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LICENCIATURA

MÉDICO CIRUJANO INTEGRAL

MANUAL DE PRÁCTICAS
DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y
CELULAR

DOCENTE:
__________________________________________

NOMBRE DEL ALUMNO: ______________________________________________

GRADO Y GRUPO: ____________________________

ENERO-JUNIO 2019
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
MANUAL DE PRÁCTICAS DE BIOLOGÍA MOLECULAR Y CELULAR
Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 1/73
01
21 06 2017 21 08 2017

ÍNDICE
No Título Página

1 Directorio 2

2 Introducción 3

3 Niveles de desempeño, objetivos (habilidades y actitudes) 4

4 Normas generales de seguridad e Higiene 5

5 Medidas generales en caso de accidente 6

6 Reglamento de ingreso y permanencia 8

7 Criterios de Evaluación de la materia de Biología Molecular y Celular. 9

9 Índice de prácticas 11

Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
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Día Mes Año Día Mes Año 2/73
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Directorio

MDA. Juan Camilo Mesa Jaramillo


Rector de la Universidad Cuauhtémoc, plantel Aguascalientes

Dr. Salvador Bueno Valenzuela


Director de la Escuela de Medicina
Universidad Cuauhtémoc plantel Aguascalientes

M. en C. María Teresa Espinosa Roque


Coordinador de la Academia de Ciencias Biomédicas de la Escuela de Medicina
Universidad Cuauhtémoc plantel Aguascalientes

M. en C. Anastacio Palacios Marmolejo


Catedrático de la materia de Biología Molecular y Celular de la Escuela de Medicina
Universidad Cuauhtémoc plantel Aguascalientes

Dr. en C. Víctor Hugo Fuentes Delgado


Catedrático de la Materia de Biología Molecular y Celular y Presidente del
Comité de Investigación de la Escuela de Medicina de la
Universidad Cuauhtémoc plantel Aguascalientes

Biología
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Día Mes Año Día Mes Año 3/73
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Introducción

El estudiante de Medicina debe de tener en cuenta que el proceso salud – enfermedad


es un reto importante para la población, ya que es un rubro que recibe un gran aporte
económico por parte del gobierno estatal y federal, para la obtención de medicamentos y
equipamiento que sirvan para el diagnóstico y tratamiento de las enfermedades; por lo tanto,
es necesario que los estudiantes, tengan una mayor especialización y conocimientos en
relación a la Biología Molecular, propiciando una educación y capacitación que les permita
resolver problemas complejos que se les presenten en su ámbito laboral.

Teniendo en cuenta lo anterior, el presente manual se ha diseñado con el propósito de


fomentar no solo el conocimiento inherente al quehacer de la Biología Molecular, sino que
también puede usarse en labores de investigación en asignaturas diferentes a la Biología
Molecular, brindando a demás herramientas docentes en aras de preparar a los alumnos para
entender muchos de los ensayos realizados comúnmente en la clínica con fines diagnósticos.

El plan general del presente manual, contempla la referencia a los fundamentos


teóricos de la Biología molecular, bioquímica y metabolismo de las sustancias en estudio.
Dado que el estudiante deberá presentar este manual y un informe para cada práctica se
facilitará el desarrollo de competencias planteadas en el programa de esta materia.

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Día Mes Año Día Mes Año 4/73
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Niveles de desempeño, desarrollo de habilidades y actitudes a las


que contribuye el presente manual
El conjunto de prácticas del presente manual desarrolla un acumulo de actividades de
naturaleza diversa, en las que se tiene que mostrar creatividad y habilidad para conciliar
intereses, motivar y dirigir grupos de trabajo por los alumnos, así como para acatar las
indicaciones que proporciona el profesor a cargo de la asignatura. Las razones por las que los
alumnos obtendrán un nivel de desempeño tan alto son:

 La realización de las prácticas en forma y tiempo presupone el dominio de diferentes


habilidades y conocimientos.
 La elaboración del reporte de la práctica en el presente manual requiere de disciplina y
laboriosidad, así como la utilización de herramientas computacionales para búsqueda de
información, lectura de textos universitarios especializados en el área de Biología
Molecular, así como artículos científicos relacionados con esta área del conocimiento.
 El desarrollo de las prácticas se realizará en equipo, lo que requiere de la participación
armónica de los elementos. La capacidad de liderazgo deberá ser usada en forma óptima
para realizar los diversos pasos de la práctica.

Puesto que el desarrollo de las prácticas se considera una actividad integradora, el


alumno deberá de observar una conducta adecuada durante la misma, con actitudes de
respeto a sus compañeros y maestros. La pulcritud y el orden será un factor que te permita
desarrollar la habilidad requerida para la realización de las actividades planteadas en el
manual, con miras a que el posterior desempeño profesional de los alumnos sea de alto nivel.

Habilidades.
 Reconocerá la organización del genoma y función desde un punto de vista molecular y
celular.
 Identificará la estructura y fisiología del núcleo y del DNA como portador de la información
genética y su empaquetamiento.
 Entenderá el flujo, regulación y expresión de la información genética en los seres vivos.
 Conocerá y describirá los principales métodos de estudio de la célula.
 Transmitirá información a otros profesionales y a un público no especializado.
 Asimilará el mapa metabólico global del humano ante salud y la enfermedad.

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Actitudes.
El alumno:
 Trabajará en equipo para la elaboración de tareas y prácticas de laboratorio, dominará
el lenguaje y tendrá capacidad de comunicación para orientar y emitir criterios en el
equipo de trabajo que le serán útiles para su desempeño profesional en la práctica
clínica.

 Cumplirá las medidas de higiene personal y uso de ropa según lo establecido en la


norma del laboratorio.

 Emitirá juicios críticos al asociar conocimientos teóricos obtenidos en esta y otras


asignatura y los relacionará con la estructura celular, tisular y orgánica sin alteraciones
patológicas.

 Demostrará la responsabilidad para el aprendizaje y aplicación del conocimiento en su


desarrollo profesional, de prestar a la aplicación de sus servicios una actuación ética
para su entorno social para la preservación de la salud y utilizara los materiales de
enseñanza con el debido cuidado y respeto.

Normas generales de seguridad e higiene


1. El uso de bata es obligatorio
2. Antes de empezar el trabajo en el laboratorio el alumno debe de familiarizarse con los
elementos de seguridad disponibles.
3. Se deben localizar las salidas principales y de emergencia si es necesaria una
evacuación por fuego o por cualquier otro incidente, así como conocer la localización
exacta de extintores, duchas de seguridad y duchas de ojos.
4. En algunas prácticas se deberá usar gafas de seguridad, esto dependerá del tipo de
reactivo químico que se emplee durante la práctica.
5. Sí un producto químico le salpica los ojos, utilice inmediatamente una ducha de ojos y
lave completamente el ojo afectado durante 15 minutos sin interrupción. Actúe siempre
con urgencia. No dirija una corriente de alta presión de agua de un grifo directamente
al ojo porque podría lesionarlo. Informe al encargado del laboratorio de lo sucedido e
informar al docente del incidente ocurrido.
6. El uso del uniforme completo es obligatorio, no se permite el uso de suéter, sudaderas
o chamarras sobre la bata.
7. Esta estrictamente prohibido introducir comida o bebidas al laboratorio, a fin de evitar
un posible incidente de contaminación química, física o microbiana.
8. Lavarse siempre las manos antes y después de hacer cualquier análisis y a la salida
del laboratorio.
9. No, inhale, pruebe o huela productos químicos, cualquier sustancia o recipiente que se
encuentre dentro del laboratorio.
10. Cerrar herméticamente los frascos de productos químicos después de utilizarlos.

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11. Para pipetear los líquidos utilice siempre una bombilla pipeteadora, está estrictamente
prohibido succionar directamente con la boca.
12. Cuando caliente tubos de ensayo hágalo siempre en la parte superior del líquido y con
agitación suave, nunca por el fondo del tubo, y debe estar inclinado y no apuntar hacia
ninguna persona.
13. No deben transportarse innecesariamente los reactivos de un sitio a otro del
laboratorio. Sí tuviese que hacerlo extreme precauciones.
14. El área de trabajo tiene que mantenerse siempre limpia y ordenada, sin libros, abrigos,
bolsas o sustancias químicas vertidas.
15. La conducta en el laboratorio debe ser seria, sin bromas, sin correr, jugar, empujar,
gritar, etc.
16. No se puede hacer ningún experimento o procedimiento de laboratorio no autorizado.
17. No utilice un equipo o aparato sin conocer perfectamente su funcionamiento.
18. No utilice material de cristal en mal estado ya que aumenta el riesgo de accidentes.
19. El material y los aparatos utilizados tienen que dejarse siempre limpios y en perfecto
estado de uso.
20. Todas las sustancias químicas tienen que ser manejadas con mucho cuidado de
acuerdo con las Hojas de Seguridad de cada una de las sustancias, por eso es
importante que se familiarice con las etiquetas de seguridad que vienen en cada uno
de ellos.
21. En caso de trabajar con reactivos químicos, no inhale los vapores de productos
químicos y trabaje siempre en vitrinas extractoras, especialmente cuando manipule
productos tóxicos, irritantes, corrosivos o lacrimógenos.

Medidas generales en caso de accidente


Plan general de emergencia:

1. Dar la alarma.
2. Ponerse a salvo.
3. Ayudar a las personas si está capacitado para ello y el peligro no representa un riesgo
para su seguridad.
4. Avisar al responsable del laboratorio.
5. Evacuación del aula en caso necesario.
6. En caso de fuego evacuar el laboratorio, por pequeño que este sea.
7. Avisar a todos los compañeros de trabajo sin que se extienda el pánico y conservando
siempre la calma.
8. Retirar los productos químicos inflamables que estén cerca del fuego.

Fuego en el cuerpo:

1. Sí se incendia su ropa, pida inmediatamente ayuda.


2. Tírese al suelo y ruede sobre sí mismo para apagar las llamas.

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3. No corra ni intente llegar a la ducha de seguridad si no es que está muy cerca de


usted.

Quemaduras:

1. Las pequeñas quemaduras producidas por material caliente, baños, placas, etc., se
tratarán lavando la zona afectada con agua fría durante 10-15 minutos.
2. En caso de cualquier incidente informar inmediatamente al docente responsable de la
práctica.

Cortes:

1. Las cortadas se tienen que lavar bien, con agua abundante, con corriente en chorro,
durante 10 minutos como mínimo.
2. En caso de cualquier incidente informar inmediatamente al docente responsable de la
práctica.

Derrame de sustancias químicas sobre la piel:

1. Las sustancias químicas que se hayan vertido sobre la piel han de ser lavados
inmediatamente con agua corriente abundantemente, como mínimo durante 15
minutos.
2. Las duchas de seguridad instaladas en los laboratorios serán utilizadas en aquellos
casos en que la zona afectada del cuerpo sea grande y no sea suficiente el lavado de
la tarja.
3. Recuerde que la rapidez en el lavado es muy importante para reducir riesgo de
afectación a la piel.
4. En caso de cualquier incidente informar inmediatamente al docente responsable de la
práctica.

Corrosiones en los ojos:

1. En este caso el tiempo es esencial (menos de 10 segundos), cuanto antes se lave el


ojo menos grave será el daño producido.
2. Lave los dos ojos con agua corriente abundantemente durante 15 minutos como
mínimo, en una ducha de ojos, y, si no hay, con un frasco de lavar los ojos.
3. Es necesario mantener los ojos abiertos con la ayuda de los dedos para facilitar el
lavado debajo de los párpados.
4. En caso de cualquier incidente informar inmediatamente al docente responsable de la
práctica.

Ingestión de accidental de sustancias químicas:

1. En caso de cualquier incidente informar inmediatamente al docente responsable de la


práctica.

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Reglamento de ingreso y permanencia al Laboratorio de Biología


Molecular y Celular.

