Polímeros endógenos como biomateriales para la terapia génica nanoparticulada.

Resumen
Los biomateriales con capacidades específicas para interactuar con estructuras biológicas se han
utilizado ampliamente en el desarrollo de diferentes dispositivos destinados al uso biomédico.
Dentro de este campo, el interés en los polímeros endógenos como componentes de los sistemas
de suministro ha ganado una atención creciente. El objetivo de este capítulo es proporcionar una
visión general del uso de estos polímeros en el desarrollo de nanopartículas y, más específicamente,
presentar estrategias novedosas que podrían abrir nuevos horizontes para la terapia de genes
basada en vectores no virales. Las estrategias que describimos podrían ofrecer una oportunidad
única para respaldar la traducción de avances científicos básicos en polímeros endógenos a
aplicaciones clínicas, ofreciendo así la posibilidad de romper barreras en la transición de enfoques
basados en recursos a estrategias basadas en el conocimiento.

Palabras clave: terapia génica, vectores no virales, administración de fármacos, nanopartículas,

polímeros endógenos, proteínas, carbohidratos.

8.1 Introducción

La búsqueda de nuevos fármacos y herramientas terapéuticas para el tratamiento de enfermedades

es un desafío continuo en el campo farmacéutico. Entre ellos, el enfoque de la terapia génica ocupa
un lugar muy prometedor. La posibilidad de inducir la expresión de una proteína terapéutica
(insertar un gen funcional), o de suprimir la expresión aberrante de una proteína (inhibir la expresión
del gen), abre innumerables posibilidades para revolucionar la práctica clínica [1-4]. Sin embargo,
este gran potencial futuro enfrenta problemas importantes que deben superarse si queremos que
la amplia aplicación clínica de la terapia génica pase de la esperanza a la realidad [5]. El primero es
el conocimiento del papel exacto de cada proteína en la fisiopatología de una enfermedad. Dicha
información es necesaria para predecir si la modificación de la expresión génica dará como resultado
alguna mejora clínica. Este es un gran desafío para las enfermedades multifactoriales, en las que
interviene más de un gen, y más fácil para las enfermedades causadas por un solo gen defectuoso.
La segunda cuestión está relacionada con el diseño de un sistema capaz de proteger y transportar
ácidos nucleicos bioactivos al sitio de acción sin representar ningún riesgo para el paciente. A este
respecto, se están estudiando diferentes vehículos como vehículos destinados a proporcionar una
transferencia de genes exitosa a las células [6, 7].
Fundamentalmente, los sistemas de administración de genes se pueden diferenciar en portadores
virales (adenovirus, lentivirus, etc.) y vectores no virales (complejos, micelas, liposomas,
nanopartículas, etc.) [8]. Los siguientes son los requisitos principales tanto para los polímeros como
para los sistemas de nanopartículas destinados a la terapia génica.

 Polímero:
 Biocompatibilidad y biodegradabilidad - el polímero debe ser metabolizado por los tejidos
y las células y los productos de degradación deben ser compatibles con las estructuras del
cuerpo.
 Ausencia de toxicidad - el polímero no debe presentar toxicidad aguda ni crónica. no debe
provocar respuestas inmunes.
  Capacidad de formar nanopartículas-- el polímero debe poder formar fácilmente un sistema
estable de nanopartículas.
 Disponibilidad y asequibilidad - el polímero debe obtenerse fácilmente en grado
farmacéutico y preferiblemente en piezas pequeñas.

 Nanopartícula:
 Protección del material genético - el sistema debe poder formar el ácido nucleico
terapéutico para la degradación (nucleasas extracelulares, lisosomas, etc.)
 captación celular específica - el sistema debe ser internalizado específicamente por la célula
objetivo para evitar posibles efectos fuera del objetivo.
 Liberación cinética - la liberación cinética debe evitar la liberación temprana del ácido
nucleico, pero debe tener una liberación apropiada en el objetivo.
 Estabilidad - el sistema debe mostrar estabilidad en anaquel así como estabilidad después
de la administración (sin agregación, precipitación o fenómenos de disociación no
deseados).

Entre los sistemas no virales y desde una perspectiva histórica, como una premisa de las ciencias
materiales relacionadas con la selección o el diseño de componentes para el desarrollo de
nanopartículas destinadas a la terapia génica, la bioinserción ha sido un requisito fundamental. La
bioinserción significa que un material no debe provocar ninguna reacción del cuerpo. Así, en la
literatura podemos encontrar diferentes nanosistemas inertes, como los basados en poliésteres. Sin
embargo, esta posición anterior se reconsideró después de comprender que el uso de moléculas
bioactivas o biomacromoléculas podría mejorar la orientación hacia tejidos / órganos específicos y
proporcionar un valor biológico agregado, como la mucoadhesividad, la capacidad de interactuar
con receptores específicos, la capacidad de proporcionar estabilidad en fluidos biológicos, la
capacidad de aumentar la eficacia de los medicamentos e incluso proporcionar efectos sinérgicos.
Estos aspectos se analizan en las siguientes secciones, en las que nos referimos a polímeros
endógenos, es decir, aquellos componentes poliméricos que se encuentran en el cuerpo humano.
Como consecuencia, en los últimos años se ha prestado mayor atención al uso de materiales
endógenos que cumplirían dichos requisitos. Aquí enfocaremos nuestra atención en estas
nanopartículas basadas en polímeros endógenos no virales.

8.2. Las nanopartículas poliméricas en la terapia génica: principal característica de los sistemas
actualmente propuestos Nano Basado en endógenos Polímeros

La literatura describe distintos sistemas Nano destinados a la terapia génica. Entre estos sistemas
nano, los basados en polímeros y el nivel submicrométrico son generalmente denominados
nanopartículas. Sin embargo, en primer lugar hay que aclarar la diferencia entre las nanopartículas
términos y nanocomplexes (o complejos en general), tal como nos referimos a ambos en este
capítulo. Complejos pueden describirse aliado estequiométrica y por lo general se forman por
simple mezcla de polímeros catiónicos y los ácidos nucleicos en cuestión. En tal caso, sin el
compuesto de ácido nucleico activo que simplemente tendríamos una dispersión polimérica. Por el
contrario, en el caso de nanopartículas polimérico la formación de la estructura polimérica no
requiere la concurrencia de un compuesto activo, resultando en lo que es posible para denotar
como sistemas Nano “en blanco”. Debido a la naturaleza obviamente más intrincado de las
interacciones entre los polímeros en nanopartículas (que pueden variar de enlaces covalentes a las
interacciones físicamente reticulados), generalmente se reconoce que tienen una capacidad
superior para proteger la secuencia nucleico. De hecho, en algunos Nano complejos de ácido
nucleico puede ser desplazado o disociada debido a las interacciones competitivas de los polímeros
con componentes biológicos.

8.2.1 estrategias basadas en el uso de polímeros endógenos como biomateriales

La interacción de vehículos en partículas nano con medios biológicos dependerá no sólo de su

tamaño de partícula, pero también en dos aspectos críticos: su carga superficial expuesta y
composición. Como consecuencia, cuando decidimos para modular estas interacciones mediante el
uso de polímeros endógenos debemos centrar nuestra atención en la disposición superficie de tales
polímeros y su influencia directa sobre las propiedades de la superficie del sistema. Por lo tanto,
tenemos dos posibilidades alternativas para llevar a cabo el diseño antes mencionado. La primera
consiste en el uso de los polímeros endógenos como bloques de construcción de la estructura de
las nanopartículas con el fin de proporcionar el biomimetismo deseado. La segunda posibilidad
consiste en cubrir la superficie de un vehículo en partículas Nano preformada de una manera tal
que el polímero endógeno se enfrenta a los medios biológicos y expone sus características.

