en que coer ia enti Practarasa, delectivos o renanentes, o son parte dz transposones. LosGENETICA BACTERIANA plisado om elena re eo te Transposasa it 1 = Ly J) glsoiccets t bacteriano | tt Nee i Tb jtuxoy ligaments = SS | fem? rf vA | Soateoe tf vw | aaa’ dt Loy 2s CHEH | scion Maes 7 Tw integra Fig, 8-8, Transposicgn espleativa de Tad deve un pllsmido al croinosoma bacteriano (200) sex integrones pueden estar jocalizados en el eramosoma o en plismidos. Los genes cassette son segmentos de DNA Girculsres no replicatives que contiencn gexeralmente un solo gen de resistencia aun antibidtico y un sitio de Fecombinacién o elemento de 59 bases (59-be). Se integran por recombinacién especifice de sitio (ver cap. 9), conservativa, en un sitio aitl del integrén eereano al gen ue codifica ia ietegrasa Intl (similar ala integrasa del Fago 4). Los integrones codifican la integrasa Toth, responsable dela captura de genes cassette, y peseen un primotor fuerte que permite I expresidn dichos genes. (a inlegrasa es capa7 de capturar genes de resistencia y. tambien de liberarios. 147 Cointeyrado: sesuencias res alixeadas ja Sanco dopliada. Los integrones pueden contener varios genes cassette, cya expresién depende del promotor del integron, generindose nuevos operones. La importancia de los sistemas integrén- genes cassette, transposones y plasmidos en la diseminacion de genes de resistencia entre bacterias mediante wansferencia horizontal se discute en otro capitula, El gen y su expresion El conjunto de genes se denomina genoma. Cada gen puede exitir en varias formas estructurales 0 alelos; 103 dalelas presentes en ind célula constinsyen su genotipo.La148 SECCION 3 10 determina las propiedades expresion del genotipo deter esiructurales y fisiolégicas de una célula, que consti ‘su fenotipo. El genolipo se designa con 3 letras minésculas seguidas por una letra mayéiscula, todas en cursiva, para indicar el ‘en. El fenotipo se designa con 1 letra maytscula seguida de dos letras mintisculas, con un signo mis ¢ menos como superindice para indicar la presencia @ ausencia del earicter. Por ejemplo el gen rec codifica Ia protcim: RecA, y las cepas que sintetizan esta proteina son RecA La expresin de un gen implica. Jos.procesos_ de transcripcién y traduccion (fig. 8-9), El genes transcriplo poruna RNA pol DNA dependiente, que utiliza nna cadena de DNA como molde y que no requiere ebador. Los sustratos de esta enzima son ribonucledtidos trifosfato que contienen adenina, uracilo, guanina y citocina Las bacterias « poseen un solo tipo de RNA pol para sintetizar la tres clases de RNA (RNA mensajero, ribosomal y de varsferencia) La enzima tiene dos subunidades: el vore y elfactor sigma La RNA pol con su factorsigma (holoenzima) se une a una secuencia de DNA llamada promotor para initia la sintesis de un RNA mensajero (RNAm), luego el fa:tor sigma se separa y ta enzima continda el proceso hasta zncontrar una secuencia de terminacién en el DNA. £f ediligo gendtico es universal y se lee como secuencias de tres bases en ef RNAm: codones. El cédigo es redundante porcue existe mais ‘de un cod6n para cada aminodcido (excepto para tiptofano ¥y metionina). Por ello, un cambio en la tereera base no necesariamente implica un cambio en el aminodcido codificado. Existen 64 codones, de los cuales 61 codifican os 20 aminodcidos y 3 son sefiales de terminacién (codanes stop). ‘A medida que se el RNAm, se le uren ribosomas para iniciar 1a raduccidn. La traduceiin pure dividiese en tres etapas: iniciacién, elongacién y terminacién. Estas ‘tapas requieren la participacién de distintos RNA de transferencia (RNAS). que transportan zminoacidos activados, GTP y factores de traduccion. Cada RNAt transporta en su extremo 3° un aminoseido especifico. La especificidad de la unidn se debe a la accion de las aminoacil-RNAtsinterasas. La incorporscién de 103 aminodeidos correetos se logra por Ia complementaridad Transenpeisn duecién DNA, —— (-) RNAR Fig. #9. Flujo de inormacién desde el DNAs tas proteinas GENERALIDADES de bases entre el triplete del RNAm (codén) y el del RNA‘ (anticodén). Para leer €| cédigo genético no son necesarios 61 RNA\, ya quealgunos pueden leer més de un codén que codifiqué el mismo aminodcido. Esto se logra por el balanceo que es permitido en el apareamiento de la base que ocupa la tercera posicién en el codén. El proceso de traduceién comienza con la unién de la subunidad ribosomal 30S al extremo 5" del RNAm, la subunidad menor del ribosoma reconoce al codén AUG que codifica para N- formil-metionina (este aminodcido es el inicial en la gran mayoria de los polipéptidos de Ia bacteria, pero una vez finalizada la sintesis puede ser separade del extremo amino~ terminal 0 puede removerse el grupo formilo). Luego, el RNAtE-met se une al codén del RNAm y la primera etapa concluye.eon la unién de la subunidad 508. Existe un factor de iniciacién (IF3) que posee una funcién de disocfacién de ribosomas, esta actividad asegura un pool de particulas 30S para iniciar la traduecién, neutralizando Ia tendencia espontinea de las subunidades 30S de unirse a las 50! Luego este factor es liberado para cue se produzea la unién de la subunidad 50S. Durante la elongasian se incorporan en forma secuencial los aminodcidos a la fmetionina y la sintesis progresa hacia el carboxilo terminal. El ribosoma presenta dos sitios para la unidn de los RNAI al complejo ribosoma-RNAm. Elsitio 4 0 acepior es el sitio que acepta al nuevo aminoacil-RNAt, cuyo anticodén reconoce cl codén del RNAm, El sitio P 0 peptidil Neva la cadena ereciente del polipéptido (pepticil-RNAt). Las uniones peptidicas las cataliza una proteinade la subunidad 50S. la ‘peptidil transferasa. Una vez formada la unién, el ribosoma ‘se mueve a lo largo del RNAm hieia el extremo 3° y asi cada codén pasa del sitio A al sito P, dejando un nuevo codén disponible en el sitio A. El RNAt descargado es liborado y reutilizado. El proceso continta hasta que el complejo ribosoma-RNAm Hega a ua secuencia de terminacién (codén stop). Los eodones stop no ticnen RNA complementarins, no pueden ser leides, pero son reconocidos por los factores de liberacién. Entonces, ef péptido se libera y se disocian los ribosomas y el RNAm (ig, 8-10), y los elementos del sistema de traduecién pueden iniciar ia lectura de otro RNAm. Los RNA ribosomales de transferencia son estables, mientras que la vida media de los RNAm es de 2 min. en E. cali Regulacién de ta expresién génica ct 1c muchas proteinas en forma cconstante ¢ condiciones del cultivo. Ejemplos de proteinas.constiauivas son las enzimas que participan en caminos metabélicos esenciales como la {glucélisis y proteinas esiructurales. Su sintesis parece estar bajo escaso 0 ningun control, salvo el de la velocidad de crecimiento de Ia eélula. En cambio, Ia sintesis de otras proteinas que son necesarias s6lo bajo ciertas condiciones {de cultivo estéregulada pura preservac recursos metabslicos, La requlacidn tiene lugar a nivel dea transcripciéa o de la traduecién. La regulacin anivel de la waductién es menos utilizada por las bucterias. Dicha regulacién se logra mediante a) laGENETICA BACTERIANA, ALINICIACION B- ELONGACION lg. NAG BNAm ste Hoke Fig, 840, Tradvecidn formacién de puentes de hidrégeno intramotecalares entre secuencias de bases complementarias det RNAm {atenvacién), 8) protefnas que se unen al RNArae impiden la taduceién, y ¢) por el procesamiento y degradacién controlada del RNAm. Las._proteinas. cu regula a rivel de Ia transcripeién son es orgenizados en win ‘operén, Un opetén consiste en un sitio. prom : operador adyacentes a los genes esiructurales, y un_gen regulador que puede estar Situado en cualquier lugar del eromosoma. gulacion, asa en ta dor oper y proteinas reguladoras que actian como represoras.0 activadoras de la transcripcién. La actividad de estas Proteinas alostéricas esta, modulada, a su vez por compuestos de bajo peso molecular que Sefalan el estado Fisiolégico o ambiental de la bacteria. Estos compuestos pueden ser inductores (induecién enzimatica) 0 Sorrepresores (represién enzinvitica). Como ejemplo de enzimas inducibles citaremos las necesarias para metabolizar lactosa, organizadas en el operdn lactosa, que ‘esintetizan en ausencia de glucosa y, presencia del inductor (eloiactosa). En cambio, Iss enzimes necesarias para sintctizar arginina (biosintesis de un aminodcido) se regulan ot represida por producio final, ya que la transeripeidn es reprimida en presencia del aminoscido (correpresor, ¥ 3610, sou sintetizadas cuando ls arginina no esta presente ca el medio de eultivo. El represor se sintetiza en forma constitutiva y puede existir en una forma activa que es Ia que se une al operador y en una forma inactiva (pierde afinidad por el oyerador). El represor del operén lactosa se intetiza en fortma activa (es inactivado por el inductor); mientras que el presor involucrado en la represin de la sintesis de un aninodcido es inactivo hasta que se une al correpresor (Fig. 8-11 A). Resumiendo, la organizaciOn de los genes de una via ‘metabéliea en ut operén permite regulir su expresién en forma coordinadh a través de un solo operador,150 