1. En la primera sesión se integraran los equipos de laboratorio y se designará a uno de


los integrantes como responsable, el cual debe responder por el material e
instrumentos que se utilicen en cada una de las prácticas.
2. El alumno se debe presentar en tiempo, con su Manual de Prácticas impreso, el uso
de bata es obligatorio, así como la vestimenta establecida en el Reglamento de la
Escuela de Medicina, si no cumple con este requisito no podrá participar en la práctica.
3. Las alumnas deberán traer el pelo perfectamente recogido, antes de ingresar al
laboratorio, además las uñas deben ser cortas y sin esmalte.
4. Para los alumnos deben traer corte de pelo tipo escolar, de preferencia sin barba y
bigote, y sí la mantienen deben estar perfectamente delineados.
5. Antes de comenzar con el desarrollo de la práctica, el alumno deberá tener
conocimientos previos sobre su contenido, para lo cual debe entregar de forma
impresa las respuestas del cuestionario de la práctica a realizar. De no cumplir con
esta reglamentación, no tiene derecho a asistir a la clase práctica. Así como incluir en
cada actividad las referencias bibliográficas consultadas en formato APA.
6. Esta estrictamente prohibido comer o beber dentro del laboratorio, el alumno que no
acate esta disposición deberá abandonar la práctica. Además no se está permitido
introducir bebidas o alimentos.
7. Se debe realizar una adecuada disposición y manejo de los residuos RPBI, que se
generen durante el desarrollo de la práctica, para lo cual deberá identificar cada uno
de los recipientes en los que debe colocar cada uno de los materiales de desecho.
Además se tiene que familiarizar con los elementos de seguridad disponibles.
8. Cada alumno debe registrar su asistencia en el Registro de Prácticas de Laboratorio.
9. La conducta en el laboratorio debe ser seria, sin bromas, sin correr, jugar, empujar,
gritar, etc. Debe siempre estar atento y concentrado en cada una de las etapas. De no
ser así, el alumno que altere el orden deberá abandonar la práctica.
10. Esta estrictamente prohibido utilizar teléfonos celulares o cualquier otros dispositivo
electrónico, salvo que el docente lo considere necesario para integrar evidencia del
desarrollo de la práctica.
11. Se debe realizar el vale del pedido de material previo al inicio de la práctica, el cual
deberá entregarse de manera íntegra y limpió al encargado del laboratorio.
12. Todos los alumnos serán responsables de la integridad de cada uno de los materiales
e instrumentos que utilizan, durante el desarrollo de la práctica, en caso de algún
desperfecto o rotura serán responsables de su reparación o reposición a la brevedad
posible, tal como se define en el Reglamento de Laboratorios de la Escuela de
Medicina.
13. Las mesas de trabajo, el material y los aparatos utilizados tienen que dejarse siempre
limpios y en perfecto estado de uso.

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Criterios de evaluación de la materia de Biología Molecular y Celular


Período Instrumento o actividad de evaluación orientada(o) a mostrar el cumplimiento del Valor
objetivo general. porcentual
Parcial Resultados de la evaluación del primer examen parcial. 80%
l
Resultados de evaluación de rúbricas: prácticas de laboratorio (1, 2 y 3). 10%
Resultados de evaluación de rúbrica de: cuadro sinóptico y dinámicas participativas orales 10%
y discusión de casos (Elaboración de tareas).
Aporte para calificación final. 16.6%
Parcial II Resultados de la evaluación del segundo examen parcial. 80%
Resultados de evaluación de rúbricas de: prácticas de laboratorio (4, 5 y 6). 10%
Resultados de evaluación de rúbrica de: cuadro sinóptico, tarea integradora, discusión de 10%
casos clínicos y dinámicas participativas orales y discusión de casos (Elaboración de
tareas).
Aporte para calificación final. 16.6%
Parcial Resultados de la evaluación del tercer examen parcial. 80%
III Resultados de evaluación de rúbricas de: prácticas de laboratorio (7 y 8). 10%
Resultados de evaluación de rúbricas de: evaluación de dinámicas participativas orales y 10%
discusión de casos (Elaboración de tareas).
Aporte para calificación final. 16.6%
Parcial Resultados de la evaluación de examen final. 80%
Final Resultado de evaluación de rúbrica de: tarea integradora, discusión de casos clínicos y 20%
dinámicas participativas orales y discusión de casos (Elaboración de tareas).
Aporte para calificación final 50%
Nota: la cantidad de prácticas que el docente realice por parcial puede variar, de
acuerdo al avance programático. Aunque se deben completar el número establecido.

Criterios de evaluación del Laboratorio de Biología Molecular y


Celular.
1. El alumno debe asistir a cada una de las sesiones de laboratorio, en caso de
inasistencia, ya sea por su decisión propia o por incumplimiento del Reglamento de
Ingreso y Permanencia, no tendrá derecho a calificación para esa práctica.
2. Al finalizar cada período parcial cada alumno de deberá entregar los Reportes de
Prácticas de Laboratorio realizadas en el mismo, desarrolladas dentro del mismo
manual, como evidencias de evaluaciones aplicadas, para conformar el Portafolio de
Evidencias, siendo este un requisito para presentarse cada uno de los exámenes
parciales; para poder presentar el examen final, deberán entregar el Manual completo,
organizado cronológicamente y engargolado ya con cada una de las prácticas
realizadas en el semestre, sus resultados y la rúbrica de evaluación.
3. El valor de calificación corresponde a la ponderación definida para cada parcial y para el
examen final, en la Planeación Docente de la materia.
4. La calificación del laboratorio tiene un valor porcentual total de 10% en la calificación de
la materia, en cada período evaluativo.
5. La evaluación del laboratorio consta de:
 El desempeño en el desarrollo y cumplimiento de las actividades de la práctica y del
reglamento de ingreso y permanencia.
 El cumplimiento de la entrega del reporte de acuerdo a los requisitos establecidos.
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6. Los resultados del desempeño en cada práctica se plasmará en la rúbrica de evaluación


que aparece al final de cada actividad del presente Manual. Se presenta el formato de
la Rúbrica del desempeño de Prácticas de Laboratorio
Categorías Ponderación asignada

Profesional Destacado Aceptable Requiere mejorar Exige compromiso

Presentación Requerimientos de portada: Logos Portada con Logos Portada sin logos o Portada sin datos de No presenta portada.
Máximo puntaje: Institucionales, Título del trabajo, datos Institucionales pero los los datos de identificación, Logos
1.0 del/los autores, Fecha de Realización, otros datos de identificación están Institucionales o
Nombre del docente y de la materia, identificación están Incompletos. presenta errores.
semestre y grupo. incompletos. Ponderación: 0.4 Ponderación: 0.0
Ponderación: 1.0 Ponderación: 0.8 Ponderación: 0.6
Desarrollo Realiza de forma precisa, concisa y en Realiza en más del Realiza en no más No realiza de forma No participa en el
experimental tiempo las instrucciones de trabajo. 70% las instrucciones del 50% las correcta ninguno de desarrollo de la
Actitudes

Máximo puntaje: Mantiene disciplina, registra los datos y de forma correcta, instrucciones de los procedimientos. práctica.
forma correcta, No participa y
3.0 participa en las actividades de la práctica. registra datos en forma
registra en forma y registra resultados
y tiempo. tiempo los datos obtenidos.
Ponderación: 3.0 Ponderación: 2.0 obtenidos. Ponderación: 0.5
Ponderación: 1.0 Ponderación: 0.0
Cuestionario Responde o elabora todas las respuestas Responde o elabora Responde o elabora Responde o elabora No responde el
Máximo del cuestionario de forma correcta, indaga una respuesta de forma dos respuestas de tres o más cuestionario.
puntaje: 2.0 y analiza la información relacionada con incorrecta, aunque forma incorrecta. respuestas de forma
los ciclos metabólicos. analice la información. incorrecta.
Ponderación: 2.0 Ponderación: 1.5 Ponderación: 1.0 Ponderación: 0.5 Ponderación: 0.0
Análisis de Presenta resultados claros y precisos, Presenta resultados Presenta resultados Los resultados No realiza análisis de
Resultados ajustándose al objetivo. Asimila la claros y sin precisión. sin claridad ni presentados no se resultados.
Máximo puntaje: información, aplica conocimientos básicos Se ajustan al objetivo precisión y estos ajustan al objetivo de
de biología molecular y celular. de la misma. Expresa difícilmente se la práctica. No puede
2.0
Demuestra capacidad para resolver capacidad analítica ajustan al objetivo de evidenciar todos los
problemas en el ámbito metabólico de la pudiendo evidenciar los la práctica, resultados.
salud y enfermedad. Genera marcos resultados. demostrando limitada
conceptuales del funcionamiento capacidad analítica.
molecular y celular y desarrolla método
analítico. Evidencia los resultados.
Ponderación: 2.0 Ponderación: 1.5 Ponderación: 1.0 Ponderación: 0.5 Ponderación: 0.0
Discusión y Sintetiza las ideas y las relaciona con los Logra cierta coherencia No logra sintetizar Las que ideas que No realiza discusión
Habilidades

conclusión objetivos y la teoría. Compara entre las ideas y las ideas y objetivo expresa son ni conclusión de
Máximo puntaje: información obtenida con la publicada en objetivo de la práctica y de la práctica y las totalmente resultados.
1.5 la literatura. Interpreta el estado de salud las contrasta de forma contrasta de forma discordantes con el
según datos de laboratorio. Transmite adecuada contra le inadecuada contra le objetivo de la
información a profesionales y personal no teoría. teoría. práctica y no hace
especializado. contraste contra le
Ponderación: 1.5 Ponderación: 1.0 teoría. Ponderación: 0.0
Ponderación: 0.5 Ponderación: 0.2
Bibliografía Aprende a buscar información Presenta las citas No cumple con la No cumple con la No presenta
Máximo puntaje: bibliográfica veraz y actualizada y la requeridas sin la cantidad de citas y si cantidad de citas o bibliografía.
0.5 presenta en cantidad y calidad: tres citas, calidad esperada: No las presenta no están
actualizadas como máximo 5 años y en actualizadas. actualizadas y actualizadas ni en el
formato Vancouver o APA. formato definido. formato definido.
Ponderación: 0.5 Ponderación: 0.3 Ponderación: 0.2 Ponderación: 0.1 Ponderación: 0.0
Calificación Final. 10 puntos, equivalentes al 10% de la evaluación del período.

Nombre y firma de los alumnos


Notas del profesor y firma:
1.-_____________________________
_______________________________________________

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Índice de prácticas

No Nombre de la práctica Página


Introducción al Laboratorio de Biología Molecular.
1 Instrumentación. 12

Observación microscópica de cromosomas y separación de


2 ADN por electroforesis en gel de agarosa. 19

Transformación bacteriana por choque térmico para la


3 expresión del plásmido +pGLO 26

Obtención de proteína recombinante y su separación por


4 electroforesis. 34

Extracción de ADN total a partir de: cultivo bacteriano, suero y


5 42
de plásmidos a partir de cultivo bacteriano.
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la
6 determinación de ADN bacteriano 50

Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para la


7 determinación de ADN humano en una muestra de suero. 56

Reacción en Cadena de la Polimerasa con Transcriptasa Inversa


8 (RT-PCR) para la determinación de material genético viral. 62

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PRÁCTICA 1.
INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE BIOLOGÍA MOLECULAR.
INSTRUMENTACIÓN.
Introducción.

El desarrollo tecnológico ha impactado directamente en el quehacer científico básico,


adecuando innovaciones técnicas a la práctica médica actual, sobre todo al considerar que
las enfermedades humanas son el resultado de una interacción entre la constitución genética
de un individuo y el ambiente. Partiendo de este concepto, la individualidad genética de cada
persona resulta trascendental, no sólo para las enfermedades básicamente de origen
genético, como en los casos de enfermedades mendelianas clásicas, sino que también en
enfermedades multifactoriales con alta frecuencia poblacional, como las enfermedades
crónicas del adulto o trastornos pediátricos y las enfermedades de carácter infeccioso. Estas
últimas han cobrado una gran importancia debido a su capacidad de contagio y propagación a
través de grandes distancias y con el potencial de producir una pandemia, por lo cual el
estudiante de Licenciatura Médico Cirujano Integral debe estar ampliamente capacitado para
hacer frente a dicha circunstancia.

El laboratorio de Biología Molecular tiene por objetivo principal, el ofrecer una


infraestructura completa y altamente especializada, que permita conjuntar el conocimiento
biomédico y el análisis molecular para proporcionar un diagnóstico basado en evidencia,
confiable, rápido y a gran escala, con el cual impactar en las diferentes especialidades de la
medicina actual. Adicionalmente a lo anterior, la combinación de distintas técnicas
moleculares (PCR punto final, PCR en Tiempo Real, microarreglos, hibridación de ácido
nucleicos, secuenciación, etc.), permite desarrollar y aplicar técnicas cuyo flujo de trabajo es
relativamente simple, con un alto grado de confiabilidad, aplicables a gran escala y de forma
automatizada. Al contar con este tipo de pruebas es posible convertir a un laboratorio de
diagnóstico molecular en un laboratorio referencial, sin embargo, esto exige, que el personal
tenga la experiencia tanto a nivel de investigación básica, como el conocimiento clínico y
médico utilizando reactivos, equipos y técnicas de Biología Molecular, de tal forma que sea
capaz de instrumentar los controles de calidad que respalden la información derivada de
estudios genético-moleculares. En forma adicional, el conocimiento del genotipo de una
persona por medio de un análisis molecular, automáticamente proporciona información de sus
familiares, con o sin su consentimiento o participación activa. Por estas razones, la
información genética de un individuo deberá ser mantenida bajo máxima confidencialidad.

