Está en la página 1de 27

Centro de Biotecnología Industrial

Nombre del Proceso: VERSIÓN: 1


Gestión de Formación Profesional Integral

FECHA: 29-09-2018
Nombre del Documento:

FORMATO DE APOYO A LA FORMACION: PRACTICAS DE LABORATORIO


PÁGINA: 1 de 27

INFORMACIÓN BÁSICA
PROGRAMA DE FORMACION: TÉCNICO EN ALISTAMIENTO DE LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA Y BIOTECNOLOGÍA
FICHA: 1835939
NOMBRE DE LA PRÁCTICA:

OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA Y MACROSCÓPICA DE


MICROORGANISMOS: MICROSCOPÍA, MORFOLOGÍA Y
TINCIONES PRÁCTICA No.
MÉTODOS DE CULTIVO Y AISLAMIENTO DE BACTERIAS 07, 08 y 09
MÉTODOS DE CULTIVO Y DESCRIPCIÓN MORFOLÓGICA DE
HONGOS

COMPETENCIA:
91201052 PREPARAR INSTALACIONES, MATERIALES Y BIOTECNOLÓGICOS
Y/O MICROBIOLÓGICOS ESTABLECIDOS
291201053 REALIZAR OPERACIONES BÁSICAS PARA ENSAYOS
BIOTECNOLÓGICOS Y/O MICROBIOLÓGICOS DE ACUERDO CON PROTOCOLOS
ESTABLECIDOS.
291201055 REALIZAR OPERACIONES BÁSICAS DE TOMA DE MUESTRAS
BIOTECNOLÓGICAS Y/O MICROBIOLÓGICAS DE ACUERDO CON PROTOCOLOS
ESTABLECIDOS
RESULTADO DE APRENDIZAJE:
REALIZAR OPERACIONES DE LIMPIEZA Y DESINFECCIÓN A LAS ÁREAS, EQUIPOS
Y MATERIALES DEL LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA O BIOTECNOLOGÍA
SEGÚN PROCEDIMIENTOS Y PROGRAMAS
ALISTAR LOS MATERIALES NECESARIOS PARA LOS ENSAYOS
MICROBIOLÓGICOS SEGÚN DIRECTRICES Y PROTOCOLOS DE LAVADO,
DESINFECCIÓN Y ESTERILIZACIÓN DEL LABORATORIO
PREPARAR MUESTRAS DE ACUERDO A LOS ENSAYOS MICROBIOLÓGICOS Y/O
BIOTECNOLÓGICOS DETERMINADOS POR EL LABORATORIO
Centro de Biotecnología Industrial

Nombre del Proceso: VERSIÓN: 1


Gestión de Formación Profesional Integral

FECHA: 29-09-2018
Nombre del Documento:

FORMATO DE APOYO A LA FORMACION: PRACTICAS DE LABORATORIO


PÁGINA: 2 de 27

PREPARAR MEDIOS DE CULTIVO DE ACUERDO A LOS ANÁLISIS


MICROBIOLÓGICOS Y/O BIOTECNOLÓGICOS REALIZADOS POR EL LABORATORIO
REALIZAR CONTROLES DE CALIDAD A LOS MEDIOS DE CULTIVO DE ACUERDO A
LOS PROTOCOLOS ESTABLECIDOS POR EL LABORATORIO
EJECUTAR LA TOMA DE MUESTRA DE ACUERDO A LA NORMATIVIDAD VIGENTE Y
EL PLAN DE MUESTREO ESTABLECIDO POR LA ORGANIZACIÓN
ALISTAR LOS MATERIALES Y EQUIPOS PARA EL MUESTREO DE ACUERDO A LOS
TIPOS, CARACTERÍSTICAS DE LAS MUESTRAS A RECOLECTAR Y AL PLAN DE
MUESTREO Y PROTOCOLOS DE SEGURIDAD
MANTENER LA CADENA DE CUSTODIA DE LA MUESTRA HASTA SU DISPOSICIÓN
FINAL TENIENDO EN CUENTA LOS PROTOCOLOS DE EMBALAJE, TRANSPORTE,
ENTREGA Y/O RECEPCIÓN Y ALMACENAMIENTO ESTABLECIDOS POR LA
ORGANIZACIÓN
OBJETIVOS DE LA PRÁCTICA:
OBSERVAR MICROSCOPÍA Y MACROSCOPÍA DE LOS MICROORGANISMOS
CRITERIOS DE EVALUACIÓN:
APLICA LAS NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA Y / O BIOTECNOLOGÍA SEGÚN LOS PROCEDIMIENTOS
ESTABLECIDOS PARA EL INGRESO, PERMANENCIA Y SALIDA DEL LABORATORIO.
PREPARA SOLUCIONES DE AGENTES LIMPIADORES Y DESINFECTANTES DE
ACUERDO CON LAS FICHA TÉCNICAS Y LOS PROTOCOLOS ESTABLECIDOS POR
EL LABORATORIO
REALIZA PROCEDIMIENTOS DE ESTERILIZACIÓN DE MEDIOS DE CULTIVO Y
MATERIAL DE ACUERDO CON LAS CARACTERÍSTICAS DE LOS MEDIOS DE
CULTIVO A PREPARAR
CONTROLA LAS CONDICIONES DE ALMACENAMIENTO DE LOS MEDIOS DE
CULTIVO DISPONIBLES EN EL LABORATORIO SEGÚN PROTOCOLOS.
ALISTA LOS MATERIALES Y EQUIPOS DE LABORATORIO DE ACUERDO CON LOS
ENSAYOS A REALIZAR
ESTERILIZA LOS MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO NECESARIOS PARA LA
EJECUCIÓN DEL MUESTREO DE ACUERDO AL PLAN DE MUESTREO
Centro de Biotecnología Industrial