Un aspecto clave adicional es determinar si podemos usar un polímero endógeno seleccionado en

este estado natural o si necesitamos para modificarla a fin de mejorar sus características,

Figura 8.1 El uso de polímeros endógenos en la formación de nanopartículas: como polímeros

endógenos en naturabilis Puris, como polímeros endógenos modificados o utilizando
combinaciones de ambos, así como con otros / semi polímeros sintéticos sintéticos (nanopartículas
híbridas).
Las posibilidades que se ilustran en la Figura 8.1. En el segundo caso podemos o bien modificar antes
de la formación de nanopartículas (como materia prima) o una vez la nanopartícula ya está formado.
Por último, algunos autores utilizan polímeros modificados endógenos no debido a sus propiedades
específicas, sino más bien como la única solución para eludir las limitaciones asociadas con su
formulación como un sistema de nanopartículas. En las siguientes secciones vamos a discutir estas
posibilidades.

8.2.1.1 Polímeros endógeno en Puris Naturabilis

polímeros endógenos básicamente se pueden clasificar de acuerdo con su naturaleza, ya sea

proteica o glicıdico. Tabla 8.1 muestra los polímeros endógenos más relevantes utilizadas para el
desarrollo de a base de partículas de suministro de genes Nano que será discutido en este capítulo.
Las proteínas son más heterogéneas en su variedad y que pueden establecer interacciones
complejas. Sin embargo, debido a su conformación terciaria su estructura es por lo general más
rígido en comparación con polímeros glicídicos. Además, se caracterizan por estructuras bien
definidas e índices muy bajos de polidispersidad. En contraste, los hidratos de carbono son más
flexibles debido a las características de los límites glicosídicos (por lo general 1,4) y presentan
distribuciones de peso molecular amplias.

A pesar de las características inherentes de estos polímeros endógenos les ofrecen un gran potencial
para el diseño de los diferentes enfoques de administración de fármacos, su uso en el desarrollo de
nanopartículas no es una tarea fácil. La mayoría de estos polímeros son solubles en agua y no se
comportan bien en disolventes orgánicos. Por lo tanto, algunas técnicas de preparación
ampliamente utilizados en la nanotecnología no son adecuados para la formación de nanopartículas
utilizando tales compuestos. Además, estos uso de agentes de reticulación químicos, tales como

Tabla 8.1 polímeros endógenos principales utilizados en la preparación de un nanopartículas para

la administración génica.

Clase Nombre Reflejos Árbitro

protamina Arginina-glicoproteína rica. 22

Con carga positiva a pH
fisiológico. Se utiliza para
proteínas condensar y proteger los
ácidos nucleicos. Aprobado
por la FDA como un
medicamento.

Albúmina La proteína más abundante 23

en el plasma. proteína
globular monomérica con
alta solubilidad.
Componente de la primera
FDA aprobó nanopartícula
polimérica (Abraxene).
 El colágeno proteína estructural 24-26
principal. Compuesto
principalmente de residuos
de glicina, prolina y alanina.
estructura de triple hélice. La
hidrólisis conduce
atelocolágeno o gelatina.

elastina proteína de estímulo- 27,28

sensible que se encuentra en
el tejido conectivo. Elastina-
como polipéptidos (ELPS)
son polipéptidos
recombinantes derivados de
elastina.

La heparina glicosaminoglicano 29-31

compuestos de diferentes
disacáridos altamente
Los hidratos de sulfatado. Interactúa
carbono fuertemente con la
antitrombina III y protamina.
Aprobado por la FDA como
un medicamento.

condroitina glicosaminoglicano 32-37

sulfatados compuestas de
unidades repetidas de N -
acetilgalactosamina y ácido
glucorónico. Componente
principal del cartílago y la
matriz extracelular.

Ácido hialurónico glicosaminoglicano no 38-40

sulfatado se encuentran en
el tejido conectivo. Fuerte
interacción con los
receptores endocíticos (por
ejemplo, CD44). Aprobado
por la FDA como dispositivo
cosmético inyectable
(relleno de arrugas)

ácido polisiálico Homopolímero de ácido 41-43

acetilneuramínico N-.
Ventajas en el tumor
 Referencia a una
propiedades sigilo.

glutaraldehído, no es infrecuente. Tienen la función de interconectar y reforzar los componentes de

las partículas Nano, mientras que el aumento de que la estabilidad de la nanoestructura deseado.
Sin embargo, cuando el uso de agentes de reticulación químicos, es necesario verificar que la
preparación de nanopartículas no modifica las propiedades naturales y la estructura de los
polímeros endógenos seleccionados antes de reclamar cualquier beneficio de su incorporación en
la base de sus propiedades inherentes, un punto crítico que es demasiado a menudo se pasa por
alto.

Otra consideración importante cuando se utilizan polímeros endógenos es la fuente de tales

polímeros. Algunos de ellos, tales como ácido hialurónico y albúmina, ya se puede encontrar como
productos de biotecnología recombinante. Sin embargo, algunos otros polímeros, tales como
sulfato de condroitina, heparina y colágeno, se obtienen principalmente de fuentes animales. Esto
significa que algunas cuestiones de seguridad deben ser considerados, así como algunos problemas
inmunológicos cocmpatibility / (especialmente relevantes para los polímeros con una naturaleza
proteica).

polímeros endógenos también pueden ser divididos sobre la base de sus características físico-
químicas a pH fisiológico, por lo que pueden ser polímeros catiónicos o aniónicos. Los compuestos
catiónicos se requieren generalmente para la terapia génica no viral, ya que la puede compactar y
proteger la secuencia terapéutica de material genético. Sin embargo, no se encuentran fácilmente
en el cuerpo. Ejemplos importantes serían protamina y la lisozima, aunque sólo el primero ha sido
propuesta como un biomaterial para la administración génica. Otras aminas de bajo peso molecular
endógenas también se han propuesto en la formación de sistemas Nano a base de compuestos
naturales, pero como agentes de reticulación iónicos e inductores de ácidos nucleicos de
compactación. Estos compuestos de amina (espermina y espermidina) están presentes en casi todos
los tejidos y poseen grupos amina que están completamente protonados a pH fisiológico. En este
nuevo enfoque, una estrategia inversa a preparación clásica ionotrópicos de nanopartículas se ha
propuesto sobre la base de carga negativa reticulantes iónicos tales como tripolifosfato o sulfato de
sodio. Los principales intereses en una estrategia de este tipo están relacionadas con la posibilidad
de: desarrollar nanopartículas a base de polímeros endógenos aniónicos tales como hialurónico o
condroitina sin la necesidad de modificar o utilizar productos químicos que pueden alterar su alto
valor biológico (polímeros endógenos en naturabilis puris); beneficiarse de las propiedades
específicas de estas poliaminas biogénicas, que son esenciales para los procesos de crecimiento del
tejido y la diferenciación celular y que tienen receptores específicos para su internalización. Poseen
propiedades especiales que confieren protección al ADN contra oxidativo. El aumento de los niveles
intracelulares de tales poliaminas puede revertir el envejecimiento procesos relacionados, lo que
conduce en última instancia a un aumento de vida útil en una gran variedad de formas de vida, tales
como levaduras, moscas y células inmunes humanas.

8.2.1.2 Modificaciones químicas de polímeros endógenos

Las características inherentes de los polímeros endógenos pueden hacerlos insatisfactorios formar
nano estructuras, proporcionar protección de ácidos nucleicos o objetivo adecuado para
orientación. En esos casos se pueden requerir modificaciones químicas. Básicamente, se pueden
dividir entre aquellos

Enfocado a mejorar la formación de nano partículas o la asociación de ingredientes activos.