Actividad: Requisito para ingresar a práctica. Resolver en el cuadernillo de biología molecular


y celular cada una de las preguntas del cuestionario de la práctica a la que corresponde. Las
cuales se deben de refutar con bibliografía sugerida.

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2. OBJETIVOS DEL APRENDIZAJE:


El alumno deberá conocer la instrumentación y equipamiento básico del laboratorio de
biología molecular así como su funcionamiento.

3. METODOLOGÍA.
3.1. Materiales, reactivos y equipo:

Materiales y equipo Reactivos


Vaso de precipitados
Matraces
Pipetas serológicas de diferentes volumen
Gradillas de polipropileno
Caja Petri de plástico
Micropipetas y puntas de diferentes volumen
Tubos Eppendorf
Tubos de reacción para PCR
H2O Destilada
Autoclave eléctrica
Gabinete de seguridad biológica
Balanza analítica
microcentrífuga
Espectrofotómetro
Termociclador
Cámara de electroforesis
Transiluminador UV

3.2. Procedimiento.
1. Explicación por parte del profesor el funcionamiento de cada uno de los equipos y/o
instrumental utilizado en el laboratorio de Biología Molecular
2. Determinación del error de exactitud y precisión para la medición del volumen utilizando
agua destilada.
a. Coloque la balanza analítica sobre una superficie nivelada.
b. Coloque una caja Petri sin tapa dentro de la balanza analítica y tare

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Día Mes Año Día Mes Año 15/73
01
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c. Realice las siguientes mediciones de volumen utilizando las pipetas


serólogicas y las micropipetas y obtenga el peso de cada una de ellas.
Considere la densidad del agua como 1 g/ml.
Volumen
en ml Peso Peso Peso promedio Error observado. Desviación % de error de exactitud Exactitud obtenida por
en g esperado por volumen E= Peso estándar por por volumen = 100*(Vol. volumen
(valor obtenido – peso volumen en real – Vol.
observado) promedio ml. Obtenido)/Vol. real Edet = (media
observada- µ (valor
esperado)

10 10 g
10
10
5 5g
5
5
1 1g
1
1
0.750 750 mg
0.750
0.750
0.500 500 mg
0.500
0.500
0.100 100 mg
0.100
0.100
0.075 75 mg
0.075
0.075
0.050 50 mg
0.050
0.050
0.025 25 mg
0.025
0.025
0.010 10 mg
0.010
0.010
0.005 5 mg
0.005
0.005
0.001 1 mg
0.001
0.001

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Día Mes Año Día Mes Año 16/73
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FORMULA DE LA DESVIACIÓN ESTÁNDAR

4. Análisis de resultados.
Actividad. Realizar un análisis de los resultados obtenidos del desarrollo experimental, puede
utilizar: tablas, gráficas, dibujos, fotografías, entre otros.
Se deben de reportar esquemas y/o imágenes del equipo y/o instrumentos utilizados en esta
práctica, cada uno debe de tener su descripción física y funcional.
Además debe explicar a detalle las diferencias obtenidas entre los las mediciones realizadas,
así como la forma en la que determino él % de error de exactitud y la precisión.

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Día Mes Año Día Mes Año 17/73
01
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5. Discusión y conclusión de resultados.

Actividad: Realizar un análisis de los datos obtenidos respecto a los esperados y explicar
cuáles son las principales fuentes de error y cómo puede afectar en las mediciones.
Realizar una conclusión sobre la importancia de la práctica para el aprendizaje de la materia.
Por último deberá realizar una conclusión si se cumplió con el objetivo planteado.

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Día Mes Año Día Mes Año 18/73
01
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6. Bibliografía consultada:
Núm. Autor (es) Libro (nombre) Año Edición Editorial País Pag.
1

7. Cuestionario con orientación clínica.

1.-Explique la diferencia entre precisión y exactitud.

2.-Mencione tres ventajas que tienen las pruebas de diagnóstico molecular sobre las pruebas
inmunológicas.

3.-Explique la importancia de la calibración del equipo utilizado en el laboratorio de Biología


Molecular.

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Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 19/73
01
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8. Evaluación de la actividad: adjuntar a la práctica la rúbrica de evaluación de práctica.

RÚBRICA DE EVALUACIÓN

Categorías Ponderación asignada


Profesional Destacado Aceptable Requiere mejorar Exige
compromiso
Presentación Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.8 Puntaje: 0.6 Puntaje: 4.0 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 1.0
Actitudes

Desarrollo experimental Puntaje: 3.0 Puntaje: 2.0 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje:0.0
Máximo puntaje: 3.0
Cuestionario Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 2.0
Análisis de Resultados Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Habilidades

Máximo puntaje: 2.0


Discusión y conclusión Puntaje:1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.2 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 1.5
Bibliografía Puntaje:0.5 Puntaje: 0.3 Puntaje: 0.2 Puntaje: 0.1 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 0.5
SUMA TOTAL

Calificación Final.

Observaciones del docente:


Nombre y firma del alumno
_______________________________________________
_____________________________________ _______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_____________________________________________

Firma:_____________________________________

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PRÁCTICA 2.
OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE CROMOSOMAS Y
SEPARACIÓN DE ADN POR ELECTROFORESIS EN GEL DE
AGAROSA.
Introducción.

Para un Médico Cirujano Integral, el reconocimiento de la organización número y tipos


de cromosomas presentes en los humano es crucial, debido a que diferentes enfermedades
y síndromes derivan de un traslape inadecuado de los genes durante la segregación e
incluso durante la repartición de la información genética presente en los cromosomas, por lo
tanto estos puntos cruciales son susceptibles de ser identificados e incluso tratados mediante
técnicas de Biología Molecular como hibridación in situ para el silenciamiento de genes, es
decir los alumnos de esta licenciatura podrán utilizar el conocimiento obtenido para
realización de investigación en terapia génica.

Toda la información genética está almacenada en el núcleo de las células de nuestro


cuerpo en el ADN, comprimido y empaquetado en unas estructuras alargadas visibles al
microscopio llamadas cromosomas. Los genes son fragmentos de la cadena de ADN con
instrucciones específicas para la síntesis de proteínas que controlan el desarrollo y el
funcionamiento de nuestro organismo.

Los humanos poseemos 46 cromosomas organizados en 23 pares, un juego de


cromosomas fue heredado de nuestra madre y otro de nuestro padre, a través del óvulo y
del espermatozoide. Con la excepción de un par, los 22 restantes son prácticamente
idénticos y se han numerado del 1 al 22, del más largo al más corto. El par 23, el último y el
único desigual, lo forman los cromosomas sexuales (X, Y). Las mujeres tiene dos
cromosomas X (46,XX), mientras que los hombres tienen uno de cada uno (46,XY).

La integridad de la información genética es fundamental para el desarrollo y el


funcionamiento normal del organismo, por lo que el incremento o decremento del número de
estos generan patologías, por ejemplo, la trisomía 21 o síndrome de Down, en la que hay tres
copias del cromosoma 21.

Los plásmidos son elementos extra cromosomales de replicación autónoma. Son


moléculas ADN de bajo peso molecular y circulares (covalentemente ligados en sus
extremos). Las funciones de los plásmidos son múltiples; portan genes de resistencia
antibióticos, los cuales codifican para fosforilasas, metilasas, etc. Asimismo muchos
plásmidos portan genes que permiten llevar a cabo a las bacterias procesos de infectividad, u
otros procesos biológicos como la asimilación biológica de nitrógeno etc.

En ingeniería genética y Biología Molecular los plásmidos son una de las herramientas
más poderosas ya que se utilizan como vectores, a los cuales se les puede insertar nuevas
secuencias de importancia y ya en el interior de una bacteria, son capaces de auto replicarse
y producir hasta cientos de copias de dicha secuencia.
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Día Mes Año Día Mes Año 21/73
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Los plásmidos desde el punto de vista técnico pueden ser clasificados en vehículos de
clonación y vehículos de expresión, estos últimos contienen las secuencias necesarias para
expresar varios genes en células animales.

Electroforesis y separación de ADN.


La electroforesis es el proceso de movimiento de moléculas cargadas en una solución
al aplicar un campo eléctrico. Debido a que las moléculas en un campo eléctrico se mueven a
una velocidad dependiente de su carga, forma y tamaño, la electroforesis se ha desarrollado
ampliamente para la separación de diversas biomoléculas.
En este tipo de técnicas de separación de macromoléculas se emplea un volumen
pequeño de la muestra en una matriz porosa, bajo la influencia del voltaje aplicado, las
diferentes moléculas presentes en la muestra se moverán a través de la matriz a diferentes
velocidades. Al final se podrá observar la separación de las moléculas detectadas como
bandas en distintas posiciones dentro de la matriz. La matriz puede estar compuesta por
diferentes materiales como papel, acetato de celulosa, agarosa o poliacrilamida.
En la unidad de electroforesis, el gel se encuentra colocado entre dos cámaras que
contienen buffer. La conexión eléctrica entre las dos cámaras es a través del gel. Los pozos
para muestras deben colocarse del lado del electrodo negativo para que estos migren hacia el
lado positivo.
Los ácidos nucleicos son comúnmente separados en geles de agarosa, la cual es un
polisacárido altamente purificado, derivado del agar
Durante la electroforesis, el voltaje y la corriente son proporcionados por una fuente de poder
y electrodos. El buffer y el gel actúan como resistencia.

Actividad: Requisito para ingresar a práctica. Resolver en este cuadernillo cada una de las
preguntas del cuestionario de la práctica a la que corresponde. Las cuales se deben de
refutar con bibliografía sugerida.

Objetivo.
1. El alumno debe ser capaz de observar, identificar y clasificar bajo el Microscopio
Óptico Compuesto (MOC) los 23 pares de cromosomas del genoma humano.

2. El alumno durante la práctica conocerá los métodos de extracción y purificación de


plásmidos bacterianos.

3. METODOLOGÍA.

3.1. Materiales, reactivos y equipo.

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Para la observación microscópica de cromosomas:

Materiales

MOC

Preparaciones de cromosomas

Aceite de Inmersión

Para la extracción de plásmidos bacterianos:

Materiales Reactivos

Micro pipetas de 1 -10µl,10 - 100µl, y


Solución de lisis
100 – 1000lµ

Puntas para micro pipeta Isopropanol absoluto

Micro tubos Solución de SDS alcalino

Micro centrifuga Solución de acetato

Baño de hielo TAE 1X

Fuente de poder Agarosa

Cámara de electroforesis Marcador de peso molecular

Balanza analítica Colorante de frente de corrida

Matraz de 250 ml Cloroformo: alcohol isoamílico

Papel parafilm Etanol al 70%

Peine para cámara de electroforesis Agua grado molecular

Parrilla eléctrica
3.2 Procedimiento.

Para la observación microscópica de cromosomas


3.2.1 Colocar la preparación de cromosomas en la platina del MOC.
3.2.2 Observar la preparación con el objetivo de 100x utilizando aceite de inmersión.
3.2.3 Realizar dibujos de los 23 pares de cromosomas identificados.

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Día Mes Año Día Mes Año 23/73
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Para la extracción de plásmidos bacterianos


3.2.4 Tomar 1.5 ml de cultivo bacteriano y centrifugar a 13,000 rpm por 5 minutos para
colectar la bacteria. Eliminar el sobrenadante y repetir este pasó en caso de ser
necesario para enriquecer la pastilla bacteriana.
3.2.5 Resuspender la pastilla en 150 µl de la solución de lisis. Mezclar con córtex.
3.2.6 Añadir 300 µl de la solución SDS alcalino, agitar por inversión cinco veces; dejar 5
minutos en baño de hielo.
3.2.7 Añadir 300 µl de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1).
3.2.8 Añadir 300 µl de la solución de Buffer acetato. Mezclar por inversión unas 100 veces
para mezclar perfectamente. Dejar 5 minutos en hielo.
3.2.9 Centrifugar 10 minutos a 13,000 rpm y transferir el sobrenadante a un tubo limpio.
3.2.10 Agregar 700 µl de isopropanol frio, agitar bruscamente por inversión y mantener por
20 minutos en baño de hielo.
3.2.11 Centrifugar 15 minutos a 3,000 rpm y eliminar el sobrenadante.
3.2.12 Agregar 1000 µl de etanol al 70%, despegar la pastilla con cuidado (No tratar de
resuspender). Centrifugar por 5 minutos a 13,000 rpm y eliminar el sobrenadante.
3.2.13 Repetir el paso 12.
3.2.14 Secar la pastilla, calentando a 56 -65° C por el tiempo necesario.
3.2.15 Resuspender la pastilla en 50 µl de agua grado molecular.