Nombre del Proceso: VERSIÓN: 1


Gestión de Formación Profesional Integral

FECHA: 29-09-2018
Nombre del Documento:

FORMATO DE APOYO A LA FORMACION: PRACTICAS DE LABORATORIO


PÁGINA: 3 de 27

ALISTA LOS MATERIALES PARA EL MUESTREO DE ACUERDO A LAS


CARACTERÍSTICAS DE LAS MUESTRAS MICROBIOLÓGICAS Y BIOTECNOLÓGICAS

AMBIENTE A UTILIZAR: Laboratorio de Microbiología A126

TIEMPO: TRABAJO GRUPAL: TRABAJO INDIVIDUAL:


6 HORAS
x
CONTENIDO DE LA PRÁCTICA
(Para elaborar por el instructor)

COMPETENCIAS DISCIPLINARES:
Promover la interacción idónea consigo mismo, con los demás y con la naturaleza en los
contextos laboral y social
MARCO TEÓRICO:

A. Ubique su área de trabajo:

Determinar las zonas de trabajo; Área de Transición - Cambio de ropas, Zona de


tránsito- Evacuación, Laboratorio Microbiología Industrial, Laboratorio Fermentaciones
Industriales, Área Almacén Medios, Materiales y Sustancias Químicas, Laboratorio
Procesos Químicos.
Centro de Biotecnología Industrial

Nombre del Proceso: VERSIÓN: 1


Gestión de Formación Profesional Integral

FECHA: 29-09-2018
Nombre del Documento:

FORMATO DE APOYO A LA FORMACION: PRACTICAS DE LABORATORIO


PÁGINA: 4 de 27

B. Utilice el Uniforme de Laboratorio (Color Blanco):

1. Gorro
2. Tapabocas
3. Bata antifluído, manga larga con puñera
4. Bota de seguridad

PALABRAS CLAVES: Tinción, Endospora, Microscopía, Cápsulas bacterianas,


Conidios, Esporangios, Tabique.

METODOLOGÍA:
Esta práctica se desarrollará en equipos de trabajo asignadas por el instructor. Para ello
se debe seguir las siguientes instrucciones para una jornada de trabajo de 8 horas de
formación, en la orientación técnica e instrucciones dadas por el Instructor.
Con el fin de lograr su aprendizaje completo deben finalizar la práctica de trabajo y como
soporte guarde la información recolectada del instrumento (método, secuencias,
cronogramas, curvas de calibración) en la BITÁCORA DE LABORATORIO con el fin de
realizar los análisis y responder a los interrogantes planteados.
CONSIDERACIONES DE SEGURIDAD
• Usar uniforme blanco y limpio
• Los materiales como bolsos ubicarlos en sus respectivas gavetas de seguridad,
solo utilizar el material de documentación y el computador portátil
• No comer ni ingerir bebidas en el Laboratorio/ No masticar chicle
• Limpiar el sitio de trabajo
• Distribuirse según los grupos asignados por el Instructor.
• La cristalería que se va a revisar dejarla en orden en el sitio de almacenamiento
• Chequear que las máquinas se encuentren limpias y en buen estado para su
identificación y revisión.

Contexto:

Identificar los microorganismos y su distribución en todos los ambientes obteniendo


microorganismos para su estudio como microorganismos contaminantes de los
materiales, medios de cultivo y Biorreactores si no se ejecutan los protocolos de limpieza
y desinfección en Plantas y la propagación e inoculación de microorganismos igualmente
su pureza en el crecimiento en los medios y la producción de Biomasa celular.
Centro de Biotecnología Industrial

Nombre del Proceso: VERSIÓN: 1


Gestión de Formación Profesional Integral

FECHA: 29-09-2018
Nombre del Documento:

FORMATO DE APOYO A LA FORMACION: PRACTICAS DE LABORATORIO


PÁGINA: 5 de 27

El tamaño de la mayoría de las células microbianas es tal que resultan difíciles de ver con
el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el
medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de
colorantes.

Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la
presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas,
cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.

Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas,
proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente, aunque
también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y alcoholes.

Después de la fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores cambios


estructurales en el protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en células que han
sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando después éste con el agente fijador, y siguiendo
inmediatamente el proceso de tinción.

La fijación produce habitualmente el encogimiento de las células; la tinción, por el


contrario, hace que las células aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera
que las medidas de las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con
mucha precisión.

MATERIALES, EQUIPOS A UTILIZAR :

EQUIPOS
 Incubadora de microorganismos (Bacterias, Fungi)
 Cuenta colonias
 Cabina de flujo laminar Nivel de Bioseguridad II

MATERIALES Y REACTIVOS
INSUMOS

 Detergente Químico EXTRAN M05 5%


 Papel Sellador Envoplast
 Papel kraft

MATERIALES

 Beaker o Vaso precipitado


Centro de Biotecnología Industrial

Nombre del Proceso: VERSIÓN: 1


Gestión de Formación Profesional Integral

FECHA: 29-09-2018
Nombre del Documento:

FORMATO DE APOYO A LA FORMACION: PRACTICAS DE LABORATORIO


PÁGINA: 6 de 27

 Caja de Petri
 Asas bacteriológicas (Asa redonda, recta, de rastrillo)
 Tubos de ensayo 13*100 mm

MEDIOS DE CULTIVO MICROBIOLÓGICO Y REACTIVOS QUÍMICOS


MEDIOS DE CULTIVO MICROBIOLÓGICO: N/A

REACTIVOS QUÍMICOS

 Cloro 0,5 % v/v


 Alcohol al 70 %
 Aceite de inmersión
 Colorante Azul de Metileno
 Reactivos de Tinción de Gram (cristal violeta, lugol, Alcohol acetona, fucsina)
 Otros aportados por el Instructor.