En g/(como la modificación con espermina) y aquellos que pueden mejorar el objetivo celular
propiedades de internalización o la capacidad de interactuar con receptores transmembrana
específicos Tors (por ejemplo, modificación utilizando ácido fólico o azúcares). Como ejemplo de lo
anterior, si nos queremos incluir albúmina en una composición de nanopartículas destinada a la
terapia génica que
Debe considerarse que su punto isoeléctrico en el agua es de 4.7. Esto significa que en fisiología pH
(7.4) la albúmina está cargada negativamente, lo que no permitiría el establecimiento de
Interacciones con ácidos nucleicos. Sin embargo, los procesos de cationización pueden proporcionar
una carga positiva a polímeros que no la poseen de forma natural. Aminas de bajo peso molecularse
utilizan generalmente para tales procesos de cationización, tales como etilendiamina, sper midine
y espermina [44-48]. Las reacciones se realizan normalmente utilizando carbodiimidas, como la etil-
3 (3-diaminopropil) carbodiimida (EDC) [49-53].
Esto permite las aminas se unen a los grupos carboxílicos de residuos ácidos en proteínas. Así que
no solo es una carga negativa potencial se bloquea, pero la carga se convierte en una positiva.
Como un como resultado
POLÍMEROS ENDÓGENOS COMO BIOMATERIALES PARA EL NANOPARTICULADO Pag 243

la modificación con dichos compuestos aumenta el punto isoeléctrico de los polímeros y así
aumenta la afinidad y la fuerza de polímero-ácido nucleico intera.
Un ejemplo, un aumento en el punto isoeléctrico de albúmina permite la producción de
nanopartículas de albúmina cationizada asociada a siRNA, como las preparadas por Han et al. (2013)
(Tamaño medio 260 nm y potencial zeta positivo +30 mV) 154).
Sin embargo, es importante tener en cuenta que la adición de amina gr aumentar la toxicidad del
polímero resultante al mismo tiempo, incluso para aquellos con alto biocompatibilidad en su estado
natural [55]. Además, la agregación inducida por el suero de nano sistemas basados en polímeros
cationizados como la albúmina se han reportado después.
Administración IV, resultando en agregados con un tamaño de hasta 5 um, lo que los lleva a ser
atrapados en los capilares pulmonares, como se ha informado anteriormente para otras
enfermedades vecinales catiónicas tors [56,57]. A pesar de que esta preferencia pulmonar puede
usarse para diseñar tratamientos específicos, debería considerarse una preocupación importante
debido a posibles daños indeseables asociados
Se abordó la agregación descrita después de la administración parenteral. Otros ejemplos se pueden
encontrar efectos indeseables en la literatura usando otras vías de administración.
Por lo tanto, después de la inyección intravítrea de partículas aniónicas basadas en albúmina, la
difusión libre en el
Se puede observar la dirección posterior desde el vítreo a la retina, pero la mayoría de los catiónicos
las partículas permanecen unidas y agregadas en el vítreo [58,59] Para ilustrar los enfoques
mencionados, la Figura 8.2 muestra algunos ligandos que ya se han utilizado en la modificación de
polímeros para sistemas de administración de medicamentos y que por lo tanto pueden encontrar
aplicaciones especiales en terapia génica.
El tripéptido RGD es un dominio de señalización derivado de la fribronectina y la laminina.y se
compone de L-arginina, glicina y ácido L-aspártico. Esta secuencia es una común elemento en el
reconocimiento celular implicado en la unión celular a través de integrinas y es uno de los enfoques
más descritos para el desarrollo de biomateriales biomiméticos.(60,61]. Por ejemplo, las
nanopartículas de albúmina injertadas con RGD demostraron 61 veces mejora en el suministro
celflar mediado por receptores específicos de oligonucleótidos en inte-células tumorales que
expresan la sonrisa en comparación con los nanoconjugados de control no dirigidos. Ellos HN

Secuencia NH RGD Azúcares (Manosa)

Ácido fólico Aminas de bajo peso molecular (Espermina)

Figura 8.2 Ejemplos de ligandos utilizados para proporcionar nuevas características a los polímeros
endógenos
POLÍMEROS ENDÓGENOS COMO BIOMATERIALES PARA EL NANOPARTICULADO Pag 244
También fueron capaces de mejorar la actividad funcional del aligonucleótido en concentraciones
molares sin causar cito expresivo.
También se han utilizado para modificar los polímeros endógenos. Ácido urónico [65], mejorando
sus interacciones con las células. Es importante que a pesar de estas modificaciones no fueron
pensadas para el gen nanoparticulado abren posibilidades interesantes para apuntar a grupos
celulares específicos
62), RGD [63,64]El ácido fólico es un ligando de alta afinidad del receptor de folato, que algún tipo
de cáncer, como el cáncer de ovario o de pulmón, pero ausente en las células normales si derivado
por su grupo y-carboxilo, mantiene la afinidad de unión al receptor (66). Folato La conjugación, por
lo tanto, presenta un método alternativo para apuntar al receptor de folato.
Esta estrategia se ha aplicado con éxito in vitro no solo para terapia génica sino también para la
administración específica de receptores de anticuerpos anti-receptor de células T, interleucina 2,
agentes de terapia madre, radiofármacos y agentes de contraste de imagen, entre otros67].
Conjugación covalente de ácido fólico en la superficie de las nanopartículas de albúmina
La reacción de carbodiimina condujo a una mayor absorción de nanopartículas por las células
cancerosas (neuro línea celular de blastoma UKF-NB-3, y línea de glioblastoma de rata 101/8) pero
no de forma normal células (fibroblastos primarios normales del prepucio humano) (68]. El mismo
enfoque también fue se utiliza para las nanopartículas de albúmina dirigidas a las células SKOV3
(células de cáncer de ovario humano).línea), siendo nanopartículas (-70 nm) internalizadas con éxito
por las células por medio de la vía del folato [69]. La conjugación covalente de folato sobre la
superficie de la las nanopartículas parecen ser cruciales para mejorar la afinidad de las
nanopartículas por el receptor Las nanopartículas adsorbidas en folato exhiben una afinidad inferior
en comparación con covalentes unidos [68]
Está sobre expresado en cómo se mencionó anteriormente, la modificación química de los
polímeros mediante la adición de azucares también puede proporcionar nuevas características a los
polímeros endógenos. Carbohidratos nativos los grupos de aldehído que se contaminan como
extremos reductores se pueden acoplar directamente con el contenido de amina. Moléculas, que
conducen a la formación de un intermedio de base de Schiff. Asialoglicoproteína
Los receptores presentados en el hígado se pueden atacar utilizando polímeros con lactosa o
galactosa.
Los residuos. Así, las nanopartículas de albúmina-polietilenimina galactosiladas probadas en vitro
para la transferencia de genes sho de receptores de galactosa en células diana en una célula de
hepatoblastoma humano cultivado ine (Hep Células G2) y células de fibroblastos de ratón (células
NIH / 3T3) 170]. Otro enfoque interesante
Es modificación del polímero con manosa. En este caso, el objetivo es la manosa. proteína de unión
(MBP), una proteína de tipo lectina que participa en el sistema inmunitario innato respuesta,
estando presente en ciertos tipos de células, por ejemplo, células hepáticas y fagocíticas (tales como
macrófagos y células dendríticas) [71]. Los estudios farmacocinéticos revelaron una mayor tasa de
internalización en comparación con otros portadores específicos del hígado basados en o Albúmina
sylated, succinilada y cationizada. Después de 2 h de administración intravenosa,el 70% de la
albúmina de suero bovino manosilado se acumula en el hígado, con Kupffer. Las células son
responsables del 66% de esta captación [72]. Tal funcionalización con la nariz también se ha descrito
con éxito para la administración de fármacos y genes con otros nano sistemas tales como liposomas
y nanopartículas lipídicas sólidas (73-75]
La captación celular casada depende específicamente de la abundancia. Para obtener un beneficio
de las propiedades de los restos antes mencionados mientras que al servicio de la delicada
naturaleza y propiedades de los polímeros endógenos, modificación.es el medio ambiente Duro
debe ser leve y preferiblemente tener lugar en una puede resultar en hidrólisis, pérdida irreversible
de reaccionar polímero