SECCION 1+ Operén lactosa y represién por catabolitos ‘Los genes éstructurales del operén lactesa.codifican 1a B-galactosidasa, la galectésido permeasa la galactésido, ‘ransacetilasa. Cuando el represos, coditicado.por.cl yen lel, se une al operador, impide la union de ta RNA pol al promotor, bloqueando 1a transcripcién de los tres genes estructurales. En presencia de lacfosa en el medio de-cultivo, se forma alolactose por accién de la.f-galactosidasa (presente en bajo nivel ea forma constitutiva,no inducible) La alolactosa es el inductor natural que se une al represory produce la pérdida de afinidad por el opendor, liberando el promotor a partir del cual comicnza la transcripcisn, Sin embargo, si en el medio existe ghicosa, € operon no se transcribe debido al efecto glucosa 0 represién por catabolitos. Una consecuencia de este efecto es el crecimiento diduxico en presencia de glucose y lactosa (fig 8-11 B), Le bauteria utiliza priwsero la glucose, vuumuy ein se agota cesa Ia represidn catabélica y se induce ta transcripcién del operén lactosa, El tiempo nevesario pare Promotor det gen regulador pen regulador fy + represor inactive cerrepresor (errincdcidos) Pig. SA , Diagram de un operon. Reguacién de Ia expesidn génica ca + @ = ao inductor sev (ala lactosa) GENERALIDADES dicha induecién corresponde a la fase lag de latencia que se observa antes de comenzar Is utlizacfon de la lactosa ‘eomo fiente de earbono y energia. En Teguladora activadora, le profeina recept 3,5'-monofostate ciclice (AMPe) 0 proteina.activada por ‘catabolite (CAP),e implica una jnteragei6a con el promstor. ‘Cuando CAP se une al AMPc es capazde uuitse al DNA ex un sitio anterioral promotor permitiendo ia union de fa RANA pol al mismo. Cuundo ta bacteria metaboliza Is. glucosa, el nivel de AMPe es bajo y el operén laciosa no se transcribe, En resumen, para que se (rans:riba el operén lactosa $= necesita un nivel suficiente de AMPe, para que el complajo activador CAP-AMPe se una al DNA, y la presencia det inductor (alolactosa), para que el represor no se uns al ‘operador, ‘Mutacién y variackin genes estructurales 1 2 3 Molécula efectora inductor 0 eorrepresor) fii la trauseaipeioas Al- Regulaciéa de la sintesis de | enzima inducible A represorinsetivo, no se une al operador y los genes se transcriben A2- Regulaci6n de la sistesis de | aminoacido. B ‘epresor activo, se une al operator inhibe la transposicionGENETICA HACTERIANA srechoiemo ‘rliznado dactosa log UFC/mt Tia glucosa se ha eoastmido Fly. AL B . Crcciaiomto diguxico, Las nnuaciones y los mecanismas de recombinactén proveen las bases de ln variabilidad genética sobre la que ‘operan las fuerzas de la evolucién 0 cualquier cambio provocedo en tas condiciones ambicataies (seleccién). A pesar de la baja frecuencia de mutaciéa y reeombinacién en cada cielo celular, los eoctes tiempos de genemeién hacen que ningiin cultivo sea genéticamente puro y que cualquier cambio en el medio pucta ser selective para un éeterminado mutante, originando un cambio en ta poblacign en lay posteriores generaciones. La recombinacion se analiza en el capitulo 9. Se define como mutacién cualquier atteracion permanente de ta secwencia de bases det DNA (cambio genotipico), aungue esta alteracion no terga efecto fenotipico detectable. Las mnutucianes so. cambios hereditarios, pasan de una generaci duplicacion semiconservativa del DNA. necesariamente es ua proceso sin salida, ya que existen ‘mecanismos de reparaciéa. Pero si ls m puede reflejarse en un cambio eoneomitante en alguna propiedad de la cétula: requerimientos untricionales, rmorfologia, composicidnantivénica, vin aantbidticos, tacteridfagos, hz UV, Las mataciones pueden ocurtit ¢: pueden ser inducidas poi o iadrsctamente prover DNA. La frecuencia de mutacion espontinea es baja y se produce con una probabilidad que oscila entre 10° y 10" por organismo (una bacteria de cada 10° 0 10"tent ‘mutaci6n). Estas mutaciones se atribuyen principalmente a crores al azar det sistema de la DNA polimerasa durante la replicacién del DNA, errores que no legan a ser corregidos por la actividad exonucleasa de la enzima que actia come revisor de pruebas, AdemAs, muchos productos © intermediarios del metabolismo son mutagénicos, incluyendo peréxidos, dcido nitroso, formaldehido y analogos de las purinas {mutégenos endéxenos). Los mieroorganismos con earacteristicas alteradas, debidio a Ia baja trecuencia dé su aparicién, son dificiles de 1st detectar en ausencia de ambientes que les permitan ‘multiplicarse, con preferencia a ie abramadora mayoria de las células no mutadas o salvajes wild pe. Sin embargo, un mutante resistente a antibidticos puede ressmplazar ripidamente « uns poblacion de células susceptibles cuando el inhibidor esti presente en el medio (seleccién). El ntibidtico es el agente que permite seleceionar al mulante preexistente, pero nv es el responsable de la aparicién de! mismo, La prueba de fluctuacion d2 Luria y Delbrtick demosin’ que fas martaciones ocurren al azar y no son determinucdas pur lus condiciones selectives, En general hay cuatro tipos de alteraciones que se producen en la secuencia de nuclestidos det DNA:1) deleciones. pérdida de uno 0 més nucledtidos; 2) inserciones 0 adiciones, adquisicion de uno o mas nucledtidos; 3) transversiones, sustitucin de una purinst por una pirimidina o viceverso: 9 4) ‘ransiciones, sustitucién de una purina por otra purina ode una pirimidina por.otca pirimidina (fg, 8-12). Las mutaciones que resultan de alteraciones que involucran a una sola base se denominan, mutaciones puntuales: mutaciones por reemplazo (trasiciones y {ransversiones),_ microdeleciones y mieroinsesciones. Otras mutaciones involucran ségmentos de DNA: macroinserciones y macrodeleciones. Los efectos de una mutacién sen potencialmente ilimitados, Pucden atectar a las propiedades del DNA respect de su funcida duplicadera asi como a ia {ransterencia de informacién, La mayor parte del DNA esta involuerade en la especificacién de la estructura primaria de protefnas, esto implica una gran progabilidad de que las ullcracivwes en la sccuemia de uutlebtidos se expresen como altcraciones en las proteinas, ramen ‘Bemplo: set of par Tea, T es sustuido par C, en In repicacién se origina al per 8 Fig, 612, Tipor de sustizaciin de nuclestidos El mensaje codificado en el RNAm debe leerse como una serie de triplets (codones), por lo tanto, es deleciones y las inserciones provocan un corrimiento del marco de lectura (lig. 8-13) y tambiga generan codones sin sentido que provocan una terminacion premetura de la cadena polipeptidiea. Esto conduce a la inactivacidn del producto ‘génico. Los codones sin sentido, cuando se ubican en moléculas de RNAm policistrSnico (que coditiea 2.0 mas, proteioas), pusden tener un el¥eto pleiotrépico (afectan @ is de una carieteristica fenotipica), Estos efectos son152 polares cuando provoean una disminucin en le expresion de los genes distales y serian eausndos por li terminacién de Ja cadena polipeptidica incompieta y la consiguiente disociacién ribosémica que provoca una disrainucién en la velocidad de iniciacin de la traduccién del gea siguiente en el RNAm policistrénico. Debe recalcarse’que las deleciones" y las inserciones pueden corregir mutaciones _genctadas previamente por desviaciones de] marco de lectura Las transversiones y Iss transiciones tambien pueden provocar mutactones sin sentido, peto es mayor la probabiiidad de crear musaciones con sentido equivocado (por cambio de sentido) en las que se altera el triplete del cédigo, de manera de especificar un amino‘cido distinto, del normalmente ubicado en esa posicién a la proteina. Las alteraciones pueden variar desde ia inactivacién (otal Gena enzima asa ios cambios mis sutles er su capacided catatitica, Las muiaciones con sentido cquivacedo tant pueden dar lugar a productos génicos termorensibles, por ‘ajemplo, alterando la unién interna de unz proteina de manera tal que su estructura secundaria o terciaria sea compatible con su funcién biologica a termperaturas bajas, pero noaltas, La temperatura elevada induce cambios et Ia conformacién que son incompatibles con le funcién bloidgica y estas mutaviones se denominan condicionales, Por tiltimo, las mutaciones por reempiazo pueden produ mutaciones sitenciosas al codificar el mismo aminosciéo por alteracién, generalmente, de Ia tervera base del triplete (los codones GCU, GCC, GCG y GCA cadifican para afanina). Ineluso puede no haber cambios cetectables, un aminodcido es sustituido por otro de propiedades similares (giotamato por aspactato). ree UY OT ayn ara soe * OTA TAQ TA Mutagenesis intrinseea y secuencias de insereién La frecuencia de mutacin espontines puede aumentarse por alteracidn de los genes mutadores (mu). Por ejemplo, en E. coli existen at menos seis loci genéticos distintos dentro de los cuales una matacién aumenta la frecuencia de mutacién espontines. Se cree que muchos de estos loci mut estin normalmente involucrados en la replicaciéa, reparacién y recombinacién. Pur cjemply, et gen que codifica Ia actividad exonucleoltica de ta DNA polimerasa ff que etimina bases mal apeseadas y los genes