Electroforesis en gel, para observar las bandas de ADN genómico y plasmídico.


3.2.16 Preparar en un matraz Erlenmeyer 100 ml de una solución de agarosa al 1.5 % en
buffer TAE 1X. fundirla en parrilla.
3.2.17 Esperar a que alcance una temperatura de aprox. 45ºC, añadir 10 µL de colorante
sybr safe.
3.2.18 Colocar el peine a 1cm del extremo del porta geles y a 1 – mm de la base del mismo.
Vaciar la agarosa fundida y dejar a temperatura ambiente.
3.2.19 Sumergir el gel en buffer TAE 0.25X. Retirar el peine justo antes de cargar las
muestras.
3.2.20 En un corte de papel parafilm colocar 10 µl de la muestra y agregar 3 µl de buffer de
frente de corrida, mezclar con micropipeta.
3.2.21 Tomar los 13 µl de (muestra – colorante) y colocarlos dentro de un pozo del gel.
3.2.22 Conectar los cables. Fijarse que le cable del polo negativo y el lado de los pozos se
encuentren en mismo lado.
3.2.23 Aplicar corriente de 200v durante 35 min. Si están bien conectados los cables se
observaran burbujas.
3.2.24 Retirar el gel de la cámara de electroforesis y teñir. Enjuagar con agua para eliminar el
exceso de colorante.
Nota: Se deben de utilizar guantes de nitrilo o vinilo, a fin de evitar contaminar la
muestra con exonucleasas, además para no tener contacto directo con los
reactivos. Todos los residuos se deben clasificar como CRETI, por lo que deben
ser colocados en un recipiente para su contención.

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4. Análisis de resultados.
Actividad: Realizar un análisis de los resultados obtenidos para cada uno de los
procedimientos, puede utilizar dibujos, imágenes, etc.

5. Discusión y conclusión de resultados.


Actividad: Debe desarrollar una idea clara de los fenómenos observados y contrastarlos con
la bibliografía consultada, así como tratar de explicar las posibles causas que aclaren la
divergencia o similitud encontrada o esperada. Por último deberá realizar una conclusión si se
cumplió con el objetivo planteado.

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6. Bibliografía consultada:

Núm. Autor (es) Libro (nombre) Año Edición Editorial País


1

7. Cuestionario con orientación clínica.

1. Describa cuales son los principales componentes de la cromatina y qué función tiene
cada uno de ellos.

2. Mencione la diferencia entre heterocromatina y eucromatina y, como es el


comportamiento de cada una de ellas durante el ciclo celular.

3. Describa la clasificación de los cromosomas en base a su estructura y cuál es la


función de cada uno de sus componentes.

4. Mencione las diferentes técnicas de bandeo cromosómico que existen y cuál es su


importancia para el diagnóstico de enfermedades hereditarias.

5. Describa las secuencias en las que se encuentra organizado el material


genético hereditario.

6. Describa al menos tres enfermedades genéticas hereditarias generadas por


incremento o disminución cromosómica.

Se adjunta link, para consulta:

https://www.ucm.es/data/cont/media/www/pag-56185/04-
El%20cromosoma%20eucari%C3%B3tico.pdf

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8. Evaluación de la actividad: adjuntar a la práctica la rúbrica de evaluación de práctica.

RÚBRICA DE EVALUACIÓN

Categorías Ponderación asignada


Profesional Destacado Aceptable Requiere mejorar Exige
compromiso
Presentación Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.8 Puntaje: 0.6 Puntaje: 4.0 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 1.0
Actitudes

Desarrollo experimental Puntaje: 3.0 Puntaje: 2.0 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje:0.0
Máximo puntaje: 3.0
Cuestionario Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 2.0
Análisis de Resultados Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Habilidades

Máximo puntaje: 2.0


Discusión y conclusión Puntaje:1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.2 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 1.5
Bibliografía Puntaje:0.5 Puntaje: 0.3 Puntaje: 0.2 Puntaje: 0.1 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 0.5
SUMA TOTAL

Calificación Final.

Observaciones del docente:


Nombre y firma del alumno
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_____________________________________ _______________________________________________
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_______________________________________________
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Firma:_____________________________________

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Día Mes Año Día Mes Año 27/73
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PRÁCTICA 3.
TRANSFORMACIÓN BACTERIANA POR CHOQUE TÉRMICO PARA
LA EXPRESIÓN DEL PLÁSMIDO +pGLO.
Introducción.
La transformación genética consiste en la incorporación de nuevo material
genético a una célula el cual puede provenir de cualquier organismo. Para la incorporación de
ADN en células bacterianas es requisito que el nuevo ADN se encuentre incorporado en
plásmido.

Existen diferentes técnicas para incorporar ADN a bacterias, algunas de ellas


están basadas en la modificación de la consistencia y propiedades fisicoquímicas de la pared
y membrana celular. Los cambios bruscos de temperatura, la adición de cloruro de calcio u
otros agentes químicos que la célula sea competente, es decir con la capacidad para permitir
la entrada de nuevo material genético a la célula.

Otro método ampliamente utilizado es la electroporación, el cual es altamente


eficiente y utilizado. Este consiste aplicar una corriente de alta intensidad (voltaje) con una
baja resistencia (amperaje) y en un tiempo muy reducido (en el orden de los milisegundos). El
protocolo que se describe es igualmente útil para transformar bacterias frescas así como
bacterias crecidas y congeladas con anterioridad, la eficiencia es de alrededor de 109
bacterias transformadas por microgramo de plásmido.

En esta práctica se transforman bacterias de la especia Escherichia coli con el


gen que codifica para la proteína verde fluorescente (gfp, por sus siglas en ingles), aisladas
de Aequorea victoria. A este gen se le ha incorporado el promotor PBAD, el cual constituye la
región reguladora del operón de arabinosa (araC), por lo que solo se transcribe en presencia
de este carbohidrato. El plásmido también contiene un origen de replicación (ori), el cual
permite que sea replicado en E. coli.

Tanto el gen que codifica para GFP como el gen araC se encuentran en el
plásmido pGLO, el cual además contiene un gen que codifica para la proteína beta-
lactamasa, que confiere resistencia a ampicilina. Así, únicamente las bacterias transformadas
pueden sobrevivir y crecer en medio que contiene ampicilina.

Actividad: Requisito para ingresar a práctica. Resolver en el cuadernillo de biología


molecular y celular cada una de las preguntas del cuestionario de la práctica a la que
corresponde. Las cuales se deben de refutar con bibliografía sugerida.

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2. OBJETIVO:
Que el alumno realice una transformación bacteriana, a fin de que comprenda de una mejor
manera los mecanismos moleculares en la transferencia de información genética entre las
bacterias.

3. METODOLOGÍA.
3.1 Materiales:

Materiales Reactivos
Micro pipetas 10 - 100µl, y 100 –
Medio LB/agar
1000lµ

Puntas para micro pipeta LB/agar/amp (100mg/L)

Micro tubos LB/agar/Amp (100mg/L)ara(6gg/L

Micro centrifuga LB liquido

Baño de hielo Plásmido pGLO

Baño maría a 42° C Cultivo líquido de E. coli

Solución de transformación
Incubadora a 37° C
(CaCl2 50 mM, glicerol 15%

3.2 Desarrollo experimental:


3.2.1 Colocar 1.5 ml de cultivo liquido de E. coli, y por duplicado; centrifugar a
13000 rpm durante 40 segundos. Desechar el sobrenadante y resuspender en
500 µl de solución de transformación y resuspender. Etiqueta un microtubo
como +pGLO y otro con –pGLO. incubar ambos tubos en baño de hielo por 20
min.
3.2.2 Examina ambos tubos con lámpara UV.
3.2.3 Centrifuga 30 segundos a 13000 rpm y elimina sobrenadante; añade
100µl de solución de transformación y resuspender. Agregar 3 -10µl de la
suspensión de plásmido (solo al tubo marcado con +pGLO).
3.2.4 Incubar los tubos en hielo por 20 minutos.
3.2.5 Transferir los tubos marcados con +pGLO a baño maría a 42° C
exactamente 90 segundos. Regresar inmediatamente los tubos al hielo, incubar
durante 10 minutos.

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Día Mes Año Día Mes Año 29/73
01
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3.2.6 Después de remover los tubos del hielo, agregar 1.5 ml del LB líquido en
ambos tubos, incubar a 37°C por 30 minutos.
3.2.7 Marcar cuatro cajas de Petri con medio de cultivo LB solido en la parte
inferior.
a) LB/amp +pGLO
b) LB/amp/ara +pGLO
c) LB/amp - pGLO
d) LB - pGLO
3.2.8 Agitar los tubos golpeando con los dedos; inocular las cajas de Petri
como se indica:
a) LB/amp +pGLO ----Añadir 100µl del tubo +pGLO
b) LB/amp/ara +pGLO ----Añadir 100µl del tubo +pGLO
c) LB/amp -pGLO -----Añadir 100µl del tubo –pGLO
d) LB -pGLO -----Añadir 100µl del tubo –pGLO
3.2.9 Dispersar la suspensión bacteriana usando el asa microbiológica
esterilizada. Incubar por 24 horas a 37°C.
3.2.10 Observar las cajas de Petri inoculadas con luz blanca y con luz
ultravioleta.

Nota: Se deben de utilizar guantes de nitrilo o vinilo, a fin de evitar contaminar la


muestra con exonucleasas, además para no tener contacto directo con los reactivos.
Todos los residuos se deben clasificar como CRETI, por lo que deben ser colocados en
un recipiente para su contención.

4. Análisis de resultados.
Actividad: Realizar un análisis de los resultados obtenidos para cada uno de los
procedimientos, puede utilizar dibujos, imágenes, etc.

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Sección 5. Discusión y conclusión de resultados.


Actividad: Debe desarrollar una idea clara de los fenómenos observados y contrastarlos con
la bibliografía consultada, así como tratar de explicar las posibles causas que aclaren la
divergencia o similitud encontrada o esperada. Por último deberá realizar una conclusión si se
cumplió con el objetivo planteado.

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Día Mes Año Día Mes Año 31/73
01
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Sección 6. Bibliografía consultada:

Núm. Autor (es) Libro (nombre) Año Edición Editorial País

7. Cuestionario con orientación clínica.

1. ¿Qué es un gen reportero?

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Día Mes Año Día Mes Año 32/73
01
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2. Describa los procesos de transferencia génica somática y germinal.

3. Mencione los diferentes tipos de vectores de transferencia genética que se pueden


utilizar tanto para la transformación de células procariotas y eucariotas.

4. ¿Cuál es la importancia clínica del hecho que las bacterias pueden generar conjugación y/o
transformación?

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Día Mes Año Día Mes Año 33/73
01
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5. ¿Qué ventajas tiene un organismo al poder apagar genes en respuesta a


determinadas condiciones?

6. Mencione y describa al menos dos BENEFICIOS a la sociedad o a la medicina generados por la


transformación bacteriana.

Se adjunta link, para consulta:

http://analesranf.com/index.php/aranf/article/view/1876/1850

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8. Evaluación de la actividad: adjuntar a la práctica la rúbrica de evaluación de práctica.

RÚBRICA DE EVALUACIÓN

Categorías Ponderación asignada


Profesional Destacado Aceptable Requiere mejorar Exige
compromiso
Presentación Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.8 Puntaje: 0.6 Puntaje: 4.0 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 1.0
Actitudes

Desarrollo experimental Puntaje: 3.0 Puntaje: 2.0 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje:0.0
Máximo puntaje: 3.0
Cuestionario Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 2.0
Análisis de Resultados Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Habilidades

Máximo puntaje: 2.0


Discusión y conclusión Puntaje:1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.2 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 1.5
Bibliografía Puntaje:0.5 Puntaje: 0.3 Puntaje: 0.2 Puntaje: 0.1 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 0.5
SUMA TOTAL

Calificación Final.

Observaciones del docente:


Nombre y firma del alumno
_______________________________________________
_____________________________________ _______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_____________________________________________

Firma:_____________________________________

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PRÁCTICA 4.
OBTENCIÓN DE PROTEÍNA RECOMBINANTE Y SU SEPARACIÓN
POR ELECTROFORESIS.
Objetivo.
El objetivo de esta práctica es que, aplicando un sistema de expresión comercial
para células procariontes, el alumno sea capaz de identificar con exactitud las partes que lo
componen y explicar para qué se requieren en la expresión de proteínas recombinantes.

Introducción.
En Biología Molecular es común estudiar la composición, estructura y, en lo
posible, la función de proteínas. Ahora es posible producir grandes cantidades de proteínas
seleccionadas usando la tecnología del ADN recombinante. En general, un ADN híbrido o
recombinante se prepara al insertar el gen que deseamos expresar en un vector y luego se
transfiere dentro de una célula hospedera (“host”) donde la proteína deseada es sintetizada.
Este procedimiento ha sido usado en la producción de cientos de proteínas con propósitos
científicos, médicos e industriales.

Proteína Uso

Insulina humana Tratamiento de la Diabetes

Activador tisular de plasminógeno Tratamiento en infarto cardiaco y embolias

Eritropoyetina Estimula la producción de eritrocitos en anemia

Interferones Tratamiento en cánceres y agente antiviral

Factor natriurético auricular Reduce la presión sanguínea

Herceptin Anticuerpo monoclonal usado en el tratamiento de cáncer de


mama metastásico.

Las células bacterianas han sido ampliamente usadas como células hospederas
para la producción de proteínas recombinantes a gran escala. El gen clonado que contiene el
mensaje para la proteína deseada es incorporado dentro de un vector de expresión que tiene
todas las secuencias de control transcripcional y traduccional necesarias.

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Día Mes Año Día Mes Año 36/73
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Si las señales apropiadas para la expresión del gen están presentes, es posible
sobre expresar la proteína deseada a una concentración que puede representar hasta el 40%
en peso de la proteína total de la bacteria. Sin embargo, esta sobreexpresión puede causar
dificultades en el crecimiento bacteriano, inestabilidad plasmídica o incluso, la proteína
extraña puede ser tóxica para la bacteria. Además, en ocasiones las células bacterianas
concentran las proteínas extrañas dentro de cuerpos de inclusión insolubles en donde las
proteínas están presentes en forma desnaturalizada y agregada. Muchos de estos problemas
pueden ser minimizados o eliminados al etiquetar (tagging) la proteína deseada con una
proteína de origen bacteriano, lo cual se logra al insertar dentro del vector un fragmento de
ADN que codifique una proteína bacteriana. Así, la bacteria puede reconocer a la proteína
extraña como propia (la etiqueta frecuentemente se agrega en el extremo N- terminal de la
proteína de interés). Estas proteínas modificadas son llamadas proteínas híbridas o de fusión.
Si es necesario, la etiqueta puede ser eliminada de la proteína deseada después de la
purificación. Otra forma de disminuir los problemas asociados a la expresión de proteínas
extrañas en las células bacterianas, es restringir al mínimo la expresión basal, es decir, utilizar
un sistema inducible de expresión proteica. Esto se puede lograr si la enzima encargada de la
transcripción del gen, la ARN polimerasa, reconoce al promotor del vector sólo en presencia
de un inductor, por ejemplo IPTG (isopropil- β-D-tiogalactopiranósido). La adición de IPTG al
cultivo en crecimiento induce la transcripción del ADN blanco bajo el control de promotores
derivados del promotor lac. Las etiquetas en las proteínas tienen otros usos, además del
mencionado previamente: pueden ser útiles para facilitar la purificación, para identificar a la
proteína de interés, para incrementar la probabilidad de actividad biológica por afectar la
solubilidad en el citoplasma o para exportar al periplasma. Varios vectores comerciales
contienen diferentes secuencias adyacentes al sitio de clonación que codifican péptidos
“etiqueta” y que pueden desarrollar varias de estas funciones cuando se fusionan con la
proteína de interés. La elección de los sitios de clonación depende de la combinación de
etiquetas deseadas y la localización de éstas en el extremo N-terminal, C- terminal o ambos,
de la proteína de interés. Ejemplos de estos sistemas de expresión para proteínas de fusión
son los vectores pGEX de la compañía GE Healthcare Life Sciences y el sistema pET de
NOVAGEN. En esta práctica utilizaremos un vector pGEX, que permite expresar, purificar y
detectar proteínas de fusión a glutatión S-transferasa (GST) producidas en E. coli. El gen gst
codifica para una proteína de 26 kDa, tiene un codón de inicio y un sitio de entrada ribosomal
y está bajo el control de un promotor que es inducible con 1 a 5 mM de IPTG. El plásmido
confiere resistencia a ampicilina y contiene un represor lacI. La proteína de fusión resultante
puede ser purificada por cromatografía de afinidad, usando una resina con glutatión.

Actividad: Requisito para ingresar a práctica. Resolver en el cuadernillo de biología


molecular y celular cada una de las preguntas del cuestionario de la práctica a la que
corresponde. Las cuales se deben de refutar con bibliografía sugerida.

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2. OBJETIVO:
2.1 el alumno debe comprender la importancia de la expresión génica, en la medicina,
mediante la obtención de una proteína recombinante.

3. METODOLOGÍA:
3.1 Materiales, reactivos y equipos:

MATERIALES Y EQUIPO REACTIVOS


Matraces Erlenmeyer de 100 mL y 250 mL Bacterias de E. coli DH5α transformadas
estériles

Microcentrífuga Medio LB/ Ampicilina100µl/ml

Termoblock IPTG (100mM)

Incubadora a 37° C con agitación Buffer de carga para proteínas

Espectrofotómetro y celdas de Buffer de corrida de proteínas


espectrofotometría

Congelador -20ªC Agarosa

Mechero de Bunsen

Micropipetas y puntas de 1,000 y 200 µL

Tubos de 1.6 mL

Hielo/contenedor

3.2 Desarrollo experimental:


Extracción

3.2.1 Agregar 0.25 mL del cultivo bacteriano a 25 mL de medio LB con ampicilina


en un matraz Erlenmeyer de 250 mL estéril (es muy importante la aireación).
3.2.2 Incubar en agitación a 37° C hasta alcanzar una A600 de entre 0.6 a 1.0.
3.2.3 Tomar una muestra de 1.5 mL del cultivo bacteriano (sin inducción) y
mantenerla en hielo hasta su procesamiento posterior.
3.2.4 Agregar el IPTG al cultivo (concentración final de 1 mM). Incubar en agitación a
37° C por al menos 2 h.
3.2.5 Tomar una muestra de 1.5 mL del cultivo bacteriano (con inducción) cada hora
y mantenerlas en hielo. A la par, medir la densidad óptica.
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3.2.6 Centrifugar las muestras a 13,000 rpm por 3 min a 4° C.


3.2.7 Decantar y resuspender las pastillas con 100 µL de buffer de carga.
3.2.8 Hervir las muestras por 4 min a 95° C.
3.2.9 Centrifugar a 13,000 rpm por 3 min a 4° C.
3.2.10 Colectar el sobrenadante en nuevos microtubos.
3.2.11 Almacenar las muestras a -20° C hasta su análisis por electroforesis.

Separación por electroforesis.


3.2.12 Preparar una solución de agarosa al 1% en buffer TAE 1X. fundirla en
parrilla.
3.2.13 Colocar el peine a 1cm del extremo del porta geles y a 1 – mm de la
base del mismo. Vaciar la agarosa fundida y dejar a temperatura ambiente.
3.2.14 Sumergir el gel en buffer TAE 0.25X. Retirar el peine justo antes de
cargar las muestras.
3.2.15 En un corte de papel parafilm colocar 10 µl de la muestra y agregar 3 µl
de colorante de frente de corrida, mezclar con micropipeta.
3.2.16 Tomar los 13 µl de (muestra – colorante) y colocarlos dentro de un
pozo del gel.
3.2.17 Conectar los cables. Fijarse que el cable del polo negativo y el lado de
los pozos se encuentren en mismo lado.
3.2.18 Aplicar corriente de 200v durante 35 min. Si están bien conectados los
cables se observaran burbujas.
3.2.19 Retirar el gel de la cámara de electroforesis y teñir. Enjuagar con agua
para eliminar el exceso de colorante.

Nota: Se deben de utilizar guantes de nitrilo o vinilo, a fin de evitar contaminar la


muestra con exonucleasas, además para no tener contacto directo con los reactivos.
Todos los residuos se deben clasificar como CRETI, por lo que deben ser colocados en
un recipiente para su contención.

4. Análisis de resultados.
Actividad: Realizar un análisis de los resultados obtenidos para cada uno de los
procedimientos, utilizando la estadística descriptiva para determinar: el promedio y la
desviación estándar de los valores obtenidos, además puede utilizar dibujos, imágenes, etc.

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5. Discusión y conclusión de resultados.


Actividad: Debe desarrollar una idea clara de los fenómenos observados y contrastarlos con
la bibliografía consultada, así como tratar de explicar las posibles causas que aclaren la
divergencia o similitud encontrada o esperada. Por último deberá realizar una conclusión si se
cumplió con el objetivo planteado.

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6. Bibliografía consultada:

Núm. Autor (es) Libro (nombre) Año Edición Editorial País


1
2
3

7. Cuestionario con orientación clínica.

1. ¿Qué es una proteína recombinante?

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2. Mencione los elementos básicos que debe tener un vector de expresión

3. Construya un flujograma de los aspectos metodológicos a tener en cuenta para la


expresión de proteínas recombinantes en una bacteria.

Se adjunta link, para consulta:

https://zaguan.unizar.es/record/75556/files/texto_completo.pdf

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8. Evaluación de la actividad: adjuntar a la práctica la rúbrica de evaluación de práctica.

RÚBRICA DE EVALUACIÓN

Categorías Ponderación asignada


Profesional Destacado Aceptable Requiere mejorar Exige
compromiso
Presentación Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.8 Puntaje: 0.6 Puntaje: 4.0 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 1.0
Actitudes

Desarrollo experimental Puntaje: 3.0 Puntaje: 2.0 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje:0.0
Máximo puntaje: 3.0
Cuestionario Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 2.0
Análisis de Resultados Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Habilidades

Máximo puntaje: 2.0


Discusión y conclusión Puntaje:1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.2 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 1.5
Bibliografía Puntaje:0.5 Puntaje: 0.3 Puntaje: 0.2 Puntaje: 0.1 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 0.5
SUMA TOTAL

Calificación Final.

Observaciones del docente:


Nombre y firma del alumno
_______________________________________________
_____________________________________ _______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_____________________________________________

Firma:_____________________________________

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PRÁCTICA 5.
EXTRACCIÓN DE ADN TOTAL A PARTIR DE: CULTIVO
BACTERIANO Y SUERO.
Introducción.
Hay diferentes técnicas que permiten obtener ácidos nucleicos con alto grado de
pureza. Las más utilizadas suelen incluir una etapa de ultracentrifugación en gradientes de
CsCl (Cloruro de cesio) o una cromatografía de intercambio iónico. Sin embargo, muchas
aplicaciones de laboratorio no necesitan un grado de pureza tal que justifique incluir estas
técnicas (laboriosas y/o caras) en los protocolos de purificación.
Se han descrito diversos métodos particulares a cada tipo de muestra. Por ejemplo, en
el caso particular de células bacterianas, se emplea típicamente la enzima lisozima, que
cataliza la degradación de la pared celular. Para facilitar a la solubilización de los
componentes celulares, y a la ruptura de membranas y complejos proteicos, la solución de
lisis contendrá un detergente iónico (dodecil sulfato de sodio, SDS). Este detergente dispersa
los componentes de las membranas y desnaturaliza las proteínas. La solución de lisis
contiene además el agente quelante de cationes divalentes EDTA. Esto impide la acción de
las ADNasas (dependientes de Mg++), aunque no tiene efectos sobre la mayor parte de las
ribonucleasas.
La purificación de ácidos nucleicos, las moléculas de gran tamaño (como por ejemplo
las moléculas de ADN genómico presentes en los cromosomas, cuyo tamaño es del orden de
millones de pares de bases) es fragmentado mecánicamente en forma parcial, por lo que se
obtienen fragmentos de tamaño mucho menor (típicamente entre 20 y 200 kb). El grado de
fragmentación dependerá, obviamente, de los métodos utilizados para la homogeneización y
purificación. Los métodos más vigorosos por lo general permiten mayores rendimientos, al
maximizar el número de células lisadas, pero por la misma razón llevan a una mayor
fragmentación del ADN.
Extracción de proteínas y lípidos
Los ácidos nucleícos son muy solubles en agua debido al fuerte carácter hidrofílico de
sus grupos fosfato. Dentro de una mezcla de solventes no miscibles, uno acuoso y otro
orgánico no polar, los ácidos nucleícos tenderán a permanecer en la fase acuosa, en tanto
que los lípidos y gran parte de las proteínas desnaturalizadas se encontrarán en la fase
orgánica. En la preparación de ácidos nucleicos, los solventes que se usan más
frecuentemente para la extracción de proteínas y lípidos son el fenol y el cloroformo.
Precipitación de ácidos nucleicos
La precipitación de los ácidos nucleicos permite su purificación y concentración. Se
basa en la simultánea neutralización de las cargas negativas (mediante el añadido de sales),
y deshidratación de la molécula (mediada por el agregado de alcoholes, típicamente etanol o
isopropanol), lo cual lleva a su precipitación. La precipitación es un fenómeno reversible
(mediante la disolución en soluciones acuosas) y no debe ser confundido ni con la

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desnaturalización (potencialmente reversible) ni con la degradación (irreversible) de los


mismos.
Actividad: Requisito para ingresar a práctica. Resolver en el cuadernillo de biología
molecular y celular cada una de las preguntas del cuestionario de la práctica a la que
corresponde. Las cuales se deben de refutar con bibliografía sugerida.
Objetivo.
El alumno desarrollará y comprenderá las técnicas la extracción, purificación y
cuantificación de ADN bacteriano a partir de un cultivo puro mediante el uso de métodos
físico-químicos, a fin de garantizar la integridad del material genético de diversas muestras
clínicas.

3. METODOLOGÍA:
3.1 Materiales:

Materiales y Equipo Reactivos


1 Caja de Petri con medio de agar Mezcla fenol:cloroformo:alcohol-iso-amilico
cuenta estándar con crecimiento de (25:24:1)
una cepa de E. coli
Tubos con medios de cultivo ICC Cloroformo
(infusión cerebro corazón)
Gradillas de polipropileno Agua grado biología molecular
Un juego de micropipetas P1000, P100 Etanol absoluto o 200 PROOF
P10 µl, con puntas.
Regulador NET (50 mM de NaCl, 125 mM de
Termobloque
EDTA y 50 mM TRIS-HCl, pH 7.6)
Microtubos de 2 ml Dodecil sulfato de sodio al 24%
Microcentrífuga Alcohol isopropílico
Vórtex Proteinasa K (20 mg/ml)
Microcentrífuga KIT BLOOD DNA QIAGEN
Espectrofotómetro UV-Visible TAE 1X
Celdillas o cubetas para
Agarosa
espectrofotómetro
Vaso de precipitado Marcador de peso molecular
Campana de flujo laminar Colorante de frente de corrida
Incinerador de asas
Asa de nicromo

3.2. Desarrollo experimental.


3.2.1 Propagar un cultivo de E. coli en medio ICC (3 mL), tomando una colonia a
partir de la placa con crecimiento, e incubar a 37ºC de 18 a 20 h.

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Proceso de extracción de ADN


3.2.2 Transferir un ml del medio de cultivo con crecimiento a un microtubo de 2 ml.
3.2.3 Centrifugar a 8000 rpm durante 2 min.
3.2.4 Decantar el sobrenadante sobre un vaso de precipitado con cloro, teniendo
precaución de no arrastrar la pastilla.
3.2.5 Resuspender la pastilla mediante la adición de 250 µl de agua grado biología
molecular, agitación vigorosa en córtex por 30 s.
3.2.6 Agregar 100 µl de regulador NET (50 mM de NaCl, 125 mM de EDTA y 50 mM
de Tris-HCl a pH 7.8) y 100 μl de SDS al 24% e incubar a 80°C por 10 min.
3.2.7 Añadir 10 μl de proteinasa K (20 mg/ml) e incubar a 50°C por 2 h.
3.2.8 Añadir 600 μl de solución fenol-cloroformo-alcohol-iso-amílico (25:24:1), agitar
en córtex por 30 s y centrifugar a 8200 rpm por 5 min.
3.2.9 Pasar la fase acuosa a otro microtubo y añadir 600 μl de cloroformo, agitar en
córtex por 30 s y centrifugar a 8200 rpm por 5 min.
3.2.10 Pasar la fase acuosa a otro microtubo y añadir 2 volúmenes iguales de
isopropanol frio, y se centrifugar a 12000 rpm por 7 min; se decantaron y
agregaron 560 μl de etanol absoluto, y se re-suspendió por agitación.
3.2.11 Decantar teniendo cuidado de no vaciar la pastilla, agregar 560 µl de etanol
absoluto frio y observar la hebra de ADN en solución.
3.2.12 Centrifugar a 14000 rpm por 5 min, decantar y colocar el microtubo hacía abajo
por 30 min, dentro del refrigerador.
3.2.13 Colocar los microtubos en una gradilla fría y rehidratar en 50 µl de agua grado
biología molecular fría.
3.2.14 Transferir 10 µl a un microtubo y el resto conservarlo en congelación para la
práctica de PCR.
Proceso de extracción con columnas KIT BLOOD DNA QIAGEN
3.2.15 Añadir en un microtubo de lisis 20 μl de proteasa para lisis (QP), 200 μl de
muestra de sangre (puede ser suero o sangre total) y 200 μl de tampón de lisis
(AL).
3.2.16 Agite en un córtex durante 15 s. Incube 10 min a 56°C.
3.2.17 Añadir 200 μl de etanol absoluto
3.2.18 Agitar en un córtex durante 15 s.
3.2.19 Transferir el contenido del microtubo a una columna QIAamp Mini Spin.
3.2.20 Centrifugar a 8000 rpm durante 1 min.
3.2.21 Colocar la columna en un tubo de lavado (WT) nuevo
3.2.22 Añadir 500 µl de tampón de lavado 1 concentrado (AW1)
3.2.23 Centrifugar a 8000 rpm durante 1 min.
3.2.24 Colocar la columna en un tubo de lavado (WT) nuevo
3.2.25 Añadir 500 µl de tampón de lavado 2 concentrado (AW2)
3.2.26 Centrifugar a 14000 rpm por tres min.
3.2.27 Colocar la columna en microtubo, añadir 60 µl de tampón de elución (AE) y
dejar reposar 1 min a temperatura ambiente.
3.2.28 Centrifugar a 8000 rpm por un min.
3.2.29 Conservar en refrigeración para cuantificación y en congelación para prueba de
PCR.
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4. Análisis de resultados.
Actividad: Realizar un análisis de los resultados obtenidos para cada uno de los
procedimientos, utilizando la estadística descriptiva para determinar: el promedio y la
desviación estándar de los valores obtenidos, además puede utilizar dibujos, gráficos,
imágenes, etc.

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Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 47/73
01
21 06 2017 21 08 2017

Sección 5: Discusión y conclusión de resultados.


Actividad: Debe desarrollar una idea clara de los fenómenos observados y contrastarlos con
la bibliografía consultada, así como tratar de explicar las posibles causas que aclaren la
divergencia o similitud encontrada o esperada. Por último deberá realizar una conclusión si se
cumplió con el objetivo planteado.

Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
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Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 48/73
01
21 06 2017 21 08 2017

Sección 6. Bibliografía consultada:


Núm. Autor (es) Libro (nombre) Año Edición Editorial País
1

Sección 7. Cuestionario con orientación clínica.

1. Describa cual es la función de las principales etapas para la obtención de ADN


genómico bacteriano: Lisis celular, eliminación de proteínas, eliminación de ARN,
separación y eliminación de proteínas y concentración y preservación de ADN.

2. Mencione cual es la acción de las exonucleasas y endonucleasas sobre el ADN


extraído.

3. Describa cual es efecto de la reacción Fenton, sobre la estabilidad del ADN extraído.

4. ¿Cuáles son las técnicas de preservación del ADN extraído?

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Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 49/73
01
21 06 2017 21 08 2017

5. ¿Qué función tienen: el detergente SDS, la solución fenol: cloroformo:alcohol-iso-


amílico, proteinasa K y la solución NET, para el proceso de extracción de ácidos
nucleicos?

6. Mencione cuales son los factores que influyen en la estabilidad, integridad y calidad
del ADN extraído.

Se adjunta link para consulta:


http://sired.udenar.edu.co/4695/1/Manual%20de%20Biolog%C3%ADa%20Molecular%208%2
0febrero%20de%202018.pdf
http://scielo.sld.cu/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0253-570X2017000300002
https://www.ogt.com/resources/literature/403_dna_storage_and_quality
7. Brinde al menos tres ejemplos de enfermedades o síndromes que sean confirmados a
través del análisis del ADN.

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Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 50/73
01
21 06 2017 21 08 2017

8. Evaluación de la actividad: adjuntar a la práctica la rúbrica de evaluación de práctica.

RÚBRICA DE EVALUACIÓN

Categorías Ponderación asignada


Profesional Destacado Aceptable Requiere mejorar Exige
compromiso
Presentación Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.8 Puntaje: 0.6 Puntaje: 4.0 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 1.0
Actitudes

Desarrollo experimental Puntaje: 3.0 Puntaje: 2.0 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje:0.0
Máximo puntaje: 3.0
Cuestionario Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 2.0
Análisis de Resultados Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Habilidades

Máximo puntaje: 2.0


Discusión y conclusión Puntaje:1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.2 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 1.5
Bibliografía Puntaje:0.5 Puntaje: 0.3 Puntaje: 0.2 Puntaje: 0.1 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 0.5
SUMA TOTAL

Calificación Final.

Observaciones del docente:


Nombre y firma del alumno
_______________________________________________
_____________________________________ _______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_____________________________________________

Firma:_____________________________________

Biología
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Día Mes Año Día Mes Año 51/73
01
21 06 2017 21 08 2017

PRÁCTICA 6.
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) PARA LA
DETERMINACIÓN DE ADN BACTERIANO.
Introducción.
Para un Médico Cirujano Integral, el conocimiento y la capacitación para comprender y
elaborar técnicas que incluyan PCR y separación de ADN por electroforesis es de vital
importancia, debido a que las aplicaciones de esta técnica son innumerables y su aporte al
avance del conocimiento y manipulación del material genético es invaluable. Dentro de las
aplicaciones más importantes se pueden mencionar: los análisis forenses, identificación de
sospechosos con pequeñas muestras de sangre, semen o pelo, identificación de padres en
litigios de paternidad, en la antropología molecular, en la arqueología molecular, en
microbiología ambiental, en el diagnóstico de enfermedades infecciosas, en el diagnóstico
prenatal de enfermedades genéticas, diagnóstico de cáncer, en técnicas de clonaje y
secuenciación de ADN genómico entre otros.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR por sus siglas en inglés) fue descrita por
primera vez en 1985 por Kary B. Mullis. El objetivo y función de esta técnica es obtener
mediante amplificación in vitro cantidades “masivas” de ADN incluso a partir de muestras de
ADN muy pequeñas.
Para realizar la PCR más sencilla, se requiere conocer las secuencias que rodean la
región a amplificar, luego se producen oligonucleótidos complementarios a estas secuencias
mediante síntesis química automatizada y estos son utilizados como cebadores o iniciadores
(primers) en una reacción de polimerización cíclica catalizada por la ADN polimerasa.
En primer lugar el ADN que contiene la secuencia que se quiere amplificar se
desnaturaliza mediante calor y luego se alinea con los cebadores, los cuales se encuentran
presentes en exceso. A continuación, la ADN polimerasa realiza la extensión de la cadena de
ADN a partir de los extremos del cebador, incorporando desoxinucleótidos trifosfato que se
añaden a la reacción. Posteriormente se aplica un segundo ciclo de desnaturalización por
calor, alineado y extensión del cebador. Se utiliza una ADN polimerasa resistente a la
temperatura, la Taq polimerasa, procedente de una bacteria llamada Thermus aquaticus que
vive en aguas termales. Sin embargo esta polimerasa no presenta actividad 3´ exonucleasa
de corrección de pruebas, por lo que la síntesis es relativamente inexacta. Este ciclo se repite
unas 30 veces o más en un dispositivo de regulación automática de temperatura conocido
como termociclador. Después de 32 ciclos se producen alrededor de 1X 109 copias del ADN
molde original, o 2n-1, donde n es el número de ciclos.
Actividad: Requisito para ingresar a práctica. Resolver en el cuadernillo de biología
molecular y celular cada una de las preguntas del cuestionario de la práctica a la que
corresponde. Las cuales se deben de refutar con bibliografía sugerida.

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Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 52/73
01
21 06 2017 21 08 2017

Objetivo.
El alumno deberá comprender y aplicar los conceptos teóricos en los cuales se basa la
reacción en cadena de la polimerasa. Así como su importancia en el diagnóstico de diversas
enfermedades.
3. METODOLOGÍA:
3.1 Materiales y reactivos.

Materiales Reactivos
Micropipetas de 10 y 100 Iniciadores (para la detección de ADN bacteriano)
µl Sentido o forward 5´-TCCTACGGGAGGCAGCAGT-
3´ (Tm, 59±4 °C)
Anti-sentido o reverse
5´-GGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTT-3´ (Tm, 58±1 °C)
Puntas para micropipetas Agarosa
Tubos eppendorf PBS
Termociclador amortiguador de carga
Cámara de electroforesis Mezcla de reacción, con Taq Polimerasa
Microtubos para reacción Agua grado biología molecular
Transiluminador UV MgCl2 25 mM
dNTPs
TAE 50X (242g de Tris-Base + Ácido acético glacial 57.1 mL +
EDTA 0.25 mM pH 8.0 200 mL + H2O cbp 1L)
3.2 Desarrollo experimental.
Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR)
3.2.1 Descongelar en refrigeración el ADN obtenido en la práctica de extracción de
ADN bacteriano.
3.2.2 Colocar en un microtubo de reacción para PCR la siguiente relación:
Reactivo
Volumen (µL)

Mezcla de reacción 12

MgCl2 1

Iniciador F (25 pmol/L) 1

Iniciador R (25pmol/L) 1

Extracto de ADN 4

H2O cbp 25

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Fecha de Elaboración y Aprobación Fecha de Última Revisión y Aprobación Núm. de Revisión HOJA
Día Mes Año Día Mes Año 53/73
01
21 06 2017 21 08 2017

3.2.3 Centrifugar la mezcla 2 segundos.


3.2.4 Amplificar las muestras en termociclador bajo las siguientes condiciones:
Efecto
Temperatura/ tiempo

Desnaturalización 95ºC/1 min.

Alineación 54ºC/1 min.

Extensión 66ºC/1 min.

Repetir 30-40 ciclos

Última extensión 72ºC/ 10 min.


Electroforesis.
3.2.5 Elaborar un gel de agarosa al 2 % en TAE 1X, colocando el peine para la
formación de los pozos antes de que solidifique.
3.2.6 Una vez solidificado llenar la cámara de electroforesis con TAE 1X y quitar el
peine con cuidado para no romper los pozos.
3.2.7 Dejar libre en un extremo un pozo y en los subsecuentes colocar la siguiente
mezcla: 10 µL del producto de amplificación + 3 µL de amortiguador de carga. Esto se
realiza para cada muestra.
3.2.8 Colocar en el primer pozo el marcador de tamaño molecular.
3.2.9 Cerrar la cámara de electroforesis y conectar correctamente los electrodos.
3.2.10 Encender la fuente de poder y calibrarla a 100-110V.
3.2.11 Dejar correr durante 1 h o hasta ver una buena separación de las bandas del
indicador de tamaño molecular.
3.2.12 Una vez corrido el gel, sacarlo de la cámara de electroforesis y con mucho
cuidado teñirlo con bromuro de etidio durante 5 min.
3.2.13 Sacar cuidadosamente el gel y observarlo en un transiluminador UV.

4. Análisis de resultados.
Actividad. Realizar un análisis de los resultados obtenidos para cada uno de los
procedimientos, utilizando la estadística descriptiva para determinar: el promedio y la
desviación estándar de los valores obtenidos, además puede utilizar: gráficos, dibujos,
imágenes, etc.

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Día Mes Año Día Mes Año 54/73
01
21 06 2017 21 08 2017

5. Discusión y conclusión de resultados.


Actividad: Debe desarrollar una idea clara de los fenómenos observados y contrastarlos con
la bibliografía consultada, así como tratar de explicar las posibles causas que aclaren la
divergencia o similitud encontrada o esperada. Por último deberá realizar una conclusión si se
cumplió con el objetivo planteado.

Bibliografía consultada:
Núm. Autor (es) Libro (nombre) Año Edición Editorial País
1
2
3

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7. Cuestionario con orientación clínica.

1. ¿A qué se factores de debe no encontrar bandas en el gel después de elaborar la


electroforesis de ADN?

2. ¿Cómo se puede mantener o incrementar la fidelidad y especificidad de la reacción de


PCR?

3. ¿Por qué motivos se utiliza una ADN polimerasa de Thermus aquaticus y no de


humano?

4. ¿cómo se puede mejorar la eficiencia de amplificación del gen de interés?

Se adjunta link para consulta:


http://www2.inecc.gob.mx/publicaciones2/libros/710/pcr.pdf

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Día Mes Año Día Mes Año 56/73
01
21 06 2017 21 08 2017

8. Evaluación de la actividad: adjuntar a la práctica la rúbrica de evaluación de práctica.

RÚBRICA DE EVALUACIÓN
Nombre y firma del alumno

Categorías Ponderación asignada


Profesional Destacado Aceptable Requiere mejorar Exige
compromiso
Presentación Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.8 Puntaje: 0.6 Puntaje: 4.0 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 1.0
Actitudes

Desarrollo experimental Puntaje: 3.0 Puntaje: 2.0 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje:0.0
Máximo puntaje: 3.0
Cuestionario Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 2.0
Análisis de Resultados Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Habilidades

Máximo puntaje: 2.0


Discusión y conclusión Puntaje:1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.2 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 1.5
Bibliografía Puntaje:0.5 Puntaje: 0.3 Puntaje: 0.2 Puntaje: 0.1 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 0.5
SUMA TOTAL

Calificación Final. Observaciones del docente:

_______________________________________________
_______________________________________________
_____________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_____________________________________________

Firma:_____________________________________

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PRÁCTICA 7.
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) PARA LA
DETERMINACIÓN DE ADN HUMANO EN UNA MUESTRA DE SUERO.

Actividad: Requisito para ingresar a práctica. Resolver en el cuadernillo de biología


molecular y celular cada una de las preguntas del cuestionario de la práctica a la que
corresponde. Las cuales se deben de refutar con bibliografía sugerida.
Objetivo.
Comprender y aplicar los conceptos teóricos en los cuales se basa la reacción en cadena de
la polimerasa para la amplificación de un fragmento de ADN humano.
4. METODOLOGÍA:
3.1 Materiales y reactivos

Materiales Reactivos
Micropipetas de 10 y Iniciadores (para la detección de ADN humano)
100 µl Sentido o forward RNAseP3F (5′-CCA AGT GTG AGG GCT GAA
AAG-3′)
Anti-sentido o reverse
RNAseP3R (5′-TGT TGT GGC TGA TGAACTATA AAA GG-3′)
Puntas para Agarosa
micropipetas
Tubos eppendorf PBS
Termociclador amortiguador de carga
Cámara de Mezcla de reacción, con Taq Polimerasa
electroforesis
Microtubos para Agua grado biología molecular
reacción
Transiluminador UV MgCl2 25 mM
dNTPs
TAE 50X (242g de Tris-Base + Ácido acético glacial 57.1 mL + EDTA
0.25 mM pH 8.0 200 mL + H2O cbp 1L)

4.2 Desarrollo experimental:


Reacción en cadena de la Polimerasa (PCR)

4.2.1 Descongelar en refrigeración el ADN obtenido en la práctica de extracción de ADN


de la muestra de sangre.
4.2.2 Colocar en un tubo microtubo de reacción para PCR la siguiente relación:

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Día Mes Año Día Mes Año 58/73
01
21 06 2017 21 08 2017

Reactivo Volumen (µL)

Mezcla de reacción 12

MgCl2 1

Iniciador F (25 pmol/L) 1

Iniciador R (25pmol/L) 1

Extracto de ADN 4

H2O cbp 25

4.2.3 Centrifugar la mezcla 2 segundos.


4.2.4 Amplificar las muestras en termociclador bajo las siguientes condiciones.

Efecto Temperatura/ tiempo

Desnaturalización 95ºC/1 min.

Alineación 54ºC/1 min.

Extensión 66ºC/1 min.

Repetir 30-40 ciclos

Última extensión 72ºC/ 10 min.


Electroforesis.
4.2.5 Elaborar un gel de agarosa al 2 % en TAE 1X, colocando el peine para la
formación de los pozos antes de que solidifique.
4.2.6 Una vez solidificado llenar la cámara de electroforesis con TAE 1X y quitar el peine
con cuidado para no romper los pozos.
4.2.7 Dejar libre en un extremo un pozo y en los subsecuentes colocar la siguiente
mezcla: 10 µL del producto de amplificación + 3 µL de amortiguador de carga. Esto se
realiza para cada muestra.
4.2.8 Colocar en el primer pozo el marcador de tamaño molecular.
4.2.9 Cerrar la cámara de electroforesis y conectar correctamente los electrodos.
4.2.10 Encender la fuente de poder y calibrarla a 100-110V.
4.2.11 Dejar correr durante 1 h o hasta ver una buena separación de las bandas del
indicador de tamaño molecular.

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Día Mes Año Día Mes Año 59/73
01
21 06 2017 21 08 2017

4.2.12 Una vez corrido el gel, sacarlo de la cámara de electroforesis y con mucho
cuidado teñirlo con bromuro de etidio durante 5 min.
4.2.13 Sacar cuidadosamente el gel y observarlo en un transiluminador UV.

4. Análisis de resultados.
Actividad: Realizar un análisis de los resultados obtenidos para cada uno de los
procedimientos, utilizando la estadística descriptiva para determinar: el promedio y la
desviación estándar de los valores obtenidos, además puede utilizar dibujos, imágenes, etc.

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Día Mes Año Día Mes Año 60/73
01
21 06 2017 21 08 2017

5. Discusión y conclusión de resultados.


Actividad: Debe desarrollar una idea clara de los fenómenos observados y contrastarlos con
la bibliografía consultada, así como tratar de explicar las posibles causas que aclaren la
divergencia o similitud encontrada o esperada. Por último deberá realizar una conclusión si se
cumplió con el objetivo planteado.

Sección 6. Bibliografía consultada:

Núm. Autor (es) Libro (nombre) Año Edición Editorial País


1
2
3

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01
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Sección 7. Cuestionario con orientación clínica.


1. Defina que es un marcador genético

2. Investigue cuales son los principales marcadores genéticos para las siguientes
enfermedades:
Diabetes Mellitus: file:///C:/Windows/system32/config/systemprofile/Downloads/558-
Article%20Text-566-1-10-20180913.pdf
Hipertensión arterial: https://www.redalyc.org/articulo.oa?id=457746536002
Cáncer de mama:
http://repositorio.puce.edu.ec/bitstream/handle/22000/12399/TESIS.pdf?sequence=1&is
Allowed=y
Cáncer de páncreas:
file:///C:/Windows/system32/config/systemprofile/Downloads/Dialnet-
DiagnosticoDeCancerDePancreasMedianteSecuenciacion-6041042.pdf
Cáncer de colón: http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0123-
90152015000400002; https://www.tdx.cat/handle/10803/378353
Alzheimer:
https://ruidera.uclm.es/xmlui/bitstream/handle/10578/19352/TESIS%20Ati%C3%A9nzar
%20N%C3%BA%C3%B1ez.pdf?sequence=1
Parkinson:
https://repositorio.unican.es/xmlui/bitstream/handle/10902/8525/Tesis%20MIGA.pdf?seq
uence=1&isAllowed=y
Cardiopatía isquémica:
http://www.morfovirtual2018.sld.cu/index.php/morfovirtual/2018/paper/viewPaper/225/42
7
Obesidad crónica:
http://revista.ened.edu.mx/index.php/revistaconade/article/view/161/143
Insuficiencia renal crónica: https://core.ac.uk/download/pdf/83599218.pdf
Artritis reumatoide: file:///C:/Windows/system32/config/systemprofile/Downloads/Dialnet-
MarcadoresGeneticosDeEficaciaYToxicidadAMetotrexat-5241006.pdf

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Día Mes Año Día Mes Año 62/73
01
21 06 2017 21 08 2017

8. Evaluación de la actividad: adjuntar a la práctica la rúbrica de evaluación de práctica.

RÚBRICA DE EVALUACIÓN

Categorías Ponderación asignada


Profesional Destacado Aceptable Requiere mejorar Exige
compromiso
Presentación Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.8 Puntaje: 0.6 Puntaje: 4.0 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 1.0
Actitudes

Desarrollo experimental Puntaje: 3.0 Puntaje: 2.0 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje:0.0
Máximo puntaje: 3.0
Cuestionario Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 2.0
Análisis de Resultados Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Habilidades

Máximo puntaje: 2.0


Discusión y conclusión Puntaje:1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.2 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 1.5
Bibliografía Puntaje:0.5 Puntaje: 0.3 Puntaje: 0.2 Puntaje: 0.1 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 0.5
SUMA TOTAL

Calificación Final.

Nombre y firma del alumno


Observaciones del docente:
_____________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_____________________________________________

Firma:_____________________________________

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Día Mes Año Día Mes Año 63/73
01
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PRÁCTICA 8.
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA CON
TRANSCRIPTASA INVERSA (RT-PCR) PARA LA DETERMINACIÓN
DE MATERIAL GENÉTICO VIRAL.
Introducción
El hecho de que las moléculas de ADN obtenidas al finalizar la reacción en
cadena correspondan efectivamente al fragmento de interés queda asegurado por la
intervención de los primers que definen los extremos "derecho" e "izquierdo" de ese
fragmento. Así, una vez que la reacción ha finalizado, el tamaño del fragmento multiplicado
puede determinarse sometiendo los productos de la reacción a una electroforesis en gel de
agarosa o poliacrilamida, es decir, a un proceso de separación por difusión bajo la acción de
un campo eléctrico.

Una estrategia distinta para confirmar la identidad del fragmento replicado


consiste en realizar dos reacciones de PCR consecutivas. Al finalizar la primera, una alícuota
de la misma es sometida nuevamente al proceso de multiplicación tras haber colocado dos
primers internos. Mediante el empleo de esta metodología, conocida como nested PCR (PCR
anidada), la filiación de los fragmentos obtenidos queda confirmada por el hecho de que
poseen tamaños previsibles. En algunos casos, los productos amplificados poseen
secuencias que son reconocidas por ciertas enzimas llamadas en endonucleasas de
restricción. La determinación del tamaño al que quedan reducidos los fragmentos al ser
puestos en contacto con la enzima de restricción adecuada indica que nos encontramos ante
los segmentos de interés.

Dado que el RNA usualmente es de una sola hebra y es sensible al calor, es


necesario hacer una transcripción reversa (RT) antes de iniciar la amplificación por PCR. La
transcripción reversa genera una copia de la hebra de RNA, pero esta copia es DNA
complementario (cDNA) el cual es estable al calor y puede resistir la metodología PCR. Los
pasos de la RT-PCR son: 1. Transcripción reversa: Unión del primer a la secuencia de RNA
objetivo. 2. Transcripción reversa: La polimerasa rTth cataliza la extensión del primer
mediante la incorporación de nucleótidos complementarios. 3. Fin de transcripción reversa, se
obtiene la hebra del cDNA complementario al RNA. 4. PCR. El mRNA es copiado a cDNA por
la transcriptasa reversa usando un primer dT (los primers al azar se pueden también utilizar).
En PCR en tiempo real, se utiliza generalmente una transcriptasa reversa que tenga una
actividad endo H. Esto elimina el mRNA permitiendo que la segunda hebra de DNA sea
formada. Se adiciona una mezcla de PCR que incluya una polimerasa termoestable (tal como
la Taq polimerasa), los primers específicos para el gen de interés, los desoxinucleótidos y un
buffer conveniente.

Biología
Licenciatura Médico Cirujano Integral
Molecular
UNIVERSIDAD CUAUHTÉMOC PLANTEL AGUASCALIENTES
ESCUELA DE MEDICINA
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El cDNA se desnaturaliza a más de 90º (~94º), las dos hebras se separan. A 50 o 60º
los primers específicos se alinean con el sitio complementario en cada cadena. Los sitios de
unión a los primers deben estar separados 400 bases, pero generalmente se encuentran a
100 bases de distancia especialmente cuando se usa el PCR en tiempo real

Actividad: Requisito para ingresar a práctica. Resolver en el cuadernillo de biología


molecular y celular cada una de las preguntas del cuestionario de la práctica a la que
corresponde. Las cuales se deben de refutar con bibliografía sugerida.

Objetivo:
El alumno deberá desarrollar la técnica para la extracción de ARN viral, así como entender y
utilizar el procedimiento de la transcriptasa reversa, para la obtención de un cADN para el
diagnóstico de diversas enfermedades.

3. METODOLOGÍA
3.1 Materiales y reactivos

Materiales Reactivos
Micropipetas de 10 y Iniciadores (para la detección de ARN viral)
100 µl
Puntas para Agarosa
micropipetas
Tubos eppendorf PBS
Termociclador amortiguador de carga
Cámara de Mezcla de reacción, con Taq Polimerasa
electroforesis
Microtubos para Agua grado biología molecular
reacción
Transiluminador UV MgCl2 25 mM
dNTPs
TAE 50X (242g de Tris-Base + Ácido acético glacial 57.1 mL + EDTA
0.25 mM pH 8.0 200 mL + H2O cbp 1L)
Vórtex Kit de extracción de ARN viral QIAGEN (Camisas (tubo colector),
Columnas, Buffer concentrado AW-1, Buffer concentrado AW-2, Buffer
de lisis AVL, Acarreador, Buffer de elusión)
Ultramicrocentrífuga Etanol absoluto (100%) grado biología molecular.
Estuche para amplificación de RNA en un solo paso por RT-PCR,
SuperScript One -StepRT-PCR with Platinum Taq.
Equipo de desoxinucléotidos trifosfatados (dNTP), viales individuales
de cada uno (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
Enzima Taq polimerasa. Caja con 1000 U

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3.2 Desarrollo experimental


Procedimiento para la extracción del ARN viral:
3.2.1 Rotular 3 tubos eppendorf estériles de 1.8ml para la muestra blanco,
control positivo y problema.
3.2.2 Colocar 560μl de buffer de lisis AVL con acarreador de ARN y 140μl del
virus en suspensión. Preparar un Blanco (control) que se rotula como
CN, con 700 μl de buffer AVL.
3.2.3 Mezcle perfectamente por córtex (20 segundos al máximo) e incube 10
minutos a temperatura ambiente.
3.2.4 En este tiempo, rotular una columna para cada una de las muestras.
3.2.5 Rotular también tres tubos eppendorf estériles de 1.8ml para cada
muestra. Estos se usarán al final del proceso para recolectar el RNA (60
μl) obtenido.
3.2.6 Centrifugue a 6000 x g (8000 rpm) por 30 segundos (dar un spin) para
remover pequeñas partículas.
3.2.7 Añada 560μl de etanol absoluto a las muestras y mezcle por córtex
suave (No. 1) por 15 segundos, repita el paso 4.
3.2.8 Pipetee 630μl de la muestra a la columna de extracción.
3.2.9 Centrifugue a 6000 x g (8000 rpm centrifuga Hermle) por 1 minuto,
transfiera la columna a un tubo colector nuevo (camisa) y descarte el
sobrenadante.
3.2.10 Repita el paso 6 hasta pasar todo el líquido por la columna.
3.2.11 Lave la columna con 500μl de buffer AW1 y centrifugue inmediatamente
a 6000 x g (8000 rpm centrifuga Hermle) por 1 minuto.
3.2.12 Transfiera la columna a un tubo colector nuevo (camisa) y coloque 500μl
de solución buffer AW2, centrifugue a 20000 x g (14,000 rpm) por 3
minutos.
3.2.13 Cambiar a un tubo colector nuevo (camisa) y centrifugar a 20000 x g
(14,000 rpm centrifuga) por 1 minuto, para eliminar el exceso de buffer
AW2.
3.2.14 Colocar la columna en un tubo eppendorf previamente rotulado que
corresponda a cada muestra y pipetee 60μl de buffer de elusión (AVE),
incube por 1 minuto a temperatura ambiente y centrifugue a 6000 x g
(8000 rpm) por 1 minuto. Desechar la columna y almacenar el ARN
obtenido a -70°C para su uso posterior.

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Diagrama de flujo para el proceso de extracción de ARN viral

Procedimiento para la transcripción reversa de ARN a cADN (obtención de ADN clonal)


3.2.15 Para la obtención del cADN se debe realizar la siguiente mezcla de
reacción:
Reactivo Volumen (µL)
Mezcla de reacción (master mix) 12
MgCl2 1
Iniciador F (25 pmol/L) 1
Iniciador R (25pmol/L) 1
Extracto de ADN 4
H2O cbp 25

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3.2.16 Programar el termociclador para la conversión de ARN a cADN

Efecto Temperatura/ tiempo

Transcriptasa reversa (RT) 50ºC/60 min.

3.2.17 Ciclo de amplificación del cADN

Efecto Temperatura/ tiempo


Primera desnaturalización 94ºC/5 min.
1. Segunda desnaturalización 94/30 s
2. Alineación 55ºC/30 s.
3. Extensión 68ºC/1 min.
Repetir 40 ciclos (pasos 1, 2 y 3)
Última extensión 68ºC/ 4 min.
Procedimiento para electroforesis de los amplicones en gel de agarosa (igual
que las prácticas anteriores).
3.2.18 Elaborar un gel de agarosa al 2 % en TAE 1X, colocando el peine para la
formación de los pozos antes de que solidifique.
3.2.19 Una vez solidificado llenar la cámara de electroforesis con TAE 1X y quitar el
peine con cuidado para no romper los pozos.
3.2.20 Dejar libre en un extremo un pozo y en los subsecuentes colocar la siguiente
mezcla: 10 µL del producto de amplificación + 3 µL de amortiguador de carga.
Esto se realiza para cada muestra.
3.2.21 Colocar en el primer pozo el marcador de tamaño molecular.
3.2.22 Cerrar la cámara de electroforesis y conectar correctamente los electrodos.
3.2.23 Encender la fuente de poder y calibrarla a 100-110V.
3.2.24 Dejar correr durante 1 h o hasta ver una buena separación de las bandas del
indicador de tamaño molecular.
3.2.25 Una vez corrido el gel, sacarlo de la cámara de electroforesis y con mucho
cuidado teñirlo con bromuro de etidio durante 5 min.
3.2.26 Sacar cuidadosamente el gel y observarlo en un transiluminador UV.

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4. Análisis de resultados.
Actividad: Realizar un análisis de los resultados obtenidos para cada uno de los
procedimientos, utilizando la estadística descriptiva para determinar: el promedio y la
desviación estándar de los valores obtenidos, además puede utilizar gráficas, imágenes, etc.

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5: Discusión y conclusión de resultados.


Actividad: Debe desarrollar una idea clara de los fenómenos observados y contrastarlos con
la bibliografía consultada, así como tratar de explicar las posibles causas que aclaren la
divergencia o similitud encontrada o esperada. Por último deberá realizar una conclusión si se
cumplió con el objetivo planteado.

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Día Mes Año Día Mes Año 70/73
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6. Bibliografía consultada:
Núm. Autor (es) Libro (nombre) Año Edición Editorial País
1
2
3
7. Cuestionario con orientación clínica.

1. Porque en la práctica es más complejo realizar la detección de ARN que de ADN.

2. Mencione algunas patologías en la que es deseable realizar el diagnóstico de la


enfermedad mediante la aplicación de la técnica de RT-PCR.

3. Describa los pasos para la obtención de cADN a partir de ARN.

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8. Evaluación de la actividad: adjuntar a la práctica la rúbrica de evaluación de práctica.

RÚBRICA DE EVALUACIÓN

Categorías Ponderación asignada


Profesional Destacado Aceptable Requiere mejorar Exige
compromiso
Presentación Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.8 Puntaje: 0.6 Puntaje: 4.0 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 1.0
Actitudes

Desarrollo experimental Puntaje: 3.0 Puntaje: 2.0 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje:0.0
Máximo puntaje: 3.0
Cuestionario Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 2.0
Análisis de Resultados Puntaje:2.0 Puntaje: 1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.0
Habilidades

Máximo puntaje: 2.0


Discusión y conclusión Puntaje:1.5 Puntaje: 1.0 Puntaje: 0.5 Puntaje: 0.2 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 1.5
Bibliografía Puntaje:0.5 Puntaje: 0.3 Puntaje: 0.2 Puntaje: 0.1 Puntaje: 0.0
Máximo puntaje: 0.5
SUMA TOTAL

Calificación Final.

Nombre y firma del alumno


Observaciones del docente:
_____________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_______________________________________________
_____________________________________________

Firma:_____________________________________

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01
21 06 2017 21 08 2017

BIBLIOGRAFIA.

Fuentes bibliográficas.
TIPO TITULO AUTOR EDITORIA AÑO
L

1 Libro Biología Celular y Molecular Gerald Karp McGrawHil 2011


l
2 Libro Biología Molecular: principios y Gómez Marín CIB 2011
aplicaciones Jorge Enrique

3 Biología Molecular: fundamentos y Salazar Montes McGrawHil


2013
Libro aplicaciones Adriana l

4 Meterial http://www.bionova.org.es/animbio/
didáctico http://www.ncbi.nlm.nih.gov
en línea http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do
http://laguna.fmedic.unam.mx/~evazquez/0403/replicacion%20dna.html
4 Revistas Revista de Salud Pública de México Varios Varios Varios
con http://bvs.insp.mx/rsp/inicio/
acceso en Instituto Nacional de Medicina genómica
línea http://www.inmegen.gob.mx/es/investigac
ion/publicaciones-cientificas/articulos-
cientificos/?anio=2008&autor=0

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