MICROORGANISMOS

1. Beauveria bassiana
2. Aspergillus niger
3. Trichoderma spp
4. Candida utilis (Torula)
5. Saccharomyces cerevisiae PRO
6. Bacteria acidoláctica
7. Microorganismos contaminantes (Origen Pruebas ambientes, superficies,
Mucosas, Piel y Ropa)

PLANTAS DIDÁCTICAS DE INVESTIGACIÓN APLICADA, PRODUCCIÓN Y


TRATAMIENTOS BIOLÓGICOS AMBIENTALES: N/A
METODOLOGÍA

Los materiales, equipos, Insumos y herramientas


Asesoría del Instructor

DESARROLLO DE LA ACTIVIDAD DE LABORATORIO.

 Realice el procedimiento de limpieza y desinfección de superficies, materiales y


equipos.
 Procedimiento de Limpieza y Desinfección de Superficies:
Centro de Biotecnología Industrial

Nombre del Proceso: VERSIÓN: 1


Gestión de Formación Profesional Integral

FECHA: 29-09-2018
Nombre del Documento:

FORMATO DE APOYO A LA FORMACION: PRACTICAS DE LABORATORIO


PÁGINA: 7 de 27

Previamente revisar condiciones de Bioprotección.


1. Con un paño húmedo pasar Jabón detergente y dejar actuar por 5 minutos.
2. Enjuagar con agua potable o limpia
3. Aspersar Hipoclorito de Sodio al 0.5 % en Solución. Dejar 3 minutos
4. Enjuagar con un paño humedecido
5. Aspersar Alcohol al 70% y dejar actuar hasta evaporar

 Trabaje en condiciones de asepsia y desinfección del personal de trabajo.

En la preparación de inóculos para procesos biotecnológicos industriales es importante


dominar ciertas técnicas de mantenimiento, cultivo, propagación e identificación de los
microorganismos en forma macroscópica y microscópica.
TINCIÓN DE GRAM. La tinción de Gram es usada para clasificar bacterias sobre la base
de sus formas, tamaños, morfologías celulares y reacción Gram (color). A nivel del
laboratorio es útil como test para un rápido diagnóstico presuntivo de agentes infecciosos,
tanto en muestras como en cultivos en crecimiento, y adicionalmente sirve para valorar la
calidad de la muestra clínica. Las bacterias se tiñen gram positivas (+), gram negativas
(–) o no se tiñen debido a sus diferencias en la composición de su pared y arquitectura
celular.
Las bacterias gram (+) tienen una gruesa capa de péptidoglucano y gran cantidad de
ácidos teicóicos que no son afectados por la decoloración con alcohol y/o acetona,
reteniendo el colorante inicial acomplejado con iodo y visualizándose en distintos grados
de tonos desde el violeta al azul claro, dependiendo de si la naturaleza de su pared celular
está intacta o dañada (por tratamientos antibióticos, edad célula).

Las bacterias gram (–) tienen en su pared celular una delgada capa de peptidoglucano
ligada a una membrana externa por moléculas de lipopolisacáridos. Esta membrana
externa es dañada por el alcohol y/o acetona de la decoloración, permitiendo que el primer
colorante acomplejado con iodo escape y sea reemplazado por el contracolorante.

Clásicamente los reactivos utilizados para la realización de la tinción de Gram han sido el
cristal violeta como colorante inicial, la solución de lugol para acomplejar a éste, el alcohol
y/o acetona para la decoloración y la safranina o fucsina básica como contracolorante.
Centro de Biotecnología Industrial

Nombre del Proceso: VERSIÓN: 1


Gestión de Formación Profesional Integral

FECHA: 29-09-2018
Nombre del Documento:

FORMATO DE APOYO A LA FORMACION: PRACTICAS DE LABORATORIO


PÁGINA: 8 de 27

Fundamento de la Tinción de Gram.

TÉCNICAS DE TINCIÓN PARA ENDOSPORAS BACTERIANAS. El tamaño de la


mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver con el microscopio
óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la célula y el medio que la rodea,
y el medio más simple de aumentar el contraste es la utilización de colorantes. Estos
pueden emplearse para distinguir entre tipos diferentes de células o para revelar la
presencia de determinados constituyentes celulares, tales como flagelos, esporas,
cápsulas, paredes celulares, centros de actividad respiratoria, etc.
Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas,
proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente, aunque
también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y alcoholes.
Después de la fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores cambios
estructurales en el protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en células que han
sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando después éste con el agente fijador, y siguiendo
inmediatamente el proceso de tinción. La fijación produce habitualmente el encogimiento
de las células; la tinción, por el contrario, hace que las células aparezcan mayores que lo
que son realmente, de manera que las medidas de las células que han sido fijadas o
teñidas no pueden realizarse con mucha precisión.
Centro de Biotecnología Industrial

Nombre del Proceso: VERSIÓN: 1


Gestión de Formación Profesional Integral

FECHA: 29-09-2018
Nombre del Documento:

FORMATO DE APOYO A LA FORMACION: PRACTICAS DE LABORATORIO


PÁGINA: 9 de 27

La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad
específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia son
moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los
constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos y los
polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno, el cristal
violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas negativameute (aniones)
y se combinan con los constituyentes celulares cargados positivamente, tales como
muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la fucsina ácida y el rojo Congo.
Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles; los colorantes de este grupo se
combinan con los materiales lipídicos de la célula, usándose a menudo para revelar la
localización de las gotículas o depósítos de grasa. Un ejemplo de colorante liposoluble es
el negro Sudán.
TINCIÓN SIMPLE. Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para
la microscopía, son suficientes los procedimientos simples de tinción. El azul de metileno
es un buen colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y
que no produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es
especialmente útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto
que la mayor parte del material no celular no se tiñe.
Las tinciones se usan para tres cosas fundamentalmente:
 Descripción de microorganismos en base a su morfología, estructura y distribución.
 Detección de determinados microorganismos para evaluación de contaminantes,
por ejemplo.
 Clasificación de microorganismos según sus características tintoriales.

