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AOAC Método Oficial 991.31


Aflatoxinas en Maíz, Maní Crudo y Mantequilla de Maní
Método de Columna de Inmunoafinidad (Aflatest)
Primera Acción 1991 – Acción Final 1994

Método AOAC-IUPAC

(Aplicable a la determinación de aflatoxinas B1, B2, G1, G2 con un contenido total de aflatoxinas de ≥ 10 ng/g en maíz, maní
crudo, y mantequilla de maní.)

Ver en la Tabla 991.31A los resultados de los estudios interlaboratoriales que apoyan la aceptación del método.

A. Principio
La porción de ensayo se extrae con CH3OH + H2O (7 + 3). El extracto se filtra, se diluye con agua, y se aplica a la columna de
afinidad que contiene un anticuerpo monoclonal específico para las aflatoxinas B 1, B2, G1, y G2. Las aflatoxinas son aisladas,
purificadas, y concentradas en la columna y son removidas de los anticuerpos con CH3OH. Las aflatoxinas totales se cuantifican
mediante la medición de la fluorescencia después de la reacción con una solución de bromo (método SFB). Las aflatoxinas
individuales se cuantifican por HPLC con un detector de fluorescencia mediante una derivatización postcolumna con yodo
(método PCD)

B. Prueba de la Eficiencia de las Columnas de Inmunoafinidad con los Estándares


El cilindro de la jeringa contiene una columna de 1 mL de anticuerpos inmovilizados para las aflatoxinas B1, B2, G1, y G2 y se
llena con solución tampón para preservarla. La columna se puede almacenar por 1 año a temperatura ambiente sin pérdida de
su eficiencia. El recobrado de una solución de aflatoxinas estándar en 15 mL de CH3OH + H2O (1 + 3) que contiene 25 ng B1,
5 ng B2, 15 ng G1, and 5 ng G2 deben ser al menos 90, 80, 90, y 60%, respectivamente.

C. Aparatos
(a) Licuadora – de alta velocidad. Con jarra de licuado para 500 mL, con su tapa.

(b) Papel Filtro – de 24 cm, doblados (Whatman 2V. Funcionando eficientemente).

(c) Papel Filtro de microfibra de vidrio – de 11 cm (Whatman 934AH. Con funcionamiento eficiente).

(d) Columna de afinidad – ver párrafo B. Columnas Aflatest P Vicam (Vicam, 313 Pleasant St, Watertown, MA 02472,
EE.UU.; www.vicam.com. Con eficiencia aprobada).

(e) Jeringa – de 20 mL, punta tipo Luer, para depósito de la muestra.

(f) Bomba manual – preparada con una Jeringa con cilindro y émbolo para 20 mL, con un tapón de polietileno conectado a la
salida.

(g) Cubeta para el Fluorómetro – tubos de ensayo de 12 x 75 mm.

(h) Fluorómetro – con filtro de excitación para 360 nm.-360 y filtro de emisión 450 nm (Sequoia Turner Modelo 450
[Mountain View, CA 94043, EE.UU.] Con desempeño satisfactorio).

(i) Dispensador automático – botella ámbar de 2 onzas con dispensador automático de 1,0 mL (Tri-Continent Scientific, Inc.
[Grass Valley, CA 95945, EE.UU.; www.tricontinent.com] Con desempeño satisfactorio).

(j) Frasco volumétrico – de 2 mL.

(k) Bomba HPLC – con flujo de 1 ± 0,005 mL/min.

(l) Sistema de inyección – con válvula cargada por jeringa con bucle (loop) de 50 µL de o equivalente.

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(m) Columna HPLC – tipo C18 de 4,6 mm (DI) x 25 cm (L), 5 µm de tamaño de partículas de la fase estacionaria de, (Cat.
No. 80-225 [Rainin, Woburn, MA 01801-4628, EE.UU.] Con desempeño satisfactorio).

(n) Sistema de derivatización de postcolumna – una segunda bomba HPLC sin pulso, volumen cero-muerto. Pieza T, de 610
cm (L) x 0,5 mm (DI) tubing de Teflon®, y baño calentador o reactor de postcolumna [Cat. Nos. F1A920 and F1A910
(Rainin)]. Con desempeño satisfactorio.