que codifican, al sistema de correccién conocido como mismatch repair. ‘Un mecanismo adicionel que provoca una inaetivacién éniea es la insercion de sccuencias de nuclestidos extrafias Centro del gen. Se sabe que una gran cantidad de rmstaciones espontineas se generan por éranslocacién de secuencias de tnsercion (IS, que son constituyentes normates de los, cromosomas y phismidos) de una regiOn de un genéforo (Gromasoma, plismido) a otra rogién del mismo o de otro ‘gendforo. La capacidad de translocacién de tas secuencias de insersién seria también eespontahle de reordenamients en ¢l eromusoma: duplicaciones, inversiones y deleciones. Ademds, muchos fenémenos de insercién y escisién de clemenios extracromosoraates ocurririan por reeombinacién de segmentos de DNA flanqueados por IS. Muchas de estas alteraciones no persisten debido a ‘un meeanismo de correceién de errores que contcibuye a la fidelidad de la replieacién, como el mismaich repair, y a mecanismos de reparacion que se analizaréy posteriormente, El mecanismo de mismateh repair también es responsabfe le restingirla recombine ‘Norm salve comisinla del maze © x 2. e Ehtbar eat | OTAQTAOTA eit | Fig, 8:13, Adiciones, delesiones y sus “ones en la secuencia de nuclebtids del DNA.de trensferencia de genes cvando existe un 10-20 % de ivergencia entre el endo y el exogenote, sregurando ta conservacién de caracteres en especies divergentes Cuando este sistema opera ante la beter-cigocidad ceasionada por alteraciones que originarfan nutaciones o por el proceso de recombinacisa, puede der lugar a la eliminacién de ia cadena alterada 0 de In cadena parental (ver cap. 9). Eyidentemente, s6i0 en el primer easo logra mantener Ia fidetidad de la informaci, Mutagénesis indueida La frecuencia de mutacin puede ser anmentada significativamente por Is accién de agentes mutagénicos que pueden ser de naturaleza fisica 0 quimrica. Heros meacionado que gran cantidad de mutaciones espontineas se generan por translocacién de secuencias ée insercién, ‘este mecanismo es Ia base de fa mutacin por mutdgonos bioiégicos. Agentes fisicos Los mis prominentes son ta Itz ultravioieta (UV) y las radiaciones de alta energia. El efecto primario de tas radiacioncs UV sobre el DNA es la produceiét de dinero, de pirimidina con formacion de un enillo de siclobutano. Estos dimeros son estables y se forman principaniente entre pirimidinas de una misma cadena. Las nutaciones provocadas por la radiacién UV no sor causadas, Jdirectamente por los dimeros de pirimidinas, sino que son cl resuliado de uu proceso de reparacién postreplicativa proclive a errores (ceparacién SOS) que se activa por la distorstéu provocada por los dimeros. Se producen transiciones, transversiones y deleciones. Los necanismos de reparacién serdn considerados més adelante, Las radiaciones ionizantes, con mayor poder de jenetracion, son efectivas en virud de su capacided de producir radicales libres. Provocan roturas monocatenarias et el DNA ‘originando deleciones (mutaciones en sitios eltiples). Agentes quimicos 1) Agentes gue modifican las purinas o pirimidinas de ‘manera de provocar errores en el apareamiente de bases 0 que labilizan las bases para una modificacion quimica esponidnea. Ejemplos: acido nitroso y agentes alquilantes. El dcido nitroso (HNO,) puede actuar sobre edenina o citocina induciendo transiciones. por ejemplo.deamina ia adenina para formar hipoxantina. La adenina se aparea con timina durante la replicacion, pero la hipoxantina se aparea on citocina provocando tuna transicién de un par AT a uno GC (fig, 8-14), Los agentes alquilantes monofuncionsles actian de manera simitar, el etil metano sulfonato (EMS) alquila un nitrégeno de Ia guenina de forma tal que al replicar se apacea con timina. La alquilacién también puede inducir la tenta hidrolisis de la purina. Los agentes alquilantes ifuncionates reaccionan con ambas cadenas del DNA imtroduciendo enlaces transversales que impiden su i 5 J. oN Jia ste A] ano, ae 4) HNO 7 - NX 7 it AY r fl T NN A | ri u i ipo Se produce uaa wansiciba de wn par A = Ta un par Ge C Fig. 8-14. Mutagénesis inducida por Aside nitose, replicacién, Esta tegi6n es efiminads por un aucleasa, por lo que el resultado final es una detecién. Pertenecen a este grupo la N-metil-N -nitro-N-nitrosoguanidina (NG), las ‘mostazas nitrogenadas y la tnitomicina C. 2) Agenies que interactiian con el DNA ysu estructura secundaria, promoviendo errores en la replicactn y, fundamentatmente, en la recombinacién. Un grupo de ‘colorantes de mokécula plana, los colorantes de acridina (proflavina y naranja de acridina), son capaces de interealarse entee las bases apliadas due forman la hélice de DNA y distorsionar esta estructura de manera tal que fa ecombidacién de cromosomas homélagos se logra por ta insercién delecién occasional de bases. Las adiciones y "delecionee" provocan un corrimiento del marco de leetura ¥ tienen, por lo tanto, um profiindo efecto sobre el producto ‘génico. Cuando las acridinas actian sebre bacterias en las que se estin replicando fagos otiginan mutaciones en los genomas bijos de dichos fagos, Esto se explica por las frecuentes secombinaciones que se producen normalmente ‘entre los mismos. El proceso de recombinacién se inicia con ruptutss en las cadenas de los DNA intervinientes; este proceso es mucho menos frecuente en bacterias, Sin embargo, durante la replicacién se producen rupiutas en las cadens de DNA. y se ha demostrado que las acridinas tienden a actuar en sitios caracterizados por la reiteracion de bases cuando cerca de los tnismos se produce una ruptura, En base a estas datos se propone un medelo en el que las moléculas de icridina intercaladas estabilizarian un apareamiento legitimo (fig. 8-15) durante el tierpo nnecesario pata que Se prosluzca la repanacién poraccién de la DNA polimerssay !aligasa, dando asi lugar a le insercién, o delecién de una base, Luego, durante la replicacién, se segregarin las mutantes. La actividad mutagénica de estos colorantes es umentada en gran medida por alquilacién de la molécula Estos compuesos se conoeen como medias mostazas nitrogevadas (ICR 91).154 SECCION 1+ GENE! proniats eftorex de intongornctona de deliccton. Segin Watson y Crick, pueden ocurtir transiciones cwando las bases que actéan de molde durante la replieacién suften cambios tautoméricos de electrones. Un cambiode la forma cetoa la forma enélics en fa timina o de ta form amino a la forma imino ea ke adenina cambia ta especifiidad de las tuniones hidrogeno de estas bases, de modo que la timina podria aparearse con guanina y la adenina con citosina. Estos cambios taxtomericos ocurren mucho mis frecuentemente en compuestos tales como et 5-bromouracilo (5-BU) y la 2-aminopuring (2-AP), andlogos estnucturales ée Ia tintiaa y la adenina respectivamente. A diferencia de los agentes quimicos gue provocan algutlaciones © deammactones y que pueden actuar sobre. las bases ya incorporadis al DNA, Jos andlozos de base y las acridians son eféctivos solamente sobre moléculas de DNA que se estin replicardo. Ciettos andlogos de bases que son incorporades en el TNA viral 0 ‘que inhiben su sintesis, sin afectara tos huumanos, sen utilzados como antivirales: azidotimidina, acictovir y rbavrina, Mutigenos biolégicos Los elementos méviles tienen un efecio musaginica, pues a ingertarse dentro de un gen interrumpen Ja contisuidad del cédigo genético. Ademis, los procesos de transposcin dentro Gel mismo replicéa se asocian com inversiones 0 delseionrs el eromesorra, de acuerdo com ia forma en que seresuelye cl cointegrado, Ciertos elementos méviles pueden activar genes bactorianos, ya que poseea promotores fuertes cxea de sus exiremos JOADES Los transposones y el fago Mu se utifizan como ‘mutigenos, ya que pueden inserlarse en diferentes sitios del cromosoma dando lugar generalmente a la pérdida de Ja funei6n def gen, Por lo tanto, al igual que los mutigenos fisicos y quimicos, originan mutacionesal azar. En cambio, se pueden oblener mutaciones especificas mediante mutagénesis dirigida (ver eap. 9). Roparacién del davio genético Las bacterias no estin indefensas ania un dafio genético, ‘8 que possen nzimascapaces de ep lgunos ips de fstructurus genéticas aberrantes. Por eemplo, existen ds procesos prerruplicativas capaces de eliminar tos dimeros de pivimidias gers por Ih. exposicign a a adc WY. Uno de ellos ocurre sito en presencia de lwzy se conoce como fotorreactivacién o reparacion luninica. E] otro, que rho tequieze luz, se conoce come reparecién a orcuras. 