Tipos de colorantes:
Ácidos. En disolución se cargan negativamente por eso se unen a estructuras cargadas
positivamente y no las células, que tienen carga negativa: Sales de Na. K, Ca, ión amonio,
eosina, rojo congo, rosa bengala, fucsina ácida.
Básicos. En disolución se cargan positivamente uniéndose a estructuras con carga
negativa como las células: Cloruros, sulfatos, azul de metileno, cristal violeta, verde
malaquita, fucsina fenicada o carbol-fucsina.
Características de un cultivo para una buena tinción:

 Ha de estar en fase exponencial de crecimiento y no ser viejo.


Centro de Biotecnología Industrial

Nombre del Proceso: VERSIÓN: 1


Gestión de Formación Profesional Integral

FECHA: 29-09-2018
Nombre del Documento:

FORMATO DE APOYO A LA FORMACION: PRACTICAS DE LABORATORIO


PÁGINA: 10 de 27

 Debe haberse obtenido de un cultivo sólido, para tinciones simples puede ser
necesario usar un cultivo líquido.

Preparación de un frotis:
 Suspensión de una colonia de un cultivo puro en una gota de agua.
 Extensión de la gota en un portaobjeto, con ayuda de otro porta, en la parte central
del primero.
 Secado al aire.
 Fijación a la llama para deshidratar la muestra. Se hace pasando tres veces el
porta por la llama rápidamente.

Figura. Preparación de un frotis

Tipos de tinciones
Simples: se usa un solo colorante disuelto en solución acuosa o alcohólica, y se
suplementan con un mordiente para una mejor fijación del colorante además de aumentar
el grosor de algunas estructuras para su mejor visión. Sirven para ver la morfología y las
agrupaciones que forman los microorganismos entre ellos y con otras células.
Diferenciales: Se usa más de un colorante. Tiñe de diferente modo a las células de
distintas especies.
Tinción negativa: se usa un colorante ácido, nigrosina o tinta china, que no entra en la
célula de modo que estas no se observan teñidas, lo que se ve de color es el fondo.
Centro de Biotecnología Industrial

Nombre del Proceso: VERSIÓN: 1


Gestión de Formación Profesional Integral

FECHA: 29-09-2018
Nombre del Documento:

FORMATO DE APOYO A LA FORMACION: PRACTICAS DE LABORATORIO


PÁGINA: 11 de 27

Tinciones diferenciales:
 Tinción Gram
 Tinción ácido-resistente
 Tinción de estructuras
 Tinción de cápsulas
 Tinción de esporas
 Tinción de flagelos
 Tinción de vacuolas grasas
 Tinción para hongos inferiores

PROCEDIMIENTO DE LABORATORIO.
PRIMERO A IDENTIFICAR EL MICROSCOPIO. OBSERVACIÓN MICROSCÓPICA DE
MICROORGANISMOS

Sistema óptico:
o OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Amplía la imagen del
objetivo.
o OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de
ésta.
o CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la
preparación.
o DIAFRAGMA: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.
o FOCO: Dirige los rayos luminosos hacia el condensador.
Centro de Biotecnología Industrial

Nombre del Proceso: VERSIÓN: 1


Gestión de Formación Profesional Integral

FECHA: 29-09-2018
Nombre del Documento:

FORMATO DE APOYO A LA FORMACION: PRACTICAS DE LABORATORIO


PÁGINA: 12 de 27

Sistema mecánico:
o SOPORTE: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el
brazo.
o PLATINA: Lugar donde se deposita la preparación.
o CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser
monocular, binocular, …..
o REVÓLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar,
cambiar los objetivos.
o TORNILLOS DE ENFOQUE: Macrométrico que aproxima el enfoque y
micrométrico que consigue el enfoque correcto.

MANEJO Y USO DEL MICROSCOPIO ÓPTICO:


1. Colocar el objetivo de menor aumento en posición de empleo y bajar la platina
completamente. Si el microscopio se recogió correctamente en el uso anterior, ya
debería estar en esas condiciones.
2. Colocar la preparación sobre la platina sujetándola con las pinzas metálicas.
3. Comenzar la observación con el objetivo de 4x (ya está en posición) o colocar el
de 10 aumentos (10x) si la preparación es de bacterias.
4. Para realizar el enfoque:

a. Acercar al máximo la lente del objetivo a la preparación, empleando el tornillo


macrométrico. Esto debe hacerse mirando directamente y no a través del ocular, ya que
se corre el riesgo de incrustar el objetivo en la preparación pudiéndose dañar alguno de
ellos o ambos.

b. Mirando, ahora sí, a través de los oculares, ir separando lentamente el objetivo de


la preparación con el macrométrico y, cuando se observe algo nítido la muestra, girar el
micrométrico hasta obtener un enfoque fino.

Pasar al siguiente objetivo. La imagen debería estar ya casi enfocada y suele ser
suficiente con mover un poco el micrométrico para lograr el enfoque fino. Si al cambiar de
objetivo se perdió por completo la imagen, es preferible volver a enfocar con el objetivo
anterior y repetir la operación desde el paso 3. El objetivo de 40x enfoca a muy poca
distancia de la preparación y por ello es fácil que ocurran dos tipos de percances:
incrustarlo en la preparación si se descuidan las precauciones anteriores y mancharlo con
aceite de inmersión si se observa una preparación que ya se enfocó con el objetivo de
inmersión.
Centro de Biotecnología Industrial

Nombre del Proceso: VERSIÓN: 1


Gestión de Formación Profesional Integral

FECHA: 29-09-2018
Nombre del Documento:

FORMATO DE APOYO A LA FORMACION: PRACTICAS DE LABORATORIO


PÁGINA: 13 de 27

Empleo del objetivo de inmersión:


a. Bajar totalmente la platina.
b. Subir totalmente el condensador para ver claramente el círculo de luz que nos indica la
zona que se va a visualizar y donde habrá que echar el aceite.
c. Girar el revólver hacia el objetivo de inmersión dejándolo a medio camino entre éste y
el de x40.
d. Colocar una gota mínima de aceite de inmersión sobre el círculo de luz.
e. Terminar de girar suavemente el revólver hasta la posición del objetivo de inmersión.
f. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente toca la
gota de aceite. En ese momento se nota como si la gota ascendiera y se adosara a la
lente.
g. Enfocar cuidadosamente con el micrométrico. La distancia de trabajo entre el objetivo
de inmersión y la preparación es mínima, aun menor que con el de 40x por lo que el riesgo
de accidente es muy grande.
h. Una vez se haya puesto aceite de inmersión sobre la preparación, ya no se puede volver
a usar el objetivo 40x sobre esa zona, pues se mancharía de aceite. Por tanto, si desea
enfocar otro campo, hay que bajar la platina y repetir la operación desde el paso 3.
i. Una vez finalizada la observación de la preparación se baja la platina y se coloca el
objetivo de menor aumento girando el revólver. En este momento ya se puede retirar la
preparación de la platina. Nunca se debe retirar con el objetivo de inmersión en posición
de observación.
j. Limpiar el objetivo de inmersión con cuidado empleando un papel especial para óptica.
Comprobar también que el objetivo 40x está perfectamente limpio.
MANTENIMIENTO Y PRECAUCIONES
1. Al finalizar el trabajo, hay que dejar puesto el objetivo de menor aumento en
posición de observación, asegurarse de que la parte mecánica de la platina no
sobresale del borde de la misma y dejarlo cubierto con su funda.
2. Cuando no se está utilizando el microscopio, hay que mantenerlo cubierto con su
funda para evitar que se ensucien y dañen las lentes. Si no se va a usar de forma
prolongada, se debe guardar en su caja dentro de un armario para protegerlo del
polvo.
3. Nunca hay que tocar las lentes con las manos. Si se ensucian, limpiarlas muy
suavemente con un papel de filtro o, mejor, con un papel de óptica.
Centro de Biotecnología Industrial

Nombre del Proceso: VERSIÓN: 1


Gestión de Formación Profesional Integral

FECHA: 29-09-2018
Nombre del Documento:

FORMATO DE APOYO A LA FORMACION: PRACTICAS DE LABORATORIO


PÁGINA: 14 de 27

4. No dejar el portaobjetos puesto sobre la platina si no se está utilizando el


microscopio.
5. Después de utilizar el objetivo de inmersión, hay que limpiar el aceite que queda
en el objetivo con pañuelos especiales para óptica o con papel de filtro (menos
recomendable). En cualquier caso se pasará el papel por la lente en un solo
sentido y con suavidad. Si el aceite ha llegado a secarse y pegarse en el objetivo,
hay que limpiarlo con una mezcla de alcohol-acetona (7:3) o xilol. No hay que
abusar de este tipo de limpieza, porque si se aplican estos disolventes en exceso
se pueden dañar las lentes y su sujeción.
6. No forzar nunca los tornillos giratorios del microscopio (macrométrico,
micrométrico, platina, revólver y condensador).
7. El cambio de objetivo se hace girando el revólver y dirigiendo siempre la mirada a
la preparación para prevenir el roce de la lente con la muestra. No cambiar nunca
de objetivo agarrándolo por el tubo del mismo ni hacerlo mientras se está
observando a través del ocular.
8. Mantener seca y limpia la platina del microscopio. Si se derrama sobre ella algún
líquido, secarlo con un paño. Si se mancha de aceite, limpiarla con un paño
humedecido en xilol.
9. Es conveniente limpiar y revisar siempre los microscopios al finalizar la sesión
práctica y, al acabar el curso, encargar a un técnico un ajuste y revisión general de
los mismos.

EJERCICIO PRÁCTICO EN EL CULTIVO MICROBIANO DE CEPAS CONOCIDAS Y


PRODUCCIÓN IN VITRO, montado por el Instructor; Laboratorista o Monitor!!
A. Preparación de Frotis bacteriano
1. Coloque una gota de agua en un portaobjetos limpio
2. Transfiera con el asa bacteriológica redonda una pequeña cantidad de la colonia
bacteriana a la gota de agua, también se puede utilizar solución salina
3. Remover hasta formar solución homogénea y extender
4. Secar la película, no flamear
5. Observar al microscopio
6. Identificar morfología, realizar esquemas.

B. Preparación Tinción Simple


1. Cubrir el frotis con colorante- Cristal violeta o safranina
2. Lavar para eliminar exceso de agua
3. Secar (No frotar)
4. Observar al microscopio morfología y agrupación de bacterias
Centro de Biotecnología Industrial

Nombre del Proceso: VERSIÓN: 1


Gestión de Formación Profesional Integral

FECHA: 29-09-2018
Nombre del Documento:

FORMATO DE APOYO A LA FORMACION: PRACTICAS DE LABORATORIO


PÁGINA: 15 de 27

C. Preparación Tinción de Gram


1. Preparar frotis bacteriano
2. Teñir con cristal violeta 1 minuto
3. Lavar con abundante agua
4. Cubrir con Lugol 1 minuto
5. Lavar con agua
6. Decolorar con Alcohol Cetona hasta dejar perder el color
7. Lavar con agua y secar, sin remover
8. Observar morfología al microscopio
9. Diferenciar y caracterizar las Bacterias Gram (+) y Gram (-).

D. Preparación Tinción de Esporas


1. Preparar frotis bacteriano
2. Teñir con Verde Malaquita
3. Calentar
4. Lavar exceso de colorante
5. Teñir con Safranina 1 minuto
6. Secar
7. Observar esporas al microscopio
9. Anotar disposición y morfología de las endosporas bacterianas.