(o) Detector de fluorescencia – con filtro de excitación de 360 nm y con filtro de corte de emisiones > 420 nm (Kratos Modelo
950 [Ramsey, NJ 07446, USA.] Con desempeño satisfactorio).

Tabla 991.31A. Resultados de los estudios interlaboratoriales para aflatoxinas


en maíz, maní crudo, y mantequilla de maní

[ng/g] 𝑹𝑺𝑫𝒓 𝑹𝑺𝑫𝑹 Radio


Alimento 𝑺𝒓 𝑺𝑹
Agregados % % Horwitz

10 4.11 33.09 1.04


Maíz 20 3.07 14.44 0.51
30 5.43 16.57 6.55 20.01 0.74

10 2.68 12.79 3.17 27.49 0.87


Maní crudo 20 2.68 12.79 3.22 15.34 0.54

30 3.93 13.44 0.50


10 1.54 11.75 1.77 13.57 0.43
Mantequilla de
20 4.38 20.55 0.72
Maní
30 3.65 10.97 0.41

HPLC con derivatización de postcolumna

10 3.66 50.77 1.60


Maíz 20 0.78 4.63 0.16
30 1.79 7.31 2.86 1 1 .68 0.43
10 4.06 47.26 1.49
Maní crudo 20 0.83 5.20 2.58 16.15 0.57
30 9.64 35.55 1.32

10 1 .45 17.22 2.54 30.17 0.95


Mantequilla de
20 3.74 23.06 0.81
Maní
30 5.07 21.74 0.81

D. Reactivos
(a) Solventes – metanol, acetonitrilo, y agua [todos grado HPLC: destilados–en–vidrio].

(b) Solvente de Extracción – CH3OH+H2O [7 + 3].

(c) Solución reveladora de bromuro – 0,002% bromuro en agua. Preparar una solución fresca cada día de trabajo, mezclando
10 mL de la solución reveladora 0.01% (Vicam Aflatest revelador concentrado) con 40 mL de H2O. mantener la solución

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en botella ámbar.
(d) Estándares de calibración del Fluorómetro – Usar H2SO4 0.05M como blanco. Usar 34 mg/mL de sulfato de quinina di-
hidratado (Ultrapuro, J.T. Baker, o equivalente) en 0.05M H2SO4 como estándar de 20 ng/g de aflatoxina.

(e) Fase móvil para HPLC – H2O+CH3CN+CH3OH (3+1+1), desgasificada.


(f) Reactivo para la postcolumna – Disolver 100 mg de iodo en 2 mL de CH3OH. Agregar 200 mL de H2O, agitar 1 hora, y
filtrar con filtro de 0.45 µm. Prepararlo diario.

(g) Soluciones estándares de aflatoxinas para HPLC –


(1) Solución estándar madre de mezcla de aflatoxinas – Preparar según la instrucción 971.22B-E (ver doc. ref. 49.2.03)
para contener 500 ng de aflatoxina B1, 125 ng de aflatoxina B2, 250 ng de aflatoxina G1, y 125 ng de aflatoxina G2/mL
en benceno-CH3CN [98 + 2].

(2) Solución estándar de trabajo –Transferir cada cantidad indicada en la Tabla 991.31B, de la Solución estándar madre
de mezcla de aflatoxinas [descrita en D(g)(1)] en series de tres frascos volumétricos de 2 mL. Evaporar las soluciones
justo a sequedad bajo una corriente de Nitrógeno a temperatura ambiente. A cada frasco agregar 1 mL de CH3OH,
mezclar bien, diluir a 2 mL con agua, y mezclar. Preparar diario.

Tabla 991.31B. Preparación de las Soluciones Estándares de Trabajo

Solución Estándar de Trabajo conteniendo,


Solución Solución ng/50 µL
Estándar de madre
Trabajo tomada, µL
B1 B2 G1 G2

1 60 0.750 0.188 0.375 0.188

2 40 0.500 0.125 0.250 0.125

3 20 0.250 0.063 0.125 0.063

E. Preparación y Extracción de las Muestras


Ver la instrucción 977.16 (ver doc. ref. 49.2.01) para aplicar los procedimientos de muestreo. Ver la instrucción 972.26A (ver
doc. ref. 49.2.14) para muestras de maíz. Ver la instrucción 968.22C (ver doc. ref. 49.2.08) para muestras de maní y de
mantequilla de maní.