POLÍMEROS ENDÓGENOS COMO BIOMATERIALES PARA EL NANOPARTICULADO Pag 345

y / o propiedades inherentes Figura de modificación de polímeros endógenos.8.3 ejemplifica las
reacciones más adecuadas para las carbodiimidas se emplean ampliamente para la activación de
grupos carbosilato por la formación de O-acylisourea altamente reactiva interna. Edias (figura 8.3a).
Esta activo las especies pueden reaccionar con los nucleófilos de amina para formar enlaces de
amida estables. En el caso de la aminación reductiva (Figura 8.3b), el resultado es un enlace entre
el aldehído y componentes de amina, formando enlaces de amina estables sin introducir ningún
espaciador
Ácido maleico imidas (maleimidas) también son una parte integral de muchas funciones hetero
bifuncionales. Agentes de reticulación, lo que permite la unión covalente de moléculas bioactivas a
polimeros en un procedimiento de dos pasos (Figura 8.3c). Finalmente, los isotiocianatos son
homobifun-Enlazadores tradicionales que reaccionan con las aminas primarias, lo que lleva a la
formación de tioure estable compuestos (Figura 8. 3d) 176]
Aunque todos los enfoques descritos anteriormente pueden ser muy útiles en fármacos es necesario
tener en cuenta que la modificación de la estructura polimérica nativa puede
Alterar dramáticamente las propiedades más interesantes del polímero endógeno como
biocompatibilidad y toxicidad y, en todo caso, el material que alguna vez fue inocuo.
y aprobado por la FDA ahora es una entidad química completamente diferente y probablemente
enfrentar una larga espera antes de su aprobación por cualquier agencia reguladora. Así, toda la
idea del uso de materiales completamente biológicos y endógenos desaparece cuando se usan
materiales modificados polímeros Conceptualmente, algunos de ellos son aproximaciones finas y
elegantes pero carecen de viabilidad practica Es tarea del investigador farmacéutico considerar
todos estos
Variables y límites a la hora de diseñar cualquier nuevo sistema de administración de fármacos.
(a) Reacción de carbodimida.

b) Aminación reductiva
(c) Reacción de maieilamida.

d) Reacción de isotiocianato

Figura 8.3 Principales mecanismos de conjugación utilizados en la modificación de polímeros.

(a) Reacción mediada por carbodiimida de aminas con ácidos carbónicos. (b) Aminación reductiva
(Reacción de maleimidas con tioles, (d) Reacción de isotiocianatos con nucleófilos

8.2.2 Características Fisicoquímicas de Nanosistemas basados en Polímeros

Endógenos.
Aunque una descripción detallada de las principales técnicas de caracterización fisicoquímica
utilizadas en la caracterización de polímeros está claramente más allá del alcance de este
capítulo, hemos incluido detalles específicos que deben considerarse cuando dicha
caracterización es específicamente para nanopartículas para fines de terapia génica. En tal
situación, debemos tener en cuenta los siguientes parámetros y detalles.
8.2.2.1 Peso molecular
El peso molecular de los polímeros es quizás una de sus características fisicoquímicas más
importantes a tener en cuenta. En algunos casos, la actividad biológica de un polímero
endógeno depende del peso molecular, así como su capacidad para formar nanoestructuras,
como se explicará más adelante. Hay varias técnicas disponibles para determinar las
diferentes formas de expresar el parámetro de peso molecular. Las expresiones más
relevantes para el desarrollo de sistemas de nanopartículas son el peso molecular promedio
en peso (Mw), el peso molecular promedio en número (Mn) y el peso molecular en viscosidad
(Mv). La polidispersidad del peso molecular del polímero (Ip) difiere del índice de
polidispersidad del tamaño de partícula (PdI). El primero se puede calcular a partir de la
relación entre el peso molecular promedio en peso y el peso molecular promedio en número,
como se describe en la siguiente:
Ip = Mw/Mn (8.1)
En el caso de las proteínas, se espera una baja polidispersidad y valores bien definidos
para el peso molecular en comparación con los polisacáridos. Por otro lado, la distribución
del peso molecular de los polisacáridos puede verse fuertemente influenciada por su fuente
y método de obtención.
Idealmente, para la formación de un sistema de nanopartículas por complejación /
gelificación iónica, la solución polimérica debería estar en un régimen semi-diluido, siendo
la.
c = 1/[n] (8.2)
Donde c es la concentración de la solución polimérica de partida y [n] es la viscosidad
intrínseca. Este es un tema importante ya que las soluciones concentradas a menudo inducen
una precipitación incontrolada. Si relacionamos esto con la ecuación de Mark-houwink,
podemos ver una relación entre la viscosidad intrínseca y el peso molecular del polímero de
la siguiente manera:
[n]=KMva (8.3)
Donde Mv es el peso molecular viscoso y K y a son las constantes de guiño de Mark y Mark
que dependen del sistema de polímero-solvente. Por lo tanto, un polímero con un peso
molecular más alto en teoría requeriría una solución más diluida para la formación adecuada.
De nanopartículas (es decir, precipitación en el estado nanométrico). Por otro lado, el uso de
oligómeros pequeños puede ser problemático, ya que la reticulación iónica puede no
mantener estos oligómeros juntos lo suficiente como para conducir a la red 3D de partículas
requerida.
También es importante tener en cuenta que el peso molecular tiene una fuerte correlación
con la toxicidad intrínseca del material, especialmente si ha sufrido alguna modificación
química. Un mayor peso molecular generalmente se asocia con una mayor toxicidad (como
se describe para la poli-L-arginina, un poli-aminoácido ampliamente utilizado en la terapia
génica), pero este perfil debe probarse en cada nueva instancia ya que, en algunos casos, un
peso molecular más bajo Las cadenas ha resultado en una mayor toxicidad.
Las principales técnicas utilizadas para determinar los pesos moleculares de los polímeros
son la ultracentrifugación analítica, la osmometría, la dispersión de luz estática y el
viscosímetro y la dispersión de luz estática dan los mejores resultados, especialmente cuando
se utiliza un detector de dispersión de luz de múltiples ángulos. En el caso de las proteínas,
donde el peso molecular es bien conocido, se puede usar la electroforesis en gel de acrilamida
para confirmar la estructura de la cadena polimérica.
8.2.2.2 Tamaño
El tamaño de una nanoestructura puede determinar su comportamiento, actividad y
estabilidad in vivo a lo largo del tiempo. Además, la internalización de las nanoestructuras
es un proceso dependiente del tamaño, como se explicará más adelante. El tamaño, sin
embargo, no necesariamente tiene una correlación con el peso molecular del polímero. Es
más dependiente de la proporción de los constituyentes en la formulación y la conformación
de los polímeros utilizados. Las estructuras más rígidas, como el atelocolágeno o la albúmina,
pueden conducir a partículas de mayor tamaño. La dispersión dinámica de la luz y la
difracción láser son las técnicas más relevantes para la determinación del tamaño. La
dispersión dinámica de la luz, a veces denominada dispersión de luz cuasi-elástica, es una
técnica bien establecida para medir el tamaño y la distribución del tamaño de las moléculas
y partículas, típicamente en la región submicrónica. La difracción láser determina las
distribuciones de tamaño de partícula midiendo el tamaño y la distribución de tamaño de las
moléculas y partículas, típicamente en la región submicrométrica. La difracción láser
determina las distribuciones de tamaño de partícula midiendo la variación angular en la
intensidad de la luz dispersada como consecuencia del efecto Tyndall a medida que un rayo
láser pasa a través de una muestra de partículas dispersas. Las partículas grandes dispersan
la luz en ángulos pequeños en relación con el rayo láser y las partículas pequeñas dispersan
la luz en ángulos grandes. Los datos de intensidad de dispersión angular luego se analizan
para calcular el tamaño de las partículas responsables de crear el patrón de dispersión,
utilizando la teoría de dispersión de luz de Mie. El tamaño de partícula se reporta
considerando una esfera con el mismo coeficiente de difusión. El índice de polidispersidad
(PdI) es un parámetro que a menudo se asocia con el tamaño promedio de las nanopartículas.
Mide el ancho de la distribución del tamaño de partícula y el PdI is:

PdI = (ơ)2 (8.4)

d
donde ơ es la desviación estándar y d es el diámetro promedio. Puede variar de 0 a 1, siendo
"1" completamente polidisperso y "0" completamente monodisperso. Los valores óptimos
varían según el uso y la técnica empleada en la preparación de las estructuras, pero los valores
inferiores a 0.2 pueden considerarse monodispersos para la mayoría de las nanopartículas
Las técnicas de microscopía también se pueden usar para realizar estimaciones de tamaño y
para corroborar la homogeneidad del tamaño en una población. Sin embargo, las más
utilizadas son la microscopía electrónica de transmisión (TEM), la microscopía electrónica
de barrido (SEM) y la microscopía de fuerza atómica (AFM). Estas técnicas se aplican con
mayor frecuencia para la caracterización visual del tamaño y la distribución con el fin de
corroborar los datos obtenidos con otras técnicas. Esto se debe a que la teoría detrás de la
mayoría de las técnicas utilizadas para la determinación del tamaño se basa en el uso de
partículas monodispersas y esféricas. Cualquier desviación de esta condición puede dar
resultados no realistas que, en consecuencia, pueden afectar la eficacia del sistema. En las
mediciones de TEM, normalmente se necesita un agente de contraste para una visualización
adecuada, como el acetato de uranilo, el tetróxido de osmio, el molibdato de amonio o el
ácido fosfotústico. Debido a su alta resolución, el AFM también puede ser útil para detectar
interacciones.
8.2.2.3 Propiedades electricas
La potencial zeta es el parámetro utilizado para caracterizar la carga superficial de una
nanoestructura. Aunque la potencial zeta no se puede medir directamente, se puede calcular
utilizando modelos teóricos aplicados a los datos proporcionados por la movilidad
electroforética determinada experimentalmente o la movilidad electroforética dinámica, los
fenómenos electrocinéticos y los fenómenos electroacústicos son las fuentes habituales de
datos para el cálculo de la potencial zeta. Mantener la potencial zeta lejos de un valor neutral
es importante para evitar problemas de estabilidad en los sistemas una vez que se favorece la
repulsión electrostática. De hecho, los potenciales zeta cercanos a los neutros dan lugar a una
tendencia a agregarse, y un alto potencial zeta (en el módulo) generalmente se asocia con
sistemas estables.
Las interacciones iónicas también se utilizan para asociar material genético con portadores
de nanopartículas. La electroforesis es quizás la forma más fácil de evaluar la eficacia de
asociación de los ácidos nucleicos a una nanoestructura. El material genético asociado no
migrará en un gel de electroforesis como sucedería con los ácidos nucleicos libres. También
es útil para determinar visualmente la conformación del ADN plasmídico, siendo el
superenrollado la forma más efectiva en comparación con las formas abiertas y circulares.
La eficacia de la asociación se puede determinar cuantitativamente usando kits comerciales
y técnicas de fluorescencia o, directamente, pero con una sensibilidad más baja, por
determinación UV. Para este propósito, el ácido nucleico libre debe haberse separado
previamente y luego cuantificarse.
La naturaleza del potencial zeta de las estructuras de nanopartículas de ADN resultantes (ya
sea positivo o negativo) también puede ser un factor determinante de la vía de administración,
la toxicidad o la estabilidad del ácido nucleico. Un potencial zeta positivo parece ser muy
importante para aumentar las interacciones entre las nanopartículas y la superficie celular y
generalmente se asocia con sistemas de transfección más efectivos. Sin embargo, se requieren
potenciales zeta negativos para evitar ciertas interacciones indeseables con el entorno
biológico que pueden conducir a la inestabilidad del sistema y los efectos
8.2.2.4 Interacciones quimicas
Las interacciones más complejas que las electrostáticas entre los constituyentes de una
nanoestructura o entre el polímero y los ácidos nucleicos requieren técnicas de
caracterización más sofisticadas para comprender los mecanismos subyacentes de estas
interacciones y las implicaciones correspondientes. En este sentido, la espectroscopia de
resonancia magnética nuclear (RMN) es una técnica analítica multipropósito, de alta
resolución y no destructiva que se puede utilizar con propósitos de caracterización tanto
cualitativa como cuantitativa. Esta técnica es útil no solo para la caracterización de materias
primas, sino que también se puede aplicar para obtener información cualitativa y cuantitativa
sobre estos mismos componentes en el estado de nanopartículas, especialmente aquellas
relacionadas con las interacciones que tienen lugar (78,79). Otras técnicas que proporcionan
información útil son la espectroscopia de Fourier Transform-Infra Red (FTIR), rayos X de
ángulo pequeño (SAXS) y calorimetría de barrido diferencial (DSC).
ACA FALTA LA 8.2.3 A QUIEN LE TOCA??????
SAQUEN SUS CONCLUSIONES A QUIEN LE TOCA
PS

MANUAL DE POLÍMEROS PARA TECNOLOGÍAS FARMACÉUTICAS.

La figura 8.4 propuso una vía de internalización para las nanopartículas basadas en ácido
hialurónico cargadas con plásmido. Las nanoestructuras interactúan con los receptores
CD44 en la membrana plasmática, lo que desencadena la internalización de las vesículas
caveola que luego se fusionan con la caveosoma. El plásmido se libera de las
nanopartículas y, finalmente, puede entrar en el núcleo.

8.3 CARACTERÍSTICAS ESPECÍFICAS DE LOS POLÍMEROS ENDÓGENOS QUE

PUEDEN ABRIR NUEVAS PERSPECTIVAS EN LA TERAPIA GÉNICA CON
NANOPARTÍCULAS.