E. Preparación Levaduras suspendidas en solución salina


1. Tomar muestra con asa de siembra
2. Agregar gota de solución salina
3. Frotar la muestra en el portaobjetos
4. Observar a 4x, 10x y 40x.
5. Anotar disposición y morfología de la levadura.

F. Preparación Levaduras suspendidas en solución de Lugol


1. Tomar muestra con asa de siembra
2. Agregar gota de solución de Lugol
3. Realice emulsión con el asa
4. Frotar la muestra en el portaobjetos
5. Observar a 4x, 10x y 40x.
6. Anotar disposición y morfología de la levaduras.
Centro de Biotecnología Industrial

Nombre del Proceso: VERSIÓN: 1


Gestión de Formación Profesional Integral

FECHA: 29-09-2018
Nombre del Documento:

FORMATO DE APOYO A LA FORMACION: PRACTICAS DE LABORATORIO


PÁGINA: 16 de 27

G. Preparación de Mohos
1. Examinar muestras de caja de petri o muestras del pan o frutas en descomposición
2. Describir color, contextura.
1. Tomar muestra con cinta transparente
2. Agregar gota de solución de Lugol al portaobjetos
4. Frotar la muestra y la cinta en el portaobjetos con la yema de los dedos
3. Observar a 4x, 10x y 40x.
9. Graficar morfología de Hongos secos.

H. Recuento en Cámara de Neubauer


1. Esquematizar la cámara de Neubauer
2. Observar cuadrículas al microscopio
3. Esquematizar
4. Tomar una muestra del cultivo o fermentación
5. Preparar una dilución seriada
6.Tomar 1 ml con pipeta estéril y llevar a un tubo de ensayo tapa rosca con 9 ml en
agua estéril
7. Agitar la muestra en el vortex
8. Por medio de un tubo capilar se llena la cámara de Neubauer
10. Expresión de resultados:

C = K * N* D
Donde:

C: Concentración de células, Células/ml


K: Constante de la cámara, 25 cuadrantes= 5*104 o de 16 cuadrantes = 6,5*104
N: Cantidad de conidios, levaduras o esporas contados en 4 o 5 cuadrantes
D: Cantidad sucesiva de diluciones, 10 n veces

I. Sanitizar materiales y equipos.


Evidencias de la Actividad.
En equipos de trabajo deben entregar:
1.Los Cuadros siguientes, según microorganismos estudiados:
Centro de Biotecnología Industrial

Nombre del Proceso: VERSIÓN: 1


Gestión de Formación Profesional Integral

FECHA: 29-09-2018
Nombre del Documento:

FORMATO DE APOYO A LA FORMACION: PRACTICAS DE LABORATORIO


PÁGINA: 17 de 27

CUADRO DE RESULTADOS: MACROSCOPÍA BACTERIAS


Características *Nombre del Equipo a Estereoscopio,
en medio Microorganismo a utilizar Lupa o
sólido evaluar, si lo tiene Cuentacolonias

Morfología Forma
Macroscópica
Tamaño
HACER LAS
Elevación
GRÁFICAS
Forma del borde

Superficie

Color

Capacidad de Emulsión
en agua
*Deben hacer el cuadro de resultados todas las veces que tengan un microrganismo diferente.

CUADRO DE RESULTADOS: MICROSCOPÍA BACTERIAS


Características *Nombre del Equipo a Microscopio
en medio Microorganismo a utilizar
sólido o evaluar, si lo tiene
líquido
Morfología Tinción simple: Forma
Microscópica
Tinción simple:
HACER LAS Agrupaciones
GRÁFICAS Tinción diferencial:
Gram
Tinción diferencial:
Esporas
Tinción diferencial:
Flagelos
Tinción diferencial:
Cápsulas
*Deben hacer el cuadro de resultados todas las veces que tengan un microrganismo diferente.
Centro de Biotecnología Industrial

Nombre del Proceso: VERSIÓN: 1


Gestión de Formación Profesional Integral

FECHA: 29-09-2018
Nombre del Documento:

FORMATO DE APOYO A LA FORMACION: PRACTICAS DE LABORATORIO


PÁGINA: 18 de 27

CUADRO DE RESULTADOS: MACROSCOPÍA HONGOS Y LEVADURAS


Características *Nombre del Equipo a Estereoscopio,
en medio Microorganismo a utilizar Lupa o
sólido o evaluar, si lo tiene Cuentacolonias
líquido
Morfología Topografía de la
Macroscópica colonia:
Forma: circular,
irregular, filamentosa
HACER LAS
GRÁFICAS
Elevación: plana y
extendida, elevada y
limitada, umbilicada

Margen: entero,
lobulado, desflecado,
rizoide

Superficie: plegada,
con surcos radiados,
cerebriforme
Pigmentación en
anverso y reverso de
la colonia o pigmento
difusible en el medio
Textura: granulosa,
pulverulenta, vellosa,
aterciopelada,
algodonosa.
Tamaño: crecimiento
limitado o
crecimiento invasivo.
*Deben hacer el cuadro de resultados todas las veces que tengan un microrganismo diferente.
Centro de Biotecnología Industrial

Nombre del Proceso: VERSIÓN: 1


Gestión de Formación Profesional Integral

FECHA: 29-09-2018
Nombre del Documento:

FORMATO DE APOYO A LA FORMACION: PRACTICAS DE LABORATORIO


PÁGINA: 19 de 27

CUADRO DE RESULTADOS: MICROSCOPÍA HONGOS Y LEVADURAS


Características *Nombre del Equipo a Microscopio
en medio Microorganismo a utilizar
sólido o evaluar, si lo tiene
líquido
Morfología Características de las
Microscópica Hifas: forma, diámetro,
pigmento, tabique
HACER LAS Tipo de esporulación:
GRÁFICAS talosporos,
conidiosporos,
esporangios
*Deben hacer el cuadro de resultados todas las veces que tengan un microrganismo diferente.