18 foxorrenctivacién se produce cuando tas slulastratadas con tuz UV son inmediotamente: irradiadas con luz de 300 a 400 nm de longitud de onda, que activala enzima fototiasa que hidrotiza dimeros de pirimidinas {rompe {as uniones enice los dimeros). El mecanismo de reparacién a oseuras (fig. 8-16) es disparado por ia distorsién de la doble hélice en Ja regién del dimero, require Is patticipacién de numerosas enzimas y ocurre en una ser de etapas: 1) uma ‘ondonusleasa produce una muscea en la cadena que conticn cl dimero, esta endonucleasa es codificaia poros Loci avr y wrB y se la conoce como correndonucleasa-UV o endonucleasa de correcceién (mutaciones en estos ioci impidea esve mecanisme de reparacion y provocan un smoléeula de acridina que estabiliza et aporeamiento entire | Notéculs Miss | Reparaniin repicacién . ss 1 Polimerasa La reiteracion mm / ~—* + de — bese a ene | i i . | | | | | | aatajo sutarte | Fig, 8:15. Modelo de corrimicnts del marco de letra por aida de Ios aeridinas,GENETICA BACTERIANA aumento de sensibilidad a la radiacién UY); el producto del locus uvrC es una proteiua que impics que la ligasa selle la mucsea y asf; 2) ia escision inicial ée cadeaa tinica expone al dimero a una actividad exonucleolitica que lo climina junto con otros nocledtidos, esta fuscisn puede ser Tlevada a cabo por la actividad exomeleasa (5°-3") de ta Nal pol I: 3) 1a DNA pol I (actividad polinerasa) rellena da brecha 2 partir del 3-OH libre (DNA cebalor), resintetiza el seemento faltanteutlizando la cadena complementaria como olde; y 4) la ligasa reestablece iacontinuidal dela molécala de DNA Elmacanismo decer'pto se denomina eeparacion por “arches corios” 0 “via corta’ Existe otto mea frecuente de reparacion por “parches largos” » “via larga” en el que se proxuce unexteaso ensenchamiento Je la brecha por In actividad de la esonucteasa V. Esta exonntcteasa de simple cadena es el producto de los genes recBC, que también participan en Is recombinacién generatizda. Luego ta brecha es rellenada por fa DNA pol fil; también participan las proteinas de unién a cadena simple de DNA (protegen las liga regiones de cadena tiniea de las nucleasas e impiden et plegamiento secundario de las mismes). la proteina RecA {Gwvolucrada en los procesos de recombinacién generalizada, ‘ver cap. 9) y la higasa (fig. 8-16). Sistemas similares pueden reparar otros tiyos de lesiones, Por ejemplo, se conocen enzimas capaces de inieiar la removién de bases alquiladas y otras que remueven Fagen cate DNA pol 2 setvi y polimerasy ana 155 hipoxontina. La enzima N-glucosilasa rompe el enlace alucosidien que une Ia base alquilada con el uzicar-fostato, on lo cual la base es desplazeds sin romper la eontinuidad dela cadena de DNA. Entonees, uns endonuclease reconoce ‘el hueeo dejndo por la base y realiza el corte para inéciae un proceso similar al dé eliminacién de los dimeros de picirnidinas, La correndonuecteasa-UV también corrige enlaces entre bases de distintas cadenas, como los producides por aitomicina C. Funciones SOS y reparacién del DNA Las bactering mutates que carecen de vias uve de reparacin son més sensibles a la mutagenesis por UV, ya que realizen una reparacién postreplicativa. Esto tarnbign cecurre cuando se somete a la radiacién UV una poblacién que:se esta duplicando activamente, condicin que favorece ta obtencién de mutantes, ya que no sleaoza a realizar la reparaciGn prerreplicativa, En Ia eparacién postreplicativa, se activa el sistema SOS de reparacién mutagénico y se remueven los dimeros dé pirimittna por recombinacton. Esta. reparacién es uno dé los muchos procesos iniluidos por el sistema regulador SOS, que es activaiio por la tesién del DNA. Elsistema SOS se encuentra normalmente reprimido ‘por In proieina LexA, pero el DNA daiiado convierte a la DNA con 4 dimoro da inion am TUT” oe Prion cee oN Feperacion por parchos lrgos 3 exonuctouse ¥ (genes rec 9.0) proteinase unién @ DNA de eadane singio (SSB) me nome | rks 7 | | totes bona pot | Tm om "mim un" | a yep | “Tm °° (Ca. * Nits a Fg. 8-16, Reparacion 9 orcura156 proteina RecA (que normalmente participa en les procesos de recombinacién homéloga, ver cap. 9) en ura proteasa ‘que corta a la protefna LexA, activando al sisterta SOS. Se sctivan muchos genes, inclusive el que codificala proveina ReeA, que estin bajo el control de Lerd. En estas emdiciones existe un elevado nivel de proteina RecA y se inhibe la actividad correctora de la DNA pol III (acividad de exohueleasa 3-5") Cuando se replica el DNA que presenta dimeros de pitimidinas, se generan discoatinuidades (de aproxi damente 1000 bases) en la nueva cadena de DNA, discontinuidades que son rellenadas al cabo de un cierto siempo, Las discontinuidades se forinan por Is imposibilidad de Ia UNA pol Ill de coptar la estructura anomata y por la reiniciacion de la replicacién a una eierta distancia de la zona lesionada. La actividad correctora de la DNA polimerasa elimina ta iiltima bese afiadida, sino es la correspondiente, Dado que una distorsién del DNA no se acopla bien con ninguna base, se produce un bloqueo de la replicacion, pues la actividad correctors elimina indefinidamente os nuclestidos incorporados. Respecto al mecanismo que regula lz reiniciacién, podria estar relacionado con los que actian en ia replicacion dscontinua el DNA formando los fragmentos de Okazaki. 1Las lesiones en e! DNA aetivan el sistema SOS, y et rellenado de los huecos del DNA podria hacerse por recombinaeién dependiente de RecA, favorecida por loz clevados nivoles de esta proteina, En este meeanismo interviene la DNA polimerasa que ai tener ithibida la funeiéa comectora ocasiona un aumento de ia Frecuencia A) Produccién de mulacin por erores de lo DIVA pol ll con setvided eoerecten iain simero \ i 0S (rsstagénieo) + DNA pe! | | mam 7 ig. 8:17, Reporacige ponceplicativa SOB. SECCION 1": GENERAL Ds de mutaci6n (fig. 8-17). El proceso de recombinacién se describe en el Ademds, la DNA polimerasa con la funcién cocrectora inhibida podria copiar la zona det dimero Introduciendo mutaciones y tumbiéa lo haria al replicar otras zonas no lesionadas del DNA. Defais y colaboradores han estudiade a cinétiea de induccidn y fa vida media de ia reparacion SOS en £, coli, A 37°C, ta actividad reparadora y In mutagénica sou miximas aproximadamente a los 20 min de fa iradiacién y decaen con una vida media de 30 min, ‘Otros agentes que causan lesiones que interfiecen en la replicacién del DNA también son capsces de inducir los ‘fendnnenos SOS. Reversién de las mutaciones Un organism mutante puede recwerar su fenotipo Salvaje original por una segunda mutacin denominada mutacin reversa 0 reiromucacion. Las puntuales pueden revertir por accion de mutigenos que provequen mutaciones puntuales del mismo tipo, por ejemplo, las mutaciones producidas por scridinas pueden revertir por agentes que provoquen microdeleciones y microinserciones, pero no por aquellos que inducen reemplazos, Las mutaciones que afectan seementos de DNA sélo pueden revertir mediante procesos de recombinacién que ce analizarin mac adelante, ‘Los experimentos corrientes de revenién sblo permiten: demostrar ta recuperacién del fenotipo original. Dicka recuperacién puede deberse a una segurda mutacin en el By Reparacide por recombinacién favocecida per los ats niveles de protein RecA, binaeidn (Ree A) Mulkiplesentrecusarntetoe 1 pscesftutacion por eroran la vesombinaciéa| es SS | |GENETICA BACTERIANA ‘mimo sto afotado por la mutacin pili en un sto Titers yas dont dal mismo geno deouo, Cuando la suusscldnreversa te produce enel mao sivo que Ie rid vay estar a ocuscla dbus origin consiye is revomatacln vordaser, Teen peda prodacies Saal eeeag ali peo tl epederarcl sowie ogi, Singur coutiqnel ino azodelao uo oalnente Hee hon. diferente del de. acion primitiva se denominan mmuleriones tenrnionmy, tastier ser Recantntace 2 Gxiragenicas, segin se encuentren en el mismo gern a Pon omer pecerye rie Hubei taanblotompenttgb ac ronas woe ied Wt producto peneo ated (We 8.18) as rutaconessupresoras interns extengénicg sgt reompoaete dl procs athe =e tas para coreg de ebtigooriginado porla primera muacién. Por ejemplo, sien Ja secuencia de bases dei DNA origina, un triplete de bases se taduce en leucina y el mutante ef fenilalanina, existen al menos dos maneros de suprimir el efecto de esa matacién. Una de ellas es que por una segurda mutacin el RNAt que carga fenilalanina adquiera ta capzcidad de cargar_ lecnihc signe ta og giaias tarde ofeeee sla eucinn alo activa a Ja fenilalanina para que pueda también activa icucina, En ambos eas0s. a pesar de que el tiple aterado codifica fenilalanina, podré ser traducido en leucina. Los ‘iecanismos de supresiSn extragénica deben operarcon baja eficiencia, pues no afeetan solamente al irplete mutante, sino a tetos ls restantes que vodifican ese eminodcido, Ea nuestro ejemplo, todos los tripletessalvajes que codifiquen fenslalanina podran también ser tmducidos 2m leucina ys ello ocurriese com alta freetenca, se inactivarian tod as 17 proteinas porcarecer de fenilalanina, Otro caso de supresion extragéniea involuera Is leetura de codones sin sentido, ‘eneradas por fa mutacion primitiva, por moléculas de RNAt modificadas. También se dispone de mecanismos pata la supresién de mutaciones por camaio en el marco de lectura Uno de éstos involucra un nuslestido adicional en el anticodén para el RNAt que carga fenitalanina, en cuyo ¢as0 cl anticodén fee UUUC ea vez de UU como codén para [a fenilalanina. Esto trae como resultado ta restauracion del marco de lectura que se habia modificado por la insercién de una base adicional. Una aplicacién de las muiaciones reversas es la detec s mulagénicos. Se basa en el hecho” de que sun compuesto es capaz de revertir una mutacion, es también