Proteínas:
Albúmina
La albúmina de suero humano (HSA) es la principal proteína plasmática, con una estructura
globular y un peso molecular de 66.4 kDa. Su estabilidad es relativamente buena contra (60
° C) y PH (de 4 a 9), así como su baja toxicidad e inmunogenicidad, hacen de la albúmina
un material muy interesante para la administración de fármacos (88,89). Además, la
albúmina exhibe una alta capacidad de unión de fármacos debido a la presencia de
múltiples sitios de unión. De hecho, muchos compuestos metabólicos y fármacos
terapéuticos son transportados por la albúmina. La mayor parte del interés en la albúmina
para la terapia génica se basa en su capacidad bien conocida para evitar interacciones no
deseadas con proteínas séricas, que se producen después de la inyección intravenosa de
sistemas de transfección (89).
El recubrimiento de nanoestructuras con albúmina puede ser útil para prevenir su
interacción con el suero y mejorar la captación intracelular. Por lo tanto, a concentraciones
adecuadas, la albúmina tiene el potencial de minimizar las interacciones de las proteínas
séricas con las nanopartículas de ARNip destinadas a la administración sistémica in vivo
de ARNip in vivo (90). Además, debido a su carga negativa, el HAS puede disminuir la carga
superficial de los PNL y aumentar la estabilidad del suero. Como ejemplo, un recubrimiento
de HAS en nanopartículas redujo significativamente la fluorescencia en las células MCF-7
transfectadas con phrGFP que destruyeron los experimentos. En presencia de FBS (5%),
la fluorescencia después de la exposición a nanopartículas lipídicas con ARNip recubiertas
con albúmina disminuyó significativamente la fluorescencia de phrGFP a una relación de
SHA a ARN
Si de 2:10. PhrGFP fue significativamente regulado a la baja en las células mcf-7, MDAMB-
231 y SK-BR-3 TRANSFECTADAS con phrGFP solo cuando la albúmina fue necesaria para
recubrir las nanopartículas lipídicas (91). Se ha utilizado un recubrimiento de albúmina para
estabilizar las nanopartículas de oro (92) y las nanopartículas de sílice (93). Las
nanopartículas de oro recubiertas con citrato se agregan y precipitan rápidamente en un
punto isoeléctrico. Sin embargo, las mediciones del potencial zeta demostraron que las
nanopartículas de oro recubiertas con albúmina son estables en su punto isoeléctrico. Tanto
la albúmina como las nanopartículas tenían casi el mismo punto isoeléctrico y estaban
cargadas negativamente a pH neutro, lo que proporcionaba una estabilización electrostática
además de la estabilización estérica (92).
En cuanto a la toxicidad, tres líneas celulares humanas de colon (CaCo-2), pulmón (A5499
y macrófagos (THP-1), así como dos líneas celulares de ratón de pulmón (ASB-XVI) y colon
(colon-26), nanopartículas estabilizadas con albúmina). Considerablemente menos tóxico
que las nanoestructuras no modificadas (93), además de no mostrar un efecto significativo
en la visibilidad celular de las células 4T1 de tumor mamario ratón (90).
Si bien las técnicas de manipulación de genes ofrecen la posibilidad de producir albúmina
de suero humana recombinante (rHSA) (94), numerosos estudios han utilizado albúmina de
suero bovino (BSA) en el desarrollo de sistemas de administración de fármacos, más debido
al factor económico que a las diferencias químicas entre HAS y BSA. Ambas proteínas
tienen un plegamiento similar y una estructura primaria bien conocida; la diferencia más
notable es la presencia de dos residuos de triptófano en la albúmina bovina, mientras que
la albúmina humana tiene un triptófano único (95).
La forma más común de preparar nanopartículas de albúmina es mediante desolvatación
seguida de reticulación química, generalmente basada en glutaraldehído (82,96). Se ha
demostrado que la cantidad de reticulador utilizado influye en la carga AND. El disolvente
orgánico, generalmente etanol, se elimina más por evaporación.
Bajo presión reducida (82,97). Las nanopartículas de albúmina se estudiaron para
determinar la expresión local del activador del plasminógeno de tipo tisú (t-PA), un agente
trombolítico que se usa para prevenir la trombosis después de la sustitución mecánica de
la válvula cardíaca en una ecografía terapéutica. En un modelo de perro de reemplazo de
válvula tricúspide mecánico, la expresión de t-PA se logró durante un período prolongado
de tiempo (hasta 8 semanas) sin reducción en el tiempo de protrombina, lo que podría
provocar efectos secundarios sistémicos (97).
Las nanopartículas de albúmina también se han utilizado como sistemas eficaces de
administración de fármacos para oligonucleótidos anti sentido (AS-ON) con anti-
citomegalovirus (96). Las nanopartículas indujeron una distribución citoplásmica difusa y
una importante acumulación nuclear de AS-ON en células MRc5 (fibroblastos). Sin
embargo, ofrecieron una protección limitada de los oligonucleótidos contra la degradación
enzimática (60 minutos), un hecho que puede limitar el uso de este enfoque para
aplicaciones in vivo. Colágeno y derivados El colágeno es el componente principal de la
matriz extracelular y se usa ampliamente como biomaterial debido a su prometedora
biocompatibilidad, baja antigenicidad y biodegradabilidad (98). Aunque el colágeno forma
hidrogeles sin la necesidad de agentes de reticulación químicos, debido a su débil
resistencia mecánica, las preparaciones de nanopartículas necesitan tratamientos
adicionales. Por ejemplo, las nanopartículas de colágeno a menudo se preparan mediante
electrostática con sulfato de sodio (99). A pesar de que el colágeno es un material
prometedor para la ingeniería de tejidos, ha conducido directamente a solo unas pocas
aplicaciones en el desarrollo de portadores de genes de nanopartículas. Por el contrario, se
han obtenido resultados prometedores con derivados de colágeno, como atelocolágeno y
gelatina. Específicamente, el atelocolágeno, un colágeno tipo 1 tratado con pepsina
purificada y con un peso molecular de alrededor de 300 kDa, es uno de los polímeros más
utilizados para el suministro de genes a tumores, especialmente el ARN de ARN (100). En
este caso, la estructura rígida del atelocolágeno puede interactuar fácilmente con la forma
de varilla de las secuencias de ARNip. Las inyecciones intratumorales de nanocomplejos
atelocolágeno-ARNip regulaban negativamente la expresión de FGF-4 en tumores de
xenoinjerto NEC8-luc-testes en nudismo, reduciendo el crecimiento del tumor en el día 21
posterior a la inyección intratumorales (101). También pudieron reducir la expresión de la
oncoproteína E7 de HPV16, reduciendo el tamaño del tumor (102). La inhibición de la
metástasis en tumores óseos se logró silenciando EZH2 y P110-falta alfa después de la
inyección IV (103). Se obtuvieron resultados similares para el cáncer de hígado en
metástasis hepáticas A549-luc en un modelo de ratones desnudos después de la inhibición
de PLK-1 (104). Sin embargo, la formación de nanopartículas de atelocolágeno no se ve
favorecida por su rigidez. Gelatina se obtiene a partir de colágeno por hidrólisis ácida y
alcalina, lo que da como resultado residuos de glicina, prolina y 4-hidroxiprolina con una
estructura típica de -Ala-Gly-Pro-Arg-Gly-Gly-Pro. Se ha informado de una serie de métodos
para preparar nanopartículas de gelatina-base, incluida la desolvatina, un proceso de
autoensamblaje conducido termodinámicamente para materiales poliméricos, emulsiones,
reticulación química, nanoprecipitación y coacervatina (98,105). La de solvatación de las
soluciones de gelatina induce la formación transitoria de la hélice de la bobina seguida de
la agregación de los elices debido a la formación de una triple hélice similar al colágeno,
que permite la formación de nano partículas. Además, el gran número de grupos
funcionales en el esqueleto de polímero se puede utilizar para fines de reticulación y la
adición de ligandos. Sin embargo, las nanas partículas formadas sobre la base de estas
características son transitorias y requieren una mayor estabilización. La reticulación química
con glutaraldehído de una manera fácil de estabilizar estas estructuras.

Una gelatina de tipo B cargada negativamente a pH neutro (7.0) puede encapsular

físicamente construcciones de ácidos nucleicos informadores y terapéuticos, a diferencia
de los lípidos y polímeros cargados positivamente que condensan el ADN de forma
electrostática (106). Sin embargo, los resultados más prometedores se han logrado
utilizando aminas de bajo peso molecular y carbodiiminas solubles en agua. Esta
cationización puede llevarse a cabo en la gelatina antes de la formación de nano partículas
(como materia prima) o en las nanas partículas de gelatina preformadas. En este último
caso, la técnica de preparación más utilizada es la gelificación iónica / nano deposición.
Las nano estructuras que contienen gelatina ionizada de gato pueden proteger a Pdna y
sirna de la degradación por nucleasas y transfretar una variedad de tipos de células y
tejidos, tanto in vitro como in vivo. Después de la ionización del gato con etilendiamina o
espermina, los niveles de eficiencia de transfección alcanzados pueden compararse con
los proporcionados por agentes de transfección clásicos como la mina de polietileno. La
Tabla 8.2 muestra los resultados más importantes obtenidos con nano partículas basadas
en gelatina ionizada para administración de genes. Sin embargo, todos los resultados
mencionados anteriormente se obtuvieron utilizando polímeros de fuentes animales. Esto
sugiere que presentarán importantes problemas de seguridad relacionados con su
inmunogenicidad y posible contaminación.

POLÍMEROS ENDÓGENOS COMO BIOMATERIALES PARA EL NANOPARTICULADO

Tabla 8.2 Recopilación de estudios que emplean gelatina catiónica con las aminas
cholamina (CA), etilendiamina (ED) o espermina (SPM).

Amina Tipo de Observaciones Ref.

terapia
amine ne
AS - ON (107,108)
Fuerte estimulación del sistema inmune y
activación de grupos celulares específicos.

CA pDNA Menor toxicidad que los complejos de polietilenimina. Buena (109)

reproducibilidad de la metodología con potencial a escala.

siRNA
Por estabilidad influenciada por el pH ambiental y la fuerza iónica. El (110,111)
secado por congelación puede mejorar el potencial de ampliación.

ED pDNA Capacidad de la gelatina catiónica para formar nano

(112)
partículas por gelación iónica.

SPM pDNA Las nano partículas híbridas con los polímeros aniónicos sulfato de 113-115)
droitina o sulfato de dextrano condujeron a la transfección ocular in
vitro e in vivo con un gen terapéutico.
8.3.1.3 Protamina

Las protaminas son pequeñas proteínas nucleares que reemplazan las histonas en la fase
haploide de la espermatogénesis. Debido a que son proteínas ricas en arginina, están
cargadas positivamente a pH fisiológico, pudiendo interactuar con el ADN para permitir su
condensación y estabilización. La protamina se puede usar en forma de sulfato o base libre,
dos formas diferentes que pueden influir significativamente en las propiedades
fisicoquímicas de las nanas partículas, especialmente su tamaño, siendo la sal de sulfato
la forma más utilizada del polímero. Protamina Las nano partículas basadas muestran una
citotoxicidad muy baja en comparación con otros sistemas de administración de genes.
Además, en comparación con los liposomas disponibles comercialmente (DOTAP,
lipofectina), un virus capsoide artificial (polyomaVP1) y dos nano partículas de acrilato
catiónico, la eficiencia de transferencia celular en una línea celular de fibroblastos de ratón
con nano partículas de protamina fue una de las más altas. Los resultados de captación de
células de ARNip más prometedores se han obtenido utilizando protamina de bajo peso
molecular. Los estudios in vivo con ratones portadores de tumores demostraron además
que el péptido podría transportar y localizar ARNsi dentro de los tumores e inhibir la
expresión de VEGF a través de la aplicación sistémica del complejo peptídico, suprimiendo
así el crecimiento del tumor (118). La protamina de bajo peso molecular posee actividad de
translocación celular y se puede usar para aumentar la internalización en ciertos tipos de
células, ya que tiene una vía de internalización similar a las encontradas para TAT, el
principal ligando de internalización para el VIH. Se han sugerido varias hipótesis para
describir cómo los péptidos que penetran en las células median en la transducción de
células por protamina, incluida la formación de enlaces de hidrógeno entre los grupos
principales de guanidina en los residuos de arginina y los fosfolípidos en la membrana
celular, y la interacción de los residuos de arginina con la matriz extracelular
glicosaminoglycan tales como sulfato de heparina o sulfato de condroitina. Las nano
partículas de protamina / AS-ON fueron capaces de proporcionar una inhibición específica
de la transactivación del VIH-1 mediada por TAT, aumentando su captación por macrófagos
25 veces en comparación con la obtenida con AS-ON libre (119).

A pesar de estas ventajas, el uso de protamina como componente de nano partículas

presenta algunas desventajas, tales como: (i) posibles fenómenos de agregación y
precipitación en soluciones acuosas en condiciones isotónicas y (ii) escasa disociación de
las nano partículas capturadas intracelulares en los endosomas (120). Para superar estos
problemas, se ha añadido albúmina de suero humano a dichos complejos para inhibir la
precipitación de las partículas. Los complejos de albúmina-protamina / AS.ON mostraron
una liberación mejorada de ON en el citoplasma en comparación con el sistema binario de
AS-ON y protamina (120). Además, la combinación de protamina y albúmina parece mejorar
significativamente la estabilidad de las nanas partículas en soluciones con mayor fuerza
iónica, mejorando su internalización por las células (121). Finalmente, debemos mencionar
el interés en la funcionalización de nano sistemas basados en protamina. Específicamente,
el recubrimiento de nano partículas de protamina-oligonucleótido con apoliporoteína A1
aumentó la captación de partículas de protamina-AS-ON y la transcitosis en un modelo in
vitro de la barrera hematoencefálica (122). También se propuso la protamina modificada
con pullulan para el suministro de pDNA, con el fin de proteger el ADN de las nucleasas y
prevenir las interacciones con los componentes del plasma. Los experimentos de
transfección revelaron la capacidad de los sistemas desarrollados para proporcionar altos
niveles de expresión génica (123). La modificación de la protamina con grupos estearílicos
también resultó en una mayor eficiencia de transfección, probablemente debido a la mayor
entrada en las células facilitada por las correspondientes interacciones hidrófobas y el
posterior desempaquetado más fácil del ADN de los portadores internalizados (124).

8.3.1.4 Otras proteínas

Algunos otros polímeros endógenos aún no han consolidado su uso como biomateriales
para la entrega de genes a base de nano partículas, pero ofrecen posibilidades interesantes
que pueden explotarse en los próximos años.
Los poli péptidos similares a la elastina son polímeros que consisten en bloques hidrófobos
alternos y dominios de reticulación. Dichos polímeros pueden producirse de forma
recombinante y están compuestos de la secuencia de aminoácidos repetitiva (Val-Pro-Gly-
Xaa-Gly) m, donde Xaa es un dominio hidrofóbico que facilita tanto la auto agregación como
las funciones elastoméricas. Por lo tanto, se someten a una transición de fase inversa, que
puede utilizarse para promover el auto ensamblaje dependiente de la temperatura (125).
La Case-caseína es el componente de proteína de la leche más abundante. Debido a su
naturaleza anfifílica, la case-caseína puede establecer interacciones intermoleculares y
auto ensamblar fácilmente las estructuras de las micelas. Se requieren alrededor de 15 a
60 moléculas de caseína para formar micelas con un radio promedio de 7-14 nm. Sin
embargo, los cambios en las condiciones ambientales como la temperatura, el pH, la fuerza
iónica, la actividad del agua y la presión hidrostática conducen a cambios en la distribución
del tamaño de las micelas de caseína debido a la ausencia de una estructura terciaria
tridimensional rígida (89)
8.3.2 carbohidratos

Otro grupo importante de polímeros endógenos son los carbohidratos. Los carbohidratos
endógenos de interés para la terapia génica generalmente están cargados negativamente debido a
la presencia de grupos de ácido carboxílico o sulfato. Debido a este hecho, pueden contribuir dos
funciones principales a las formulaciones de nanopartículas. El primero es reducir la toxicidad,
generalmente asociada con los compuestos cargados positivamente utilizados para la transfección,
mediante la neutralización de la carga. El segundo es la capacidad de interactuar con receptores
específicos relacionados con la adhesión celular o la internalización de macromoléculas. Entre los
carbohidratos utilizados, la figura 8.5 muestra las estructuras del ácido polisialico y los
glicosaminoglicanos sulfato de condroitina, heparina y ácido hialurónico. Son los principales
hidratos de carbono endógenos utilizados como biomateriales en la preparación de sistemas
nanoparticulados para el suministro de genes.

8.3.2.1 sulfato de condroitina

sulfato de condroitina es un glicosaminoglicano lineal ampliamente distribuido que desempeña un

papel importante en el tejido conectivo y el metabolismo. Está compuesto por unidades alternas de
N-acetil-D-galactosamina y ácido D-glucurónico con diferentes grados y patrones de sulfonación. Se
ha propuesto como un agente biomimético para la administración racional de genes, ya que puede
mejorar el comportamiento de los portadores de genes de nanopartículas al disminuir su
citotoxicidad, prevenir interacciones no específicas con proteínas séricas y mejorar su eficacia de
transfección. A este respecto, y como un polímero negativo, la condroitina se ha utilizado con éxito
para disminuir la toxicidad intrínseca asociada con los componentes cargados positivamente
utilizados en la terapia génica no viral. Incluso la adición de pequeñas cantidades de sulfato de
condroitina se informó capaz de reducir la citotoxicidad a las células de la córnea humana de las
nanopartículas de gelatina cationizadas asociadas con el pDNA 3 veces (115). En el caso de los
complejos de polietilenimina-pDNA, el sulfato de condroitina fue capaz de reducir la citotoxicidad a
células de melanoma de ratón B16-F10 5 veces (126,127). Además, como se mencionó
anteriormente, las nanoestructuras que presentan sulfato de condroitina en su composición pueden
incorporarse específicamente a las células a través de su interacción con los receptores de
internalización CD44 y receptores HARE (128,129).
Figura 8.5 Estructuras de los principales hidratos de carbono endógenos utilizados como biomateriales en la preparación
de sistemas de nanopartículas para el suministro de genes.

Cuando se usa como agente de recubrimiento para la funcionalización de nanopartículas, el peso

molecular y el grado de sulfonación del sulfato de condroitina pueden ser críticos para el tamaño
medio de la nanoestructura final. Por lo tanto, se ha informado que cuanto más bajo es el peso
molecular, mayor es el tamaño de La formulación final (hasta 1 µm), aunque los pesos moleculares
superiores a 22 KDa no parecen afectar el tamaño. Por el contrario, un aumento en el grado de
sulfonación puede fortalecer las interacciones entre cadenas más pequeñas, lo que contribuye a
disminuir el tamaño de partícula. Por otro lado, ni el tamaño de las cadenas de sulfato de condroitina
ni la extensión de su sulfonación parecen influir en el potencial zeta de las nanopartículas
desarrolladas (130,131).

Recientemente, se han propuesto nanopartículas híbridas de gelatina cationizada con sulfato de

condroitina para la terapia génica ocular destinada a la administración tópica. Un plásmido que
codifica la mucina MUC5AC, esencial para la homeostasis de las lágrimas pero que se encuentra a
un nivel reducido en el ojo seco, se transfectó con éxito in vitro en células de córnea y conjuntiva
(113,114). Además, estas nanopartículas a base de sulfato de condroitina fueron capaces de
transfectar específicamente la conjuntiva de conejos y ratones, como se muestra en la Figura 8.6.
La citotoxicidad in vitro y los estudios de tolerancia in vivo también mostraron que el sistema era
inocuo en las condiciones probadas.

8.3.2.2 Ácido hialurónico

El ácido hialurónico, o hialuronano, es un glicosaminoglicano endógeno, no epimerizado, no
sulfatado, que existe in vivo como un polianión de ácido hialurónico y se compone de unidades de
disacáridos repetidas de ácido D-glucurónico y N-acetil-D-glucosamina. Es un compuesto
relativamente seguro, se usa ampliamente en formulaciones cosméticas y en medicina regenerativa
debido a su baja toxicidad (132), así como en nanotecnología para reducir la toxicidad asociada con
otros componentes de las nanopartículas. Sin embargo, la propiedad más atractiva del ácido
hialurónico como constituyente de un sistema de administración de genes es su capacidad para
interactuar fuertemente con varios receptores, por ejemplo, los receptores HARE y CD44, como se
indicó anteriormente (35,40,84-87).

Figura 8.6 Expresión de MUC5AC en córnea y conjuntiva experimentales de ojo seco (EDE) tratadas con pMUC5AC-NPs
(EDE + MUC5AC-NP). Los controles incluyen ratones sanos no tratados (control), ratones EDE de control (EDE), ratones
EDE tratados con plásmido desnudo (pEUC5AC desnudo EDE) y con NPs en blanco (NP en blanco EDE). Los ratones EDE
tratados con pMUC5AC NP mostraron una expresión significativa de MUC5AC en la córnea y conjuntiva (* P <0.05).
Adaptado con permiso de (113).

Con respecto a las nanopartículas híbridas de ácido hialurónico, la alta eficiencia observada en el
proceso de transfección se debió a la interacción del ácido hialurónico con los receptores CD44,
como se ilustra en la Figura 8.7. El efecto de la transfección pareció durar al menos 10 días,
alcanzando su nivel máximo en el cuarto día después de la transfección de células corneales
humanas (HCE) y células conjuntivas humanas (IOBA-NHC) (13,133). Esto se evidenció bloqueando
(usando un anticuerpo o un exceso de HA) estos receptores, lo que condujo a una disminución
dramática en la eficacia de la transfección.

Como se observó con otros polímeros, la actividad del ácido hialurónico parece estar influenciada
por su peso molecular. Los oligómeros de ácido hialurónico son más efectivos que sus homólogos
de mayor peso molecular, las cadenas poliméricas con pesos moleculares de más de 10 kDa son más
efectivas en la transfección de células HCE y IOBA-NHC (13,133,134).

8.3.2.3 otros carbohidratos

La heparina es un glicosaminoglicano altamente sulfonado y con carga negativa, mejor conocido por
su uso como anticoagulante. Está compuesto por varias unidades de disacáridos, especialmente
ácido idurónico 2-O y 6-O-sulfatado. Se han utilizado nanopartículas híbridas de heparina y
polietilenimina para transfectar eficazmente plásmidos que codifican la proteína de la matriz del
virus de la estomatitis vesicular ms-T34A, lo que conduce a una reducción de la proliferación de las
células C.26 (cáncer de colon) por inducción de la apoptosis in vitro. La inyección intratumoral de
estas nanopartículas inhibió significativamente el crecimiento del carcinoma subcutáneo C-26 in
vivo al inducir la apoptosis e inhibiendo la angiogénesis (135), mientras que la inyección
intraperitoneal inhibió las metástasis abdominales del carcinoma de colon C-26 a través de la
inducción de la apoptosis y prolongó la supervivencia de los ratones tratados (136 ). La función de
la heparina parece ser solo disminuir la toxicidad inherente de la polietilenimina en lugar de
estimular la transfección o internalización como otros carbohidratos que se mencionaron
anteriormente (137). La desventaja más importante de usar heparina es, sin embargo, su fuerte
efecto biológico como anticoagulante.

Figura 8.7 Eficacia de transfección de NP cargados con pDNA (HA: CSO 1: 2) incubados con células HCE. El receptor CD44
se bloqueó con 1 µg del anticuerpo monoclonal Hermes-1 o con un exceso de una mezcla de HA / HAO (50 veces con
respecto a la cantidad de HA en las nanoestructuras). La β-galactosidasa expresada se cuantificó mediante la reacción de
ONPG (media ± SD, n = 3). (* Diferencia significativa, p <0,05). Adaptado con permiso de (133).

Los ácidos polisialicos son polímeros lineales de unidades de ácido N-acetilneuramínico (ácidos
siálicos) unidas mediante enlaces α- (2 → 8) glicosídicos. Están abundantemente presentes en la
superficie de las células (42). Debido a su alta hidrofilicidad, el ácido polisialico se ha propuesto
como un sustituto natural del polietilenglicol (PEG) en el desarrollo de sistemas ocultos de segunda
generación (sistemas de administración de fármacos que presentan un aclaramiento reducido)
(138). Sobre la base de estas propiedades, el ácido polisialico también se ha descrito como capaz de
mejorar la vida media de hormonas, factores de crecimiento y enzimas que, como ácidos nucleicos,
son moléculas muy delicadas. con respecto a la PEG, se debe enfatizar que aunque se sabe que los
productos de la biodegradación de la PEG estimulan el sistema inmune, lo que lleva a reacciones no
deseadas, dichos efectos no se han reportado para el ácido polisialico (139).

8.4 conclusión y perspectiva de futuro

A pesar de la extensa investigación en el campo, el principal problema en la administración de genes

es proporcionar una administración adecuada de ácido nucleico espacio temporal o, en otras
palabras, las concentraciones correctas de ácido nucleico en el sitio de acción durante un período
de tiempo suficiente. Como podemos concluir a partir de los datos analizados en el presente
capítulo, los enfoques nanotecnológicos basados en polímeros endógenos como biomateriales
ofrecen una gran oportunidad para sortear la mayoría de las barreras significativas que limitan la
aplicación clínica amplia de la terapia génica. Esta es la razón por la cual una gran cantidad de
biomateriales y modificaciones de los mismos se han propuesto recientemente para el desarrollo
de sistemas de suministro de genes basados en nanotecnología. Sin embargo, la selección del
biomaterial correcto depende de varios factores, como la disponibilidad y asequibilidad en el grado
farmacéutico, la naturaleza del ácido nucleico que se debe asociar y administrar, el tipo de sistema
y el tejido objetivo, entre otros. Por lo tanto, se requiere un diseño racional de los componentes de
nanopartículas y sus propiedades fisicoquímicas finales. Además, el uso extenso y práctico de
proteínas endógenas dependerá de los avances en tecnología recombinante, para evitar problemas
de seguridad, así como reducciones en el costo para hacer que su uso sea competitivo. En cualquier
caso, lo que es probablemente una afirmación de lo obvio es que los portadores de nanopartículas
basados en polímeros endógenos deben prepararse en condiciones suaves. Teniendo en cuenta
estas premisas, el uso de aminas endógenas de bajo peso molecular como agentes de reticulación
tiene un enorme potencial, mientras que la modificación de los polímeros, aunque sea posible,
debería ser la última alternativa para evitar complicaciones en términos de seguridad, aprobación y
producción a gran escala. En tal escenario, podemos prever polímeros aniónicos no modificados,
como el sulfato de condroitina y el ácido hialurónico, y polianimes endógenos como futuros actores
principales. Además, el ácido polisialico, que solo ha sido evaluado fugazmente, es muy prometedor
o, al menos, es una promesa incierta pero provocativa. Específicamente, nuestra predicción es que,
en los próximos años, varias próximas generaciones de nanotemplacas de base natural con
arquitecturas específicas que imitan las demandas bioquímicas de la superficie celular de los tejidos
de trago se desarrollarán para la entrega de genes, que se pueden denotar como "de vuelta a la
naturaleza". Estrategias de entrega de genes.