Nombre-Año
(1) Heteroresistance to
Itraconazole Alters the
Morphology and Increases
the Virulence of
Cryptococcus gattii - 2015 –
Ferreira, G, et al.
(2) Dynamic ploidy changes
drive fluconazole resistance
in human cryptococcal
meningitis - 2018 -Stone, N,
et al.
Agente en estudio Método
Cryptococcus gattii -Pruebas de susceptibilidad a
fármacos antimicóticos: La CIM para
itraconazol se determinó tanto por el
método de microdilución como por
spot en agar dextrosa de Sabouraud
(SDA) suplementado con diferentes
concentraciones de itraconazol.
-Detección inicial y estabilidad de la
heterorresistencia al itraconazol: los
aislamientos se consideraron
heterorresistentes cuando una
fracción del inóculo pudo crecer a
una concentración mayor que la CIM
Visualización de cápsulas y
mediciones de tamaño mediante la
tinción de contraste con tinta:
establecer S/V y cambios
morfológicos
-Electroforesis en gel de campo
pulsado (PFGE)
-Efecto post antifúngico (PAGE)
Cryptococcus -Ensayo rodamina 6G (R6G): mide la
neoformans, actividad del flujo de salida de los
Cryptococcus gattii transportadores tipo ABC, que
depende del ATP y se reduce
Resultados
-Pruebas de susceptibilidad a
fármacos antimicóticos: Todas las
cepas de C. gattii exhibieron
heteroresistencia, pero lo hicieron en
diferentes niveles que oscilaron
entre 3 µg/ml y 13 µg/ml.
-Visualización de cápsulas y
mediciones de tamaño mediante la
tinción de contraste con tinta:
-PFGE: reveló que las células de
levadura originales y
heteroresistentes de la cepa L135/03
tenían el mismo número de
cromosomas (nueve) pero diferentes
patrones de bandas. Los clones
heterorresistentes revelaron un
contenido de ergosterol
significativamente menor que el de
las cepas originales
PAFE: Los clones heterorresistentes
murieron lentamente y exhibieron
PAFE cortos o nulos de itraconazol.
-Se demostró que la disomía,
particularmente de Chr1, era común
en los aislamientos heteorresistentes
de la línea de base y se
correlacionaba con las medidas
Conclusiones
-El desarrollo de heteroresistencia se
correlaciona con un aumento en la
relación superficie/volumen (S/V) en
células de C. gattii y que los clones
heteroresistentes son más virulentos
que las cepas originales de las cuales se
derivan. La relación S / V de una célula
afecta varios aspectos de su biología, ya
que la tasa de crecimiento de la célula
depende, entre otras cosas, de la tasa de
intercambio de nutrientes.
-Con base en las características
farmacodinámicas descritas
anteriormente, podemos suponer que
las células heterorresistentes
necesitarían una exposición más larga y
continua que las células originales al
itraconazol para producir un efecto
fungistático eficiente.
-La heterorresistencia al itraconazol es
intrínseca en todas las cepas de C. gattii
analizadas y representa un mecanismo
adaptativo para la supervivencia bajo
estrés de azol. Los hallazgos
demostraron que la heteroresistencia
altera la morfología celular (S/V y el
tamaño de la cápsula), las cantidades de
ergosterol en las células y las actividades
enzimáticas antioxidantes. Estas
modificaciones pueden representar
mecanismos adicionales que resultan en
la ineficacia del tratamiento con
itraconazol en pacientes con alta carga
fúngica, ya que conducen a cambios en
los parámetros farmacodinámicos (por
ejemplo, curva de tiempo muerto y
PAFE) y aumento de la virulencia de C.
gattii
-La recaída clínica y HetR se asocia con
disomía Chr1.
-En 2 de los 3 pacientes, el aislado de
recaída fue aneuploide y se asoció con
un aumento en la CIM en comparación
 drásticamente en ausencia de fenotípicas de resistencia in vitro, con la cepa parental inicial original, así
glucosa incluida la actividad de la bomba de como un aumento en el% de HetR en
-RT-PCR: para analizar los niveles de eflujo y MIC. cada punto de tiempo de recaída
expresión de 2 genes relevantes en -Las cepas de recaída volvieron al - La reversión a la línea de base MIC
Chr1: AFR1, que codifica una bomba MIC basal después de 10 y 12 pases, estuvo acompañada por la pérdida de
de eflujo, y ERG11, que codifica la respectivamente. las aneuploidías relevantes, de acuerdo
enzima diana del FLC. - Hubo una asociación significativa con la hipótesis de que las aneuploidías
Los cebadores AFR1 fueron 5'- entre los aislados de HetR con la son responsables del fenotipo HetR en
CCCACTTTGCCATACTTTTGG-3' forward y disomía de Chr1 y la actividad del estos aislamientos y que incurren en un
5'-AACTGTGGAGACAAGACCACTGATAA-3' flujo de salida. costo de aptitud en ausencia de
reverse. selección de medicamentos que
Los cebadores Erg11 utilizados conduciendo a una reversión del
fueron 5'-TGGCAAGACGCCAAAGTCT-3' fenotipo HetR
forward, 5'-GGCGGCAAATCCCTTTTC-3' -La heteroresistencia a FLC es intrínseca
reverse. a las cepas clínicas de Cn que causan CM
-E-test asociada al VIH. Además, el tratamiento
-Perfil de análisis de población de inducción en CM con monoterapia
-Extracción de ADN y secuenciación con FLU puede aumentar el tamaño de
- Estudio de evolución in vitro de las subpoblaciones criptocócicas HetR
heteroresistencia que acumulan aneuploidías.
- Las pruebas de diagnóstico de rutina
realizadas por Etest o microdilución de
caldo no miden HetR; generalmente
implica un tamaño de subpoblación que
es demasiado pequeño para ser
detectado con estos ensayos.
- La naturaleza transitoria de la
resistencia a la FLC debido a la
aneuploidía también confunde su
detección porque se pierde rápidamente
al eliminar la presión del fármaco.
(1) C. neoformans supera el estrés del contacto con fluconazol mediante la formación de disomía en cromosomas específicos, especialmente el cromosoma 1, que está estrechamente relacionado
con el gen ERG11. Nuestros resultados revelaron diferentes patrones de bandas entre las células heterorresistentes y originales por PFGE, lo que sugiere un mecanismo de adaptación debido a la
presión de itraconazol. La duplicación y pérdida de genes es un mecanismo poderoso en la evolución de hongos (26). Por lo tanto, suponemos que la organización del genoma, como se ve en los
clones heterorresistentes, es una consecuencia del desarrollo de resistencia a los azoles. Algunos autores también han informado que la exposición de C. neoformans a concentraciones subinhibitorias
de fluconazol altera el perfil lipídico de las células de levadura

(2) Se sabe que dos genes en Chr1 desempeñan un papel importante en la resistencia criptocócica a FLC: ERG11, que codifica la enzima diana FLC lanosterol-α-desmetilasa (26), y AFR1, una bomba
de flujo de flujo de tipo ABC.

La disfunción en la regulación de la apoptosis también puede permitir que las células aneuploides persistan en la población. En ausencia de Aif1, una proteína que induce la muerte celular similar a
la apoptosis en C. neoformans, las poblaciones tienen una mayor frecuencia de disomía de Chr1 y resistencia a FLC.

La reversión a la euploidía en ausencia de estrés farmacológico sugiere que la aneuploidía conlleva un costo de acondicionamiento que ya no vale la pena soportar en ausencia de la selección de
fluconazol.