capaz de produciele. Presenta Ia ventaja de climinar la necesidad de encontrar las condiciones apropiadas pera ta expresion de la mutacin. Por ejemplo, el ensayo de Ames se basa en [a utilizacién de mutantes ‘auxétrofos para histidina (His") los cuales no pueden crecer ‘e0 un medio sinistico sin este sminodcido. Se agrega al medio sintético el compuesto en estudio ¥ se evatin ol nimero de colonias revertantes (His") que debe ser significativamente mayor al correspondiente a la reversion cespontanea (contra! sin el agregado de dicho compuesto) si dicho compuesto es mutagénico. En muchos casos, fa validez de las conclusiones sobre Jos mecanismos de mutagénesis requiere Ia demostracién de que ha ocurrido una retromutacién verdadera. Ung supre' en revertante y salvaje y analicando ta progenie. riginan organismos portadores de la mutacién primitiva, In retromatacién es verdadera, En cambio, exando Ia f ‘cf vir sido que ta 1 aacion | 7 hnetadas tase ecgel ia ase BONAsinie SfBCAOGTAGTOARTEA. Rereston 77 cee ‘NAM SmQGU CCA UCA CUU AUF : pam SRY CCA UCA COU seauetie {SEE se ro -Stectma-Asn (aia masse). a sie = [anda rape ee fw \ xa 3uAICAGGTAGTGAATTA..5° | | Iomangtied ——_acnagiaa oe ja eat on Posen | 2 maacin o: Paling Val « Mis - His - Lew | as stati robes a we ote on cacctiraareaarea.. seroma ee = | ™ a ia = USES Uo OU sein weasel | ae lng Se oan epoca prone calor the fete ale Fig, $18. A) Recuperacin del fenctpo salvaje por reroraciéa, B) Supresia inrapénica158 SECCION 1 recuperacién del fenotipo obedece a uns mutacion supresora, en ls progenie habeé algunos erganismos portadores de la mutacién primitiva y otros des mutacioa Supresora, que ahora puede expresarse (Fig. 8-9). En una poblacién bacteriana, las velocidades de mutacin y reromutacién junto con ia presiones selectivas conducen a un equilibrio oa un pseudoequilibrieeimpiden, luego de varias generaciones, que se pierdan las caracteristcas de esa determinada especie Supresi6n fenotipica Las mutaciones. pueden ser supcimidas tembién por tuna alteracisn no mitacie sistema de traduccisn. Por ejemplo. concentraciones subletales de estreptomicina que causan m error de lectura del cddigo genético pueden permitie que codones sin sentido 0 con sentido equivocado sean traducidos como codones con sentido. Un bajo nivel de anbighedad introducido por el compuesto supresor es suftsiente para producir una cantidad efectiva functonal del producto, del gen mutado sin disminuir significativamente el nivel de productos funcionales de genes no mutados Expresiéa fenotipiea de las mutaciones Muchas tunciones celulares, como la utilizacién de determinadas fuentes de carbono, nitrogonc, azutre y fosforo, ta sintesis de precursores de macrowoléculas y coenzimas, la regulacidn de la sintesis y actividad enzimatica, la sintesis de algunos componentes de lx superficfe celular, etc., no son incispensabtes es todas las condiciones de cultivo. Asi, la incapacidad de an mutante para utilizar doterminada fuente dec; actividad enzimatica 0 de tcanspor mediante Ia vtilizacién al carbonado. Cuando una de ana enzima de un camino biosintético no indispensable, la eélula se hace dependiente de factores de crecimiento Esta caracteristies fevatip ausxoriofisma.EL GENERALIDADE: je Ins compenentes del? lenomina proioirafismo, Los camines biosintéticos no jndispenables soa aquellos cuyos preductos fiaales son moléculas capaces de entrar en la edlula (eminodcides, purinas, pirimidinas, vitaminas). Las rtas biosintéticas de los aminodcidas estén constituidas de modo tal que el efecto de la pérdida de setividad de una enzima anterior a una ramificacién de la ruta es el de obterer th mutante con multiples ceqnecimientos (auxdtrof para dos 0 mis aminoscidos). Tambien pueden surgit requerimientos ihtiples por pérdida de una actividad enzimaties comin a dos ratas diferentes. ‘Las mutaciones también pueden eoafericun.aumente de Ia sensihilidad o resistencia a inhididores. Ya_se ha ~maeneionado que la Sensibilidad de ls bucterias aa luz UY es mucho mayor si se piorde alguna de las efectin le teparavion del DNA data, Lan damian laaiied dal elgice Scere inhibidor. Estos mecanismos son eespousables de la adquisicidn de resister iGaa aniibiHeos. Por ‘ejemplo, una mutacion en el gen que edifica la proteina S12 de ta subunidad ribosomal 30S genera mutantes resistentes a la estreplomicina (modificacién del sitio blanco), Las mutaciones que aleran una fineién no indispensable permiten el estudio de eaminos metabélieos, funciones regulatorias y otos aspectos de la fisiologia celular, dando origen a la bioguimica genética. Las mutaciones que alteran un gen cuyo producto es indispensabie en exalqiier condicion de eultiva. y que no puede ser aportado por el eultivo, constituyen nutaciones letales. Botte estos productos estin las polimerasas, que eptican y transeriben el NA; los diversos Componentes de! aparato de traduccion y proteinas esenciales para el proceso de divisién celular y algunas proteinas de tas membraaas. El objetivo de aplicar las iSonicas de la genética bioquimica al analisis de las funciones génicas imprescindibles Ulev6a la utilizacién de Mutacién supresora © Sa. © Sui sup e , | \ of meat ote mew ore mPa | tH + | gon | ego Tiantps | salvaje 2 . salvaje rnutantes | smutacion snutante ee a | Fig. $19, Crue yendtco entre un mutante suprimido con Feootipe salvaje y una cepa salvajeGENETICA BACTERIANA 139 muutuntes letaies condicionates. Estas mulaciones lelales se expresan s6lo en condiciones denowi ‘no_permiten_ que se repliq 'son aqueflas en las que no se expresa [a mutacion desarrolle_su_portador. condicionales soa las sputantes termosensibles en Jas que Ja mutacin ocurre en un gen que codifica una polimerass. Las bacterias portadoras de la mutacin pueden replicarse 4 una temperatura permtisiva (30°C) pero al pasarlas a una temperatura no penmisive (42°C), la mutociéa se expresa y la polimerasa se inactiva impidiendo la ceplicsciéa, Retardo fenotipico ‘Cuando el efecto prionatio de una mutacién es la pérdide dz un producto geaico estable, pueden ocurric varias jones antes de que la mutacin te exprese ipicamente, Este fenémeno es conocido cemo retardo fenotipico y corcesponde al tiempe requerdo para Ja dilucién dei producto wénico que dejs de ser sinictizado. Experimentalmente se observa que ciando una suspension bacteriana sensible aun bacteriéfagoes sometida a Ia aceién de un agente mutagénieo e inmediatamente ploqueada en presencia de esos bacterifagos, casi no se enettentrun matantes resistentes al fago. Sin embargo, si transcurren varias generaciones entre e! tatamiento mutagénico y el enfrentamiento con los bacteribfages. cl mimero de mutanies resistentes aumenta en funcidn del nimero de generaciones transcurridas hasta estabilizarse. Este Ferdmeno puede expticarse teniendo en cuenta que las bacterias sensibles al fago poseen receptores especificos ‘que dejan de sintetizarse por accidn del agente rutayénico. Cuando une bacteria sensible a un fago se eonviere en genotipicamente resistente todavia posee los re preexistentes.y, por lo taato, sigue siendo Fenolpicamente ‘express 00 Crdel2” 9¢ fiaal) INP de generasianes despuds de a mutapénesis ““ailuyan” sensible hasta que tran varias gener los viejos r La expresin fetrasa hasts que las células mutenies carezcan de fos receptores necesarios para la adsorcién del fago (Fig. 8-20). Se observa retardo fenotipico cuando se obtienen ‘mutantes auxétrofos' mutantes que pierden In capacidad de utilizar un compuesto como fiiznte de eacbono 0 njtrigeno. El efecto primario de la mutacidm es ta pérdida cde una actividad enzimatica, al ocurrir a matacién la célula posee muchas moléculos de la enzima, que han de scr diluidas por divisidn celular para que se observe el efecto de la mutacién, El significado del retardo fenotipico puede verse en el or paniailina de mecantes auxdtrofos. La penicilinit acti s6to sobre eélulas en crecimiemto activo. Si los sobrevivientes a Ia accion mutagénica se tratan inmediatamente con este antibidtico, mueren tanto los matantes com los salvajes. Es necesirio que transcurran varias generaciones antes de tratarlos con penicilina para que la mutacin se exprese fenotipicamente (fig. 8-22). Cuando una mutacién conduce a la gananeia, y no a la pérdiga, de un producto génico, la expresion fenotipica es pricticamente inmediata. Sogregacién de equivalentes eromosémicus retardo fenotipico tiende a enmascarar otro factor que también retrasa la expresién fenotipica de las muutaciones: Is existencia de varios equivalentes cromosémicos en algunas becterias. Las bacterias pueden presentar mis de ‘na copia de alguaos genes cuando se dividen rapidamente. En esas circunstancis, una mutacidn puede afectar s6lo una copia del gen dando lugar a un feteracorionte. Si la ‘mutacida causa Ia pérdida de un producte recesiva, porque las otras copias del gen continuarén fabricando dicho producto. Ast, serd nevesaria la segregacién = receptor at 1340 SD boateiasresstrtes al ayo ‘ bacterins sensibies al fags Fig. $20. A) Retrso on be expeesib fenceipica de waa mutacin, B)Dilucn de un produc ic enable recep del fo) a raves de suceives _generacones bacteriams,160 del heterocarionte pora obtener un homocartente en cf que se manifieste Iz mutacin (segregacién de equivalentes cromosSmicos, fig. 8-21) Las bacterias son haploides porque todos susequivalentes exomos ni . Aunque s6 produzéa heterogencidad por mutacin o por transferercia genética, Jos procesos de divisién celular y segregacién gencralmente restauran ia haploidia en poeas generaciones (ver fig, 9-4), Rnriquecimionta de ta poblaclén muragesizada en el ‘mutante deseado Debe destacarse que al someter una poblavién salvaje a laaccidn de un agente mutagénico se obtiene ina poblacién mixta compuesta por bacterias salvajes que no fueron afectadas © repararon et dao del DNA y mutants. Las ‘mutacfones se producen al azar y por ello puede obtenerse cel mutante deseado. pero ademas siempre se genaran aches ofros meutantes Se recurre a técnicas de ensiquecimiento cuando no es posible el desarrollo det mutante deseado sin gue lo hagan también las bacterias salvajes (u otros mufantes). Por ejemplo, si se desean obtener mutantes. auxstrofos para {rnptotano (rp) a partirde una poblacion salvaje protétrofa para este marcadar (Tzp", capaz de sintetizar uiptofano), fa linica manera de cultivar las mutantes es en sresencia de triptofano y en estas condiciones también =recerin las salvajes. EI método se basa en la nhibicién fenporaria de Ja poblacion mutante, Se logra cultivando 8 poblacién mixta (Trp'y Trp), a la cual se le permit sreviamente replicatse en preseucia de tripiofane (Cetardo fenotipico y segregacion de equivalentes cromosémicos),encondiciones selectivas en las que s6lo Iss salvajes (Trp") sean capuces de reproducirse (medio minimo liquide carente de 4 aS t ZL { 11" goneracién 2 generacién ‘ mutants i omecationte Fig. 8:21, Segregasion de equivalenteseromosdmices, ae CED SECCION 1: GENERALIDADES triptofano) y en presencia de un boctericida, como la penicilina, que acti s6lo sobre células en crecimiento, El antibistico matard sélo fas salvajes (Trp") y permanceerén latentes las mutantes Trp’ que no sereproduicen en ausencia de triptofano. De esta forma, el mutante deseado estaré presente en la poblacién mixta em mayor proporcién con Fespecto a Ia inicial. Luego se elimina el bactericida y se provedea seleccionar los motantes Trp" uikizando la téeniea de séplica (fig. 8-22), Para climinar el bacterivida se puede hacer pasar el cultivo a través de una membrana Giltrante, ¥ luego se procede @ lavar las células retenidas en Is membrana con medio de culivo fresco, o se puede agregar un inhibidor del antibistico (en el caso de utilizar penicilina se puede agregar ung B-lactamasa), Seleceion de mutantes, Se utilizan condiciones de crecimiento selectivas © diferenciales que permiten distinguir los organismos mutantes de los salvajes. 1Los méodos que emplean condiciones setectivas pueden inhibiro matars ia poblacién salvaje 0 a la mutant. Iahibiciéa de 1a poblacion salvaje Este método es aplicable a la seleccidn de mutantes que adguieren una actividad encimética y, pot lo tanto, se hacen independientes de la presencia de un factor de crecimiento Por ejemplo, sise quieren seleccionsr mutantes Trp" a partir de una poblacin Trp” y Trp, se inocula un medio sSlido carente de triptofane con un niimero elevade de bartecins de la poblacién mixta (210%), ya que en ella la proporcién del mutante deseado es pequetia, En este medio sélo desarzollaran las rmutantes Tep’, dando colonias visibles. rmutante betorocarionte N\ J g 3 8GENETICA BACTERIANA ‘También pueden seleccionarse mutantes que sdquieren la ‘copacidad de utilizar un determinado compuestocomo fuente ce carbono, sembrando ia poblacién matagenizadsen un medio {ue contenga dicho compueste como inica fuente de carbono, Muerte de ta poblacién salvaje Si se quiere seleccionar un mutante resittente a un antibiotigo, por ejemplo estreptomicina (Str), es suficiente incubar la poblacién mutagenizada compuesta yor bacterias sensibles (Str) y resistentes (Str) enuusencia de antibistico Getarde fenotipico) y luego sembrarla en un medio de Cultivo sélido que contenga concentraciones bactericidas del antibidtico, Séto desarroltardn colonias del mutante St ‘Tambien pueden seleccionarse mutantes resistentes a un fago sembrando la poblacin mutagenizada, ala cual se le ‘permitié previamente replicarse en ausenca del fago (retardo fenotipico), en un agar nutrtivo al que se agrega una suspension del fago. Inhibici6a o muerte de ta poblacién mutants Se aplica a Ia seleccién de mutantes axxétrofos 0 termasensibles, que tequieren condiciones de srecimiento cen las que también desarrollan tos organismos salvajes. La seleccidn de auxdtrofos, que generalmente es precedida por Un enriquecimiento en el mutante deseado, puede llevarse a cabo utilizando Ia técnica de siembra por réplica: $8 16t cultiva la poblacién mixia en placas matrices que contienen tun medio de eultivo que permite el desarmollo de todas las bacterias presentes (rautantes y salvajes); una vez obtenidas Jas colonies aisladas, éstas se transfierea mediante un sello estéril de terciopelo 0 gasa a otras placas orientadas, iénticamente y que contienen un medio que pemnite slo el Sesarcollo de las células salvajes. Las colonias salvajes >> mutantes Tape (ealvajes) “Tp (y ots matentes) —> fy —— 2] Dincionee | LS murantes TTP piace matriz inedio sia Trp medio a 4} v*doboteras Tint 4 colativobactesis Tr 4 sures de edonias Fig, 82 , Enrquecimiento en mutantes suxdtrofbs y seeccion,142 SECCION curacleristicns de los matantes, los compuestos necessrios pura peamitir su diferencinciOn pueden ser letales, En esos tuigns se reenrre a la seleccién por réplica, utifizando ef inisino meclip de cutivo en Ta placa matriz y en la répliea, perv tevelurido solo una de elias (¢)., deteccién de bacterias productoras de amilasas ulilizanda Ingo pasa revel), Presiones selcctivas en ef ambiente natural Hasta ahora se ban considerado fuerzas selectivas que ‘actitan en cultivos artificiates. En la naturaleza To seleceton actiia de un modo ain més exigente. Po: ejemplo, un roorganismo del suslo debe ser capaz no solo de sobrevivir bajo un conjunto de condiciones fiico-quimicas, sino también en competicién con las otras formas mictobianas que comparten ese nicho ecolég.co, Cuaiguier mutacidn que dismimaya Je capacidad del microorganismo para competi seri seleecionada negativamente y eliminada con rapidez, La naturaleza tolera muy poca viriaciGn en las, pobiaciones microbianas. Ins leyes de In competencia demancian que cada especie retenga et conjunto de genes que le confiece ka mejor adaptacién, Adaptaci genética y no genética La adaptacién genética consiste en la accion de lu seleceidn sobre las variacioncs heredables. Ex la naturalezn la adaptacién genética es el mecanismo prineipal de evolucién. La adapiaciéa no genética o Misiol3gica implica luna sdecuacién fenotipica directs, [a célula sutre un cambio Fisiolégivo en respuesta directa al ambiente, Este cambio se debe a in induecién de enzimas, involucra a toda la poblaciin y ee rauarsihte (induncian de lac enzimae necesarias para metabolizar una fuente de carbono, de aquelias responsables de la Fotosintzata, etc). Caracterizacién de mutuntes Existen diferentes mancras de encarar la ceracterizue de un mutante, que depencen de ia naturalezade la faneisn afectada y de las exigeneins del objetivo propuesto. Asi cuando se tra de pédida de una actividad enzimitica puede med:rse dicha actividad, detectarse la acumalacion de su sustrato 0 Ia desaparicién del producto de reaceién inmediato,o el requerimiento exégeno de un produeto final cuya biosintesis requiere obligatoriamente laactividad de sa enaima El esquema que leva ala caracterizacin de un mutante descado, previamente seleceionado, difiere de ague! a aplicar cuando se trata de caracterizar las mutantes GENERALIDADES producidos por un tratamiento dao. Enel primer exso solo se confirman les earacteristicas fenotipicas deseadas, deseansindose todas Ins demas. En el seguncio no existen caracteristicas fenotipicas deseadas sino caracteristicas fenotipicas obtenidas, que deben ser elucidadss probendo, por ejemplo, una variedad de factores de crecimiento, sise trataca de ua mutgate nulricional (euxstrofo). La preparacién de mezclas de esos factores de crecimiento y el afadido de las diferentes combinaciones de todos menos uno de ellos permite caracterizar mutantes con requesimientos simples 0 mittites. Uso de mutantes Es ampliamente conocida la utitidad que brindan los smutantes bacterianos auxétofos. A ula de ejemplo pueden mencionarye: 1) la valoracién de fuctams de ceesmfent (valoracion microbiologice de vitaminas), 2) el esclarccimiento de caminos metabdlicas, 3) la deteccién dle propiedatesmlagénicas (ensayo de Ames), 74) estuios ‘de mecaoismes regulstorios. Resientomentec a:st0fmo fe también utiliznd como eritevo de seleceién de e=pae se superprodaven y exeretan aminosvidas y bases BIBLIOGRAFLA ‘Avera ti, How boxteria cope with oxidaniscly damaged DNA. ASAI News Tov3e SO 19-123, Fraser CL. Sige}, Fleischmann R, Ketchum Peterson S. Comparctine ‘gennics und wadertunding of auerdbicl loin: CDC Emerging Infections Dissises, Sep -Ost. 