(a) Pesar 25 g de la porción de muestra para ensayo en una jarra de licuadora [C (a)]. Agregar 5 g de NaCl y 125 mL de
Solvente de Extracción [D (b)].

(b) Homogeneizar por 2 minutos a velocidad alta.

(c) Filtrar con Papel Filtro doblado de 24 cm [C (b)].

(d) Pipetear 15 mL del filtrado en un frasco Erlenmeyer de 125 mL con tapón de vidrio.

(e) Agregar 30 mL de H2O, tapar, y mezclar.

(f) Filtrar el extracto diluido con Papel filtro de microfibra de vidrio de 11 cm [C (c)], pasando toda la solución en menos de
30 minutos antes de pasarla por la columna cromatográfica de afinidad. El filtrado debe ser claro. Si no es así, refiltrar.

Nota: Pasar el extracto [E (f)] inmediatamente por la columna cromatográfica de afinidad.

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F. Ensamble de la Columna Cromatográfica de Afinidad
(a) Asegurar el depósito de la jeringa al anillo del soporte.

(b) Quitar la tapa superior de la columna.

(c) Cortar la punta y utilizar la tapa como conector entre la columna y el cilindro de la jeringa
(d) Pipetear 15 mL del segundo filtrado [E (f)] (equivalente a 1 g de la porción de ensayo) en el cilindro de la jeringa.

(e) Conectar el cilindro de la jeringa a la bomba manual llena de aire.

(f) Quitar la tapa superior de la columna.

(g) Empujar el extracto a través de la columna de afinidad a un flujo cerca de 2 gotas/s (6 mL/minuto)

(h) Desconectar bomba manual del cilindro de la jeringa y llenarla con aire.

(i) Reconectar la bomba al cilindro de la jeringa y pasar de 2 a 3 mL de air a través de la columna.

(j) Desconectar la bomba manual y agregar 10 mL de H2O al depósito de la jeringa. Llenar la bomba manual con aire y
reconectar.

(k) Empujar el agua a través de la columna a un flujo de 6 mL/minuto. Repetir con otros 10 mL de H2O. Descartar los
enjuagues de agua.

(l) Desconectar la bomba manual y llenarla con aire. Reconectarla y pasar de 2 a 3 mL de aire a través de la columna.

(m) Desconectar la bomba manual y agregar 1,0 mL CH3OH grado HPLC al cilindro de la jeringa. Colectar el eluato de la
columna en un contenedor apropiado (vial con tapa de rosca).

(n) Desconectar la bomba manual y llenarla con aire. Reconectarla y asegurar pasar todo el CH3OH a través de la columna.
Pasar de 2 a 3 mL de aire adicionales a través de la columna.

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(o) Para cuantificar las aflatoxinas por el método SFB, colectar el eluato de CH3OH en las cubetas del fluorómetro.
Inmediatamente proceder con la determinación fluorométrica.

Nota: Realizar las determinaciones cromatográfica en la columna de afinidad, con alícuotas duplicadas de un segundo filtrado y determinar
la lectura de ambos en el fluorómetro.

(p) Para cuantificar las aflatoxinas por el método PCD, colectar el eluato de CH3OH en frascos volumétricos de 2 mL. Diluir
al volumen con agua grado HPLC, mezclar, y proceder con la cuantificación con HPLC.

G. Fluorometría de la solución
(a) Calibración del fluorómetro – dejar calendar el fluorómetro por 20 minutos. Insertar el blanco, D (d), y usar el botón Zero
para ajustar la lectura del instrumento a cero (0). Insertar el estándar de 20 ng/g de Aflatoxina, D (d), y usar el botón Span
para ajustar la lectura del instrumento a 20. Usar el ajuste del Gain apropiado para que el blanco produzca lecturas de 0 y
el estándar produzca lecturas de 20. Calibrar el fluorómetro justamente de hacer las lecturas de los eluatos de la columna
de afinidad para evitar posibles derivas de las lecturas en el instrumento.

(b) Cuantificación – Agregar 1,0 mL de revelador diluido al eluato, F(a), en tubo de ensayo limpio, C (g). Mezclar en una
mezcladora Vortex por 5 s. Si las burbujas se adhieren a la pared del tubo de ensayo, golpee ligeramente para desalojar.
Inserte el tubo en el fluorómetro, C (h), y espere 60 s. Registre la lectura, que es equivalente a los ng/g, de la porción de
ensayo de aflatoxinas totales.

H. Determinación por HPLC con detección de fluorescencia y derivatización postcolumna.


Conecte la salida de la columna del HPLC a un brazo de la T de acero inoxidable, de bajo volumen muerto, usando una pieza
corta de tubo capilar de 0.01 pulg. (0.25 mm) de diámetro interno. Conecte la segunda bomba de HPLC, que entrega los reactivos
postcolumna, al segundo brazo de T. Conecte al tercer brazo de T, un extremo de la espiral de un tubo capilar de teflón de 610
cm de largo x 0.5 mm de diámetro interno, y conecte el otro extremo de la espiral, al detector.

Usando horno o baño de temperatura constante, mantenga la temperatura de la espiral de reacción a 70 °C. Configure los
siguientes caudales:

(1) fase móvil (columna), 1.0 mL / min;


(2) reactivo postcolumna, 0.3 mL/min;
(3) velocidad total a través de la espiral de reacción, 1.3 mL / min.

El volumen de la espiral de reacción es de aproximadamente 1.2 cm3, de modo que, con una velocidad de flujo total de 1.3
mL/min, el tiempo de reacción posterior a la columna es de aproximadamente 55 s. Deje que todo el sistema funcione 10-20
minutos para estabilizarse. Si se utiliza el integrador, ajuste los controles de sensibilidad del detector de fluorescencia, C(o) o
integrador para dar una respuesta razonable (señal:ruido = 5:1) para 0.125 ng de aflatoxina G2/50 µL. Si se usa un registrador
de gráficos de bandas, ajuste el detector de fluorescencia, C(o), y contrólelo para dar una desviación de escala del 30-40% con
0.125 ng de aflatoxina G2/50 µL.

Inyecte 50 µL de mezcla estándar de trabajo en el inyector, usando un exceso de 20-30 µL para asegurar que el loop (lazo) de
50 µL esté completamente lleno. Las aflatoxinas eluyen en el orden siguiente: G2, G1, B2 y B1 con tiempos de retención de
aproximadamente 6, 8, 9 y 11 min., respectivamente, y deben resolverse en la línea base. Si es necesario, ajuste los tiempos de
retención cambiando la concentración de CH3OH del solvente de la fase móvil. Inyecte 50 µL de las soluciones estándar de
trabajo 1, 2 y 3, D(g)(2), diariamente y prepare curvas estándar para las aflatoxinas

Inyecte 50 µL de solución de ensayo de F(p) en el inyector. Identifique cada pico de aflatoxina en el cromatograma del análisis
de la solución de ensayo comparando los tiempos de retención con los de los estándares de referencia correspondientes.
Determine la cantidad de cada aflatoxina en el eluato inyectado de las curvas estándar correspondientes. Calcule la concentración
de cada aflatoxina en la porción de ensayo, usando las siguientes fórmulas:

𝑊 = 25g × (15 mL/125 mL) × (15 mL/45 mL) = 1 g

𝐴𝑓𝑙𝑎𝑡𝑜𝑥𝑖𝑛, 𝑛𝑔/𝑔 = A × (Tv /Iv ) × (1/W) = 𝐴 × 40


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donde:
W = peso del producto representado por eluato,
A = ng aflatoxina en el eluato inyectado,
Tv = volumen final del eluato (2000 µL), y
Iv = eluato inyectado (50 µL).

Sumar las concentraciones individuales de las 4 aflatoxinas, para obtener la concentración total de aflatoxinas

[Nota: Ponga en remojo toda la cristalería de laboratorio en una solución de lejía doméstica al 10%, que generalmente contiene
hipoclorito de sodio (NaClO al 5,25%), antes de volver a usarla o desecharla. Ver 990.32J (ver 49.2.16) para más detalles sobre
descontaminación.]

Referencia: JAOAC 74, 81(1991).

Revisado: Marzo 2002

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