2. Reportar en el Anexo Bitácora de trabajo.


3. Entregar un informe especificando la morfología observada (según cuadros arriba
dados), tipos de reactivos y funciones de los mismos.
Evidencia(as):

1. Resultado de Desempeño: Resultado de la observación por Lista de verificación


en la realización de prácticas en el Laboratorio.
2. Evidencia de producto: Valoración de la entrega en físico del Documento
prácticas en el Laboratorio.
3. Evidencia de producto: Valoración de la entrega en físico de la Bitácora de
Laboratorio.

BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA: N/A

ANEXOS: 1. Morfologías macroscópicas y microscópicas


Centro de Biotecnología Industrial

Nombre del Proceso: VERSIÓN: 1


Gestión de Formación Profesional Integral

FECHA: 29-09-2018
Nombre del Documento:

FORMATO DE APOYO A LA FORMACION: PRACTICAS DE LABORATORIO


PÁGINA: 20 de 27

INFORME DE RESULTADO DE LA PRACTICA


(Para elaborar por el Equipo de Trabajo)
EQUIPO DE TRABAJO:

1
2
3
4
5
6

CONCLUSIONES: Deben diligenciar en hoja adjunta.


Observaciones y sugerencias por el aprendiz. Deben diligenciar en hoja adjunta.
Centro de Biotecnología Industrial

Nombre del Proceso: VERSIÓN: 1


Gestión de Formación Profesional Integral

FECHA: 29-09-2018
Nombre del Documento:

FORMATO DE APOYO A LA FORMACION: PRACTICAS DE LABORATORIO


PÁGINA: 21 de 27

ANEXO 1. OBSERVACIONES MACROSCOPICAS

A. Crecimiento en medio sólido: las células microbianas se reproducen habitualmente con


tal rapidez que en 18 - 24 horas dan lugar a la aparición de masas visibles de células
sobre medios sólidos que se denominan colonias. Cada colonia se considera que está
formada por un único tipo de microorganismo.

Las colonias tienen una morfología característica que se estudia a simple vista o con la
ayuda de una lupa. Los caracteres más importantes de las colonias y cuyo estudio tiene
interés en la caracterización son los siguientes:

1. Forma: Puede ser puntiforme, circular, irregular, filamentosa, rizoide u ovalada


2. Tamaño: Se mide en mm. Se dice que es puntiforme si mide menos de 1mm.
3. Elevación: Vistas de perfil las colonias pueden ser plana, elevada (o en relieve),
convexa, pulvinada (más elevada que convexa), mamelonada (con una protuberancia
central), o umbilicada (con una depresión central).
Centro de Biotecnología Industrial

Nombre del Proceso: VERSIÓN: 1


Gestión de Formación Profesional Integral

FECHA: 29-09-2018
Nombre del Documento:

FORMATO DE APOYO A LA FORMACION: PRACTICAS DE LABORATORIO


PÁGINA: 22 de 27

4. Forma del borde: Puede ser entero, ondulado, lobulado, dentado (o aserrado),
filamentoso, y rizado.
5. Superficie:
* Lisa
* Rugosa
* Mate
* Brillante
* Transparente
* Opaca
6. Color:
Presencia de colores característicos y difusión de pigmentos en el medio.
7. Capacidad de emulsión en agua:
* Forma una suspensión uniforme
* Forma una suspensión grumosa
* No se emulsiona

B. Crecimiento en medio líquido: tiene interés los siguientes aspectos:


1. Cantidad de crecimiento:
* Ninguna
* Escasa
* Moderada
* Abundante.

2. Crecimiento en la superficie:
* Positivo
* Negativo
* Formación de un anillo
* Película superficial que se desintegra o no al agitar

3. Turbidez:
* Uniforme
* Floculante
* Negativa

4. Depósito en el fondo del tubo:


* Ausente
* Granular
* Floculante
* Viscoso
* Se desintegra o no al agitar.
Centro de Biotecnología Industrial

Nombre del Proceso: VERSIÓN: 1


Gestión de Formación Profesional Integral

FECHA: 29-09-2018
Nombre del Documento:

FORMATO DE APOYO A LA FORMACION: PRACTICAS DE LABORATORIO


PÁGINA: 23 de 27

OBSERVACIONES MICROSCOPICAS

El índice de refracción de las bacterias es similar al medio que las rodea y por tanto
son difíciles de ver al microscopio. En cambio son químicamente muy diferentes; estas
diferencias son las que permiten distinguir las bacterias por medio de TINCIONES. Las
tinciones son de dos tipos:

a) Tinciones simples: Son aquéllas que utilizan un solo colorante. Muestran la forma,
el tamaño y la ordenación de las bacterias.
b) Tinciones diferenciales: Son aquéllas que utilizan dos o más reactivos. Con ellas
se pueden observar diferencias entre células o partes de células. Las más importantes
son:

1. Tinción de Gram.
2. Tinción de microorganismos ácido-alcohol resistentes (Ziehl-Neelsen).
3. Tinción de estructuras.
- Tinción de esporos.
- Tinción de flagelos.
- Tinción de cápsulas.

Los principales pasos para realizar una tinción para su posterior examen microscópico
son:

1. Extensión:
* A partir de un caldo de cultivo. Con un asa de platino se coloca una gota de caldo en el
portaobjetos y se extiende con movimientos circulares (figura 10).
* A partir de una colonia en medio sólido. Con el asa de platino se toma una gota de agua
que se deposita en el portaobjetos; después se toma una colonia, se mezcla y se extiende
como antes (figura 11).
2. Secar: dejando la preparación al aire hasta la evaporación
3. Fijación:
Tiene como objeto fijar los microorganismos al portaobjetos por la llama hasta que se
seque, sin calentar demasiado (figura 12). El calor excesivo alteraría la forma normal y la
estructura
de los microorganismos que se van a teñir. El portaobjetos debe notarse caliente, pero
no debe quemar cuando se coloca sobre el dorso de la mano.
4. Tinción: En función del objetivo existen distintos procedimientos de tinción.