2000, VOL. 6. N" 5 eshte EL, Mocray ROE, Wosl WA, Kileg NR. bends for General Molecuber Bueteridaes, Arvcicm Society tor Microbiology, Puaier PA. Alergy” Coneypee atl Applications, Joke Wiley ons, Ine. 1988, Krawiss S, Riley M. Organization of the Buetetiat Chromosome, ‘Micrabitosied Reviews 1090 St: 502-539. Lewin 0, une ¥ OXford University Presi and Coll Press, 1994, kg FM, Parker h Brock, Biologie ue lox ‘sk, Prentice Hil Iberia, Madrid, 19. Wriew NO Alerohtoloe- Concepts anal Anplicutone ist cdiign, Me Grsw-tite, Le. Prescott EM, Harky JP. Klein DA, Adhermbiolngh 4h edition, WCBY MeGeaw Hil. 199. Reechia GD, Hs RM. Gene catstts: 2 new clase of mebile element ‘Microbiloys 1995; (Al: 301830. Salyers A. Armbile Cuevas C, Minieeview: Wey ar antibiotic resisonee genes to resivantto elimination? Anuinserabstgents Chenier 1997, at 2531-23 Saya Ly Champnese WU, Molecular Contes of Buturia. ASM Press, 1997 Zinsser W, Jokli WK, Wille HP, Aso DN. Microbiologia 20°04, Ed ‘Maédiea Panamericana, 1994,CAPITULO 10 REGULACION METABOLICA En una célula tienen lugar cientos de reaeciones enzimaticas simulténeamente, ya sean de naturaleza catabélica o anabélica. Sin embargo, no todes ellas ocurren con Is misma frecuencia, porque, por ejenplo, algunos compuestos son necesarios en grandes cartidades, otros en cantidades mucho menores, y algunos compuestos sélo serin necesarios en determinadas condiciones de erecimmiento y no en otras. Ademés, para sobrevivir las bacterias deben lograr adaptarse alos cambios en las condiciones del medio ambiente (varieciones en la concentracién y/o tipo de autrientes disponibles, en la ‘osmolaridad, en ia temperatura, y may ain conspetir con otros microotganisinos). Por lo tanto, para una célukt es necesacio regular las diferentes reacciones bioguimicas en funcidn de las condiciones de crecimiento, con el objeto de optimnizar la utilizacién de recursos. Los principales mecanismos mediante lo: cuales puede ‘operat la regulacién dentro de una célula son controlando Ja actividad de una enzima preexistente 0 controlando fa cantidad de enzima gue se sintetiz Regulaciéa de Ia actividad de una enzima Laregulacidn de la activielad de una enzina ocuere ver que ésta so ha sintetizado, es decir, es ur mecanisimo de control postraduccioral. Este tipo de regulacién puede llevarse a cabo mediante diferentes estrategias. Una de las mis communes cs le regulacién teraporal y reversible de la ensimas alostéricas. Estas enzimas presenian en su esteuetura un sitio eatalitico © centro activo, donde se une el sustrato para see procesado, y otro sitio denominado alostérico al que se use feversiblemente la molécula regulatora, también llamada efector 0 modulador. Cuando el efector et unido, se produce un cambio conformacioral ex Ia envima que tne como consecuencia una alteracién en la actividad del sitio catalitico. Un efector positive auments Ia actividad de ia enzima, mientras que un efector negativo la disminuye ola Marta Mollerach Inhibe. En general, estos cambics en la actividad son el resultado de cambios en la afinidad aparente de la enzima por su sustrato, pero también ex algunos casos pueden curric cambios en ta velocidad maxima. ‘Otro mecanismo por el cual puede ocurrir ta regulacion de laactividad de una enzima, es una modificacién covalente reversible de Ia misma. La estrategia mas frectiente es la adicién o remociéa de un grupo quimico particular (@j, Ja fosforilacion y desfosforilacién de uns enzima, o su uniée a AMP), En este caso, también se produce un cambio conformacional en la enzima que se traduce en pasaje de “enzima inactiva” a “enzima activa”. Finalmente, debomos considerar que estos mecanismos operan en el marco de! metabolismo general de la célula; 5 decir, una reaccién enzimitica formara pane de una 0 mis rutas metabdlicas complejas, tales como las rutas de sintesis de aminodcidos o purinas, La sintesis del producto final se logea luego de varios pases en los que intervienen diferentes enzimas. Por Io tanto, la odlula debe regular el funcionamiento de la totalidad de la ruta, Muchas veces, el aminoacido ¢ producto final acts como medulador de. la actividad de la primera enzima de la ruta, de manera que ua cambio en la actividad de la primera enzima alterard la velocidad con que funeiona toda ia nuta. Este mecanismo de inhibicién alostérica se denomins Inhibiciin por retroalimentacién 0 inhibictén por predeto final Regulacion de Ia sintesis de mRNA La regulaci6n de la etivided de una enzima es un mecanismo de “ajuste fino”, porque le permite a la cétula justar répidamente y modificar en cada momento la actividad metab6lica. Ademas de este mecanismo ya descripto, las eélulas son cagaces de controlar ta expresidn de sus genomas. Fate mecenismo de ajuste es comparativamente mis lento que ei anterior, ya que si se requiere una nueva enzime, la oélule debert sintetizaria y esperar que se acumule en cantidad suftciente para que seIsa segistre un cambio en el metabolismo. Inversumente, cuando tava enzima deja de sintetizarse pasart un tizmpo anies de ‘que la enzima existente desaparezca y eso se tradhvzca en it aioiogia celular. Sin embargo, la regulacidn dela expresién _génien complementa lareguiacidn de la actividad enziratica ¥ permite a fa célula una mejor utitizacién de ln energia y ae los nutriences Regutaciéa mediante factores sigma Las RIVA polimerasas de tox microorganismos del dominio Bacteria estin constituidas por 5 subunidades. Como se muestra en la figura 19-1, ta holoenzima contiene 2 subunidades c, 2 subunidades mayores derominadas By Ai y el factor 6. Este Gltimo es requeride durante fa injcincion de la wanscripcién y se libera de b enzima core tune voz que ha transcurrido la iniciaeisn. Cada factor sigina le permite a fa encima care reconocer tn grupo especifico de promatores y transerbir solamente esos genes. Este mecanismo regulatorio es my atilizade por lis bacterias para modifiear su pairén de expresi6u génica. Por ejemplo, Escherichia coli sintetiza varias fhnctores sigma. EI factor sigma 6” dirige e» condiciones normales la actividad de [1 RNA polimoraca (en este ea ef superindice 70 esté relacionado con la misa molecular deeste factor sigma que 2s de 7 kDa), pero arte un aumento de la temperatura aparece o* (6) y promueve ta sintesis de mas de 15 proteinas nesesarias para proteger i ts célula del dao que podria causa ese aumento de temperaturs {proteinas de shock térmico). Obviamente las promotores reconbcidas por diferentes lactures sigma poseen escencialimente distintas secuencias en las regiones «U0 y 35. Indu ibm y represiOn enzinvit En lacéiula existen algunas enzimas que sen sintetizadas continvamente ea Ia celuia y sus nivetes se inantienen constantes. Los genes que codifican éstas enzimas se transcriben de manera permanente y codifican enzimas denominadas constitntivas, que en general desempeiian —~ 8 () G + (0) * ge ») oS Enzima core Subunidad Sigma Hobe Lo a _ Fi. 11. Een de RNA polars demicronanins del dons Boveria tun papel esencial en ef metabolism central, por ejemplo, las enzimas de fa glucslisis pertenecen a este grupo. Eniste otro tipo de enzimas que no se sintetizan de ‘manera permanente. pero su sintesis puede ser inducida en determisiadas condiciones. Muchas de estas ensimus inducibles estin involucradas en Ia utilizacién de una fuente de energia especttica. Por ejemplo, le enzit galactosidasa es cequerida para hidrotizar e! disa Inetosa en los monosacarides glucess y galastonas te sintesis Ue esta enzima en condiciones ea gue no e3 necesaria su funciGn, representaria un desperdicio de recursos por parte de la célul, La f-galactosidasa esel (pico ejemplo de una enzima inducible. Los genes que covifican euzimas involucradas en ta sintesis de aminodcides se comportan de manera diferente a los que codifiean enzimas eatabéticas: la presencia det aminofeido on ot medio inhibe ly formacidn de enzinu involucradas cn su biosintesis, Esto es tambien scondmico” para Ii célula, dado que no es necesariv producie enzimas para sintctizar una sustancla que ya esté disponible on ef medio donde se esti desarrollanco. Estas enzimias son repeiimibles El meeanismo de induecidn y represién Antes de diseutir los diferentes ejemplos de regulacién transeripeional, reswniremos los diferentes tipos de regulacién nafs freeuentemente utifizados por las bacterias y detinitemos algunos de los términos utilizados para escribir los faetores involuucradas, La transeripesn de los operones bacterianos esti mRNA REPRESOR ACTIVO Tea cenzimas catabéticas, cuando la eélula cece en presencia de glucosa, Es importante aclarer que no todas las bacterias poseen este mecanisno de control global en respuesta a lx presencia de glucosa {.Cémo funciona fs represién eatabélica? Las enzimas controladas por este mecanismo se sintetizan solamente cuando existe una proteina activadora, denominada proteina activada por eabibolito (CAP), gue se ha unido primero al DNA y permite, as la unidn de ls RNA polimerasa. Pero, la proteina CAP solamente se une al sitio activadar det DNA cuanda su efector, el adenosie. monofosfato ciico (cAMP), estd unide aella. En ausencia de CAP-cAMP, a RNA polimerasa se une muy dSbilmente al promotor. £1 :AMP es, entonces, us elemento clave de este mecanismo de control. Es sintetizado por la enzima adenilato ciclase a partic de ATP y su cencentracién dentro de la célula variainversamente al nivel dr glucosa ingresada. Es decir, las comentraciones celulares ée cAMP son hajas cuando existe sificiente suministro de giucosa. En esta situacién, se detzctiva CAP y se inhite Ia expresiéa del ‘operén lactosa. La disminuetén de CAMP en presencia desglucosa puede explicarse al considerar el efzcto de sistema Ge la {osfotransferasa (PTS) sobre la actividad de Ia adenilato ciclasa: enol transporte de la glucose através de la membrana existe una enzima del sistema PTS que actia vwansfiriendo un fosfuto 2 a glucosa duramve su transporte (recordemos que entra como glucosa-6-fostato). La forma fosforilada de esta enzima también activa In adenilato cielasa, pero cuando le glucosa est siendo constantemente tcansportada por el sistema PTS, la cantidadde esta enzima en su estado fosforilado es baja, por lo que Ia adenitato ‘ivliow esis mesos activa y fue niveies de CAMP bajan, Sitio do union de 187 En resumen, en presencia de glucosa, la represiOn catabolica bloquea ta expresién del operén lactosa y le otras operones que estén bajo este mismo sistema de control global, Cuando Jos niveles de glacosa caen, comienzn a aumentar el nivel de CAMP. Por lo tanto, CAP-cAMP se une a su sitio y prosmieve Ja ranscripcidn, pero, ademas, dobe estar presente el inductor (a allolactosa) para evita que et reprosor se una al operador Cumplidos estos dos requisitos, se producira la wanscripeiGn. Es por eso que ol operda lactoes 0 oo simplemente un ejemplo de control negativo, sino tarnbién de control globat (fie. 10-5). CaP OPERON OPERON Ul ee [ere] ‘CON GLUCOSA | SIN LACTOSA CAB INACTIVO REPRESOR -- ACTIVO, | i [uz [tesa | La transcripoidm no esté activada y esti BLOQUEADA Fig. 10-5, Regolacién det operdn tactea. SIN GLUCOSA Allo}actoca CON LACTOSA inductor) cap fd A Ww REERESOR { TNACTIVO - INACTEVO REPRESOR ACTIVO: @ cAMP cap BNA poimerasa ACTIVO x E oh eer | ter) el mRNA La transeripeién esta ACTIVADA yo esti blequeada183 . SICCION 1+ Otros mecanismos regulatorios globales La represidn catabélica no es el Gnico mecanismo de control global; en £. cali, se han descripto, ademas, varios mecanismos de control global, que le sirven alas eétulas para regular simultineamente varios operones, Por ejemplo, frente.a una limitacién de aminoceil (RNA, se desencadena una modificacién de Ia transcripei6n de varios genes, entre ellos los que codifican RNA y FRNA, denominada respuesta esiricta. La respuesta an shock térmico es otro mecanismo de control global mediado por el fistor o” que se earacleriza por la expresion de mas de 20 genes que coditican diferentes proteinas Ue shock térmico. De manera, simflat, Dente aun dano en et DNA produelio por he ullravioleta 0 poralgtia otro agente, se produtee ks indueci6n de la respuesta SOS que implica fa transeripciéa de varios, genes de iy inactivacign de la proteins represors Lex. La respuesta a modificaciones bruscas de! pHa cambios abrupios de la prestén osmatica, a la preseneiade formas reactiyas del oxigeno, a I entradaen fase estacionaria, ete. representa diferentes ejemplos de respuestas en Ins que interviene algiin tipo de sistema global de regrlacidn. El esludio de los mecanismos moleculares invoiterados en sistemas globules de regulacidn es actualmente un area de investigacién en desarrollo activo en muchas especies bbacterianas. El operdn triptofano: regulacién megativa y atenuacién Et operia triptotino de E. cofies el clisico éemplo de un operdn biosintétice regulado negativamerte por un represor. Esie operén comtiene $ geves estructirales yue codifiean pata S enzinsas involucradas en la ruta bosintética en muchos opercnes, existe mas de un mecanismo de egulacisn operando en su control Como podria esperarse en el easo de una ruta bist existe una proteina represora codilicada por el gen regulatorio “7p, Ia cual en exceso de tiptofene inhibe ta transeripeion de los genes del operdn. El triptolano actia ‘como corepresory cs tn ejemplo tipico de conte! nexativo (represidn) (ig. 10-3). Auingue éste representa e. principal mecanismo de control. la eontinuaciéa de la transcrip también estf controlada por el mecanismo de stenuiaci6a, Seenencia lider ‘ianundor ine ms neil ey 3 4 GENERALIOADES La atenuacién es un mecanisme de control de !a transcripeién, may utifizada por las bacterias, En este caso el control tiene lugar una vez que se ha iniciado Ia transcripcién, pero antes de que ésta termine. La sintesis de varios aminoacids estd sometida a conrol por atemacién En £. coli, uno de los primeros ejemplos deseriptos fue cl del opera triprofano. En éste existe una secuencia lider uubicada entre el onerador y el primer gem estructural. Esta regién codifiea para la sintesis de un péptido lider y es responsable de controlar Ie continuaciér dela transeripeién una vez. que In RINA polimerasa se ha unido al promotor, Esto ocurre porque Ia regién lider (fg, 10-6) contiene ademas un atenuader, Ei aleauador es un tenninador rho- independiente eon un cono segmento rico en GC y seguido de 8 residuos U. Ef mRNA transeripto a partir de esa secuencia lider posee 4 regiones (/ a 4),que pueden formar tres horquillas diferentes (horquilla 1:2, horquilla 2:3, hhorquilla 3:4). La cantidad de triptofanitif@NA presente en fa célula determinard cudt de las diferentes estructuras secundarias posibles formard ese mRNA, Recordemos qure la formacidn de estructuras secuncdarias (horquillas) en el mRNA resulta de un apareamiento complemeniario de las bases dal RNA tennscripto a partir de secuencias epetidas invertidas. El comportamiente det ribosoma dante la traduecién regulard la actividad de Is RNA polimeresa. Esto es posible Porque en provariotis la transeripcidn y a traduccién estin estrechanente aenptadas Cuando hay triptofano en el ‘medio, la conticad de teiptofaail-¢RNA es suficiente pars Ia sintesis proteica, por fo tanto, ef ribosoma continuard leyendo ef mRNA hasta que aleance et codén de termiinacion det péptico lider. Al no estar la regién 2 dsponible, se forraa Ja horquilla 3:4, y la RNA polimerast se detiene en et atentiador y los Zenes estructurales del operda triptofano na se transcriber (fig. 10-7). Si no hay triptofino disponible, el rivosoma se detiene Al Negara los dos codones adyacentes gue ¢odifican para triptofuno localizades en ta region | de la secuencia del Peptide lider. Cuando eato eeurre, no puede Formarse la Wa. Asi, esa regis quedacé libre y no se formard la horguilia de terminacién, Consecuentemeate, al estar ausente el triptofano, transeribicin los genes esteucturales del operdn triptot Fig, (0-6, Orarizaci de a gin lider ds operin rptofuno. | promotor y el operalor est ala izqucrda del segmento dinyrumado y el primer soo strewn! (e7E) comieuza a la derocba del atenuader. Los segmentos | a4 pueden aparcase en ela radoe com pagushos czculoy Nlanoos em Ia eosin | codiesnts pura tripotine est roprven y formar hoquillis. Los covonesREGULACION METABOLICA, 189 DNA KCESODE TRIPTOFANO RNA polimerasa — “ 4 > Genesestructurtes del > v > opera triptofaxe PEPTIDO LIDER Y/ con Z BeRaORNNS! TRANSCRIPCION BLOQUEADA, Fig, 10-7. En condiciones de excoso de roFno, cl ihoroma tadave el peptide fier comple, Ail region 2 puede sparcar con la 3. Ents In regién 3 se aparca co lay se forms ute estos temitadors de fs Iengcripesin que bloques fa RNA polimeras. Estemecanismio de control medinds por cut suuinacit especitico se denomina atenuacien. — | Ambos mecanisinos, el cont negative medindo por una proteina represora y ta alenvaci6n operin de manent contral ile la transeripeidn del operon conju logrando el Ariplifiues de nianera mas eficiome Ca oportung recodar aqui que ef esta rita metabdlica no sélo operan los mecanismos que regulan fa transerigcién del mRNA, sino que también existe regulscién sobre la actividad ehzimstica, Cuanito hay triptofano en ta eétida, éste se uve a la primera enzims de fa ruta biosintética inhibiendo asi fa sintesis de mis triptofaao. Es decir, este ‘aUTEIICIA DE | | esum ejemplo mis de inhbicibn por retroatimentacion, | THPTOEANG | cm etreneam an | Regeicin génleu medida por RNA asthestide 4 paiatsetoe Como hemos visto hasta ahora, los mecanismos que regllan Ta expresign génica imvolucran la partieipacién de diferentes tipos de proteinas regultorias. Sic embargo, en ciertos casos la molécula regiladora puede ser RNA y no tna protein. E1 RNA aatisentido es una molzcula de RNA regulatoria con una secucncta nuceotidiea complementaria al mRNA blanco (RNA coa sentido). El aparearniento del RNA antisentido al mRNA produce la inhibiciéa de fa teaduccidn EI RNA ontisentido se puetesintetiaar a parir codons due cdiin pur te amide ge frna la hong 23. delamismo gen que coditiea para ¢! mRNA siempre yeuando {e's preview formacin defo frye 3 por a lam ia tenga un segundo promotor orientado en sentido contraio tase saline seamen 6 mie an al oteo extrema det gen. (Un ejemplo para ilustar este Fig, 10:8. En avsencia de trptofino, bt tenduccidn se deigne 20 los