Tinción de Gram. Cuando se emplea este método de tinción, debido a diferencias en la


pared celular, las
Centro de Biotecnología Industrial

Nombre del Proceso: VERSIÓN: 1


Gestión de Formación Profesional Integral

FECHA: 29-09-2018
Nombre del Documento:

FORMATO DE APOYO A LA FORMACION: PRACTICAS DE LABORATORIO


PÁGINA: 24 de 27

bacterias se dividen por lo general en dos grandes grupos, según retengan o no el


colorante primario ("GRAMPOSITIVAS" o "GRAMNEGATIVAS" respectivamente) tras
sufrir la acción de un decolorante.

En esta técnica se emplean cuatro reactivos diferentes:

METODO: * Un colorante primario (violeta de genciana) durante tres minutos.


* Lavar con agua.
* Un mordiente (lugol) durante dos minutos.
* Lavar con agua.
* Un agente decolorante (alcohol-acetona) durante diez segundos.
* Lavar con agua.
* Un colorante de contraste (safranina) durante treinta segundos.
* Lavar con agua y secar sobre un papel de filtro.

Las células que retienen el colorante primario se denominan "GRAMPOSITIVAS"


(color violeta) y las que se decoloran con el alcohol-acetona y se tiñen posteriormente con
la safranina reciben el nombre de "GRAMNEGATIVAS" (color rojizo).
* Observar al microscopio con el objetivo de inmersión.

Tinción de esporas. Las bacterias de algunos géneros forman endosporos que son
estructuras muy resistentes a las altas temperaturas, a la falta de humedad y a la acción de
productos químicos. Los endosporos son también resistentes a la penetración de colorantes
utilizados en Microbiología y por tanto en una extensión teñida según el método de Gram
se pueden distinguir como zonas incoloras en el interior de las formas vegetativas de las
bacterias Gram positivas. Sin embargo, una vez teñidas su decoloración suele ser difícil.

METODO (Bartolomew y Mittwer).

* Se prepara una extensión en la forma habitual y se fija intensamente al calor para lo


cual se pasa unas veinte veces por la llama.
* Se cubre la extensión durante 10 minutos con solución acuosa saturada de verde
malaquita, calentando hasta la emisión de vapores.
* Se lava con agua y se añade safranina durante 30 segundos, se lava con agua y se
seca con papel de filtro.
* Observar al microscopio con el objetivo de inmersión
Según este método de tinción, los endosporos se tiñen en verde, pero el resto de la célula
(o la célula que no posee endosporos) se tiñe de rojo débil.

Tinción de cápsulas. Los métodos ordinarios de tinción no colorean la cápsula, aunque a


veces se puede observar una zona clara rodeando al organismo teñido. Para demostrar la
Centro de Biotecnología Industrial

Nombre del Proceso: VERSIÓN: 1


Gestión de Formación Profesional Integral

FECHA: 29-09-2018
Nombre del Documento:

FORMATO DE APOYO A LA FORMACION: PRACTICAS DE LABORATORIO


PÁGINA: 25 de 27

presencia de cápsulas se emplea generalmente la tinción negativa con tinta china o


nigrosina.

METODO
* Depositar una gota de tinta china o nigrosina sobre un portaobjetos.
* Mezclar con ella una colonia procedente de un medio sólido, con ayuda del asa de
platino.
* Cubrir con un cubreobjetos, evitando la formación de burbujas de aire. Presionar con
fuerza entre papel de filtro para eliminar los restos de tinta china que puedan enturbiar
la observación.

* Examinar al microscopio con el objetivo de inmersión.

Las bacterias con cápsula aparecen rodeadas de una zona clara destacando del fondo
gris oscuro. Las bacterias no capsuladas no presentan esta zona clara.

1. Observación al microscopio con el objetivo de inmersión

METODO
* Depositar en la preparación una pequeña gota de aceite de inmersión. De esta forma
se reduce la refracción de los rayos de luz al pasar del portaobjetos al aire, consiguiéndose
que un mayor número de ellos penetren en el objetivo.
* Colocar el portaobjetos en la platina.
* Elevar el condensador del microscopio al nivel de la platina para lograr el máximo de
luz.
* Bajar el objetivo de inmersión hasta que contacte con la gota de aceite y enfocar hasta
observar la morfología del microorganismo.
Centro de Biotecnología Industrial

Nombre del Proceso: VERSIÓN: 1


Gestión de Formación Profesional Integral

FECHA: 29-09-2018
Nombre del Documento:

FORMATO DE APOYO A LA FORMACION: PRACTICAS DE LABORATORIO


PÁGINA: 26 de 27

MORFOLOGIA DE LAS BACTERIAS, ver gráfica abajo:

a-e: cocos a: cocos arracimados


b-c: diplococos
d: cocos en cadena
e: cocos en tétradas
f: cocobacilos
g-i: bacilos g: bacilos aislados
h: bacilos en cadenas
i: bacilos aislados, en empalizada y formando ángulos
j-k: espirilos
Centro de Biotecnología Industrial

Nombre del Proceso: VERSIÓN: 1


Gestión de Formación Profesional Integral

FECHA: 29-09-2018
Nombre del Documento:

FORMATO DE APOYO A LA FORMACION: PRACTICAS DE LABORATORIO


PÁGINA: 27 de 27

IMAGEN OBSERVACIÓN MICROSCOPICA DE HONGOS: