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INSTITUTO DE FARMACIA Y ALIMENTOS

UNIVERSIDAD DE LA HABANA

TESIS EN OPCIÓN AL TÍTULO DE


LICENCIADO EN CIENCIAS FARMACÉUTICAS

EVALUACIÓN FARMACOGNÓSTICA,
FITOQUÍMICA Y ACTIVIDAD
ANTIOXIDANTE DE
Guettarda calyptrata A. Rich.
(Contraguao)

Autora: Zuleira Ocanto Torres


Tutores: Dra C. Yamilet I. Gutiérrez Gaitén
MSc. Ramón Scull Lizama

Asesores: Lic. José Luis Mayoral Jiménez


MSc. Alejandro Felipe González

La Habana
2017
INSTITUTO DE FARMACIA Y ALIMENTOS
UNIVERSIDAD DE LA HABANA

TESIS EN OPCIÓN AL TÍTULO DE


LICENCIADO EN CIENCIAS FARMACÉUTICAS

EVALUACIÓN FARMACOGNÓSTICA,
FITOQUÍMICA Y ACTIVIDAD
ANTIOXIDANTE DE
Guettarda calyptrata A. Rich.
(Contraguao)

Autora: Zuleira Ocanto Torres


Tutores: Dra. C. Yamilet I. Gutiérrez Gaitén
MSc. Ramón Scull Lizama

Asesores: Lic. José Luis Mayoral Jiménez


MSc. Alejandro Felipe González

La Habana
2017
DEDICATORIA

A mi mamá, por todo el apoyo, paciencia y amor incondicional, porque con ella aprendí a dar mis
primeros pasos y ahora le toca verme volar…
A mi hija, porque tenerla a mi lado me da fuerzas para ser mejor cada día…
AGRADECIMIENTOS

A mis profesosres Dra.C. Yamilei I. Gutiérrez Gaitén y MsC. Ramón Scull por darme la
oportunidad de trabajar con ellos en este proyecto,
A Lic, José Luis Mayoral por dar su idea,
A mis directoras DraC. Miriam Díaz de Armas y Lic. Yailen Cartaya por su ayuda, paciencia y
comprensión.
A MsC. Tahimi Pinillos Saavedra por su asesoría y apoyo incondicional,
A mis compañeros de trabajo en la EPB “Carlos J. Fnlay porque son mis cómplices en todo.
A mis familiares y amigos por creer en mí cuando esto parecía un sueño inalcanzable.
Sin su ayuda realmente, hubiese sido imposible.
Resumen

RESUMEN

Guettarda calyptrata A. Rich., originaria de Cuba y conocida como Contraguao, se ha


utilizado tradicionalmente en preparaciones artesanales para contrarrestar de forma
rápida y eficaz los efectos tóxicos de Comocladia dentata Jacq. (Guao), una especie
vegetal que segrega un látex altamente cáustico para piel y mucosas. Se ha
demostrado que el daño oxidativo causado por radicales libres está relacionado con
una amplia gama de enfermedades y desórdenes entre los cuales se incluye la
causticación. Con el propósito de ofrecer aspectos relacionados con la calidad y
efectividad de la planta, se presenta su estudio farmacognóstico y la actividad
antioxidante. Se realizó la evaluación morfoanatómica, se determinaron parámetros
físico-químicos a la droga cruda y a los extractos (acuoso e hidroalcohólicos). Se estimó
el perfil químico de los extractos por cromatografía en capa delgada, espectroscopía
ultravioleta-visible e infrarroja, así como cuantificación de fenoles totales por Folin-
Ciocalteu y flavonoides totales por el método colorimétrico del tricloruro de aluminio.
Finalmente, se ensayó la actividad antioxidante por las técnicas FRAP y DPPH.
Mediante el estudio farmacognóstico se establecieron las especificaciones de calidad
de la droga y sus extractos. Los métodos de análisis utilizados para el perfil químico
sugirieron la presencia de flavonoides y fenoles en general, encontrándose diferencias
en el contenido de dichos compuestos. Los extractos manifestaron propiedades
antioxidantes por los dos métodos evaluados; la mayor actividad se obtuvo para el
extracto hidroalcohólico al 80 %. El estudio de G. calyptrata brindó evidencias de
calidad y efectividad como antioxidante, aspectos a considerar en el posible uso de la
planta por nuestra Medicina Natural y Tradicional.
Índice

ÍNDICE

Páginas
INTRODUCCIÓN……………………………………………………..…………….. 1

CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA…………….……………….………. 4


I.1. Familia Rubiácea. Generalidades………………………..…….………….... 4
I.2. Género Guettarda…………………………………………………………..….. 6
I.2.1. Hábitat y distribución………………………………………….……….. 6
I.2.2. Principales usos tradicionales…...………………..……………....…. 6
I.2.3. Composición química y actividad biológica…………………...…... 7
I.3. Guettarda calyptrata A. Rich………………..……………………………….. 7
I.3.1. Características botánicas……………………..……...……………….. 7
I.3.2. Hábitat y distribución……………………..……………………………. 8
I.3.3. Usos tradicionales………………………………..…………………….. 8
I.3.4. Estudios fitoquímicos y biológicos………………………..………… 9
I.4. Compuestos fenólicos…………………………………….……………….…. 9
I.5. Actividad antioxidante……………………………………………………..…. 11
I.5.1. Radicales libres y antioxidantes………...………………………….... 11
I.5.2. Algunas técnicas antioxidantes…………………………………..….. 12

CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS…………………………………..…. 14


II.1. Recolección, selección y procesamiento del material vegetal………. 14
II.2. Caracterización botánica de la especie G. calyptrata………………..… 14
II.2.1. Evaluación macromorfológica de las hojas…………………..….. 14
II.2.2. Evaluación micromorfológica de la droga en polvo..………..… 14
II.3. Parámetros farmacognósticos del material vegetal…………………..... 15
II.3.1. Estudio de secado…………………………………………………..… 15
II.3.2. Parámetros físico-químicos……………………………………..…... 15
II.4. Identificación de metabolitos secundarios por tamizaje
18
fitoquímico………………………………………………………………..………….
II.5. Obtención de extractos…………………………………………..………….. 19
II.5.1.Parámetros físico-químicos de calidad de los extractos............. 19
II.6. Perfil fitoquímico de los extractos de G. calyptrata.............................. 22
II.6.1. Cromatografía en capa delgada……………….………………..….. 22
II.6.2. Métodos de análisis espectroscópicos………………………..….. 22
II.6.2.1. Espectroscopía ultravioleta visible (UV)……………..….. 22
II.6.2.1. Espectroscopía infrarroja………………..……………..….. 22
II.3.3. Determinación del contenido de fenoles totales………………… 23
Índice

24
II.6.4. Determinación del contenido de flavonoides totales……..…….
II.7. Actividad antioxidante de los extractos....…..………………………..….. 25
II.7.1. Técnica FRAP………………………….…………………………..….. 25
II.7.2. Técnica de DPPH………………………….....……………………..… 25
II.8. Análisis estadístico………………………………………………………..…. 27

CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN………………………….………. 28


III.I. Caracterización botánica de la especie G. calyptrata………..………… 28
III.I.1. Evaluación macromorfológica de las hojas………………..……. 28
III.I.2. Evaluación micromorfológica de la droga en polvo………..….. 29
III.2. Parámetros farmacognósticos del material vegetal……………..…….. 31
III.2.1. Estudio de secado………………………………………………..….. 31
III.2.2. Parámetros físico-químicos……………………………………..…. 32
III.3. Identificación de metabolitos secundarios por tamizaje
33
fitoquímico…………………………………………………………………..……….

III.4. Obtención de los extractos………………………..……………………….. 36


III.4.1.Parámetros físico-químicos de calidad de los extractos……... 36
III.5. Perfil fitoquímico de los extractos de G. calyptrata………………..….. 38
III.5.1. Cromatografía en capa delgada………………………………..….. 38
III.5.2. Métodos de análisis espectroscópicos………………………..… 40
III.6.2.1. Espectroscopía ultravioleta visible (UV)………..…... 40
III.6.2.2. Espectroscopía infrarroja…………………………...…... 41
III.5.3. Determinación del contenido de fenoles totales…………...….. 42
III.5.4. Determinación del contenido de flavonoides totales……..…... 44
III.6. Actividad antioxidante de los extractos………………..…………..……. 45
III.6.1. Técnica FRAP………………………….………………………….…. 45
III.6.2. Técnica de DPPH………………………………………………..…… 47

CONCLUSIONES…………………………………..……………………………….. 50
RECOMENDACIONES…………………………………………..…………………. 51
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
INTRODUCCIÓN
Introducción

INTRODUCCIÓN

La Fitoterapia es una parte de la Terapéutica, cuyo desarrollo racional requiere


disponer de medicamentos a base de plantas, donde la calidad, seguridad y eficacia
estén garantizadas, teniendo en cuenta las especiales características de las drogas
vegetales y extractos. Históricamente, la producción de medicamentos y el tratamiento
farmacológico de las enfermedades se inició con la utilización de las plantas, que
gracias a su maravilloso y complejo metabolismo, constituyen un verdadero arsenal
químico, del cual queda mucho por conocer (Haya y Cañigueral, 2008; Avello y
Cisternas, 2010).

El estudio de las plantas medicinales brinda la oportunidad de encontrar nuevas


sustancias activas a partir de una materia prima más económica y natural,
constituyendo la base para el desarrollo de programas encaminados a obtener el
máximo conocimiento sobre el uso de la medicina tradicional, el enriquecimiento del
acervo cultural y la mejor utilización de este patrimonio, permitiendo la disponibilidad de
ensayos que sirvan de guía en la investigación fitoquímica moderna de productos
naturales (Beyra y col., 2004).

La Organización Mundial de la Salud (OMS), para asegurar el correcto uso de los


recursos naturales vegetales, ha establecido pautas a seguir en su evaluación, que
permiten la homogenización de los estudios en el mundo, de manera que la calidad de
los productos elaborados sean confiables. Promueve la utilización segura y eficaz de la
Medicina Tradicional a través de la reglamentación y la investigación, mediante la
incorporación de productos, profesionales y prácticas en los sistemas de salud, según
proceda (Organización Mundial de la Salud, 2013).

El regreso del interés científico sobre las plantas medicinales, investigando su riqueza y
variabilidad química, ha impulsado una revalorización de su empleo en muchas partes
del mundo, representando una forma complementaria de curar, en que el empirismo
queda atrás en función de la evidencia científica, armonizando la medicina tradicional
con las terapias oficiales de cada país (Avello y Cisternas, 2010).

~1~
Introducción

Cuba, con sus 7 500 especies y un 53 % de endemismo, es considerada la isla con


mayor variedad de plantas por kilómetro cuadrado (Granado y col., 2013). Esta
diversidad explica el interés del estudio sistemático, con el fin de encontrar nuevas
terapias que podrían integrar el patrimonio científico de las especies recomendadas de
plantas, en los servicios de salud, mientras se conduce el desarrollo y/o búsqueda de
un nuevo potencial en nuestra grande y rica vegetación.

Dentro de las especies referidas con gran importancia económica, por su utilidad en el
campo alimenticio, ornamental y farmacéutico, se encuentran las correspondientes a la
familia Rubiácea. Está constituida, aproximadamente, por 650 géneros y 13 000
especies (Delprete y Jardim, 2012; Dias y col., 2013). Entre los representantes se
encuentra el género Guettarda, del que existen en nuestro país ocho especies
arbóreas, incluida Guettarda calyptrata A. Rich. (Bisse, 1988).

G. calyptrata, es endémica de Cuba (Bissea, 1988). Fue descrita por Achille Richard y
publicado en Historia Física Política y Natural de la Isla de Cuba, Botánica. Esta especie
ha sido empleada tradicionalmente por los campesinos en preparaciones artesanales,
para contrarrestar de forma rápida y eficaz los efectos tóxicos de Comocladia dentata
Jacq. (Guao), muy común en terrenos áridos y pedregosos, sabanas y costas de toda
la isla y que se caracteriza por segregar un látex altamente cáustico para piel y
mucosas (Roig, 1974; 2014).

Los antioxidantes naturales presentes en las plantas han cobrado gran interés en las
ultimas décadas, puesto que el estrés oxidativo (un desbalance entre las sustancias
oxidantes y prooxidantes) está implicado en un gran número de afecciones de salud. Se
ha demostrado que el daño oxidativo causado por radicales libres está relacionado con
una amplia gama de enfermedades y desórdenes, entre los cuales se incluye la
causticación (Calderón, 2011).

Considerando que en la literatura científica no existen reportes de investigaciones


farmacognósticas, fitoquímicas y biológicas para la subespecie G. calyptrata y para
contar con una alternativa terapéutica, que reúna los requisitos de calidad, seguridad y

~2~
Introducción

eficacia, es indispensable demostrar sobre bases científicas, la utilidad medicinal de la


especie objeto de estudio.

Teniendo en cuenta los elementos expuestos anteriormente, se propusieron los


objetivos siguientes:

Objetivo general:

 Evaluar desde el punto de vista farmacognóstico, fitoquímico y antioxidante a la


especie Guettarda calyptrata A. Rich.

Objetivos específicos:

 Determinar los principales parámetros farmacognósticos del material vegetal y de


sus extractos.
 Analizar el perfil fitoquímico de los extractos obtenidos.
 Evaluar la actividad antioxidante de los extractos por las técnicas FRAP y DPPH.

~3~
CAPÍTULO I
REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA
Revisión Bibliográfica

CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

I.1. FAMILIA RUBIACEA. GENERALIDADES

Rubiaceae es la cuarta familia más grande de plantas (después de Asteraceae,


Orchidaceae y Fabaceae). La mayoria de ellas viven en la región tropical y juegan un
papel importante en la vegetación de las zonas calientes, donde está representada,
sobre todo, por plantas leñosas (Mabberley, 1997; Borhidi y Diego-Pérez, 2002;
Delprete, 2004, Borhidi, 2012).

Comprende aproximadamente 650 géneros y 13 000 especies. Estudios filogenéticos


proponen una división de Rubiaceae en tres subfamilias: Rubioideae, Cinchonoideae
e Ixoroideae (Delprete y Jardim, 2012; Dias y col., 2013).

En cuanto a sus características botánicas se puede plantear que son árboles, arbustos,
sufrútices, hierbas, enredaderas o lianas, de hábitos terrestres o raras veces epífitas, a
veces con rafidios. Los tallos son tetragonales y con muchos ganchos, que permiten a
las especies trepadoras sujetarse a las especies circundantes. Las hojas se presentan
simples, opuestas o verticiladas, de borde generalmente entero con estípulas situadas
entre los peciolos de las mismas (Borhidi y Diego-Pérez, 2002).

Diversas especies tienen importancia económica, siendo utilizadas como alimentos,


ornamentales y en la industria farmacéutica (Coelho y col., 2006; Dias y col., 2013).

Muchas Rubiáceas producen alcaloides, que se encuentran normalmente acumulados


en la corteza, raíces, hojas, flores, frutas, semillas y polen. De los 70 géneros
neotropicales están: Antirhea, Cinchona, Coutarea, Capirona, Bothriospora,
Borreria, Exoterma, Ferdinandusa, Genipa, Hedyotis, Hillia, Ladenbergia,
Pogonopus, Palicourea, Psychotria, Remijia, Spermacoce, Tocoyena, Uncaria y
otros (Delprete, 2004).

Géneros como Cinchona y Remigia son fuentes de alcaloides derivados de quinidina,


el único remedio para la malaria hasta que se puso disponible la droga sintética. La

~4~
Revisión Bibliográfica

malaria es responsable de gran número de muertes en la historia humana,


especialmente, en los países tropicales. Otro representante de Rubiaceae es el café, el
mayor producto económico de esta familia que pertenece al género Coffea, que
comprende aproximadamente 100 especies; nativa de África, Madagascar e Islas de la
India. Las especies cultivadas Coffea arabica y C. robusta son originarias del este de
África y ricas en el alcaloide cafeína (Delprete, 2004). En la figura 1 se muestran dos de
los alcaloides más representativos de dichos géneros.

a) b)

Figura 1. Alcaloides producidos por especies de la familia Rubiácea


a) Quinidina (género Cinchona y Remigia), b) Cafeína (género Coffea)

El género Pogonopus y varios otros son las fuentes de compuestos activos de pruebas
y actividad anticancerígena, eso involucra la inhibición de la formación de microtúbulos
durante la división celular (Delprete, 2004). Por su parte, el género Uncaria (uña de
gato), tiene numerosos reportes de usos medicinales por médicos naturistas en el Perú.
Psychotria viridis y especies relacionadas son usadas en importantes ingredientes en
la producción de alucinógenos (Andersson, 1992).

Varias especies de los géneros Psychotria y Palicourea son plantas venenosas


responsables de la parálisis y muerte del ganado en América Tropical. Muchos géneros
arbóreos de Rubiaceae son usados para la construcción de casas y botes (Capirona), y
otros producen frutas comestibles grandes (Genipa, G. americana) (Robbrecht, 1988).

En Cuba, existen varios géneros de la familia Rubiácea, entre los que se encuentran:
Cephalanthus, Calycophyllum, Exostema, Chimarrhis, Rondeletia, Casasia,
Genipa, Morinda, Antirrhea, Chione, Faramea, Guettarda, etc. (Bisse, 1988).

~5~
Revisión Bibliográfica

I.2. GÉNERO Guettarda

El género fue nombrado por Linnaeus en 1753 en su libro Species Plantarum, en honor
al naturalista francés del siglo XVIII Jean-Etienne Guettard (Quattrocchi, 2000).

Entre las especies que ocupan el género se encuentran: G. speciosa, G. uruguensis,


G. crispiflora, G. argentea, G. odorata, G. scabra, G. retusa, G. comata, G.
frangulifolia Urban, G. insularis Brandegee, G. krugii Urban, G. longiflora
Grisebach, G. noumeana L.A.F. Baillon, G. ochreata Schechtendal y otros
(Wikipedia, 2016).

Existen en Cuba ocho especies arbóreas: G. scabra, G. baracohensis Bisse, G.


urbanii Ekm. ex Urb, G. combsii Urb, G. calyptrata A. Rich, G. brevinodis Urb., G.
elliptica Sw y G. valenzuelana A. Rich (Bisse, 1988).

I.2.1. HABITAT Y DISTRIBUCIÓN

Algunas especies habitan en los bosques tropicales, la mayoría en América tropical y


región del Pacífico; también se extienden en las costas del Océano Indico, en el este de
África, la India y otras en China (Achille y col., 2006; Chen y Charlotte, 2011).

I.2.2. PRINCIPALES USOS TRADICIONALES

Muchas especies del género han sido empleadas tradicionalmente como


antiinflamatorias (Agra y col., 2007; Albuquerque y col., 2007; Agra y col., 2008). Las
hojas grandes de G. speciosa fueron utilizadas de diversas maneras por los pueblos
indígenas del norte de Australia para aliviar dolores de cabeza y dolores en miembros.
La decocción de las hojas es usada para tratar la tos, resfriados en la garganta y en
epilepsia. Los tallos eran empleados para hacer tubos de Macassan y la madera para
hacer viviendas y canoas (McCormack, 2007; Saravana y Gandhimathi, 2010; Revathi y
Rajeswari, 2015). Por su parte, G. uruguensis, ha sido usada como planta ornamental.

~6~
Revisión Bibliográfica

I.2.3. COMPOSICIÓN QUÍMICA Y ACTIVIDAD BIOLÓGICA

Investigaciones fitoquímicas revelan varios constituyentes químicos, tales como


alcaloides (Capasso y col., 1998), iridoides (Naressi y col., 2015), triterpenoides
(Aquino y col., 1988), ésteres fenólicos (Oliveira y col., 2008; Testa y col., 2012;
Naressi y col., 2015), ácidos fenólicos, quercetin-3-O-B-D-galactopiranósido, quercetin-
3-O-B-D-glucopiranósido, grandiflorósido (Naressi y col., 2015), así como, péptidos de
extractos de diclorometano e hidrometanólico de G. crispiflora, (González y col., 2012).

También ha sido reportada para el género la actividad antiinflamatoria y antiviral


(Saravana y col., 2009; Barros y col., 2012; Pina y col., 2012; Duarte y col., 2014).

Estudios efectuados por Duarte y col. (2016), demostraron la actividad antioxidante y


antimicrobiana frente Enterococcus faecalis, de extractos y fracciones de flores y frutos
de G. uruguensis.

Otras referencias plantean la actividad antioxidante y anticonvulsivante de un extracto


alcohólico al 95 % de la planta completa de G. speciosa (Saravana y Gandhimathi,
2010; Mittal y col., 2015), así como la presencia en las hojas de terpenoides,
coumarinas, taninos, saponinas, esteroles (estigmasterol, campesterol), entre otros
(Revathi y Rajeswari, 2015).

I.3. Guettarda calyptrata A. Rich

I.3.1. CARACTERÍSTICAS BOTÁNICAS

La especie es conocida por los nombres comunes de contraguao, guayabillo, cuero de


hojas verdes. Es un arbusto o árbol, que alcanza un tamaño de hasta 6 m de altura;
las ramitas densamente ferrugíneo-pubérulas; con estípulas oblongo-ovales, de 10-16
mm, obtusas o aguditas, mucronadas, tomentulosas y pelosas. Las hojas (figura 2)
son oblongas a ovales o redondo-aovadas, de 3,5-13 cm de largo y de 2-7 cm de
ancho, redondeadas o muy obtusas en el ápice, acorazonadas en la base, coriáceas,
pelositas a glabrescentes en el haz, el envés albo-tomentoso, peloso en los nervios;
cimas subcapitadas, 3-floras, pedúnculos de 0,3-2.5 cm, flores sésiles, cáliz tomentoso

~7~
Revisión Bibliográfica

y peloso, de 7 mm en el botón; corola blanca, tubo de 2.5-5 cm, retroso-peloso, lóbulos


aovado-oblongos, de 8-10 mm; fruto globoso, de 8-18 mm, tomentuloso (Roig, 1974;
Bisse, 1988).

Figura 2. Detalles morfológicos de las hojas de G. calyptrata

I.3.2. HÁBITAT Y DISTRIBUCIÓN

Es una especie endémica de Cuba, común en todas las provincias, sabanas y terrenos
pedregosos, áridos y cuabales (Roig, 1974; Bisse, 1988).

I.3.3. USOS TRADICIONALES

Tradicionalmente, se le atribuye a las hojas y cortezas (decocción de 2 a 3 veces al día,


sobre la piel), la propiedad medicinal de aliviar o curar las quemaduras producidas por
el guao (Comocladia dentata Jacq.), una planta muy común en terrenos áridos y
pedregosos, sabanas y costas de toda la isla y que se caracteriza por segregar un látex
altamente cáustico para la piel y mucosas (Roig, 1974; 2014). Por la propiedad
anteriormente señalada, G. calyptrata es conocida, comúnmente, como contraguao.

Se reportan casos de personas afectadas por el solo hecho de pasar cerca del guao, al
alcance de los vapores que emite su savia lechosa al reaccionar con el calor. De ahí
surgió la superstición de que hasta la sombra del guao afecta a las personas (Roig,
1974). La causticación que produce esta planta supone una desorganización de los
componentes tisulares. Es una quemadura química muy diferente a la térmica. Se
produce en el lugar de contacto del látex tóxico con el tejido orgánico, donde se
desnaturalizan los lípidos y proteínas celulares. En el tejido afectado se producen

~8~
Revisión Bibliográfica

lesiones que se caracterizan por eritema, edema y urticaria que varían en gravedad de
un individuo a otro (Repetto J y Repetto K, 2009).

I.3.4. ESTUDIOS FITOQUÍMICOS Y BIOLÓGICOS

Desde el punto de vista fitoquímico y farmacológico no se reportan estudios en la


literatura, por lo que el trabajo brindará los primeros hallazgos en este sentido.

I.4. COMPUESTOS FENÓLICOS

Los compuestos fenólicos o polifenoles constituyen un amplio grupo de sustancias


químicas, considerados metabolitos secundarios de las plantas, con diferentes
estructuras químicas y actividad. Son sustancias químicas que poseen un anillo
aromático, con uno o más grupos hidróxidos, incluyendo derivados funcionales (ésteres,
metil ésteres, glicósidos, etc.). La naturaleza de los polifenoles varía desde moléculas
simples como los ácidos fenólicos hasta compuestos altamente polimerizados, como los
taninos. Se presentan en las plantas en forma conjugada con uno o más residuos de
azúcar unidos a los grupos hidroxilos, aunque en algunos casos se pueden producir
uniones directas entre una molécula de azúcar y un carbono aromático. Por ello, la
forma más común de encontrarlos en la naturaleza es en forma de glicósidos, siendo
solubles en agua y disolventes orgánicos (Martínez y col., 2000; Ali y col., 2013).

Dependiendo de su estructura química básica, los compuestos fenólicos se pueden


clasificar en: fenoles, ácidos fenólicos y ácidos fenil acéticos, ácidos cinámicos,
cumarinas, isocumarinas y cromonoles, lignanos y neolignanos, flavonoides y taninos
(Harborne, 1989; Martínez y col., 2000; Ali y col., 2013).

Estos compuestos tradicionalmente han sido considerados como antinutrientes, debido


al efecto adverso de uno de sus componentes mayoritarios, los taninos, sobre la
digestibilidad de las proteínas. Sin embargo, se han demostrado sus propiedades
antioxidantes y sus posibles implicaciones beneficiosas en la salud humana, tales como
en el tratamiento y prevención del cáncer, enfermedad cardiovascular y otras patologías
de carácter inflamatorio; también reducen el riesgo de diabetes, otros son antifúngicos,
antivirales, antimutagénicos, etc. (Jin y col., 2006; Hoye y col., 2008; Wijngaard y col.,

~9~
Revisión Bibliográfica

2009; Jin y Mumper, 2010; Zhang y col., 2011; Castellano y col., 2012; Mohanlal y col.,
2012; Sawadogo y col., 2012).

La gran diversidad de compuestos fenólicos dispersos en los tejidos vegetales, así


como sus diferentes estructuras químicas, ha traído consigo la necesidad de desarrollar
un gran número de técnicas analíticas para su identificación y cuantificación. Las
primeras técnicas desarrolladas fueron espectrofotométricas, las cuales tienen interés
desde el punto de vista del control de calidad, entre los métodos usados, comúnmente,
destacan el ensayo de la vainillina, los ensayos de Folin-Denis y Folin-Ciocalteu
(Singleton y col., 1985; Martínez y col., 2000).

Numerosos estudios han desarrollado técnicas rápidas de cuantificación de compuestos


fenólicos mediante ensayos ultravioletas. Cada grupo de compuestos fenólicos se
caracteriza por tener una o varias absorbancias máximas a distintas longitudes de onda
dentro del espectro ultravioleta. Así, los fenoles simples tienen una absorbancia máxima
entre 220 y 280 nm, mientras que los compuestos fenólicos relacionados presentan una
amplia variación en la longitud de onda a la cual presentan una absorbancia máxima
(Martínez y col., 2000).

Las técnicas cromatográficas han permitido la separación, aislamiento, purificación e


identificación de compuestos fenólicos. La cromatografía en papel y en capa fina, son
utilizadas para la purificación y aislamiento de estos compuestos (Jackman y col., 1987;
Karchesy y col., 1989). La cromatografía líquida de alta resolución (CLAR) es la más
empleada para la separación y cuantificación de fenoles y su acoplamiento a un
detector de masas es muy útil para su cuantificación, especialmente, de flavonoides
(Justesen y col., 1998; Martínez y col., 2000).

I.5. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE

I.5.1. RADICALES LIBRES Y ANTIOXIDANTES

Radical libre (RL) es cualquier especie química capaz de existir de forma independiente
y que presenta uno o más electrones desapareados en su estructura. Son conocidos

~ 10 ~
Revisión Bibliográfica

como especies reactivas oxigénicas o del oxígeno (ROS) y especies reactivas del
nitrógeno (RNS). Son responsables del daño oxidativo de macromoléculas biológicas
como el DNA, lípidos, carbohidratos y proteínas. Participan en los mecanismos
fisiopatológicos de muchas enfermedades, como algunos tipos de cáncer, diabetes,
patologías cardiovasculares, procesos reumáticos, patologías gastroentéricas,
afecciones broncopulmonares o procesos neurodegenerativos y otros (González, 2000;
Agudo, 2010).

Un antioxidante es cualquier sustancia que en presencia de un sustrato oxidable retrasa


o inhibe la oxidación del mismo. Se caracterizan por ser muy heterogéneos, pueden ser
hidrosolubles y liposolubles, localizarse intra y extracelularmente, y proceder de
diferentes fuentes; algunos son nutrientes o derivan de éstos y otros son productos del
metabolismo. Pueden actuar previniendo la formación de ROS, interceptando el ataque
de ROS, secuestrando los metabolitos reactivos y convirtiéndolos en moléculas menos
reactivas, facilitando la reparación del daño causado por ROS, manteniendo un
ambiente favorable para la actuación de otros antioxidantes y amplificando la
resistencia de las dianas biológicas sensibles al ataque de ROS (Agudo, 2010).

I.5.2. ALGUNAS TÉCNICAS ANTIOXIDANTES

Se han desarrollado distintos métodos de evaluación de la actividad antioxidante,


generalmente, basados en la evaluación de la capacidad de captura de radicales libres
o en la evaluación de su capacidad reductora, constituyendo el grupo de “métodos
químicos”. Estos métodos ofrecen información muy diversa a la que aportan aquellos
basados en medidas biológicas o metabólicas que determinan o evalúan capacidades
antioxidantes específicas (Kuskoski y col., 2005; Thaipong y col., 2006).

En la actualidad, debido a la complejidad de los procesos de oxidación, no existe un


método que refleje de forma completa el perfil antioxidante de una muestra, por tanto,
es bueno trabajar con varios métodos para facilitar la comparación e interpretación de
los resultados. Las características “ideales” que debe reunir un método de
determinación de capacidad antioxidante son: sencillez, mecanismo químico definido y

~ 11 ~
Revisión Bibliográfica

punto final fijo, reproducibilidad, adaptabilidad a sustancias antioxidantes hidrofílicas y


lipofílicas y elevado rendimiento de análisis (Medina, 2010).
Las medidas de la actividad antirradicalaria se pueden realizar mediante dos estrategias
distintas, en función de la información que se desea obtener (Sánchez-Moreno, 2002):

 Determinación directa: el radical se emplea como un factor de cuantificación


(produce una señal analítica). La adición del antioxidante, antes o después de la
generación del radical, provoca una disminución de la señal. En el ensayo de
post-adición se forma el radical en ausencia de la muestra y así, cuando se
añade la sustancia antioxidante se produce un descenso en la señal debido a la
disminución de la concentración del radical. En ensayos de inhibición, la muestra
se añade a los sustratos de oxidación antes que sea generado el radical. La
reacción comienza con la adición del oxidante. Entre los ensayos se encuentran:

• ABTS●+ (ácido 2,2’-azinobis (3- etilbenzotiazolín)-6-sulfónico): dicho radical


se genera a partir de su precursor el ácido 2,2’-azinobis (3- etilbenzotiazolín)-
6-sulfónico (ABTS). El radical catiónico obtenido es un compuesto de color
verde-azulado, estable y con un espectro de absorción en el UV-visible.

• La metodología del radical 2,2-difenil-1-picrilhidracil (DPPH•): se basa en la


reducción del DPPH• por un antioxidante, la cual se monitorea por la
disminución en la absorbancia a una longitud de onda característica. Como
consecuencia ocurre un cambio de coloración de morado a amarillo que es
monitoreado espectrofotométricamente a 517 nm (Brand-Williams y col.,
1995; Molyneux, 2004)

 Determinación indirecta: la presencia de radicales libres produce la pérdida o


aparición de un reactivo, y por tanto, en presencia de un antioxidante se provoca
el aumento o disminución de la señal. Entre los métodos utilizados se
encuentran:

~ 12 ~
Revisión Bibliográfica

• ORAC (Oxygen Radical Absorbance Capacity): se basa en la habilidad que


tienen los compuestos antioxidantes para bloquear radicales libres por
donación de un átomo de hidrógeno.

• FRAP (Ferric-Reducing Antioxidant Power): se basa en el poder que tiene


una sustancia antioxidante para reducir el Fe3+ a Fe2+ que es menos
antioxidante. El complejo férrico-2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) incoloro es
reducido al complejo ferroso coloreado (azul).

~ 13 ~
CAPÍTULO II
MATERIALES Y MÉTODOS
Materiales y Métodos

CAPÍTULO II. MATERIALES Y MÉTODOS

II.1. RECOLECCIÓN, SELECCIÓN Y PROCESAMIENTO DEL MATERIAL VEGETAL

La especie vegetal utilizada fue Guettarda calyptrata A. Rich., recolectada en el mes


de noviembre de 2016, en áreas costeras de la localidad de Cojimar, municipio Habana
del Este. Las plantas se encontraron en estado fenológico vegetativo y fueron
herborizadas, identificadas y depositadas en el herbario Johannes Bisse del Jardín
Botánico Nacional (HAJB) con el código de identificación HFC-089021.

De las colectas realizadas solo se emplearon las hojas, previamente lavadas con agua
potable, las cuales fueron cortadas en trozos pequeños con ayuda de tijeras para
facilitar el proceso de secado.

II.2. CARACTERIZACIÓN BOTÁNICA DE LA ESPECIE G. calyptrata

II.2.1. EVALUACIÓN MACROMORFOLÓGICA DE LAS HOJAS

Se realizó una valoración de las características macromorfológicas de la especie,


considerándose la disposición de las hojas sobre el tallo. Se describieron 100 hojas, a
las cuales se les determinó la forma del limbo, borde, ápice, base, peciolo, venación y
color. Las observaciones se realizaron a simple vista y con ayuda de un microscopio
estéreo NTB-2B, de fabricación china, empleando cámara modelo HDCE-50B.

También se efectuaron mediciones de largo y ancho de las hojas con ayuda de un pie
de rey; se calcularon los valores promedios y la desviación estándar. (Miranda y
Cuéllar, 2000).

II.2.2. EVALUACIÓN MICROMORFOLÓGICA DE LA DROGA EN POLVO

Se determinaron las características microscópicas de la droga seca. Las muestras


fueron aclaradas con hipoclorito de sodio y después de lavadas se colorearon con
safranina al 1 % para finalmente ser fijadas en gelatina glicerinada. Sobre la droga en
polvo se realizaron determinaciones de estructuras celulares tales como: elementos

~ 14 ~
Materiales y Métodos

conductores, células epidérmicas, estomas, pelos y fibras (Gattuso M y Gattuso S.


1999; Miranda y Cuéllar, 2000).

Para visualizar los diferentes caracteres anatómicos internos del vegetal se utilizó un
microscopio NOVEL (lente 10X) con cámara acoplada modelo HDCE-50B.

II.3. PARÁMETROS FARMACOGNÓSTICOS DEL MATERIAL VEGETAL

Los diferentes ensayos se realizaron según la metodología descrita por la NRSP 309
(1992) y Miranda y Cuéllar (2000).

II.3.1. ESTUDIO DE SECADO

El secado se realizó a 40 ºC, en estufa con recirculación de aire, modelo P/G 2007 ba
serie 081070207 de procedencia China. En el estudio se utilizaron 100 g de muestra por
cada réplica. Se tuvo en cuenta el número de días que demoró la droga en alcanzar
peso constante (tiempo de secado) y el porcentaje de la pérdida en peso de agua (con
una frecuencia de 12 h) (NRSP 309, 1992; Miranda y Cuéllar, 2000).

II.3.2. PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS

a) Humedad residual

Se empleó el método azeotrópico, por triplicado a partir de 10 g de muestra, se utilizó


tolueno como disolvente, un equipo Dean Star, una plancha de calentamiento eléctrica
marca MLW VEB y para las pesadas una balanza analítica marca Sartorius. Los
resultados se obtuvieron a partir de la expresión:

Hr = Vf - Vi
x 100
M
Donde:
Hr: humedad residual (%)
Vf: volumen final de agua (mL)
Vi: volumen inicial de agua (mL)
M: masa de la muestra (g)
100: factor matemático para el cálculo.

~ 15 ~
Materiales y Métodos

b) Sustancias solubles o extraíbles

Este ensayo se llevó a cabo por triplicado, a partir de 5 g de droga. Se utilizaron como
disolventes agua y mezclas hidroalcohólicas al 30, 50 y 80 %. Las muestras se agitaron
en una zaranda por un tiempo de 6 horas. Cada extracto obtenido se filtró por un
embudo de vidrio utilizando papel Whatman de filtración rápida.

Los cálculos se realizaron según:

R x 500 x 100
Ss =
M (100-H)

Donde:
Ss: sustancias solubles (%)
R: residuo de la muestra (g)
M: masa de la muestra (g)
H: humedad residual (%)
500 y 100: factores matemáticos para el cálculo.

c) Cenizas totales, cenizas solubles en agua y cenizas insolubles en ácido


clorhídrico al 10 %

Para las determinaciones se empleó una mufla modelo SX2-12TP, procedencia China.
Las pesadas se realizaron en balanza analítica marca Sartorius. Cada determinación se
efectuó por triplicado a partir de 2 g de material vegetal.

Cenizas totales

Los cálculos se efectuaron por la expresión siguiente:

M2 - M
CT = x 100
M1 - M

Donde:
C T : cenizas totales en base hidratada (%)
M: masa del crisol vacío (g)
M 1 : masa del crisol con la muestra (g)

~ 16 ~
Materiales y Métodos

M 2 : masa del crisol con la ceniza (g)


100: factor matemático para el cálculo.

Cenizas solubles en agua

Las determinaciones se llevaron a cabo a partir de las cenizas totales, luego de disolver
las mismas con agua destilada. Los cálculos se realizaron por la expresión siguiente:

M2 - Ma
Ca = x 100
M1 - M

Donde:
Ca: cenizas solubles en agua en base hidratada (%)
M 2 : masa del crisol con las cenizas totales (g)
Ma: masa del crisol con las cenizas insolubles en agua (g)
M 1 : masa del crisol con la muestra de ensayo (g)
M: masa del crisol vacío (g)
100: factor matemático para el cálculo.

Cenizas insolubles en ácido clorhídrico al 10 %

Se determinaron a partir de las cenizas totales, después de tratar las mismas con ácido
clorhídrico al 10 %. Los resultados se obtuvieron por la expresión siguiente:

M2 - M
B= x 100
M1 - M

Donde:
B: cenizas insolubles en ácido clorhídrico en base hidratada (%)
M 2 : masa del crisol con la ceniza (g)
M: masa del crisol vacío (g)
M 1 : masa del crisol con la porción de ensayo (g)
100: factor matemático para el cálculo.

~ 17 ~
Materiales y Métodos

II.4. IDENTIFICACIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS POR TAMIZAJE


FITOQUÍMICO

El tamizaje fitoquímico se le realizó a la droga cruda, según procedimiento descrito por


Miranda y Cuéllar (2000). Se utilizó un sistema de extracción con una batería de
disolventes, de menor a mayor polaridad, sobre el mismo material vegetal, para lograr
que cada metabolito fuera extraído adecuadamente según su selectividad por el
disolvente empleado. La droga cruda se extrajo sucesivamente con éter dietílico, etanol
y agua, para obtener los extractos correspondientes, los que fueron sometidos a los
diferentes ensayos. En las figuras 3 y 4 se muestran el esquema general de extracción
y los diferentes ensayos a realizar en cada extracto obtenido, respectivamente.

10g DE MATERIAL VEGETAL

EXTRAER CON 30 mL DE ÉTER DIETÍLICO


DURANTE 48h A TEMPERATURA AMBIENTE

FILTRAR

EXTRACTO ETÉREO RESIDUO SÓLIDO

EXTRAER CON ETANOL


POR MACERACIÓN DURANTE 48h

FILTRAR

RESIDUO SÓLIDO EXTRACTO ALCOHÓLICO

EXTRAER CON AGUA


POR MACERACIÓN DURANTE 24h

FILTRAR

EXTRACTO ACUOSO RESIDUO SÓLIDO


Desechar

Figura 3. Esquema de extracción sucesiva del material vegetal para la aplicación


de técnicas de tamizaje fitoquímico

~ 18 ~
Materiales y Métodos

SUDAN (COMPUESTOS GRASOS)


DRAGENDORFF, MAYER Y WAGNER (ALCALOIDES)
EXTRACTO ETÉREO BALJET (LACTONAS Y COUMARINAS)
LIEBERMANN-BUCHARD (TRITERPENOS Y/O ESTEROIDES)

RESINAS
FEHLING (SUSTANCIAS REDUCTORAS)
TRICLORURO FÉRRICO (COMPUESTOS FENÓLICOS)
BALJET (LACTONAS Y COUMARINAS)
ESPUMA (SAPONINAS)
EXTRACTO ALCOHÓLICO
LIEBERMANN-BUCHARD (TRITERPENOS Y/O ESTEROIDES)
DRAGENDORFF, MAYER Y WAGNER (ALCALOIDES)
NINHIDRINA (AMINOÁCIDOS)
BONTRAGUER (QUINONAS)
SHINODA (FLAVONOIDES)
KEDDE (CARDIOTÓNICOS)
ANTOCIANIDINAS

FEHLING (SUSTANCIAS REDUCTORAS)


TRICLORURO FÉRRICO (FENOLES)
ESPUMA (SAPONINAS)
EXTRACTO ACUOSO DRAGENDORFF, MAYER Y WAGNER (ALCALOIDES)
SHINODA (FLAVONOIDES)
MUCÍLAGOS

Figura 4. Esquema de las reacciones de tamizaje fitoquímico a realizar a los


extractos obtenidos.

II.5. OBTENCIÓN DE EXTRACTOS

A partir del material vegetal se elaboraron extractos acuosos por decocción e


hidroalcohólicos al 30, 50 y 80 %, por el método de maceración (durante un periodo de
siete días, a una temperatura de 30 °C ± 2 °C). Se utilizó en todos los casos una
proporción de 20 g de droga por cada 100 mL de disolvente. Se siguió el procedimiento
descrito en la norma cubana NRSP 312 (1992) y por Miranda y Cuéllar (2000).

II.5.1. PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS DE CALIDAD DE LOS EXTRACTOS

Las determinaciones de calidad se llevaron a cabo mediante el procedimiento descrito


en la NRSP 312 (1992) y por Miranda y Cuéllar (2000), se efectuaron cinco réplicas
para cada experimento, siendo evaluados los parámetros siguientes:

a) Requisitos organolépticos

- Determinación del olor: se tomó una tira de papel secante de


aproximadamente 1 cm de ancho por 10 cm de longitud y se introdujo un

~ 19 ~
Materiales y Métodos

extremo en la muestra de ensayo. Se olió y se determinó si correspondía con las


características del producto.

- Determinación del color: se tomó un tubo para ensayos, bien limpio y seco, se
llenó hasta las tres cuartas partes con la muestra de ensayo y se observó el
color, la transparencia, la presencia de partículas y la separación en capas. Se
informó el resultado.

b) pH

Para la determinación del pH se utilizó un pH-metro modelo Basic 20 Crizon,


previamente ajustado con soluciones buffer a pH = 4,01 y 7.

c) Sólidos totales

Se realizó a partir de 5 mL de extracto, los cuales se transfirieron a una cápsula de


porcelana previamente tarada. Se sometió la muestra a 105 oC hasta evaporación del
disolvente y peso constante. La cantidad de sólidos totales (S t ), expresados en %, se
calculó por la expresión siguiente:

Pr - P
St = x 100
V

Donde:
P r = masa de la cápsula más el residuo (g)
P = masa de la cápsula vacía (g)
V = volumen de la porción de ensayo (mL)
100 = factor matemático

d) Densidad relativa

Se realizó por picnometría y se utilizó una balanza analítica monoplato marca Sartorius.
De la muestra de ensayo se tomó la cantidad necesaria de acuerdo con la capacidad
del picnómetro y se enfrió a 25 °C.

~ 20 ~
Materiales y Métodos

La densidad relativa a 25 °C se calculó mediante la fórmula siguiente:

M1 - M
D25 =
M2 - M

Donde:
M = masa del picnómetro vacío (g)
M1= masa del picnómetro con la muestra de ensayo (g)
M2= masa del picnómetro con agua (g)

D= densidad relativa (g/mL)

e) Índice de refracción

La determinación se realizó por triplicado a una temperatura de 25 oC. Se utilizó un


refractómetro ABBE digital.

f) Análisis capilar

Este ensayo se desarrolló según lo descrito en la NRSP 312 (1992) y por Miranda y
Cuéllar (2000), a partir de 20 mL de extracto, empleando papel Whatman # 1. El tiempo
de corrida fue de 2 horas y la temperatura de trabajo de 25 ºC (± 1).
Para el análisis e interpretación de la imagen capilar se tuvieron en cuenta los aspectos
siguientes:

 Color
 Altura
 Descripción de las diferentes partes (franja, sub-franja, banda y sub-banda)
 Cambios de coloración con vapores de amoníaco

~ 21 ~
Materiales y Métodos

II.6. PERFIL FITOQUÍMICO DE LOS EXTRACTOS DE G. calyptrata

II.6.1. CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA

Se utilizaron placas de gel de sílice F 254nm de la Merck, sobre soporte de aluminio. El


desarrollo cromatográfico fue de forma ascendente, utilizando como fase móvil:

 n-butanol: ácido acético: agua (65:25:10)

Para el revelado de las placas, fueron empleadas las condiciones siguientes:

 Luz UV a 254 nm de longitud de onda


 Vapores de amoníaco
 Solución de tricloruro de alumino (AlCl 3 ) al 10 % en metanol y AlCl 3 /luz UV a 254
nm.
 Solución acuosa de tricloruro férrico al 5 % (FeCl 3 )
 Ácido sulfúrico al 5 % en etanol. Se calentó a una temperatura de 105 ºC,
aproximadamente, hasta la aparición de manchas o modificación de la apariencia
de las ya existentes.
 Vainillina al 1 % en etanol - H 2 SO 4 al 5 % en etanol y calor: se calentó a una
o
temperatura de 105 C, aproximadamente, hasta la aparición de manchas o
modificación de la apariencia de las ya existentes.

Fueron ensayados dos patrones de flavonoides: rutina y quercetina

II.6.2. MÉTODOS DE ANÁLISIS ESPECTROSCÓPICOS

II.6.2.1. ESPECTROSCOPÍA ULTRAVIOLETA VISIBLE (UV)

Los extractos acuosos e hidroalcohólicos fueron analizados en un espectrofotómetro


UV-Visible, marca Analytikjena, modelo SPECORD-200 plus de procedencia alemana.
Se realizó un barrido de 200 a 700 nm.

II.6.2.2. ESPECTROSCOPÍA INFRARROJA (IR)

Los análisis se efectuaron a los cuatro extractos, los cuales se diluyeron y añadieron a
una tableta de KBr. Las mediciones se realizaron en un equipo infrarrojo marca Jasco,

~ 22 ~
Materiales y Métodos

modelo FT/IR-460 plus de procedencia japonesa. Se obtuvieron espectros infrarrojos


en la región de 3856,1 a 581,5 cm-1.

II.6.3. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE FENOLES TOTALES

El contenido de fenoles totales se determinó por el método de Folin-Ciocalteu (Singleton


y col., 1999; McDonald y col., 2001; Pourmorad y col., 2006; Memnune y col., 2009;
Chlopicka y col., 2012).

Muestras
 Extractos acuoso e hidroalcohólicos al 30, 50 y 80 % de G. calyptrata
 Sustancia de referencia: ácido gálico

Procedimiento:
 Solución diluida de Folin-Ciocalteu: se tomó 10 mL del reactivo y se diluyó a 100
mL con agua destilada.
 Solución de carbonato de sodio 7,5 %: se pesó 75 g de Na 2 CO 3 anhidro y se
disolvió en un litro de agua destilada.

En tubos de ensayos de aproximadamente 50 mL de capacidad se adicionaron:

 200 µL de la muestra (extractos y solución de referencia de ácido gálico)


 10 mL de solución diluida de Folin-Ciocalteu
 1,8 mL de agua destilada
 Se agitó y esperó cinco minutos
 Se adicionaron 8 mL de solución 7,5 % de Na 2 CO 3 . Se agitó nuevamente
 Se dejó en reposo durante dos horas
 Se leyó la absorbancia a 765 nm
 El blanco estuvo constituido por las soluciones señaladas anteriormente sin las
muestras de ensayos.

Se pesó 500 mg de ácido gálico y se disolvió en 20 mL de etanol al 96 %. Se transfirió


cuantitativamente a matraz aforado de 50 mL y se enrasó con agua destilada. De esta
solución concentrada de ácido gálico se tomaron alícuotas de 1, 2, 3, 4 y 5 mL y se

~ 23 ~
Materiales y Métodos

diluyeron a 100 mL. Estas diluciones correspondieron a las concentraciones de 10, 20,
30, 40 y 50 mg/100 mL de ácido gálico, con las que se construyó una curva de
calibración de absorbancia contra concentración. El contenido de fenoles totales se
expresó en mg/mL.

II.6.4. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE FLAVONOIDES TOTALES

Se llevó a cabo por el método colorimétrico del tricloruro de aluminio, según lo referido
por Woisky y Salatino (1998); Chang y cols., (2002) y Pourmorad y cols. (2006).

Muestras
 Extractos acuoso e hidroalcohólicos al 30, 50 y 80 % de G. calyptrata
 Sustancia de referencia: quercetina

Procedimiento

 Solución de tricloruro de aluminio al 10 % en etanol al 96 %


 Solución de Acetato de potasio (CH 3 CO 2 K) diluida en agua (1 M)
 Diluir 10 mg de quercetina en etanol al 96 % y de ahí diluir a 10, 15, 25, 50 y 100
µg/mL.

En tubos de ensayos se adicionaron:


 0,5 mL de extracto o solución patrón de quercetina
 1,5 mL de etanol al 96 %
 0,1 mL de tricloruro de aluminio al 10 %
 0,1 mL de acetato de potasio 1 M
 2,8 mL de agua destilada
 Esperar 30 minutos y leer a 415 nm
 El blanco es etanol al 96 %

Con las concentraciones del patrón anteriormente señaladas, se construyó una curva
de calibración de absorbancia contra concentración. El contenido de flavonoides totales
se expresó en base a quercetina (mg/mL).

~ 24 ~
Materiales y Métodos

II.7. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS

II.7.1. TÉCNICA FRAP

El ensayo seleccionado fue el de Potencial de Reducción Total (técnica


FRAP). Las determinaciones fueron de carácter espectrofotométrico, se empleó un
espectrofotómetro UV- visible a una absorbancia de 593 nm (Benzie y Strain, 1996).

Materiales:
 Micropipetas de 5-1000 µL
 Tubos de ensayos

Reactivos:
 Acetato de sodio anhidro o acetato de sodio tri-hidratado.
 Ácido acético (99,7 %)
 2,4,6-tripiridil-s-triazina (TPTZ) (Aldrich)
 Ácido clorhídrico (37 %)
 FeCl 3 x 6 H 2 O (0,02 M)

Muestras:
 Extractos acuoso e hidroalcohólicos al 30, 50 y 80 % de G. calyptrata, a las
concentraciones de 2; 10; 20; 30 y 40 μg/mL.

Fundamento del método

Consiste en medir la capacidad de la muestra para reducir el hierro férrico (Fe 3+) a ferroso
2+ 3+
(Fe ). Se coloca en el medio de reacción el complejo Fe -TPTZ y el mismo en
2+
presencia de agentes reductores se reduce a Fe -TPTZ que desarrolla un color azul
intenso con un máximo de absorción a 593 nm.

II.7.2. TÉCNICA DE DPPH

Para la determinación cuantitativa se utilizó el método del radical libre DPPH (radical
2,2-difenil-1-picrilhidracilo). Se empleó un espectrofotómetro UV- visible y las

~ 25 ~
Materiales y Métodos

determinaciones fueron medidas a 517 nm al cabo de los 30 min. (Brand-Williams y col.,


1995).

Materiales:
 Micropipetas de 5-1000 µL
 Tubos de ensayos

Reactivos:
 DPPH (2,2 difenil-1-picrilhidracilo) (Sigma)
 Etanol absoluto calidad para análisis

Muestras:
 Extractos acuoso e hidroalcohólicos al 30, 50 y 80 % de G. calyptrata, a las
concentraciones de 5; 12,5; 25; 37,5 y 50 μg/mL.

Fundamento del método

El radical libre DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidracilo) se reduce a 2,2-difenil-1-pricril


hidrazina por la acción antioxidante de compuestos que contienen grupos -OH que
decoloran dicho reactivo. La absorbancia característica de este radical que posee un
color violeta intenso, disminuye en presencia de un antioxidante (que sea capaz de
capturar un electrón libre) u otro radical. Es posible por tanto, cuantificar la capacidad
capturadora de radicales libres que poseen ciertos compuestos mediante la determinación
del grado de decoloración que provoca a una solución etanólica de DPPH (Brand-Williams
y col., 1995).

Se calculó el porcentaje de inhibición de la coloración del DPPH por la fórmula siguiente:

D.Oc - D.Om
% inhibición DPPH = x 100
D.Om

Donde:
D.O m: densidad óptica de la muestra (nm)
D.O c: densidad óptica del control (nm)

~ 26 ~
Materiales y Métodos

% DPPH: porcentaje de decoloración del DPPH (%)

Valores cercanos a 20 µg/mL se consideran de interés.

II.8. ANÁLISIS ESTADÍSTICO

Los resultados correspondientes al control de calidad fueron procesados para calcular


los valores medios y desviaciones estándar. Se llevó a cabo un análisis de varianza de
clasificación simple a través de ANOVA-1, para un nivel de significación del 95% y para
la comparación de las medias se utilizó el test de Rangos Múltiples de Duncan.

En el estudio antioxidante se llevó a cabo un análisis de varianza, seguido de la prueba


de Dunnett o Tukey según fuera el caso. Todos los análisis fueron efectuados a través
del programa Statgraphics®Plus, versión 5.0.

~ 27 ~
CAPÍTULO III
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Resultados y discusión

CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

III.1. CARACTERIZACIÓN BOTÁNICA DE LA ESPECIE G. calyptrata

En un estudio farmacognóstico, el primer aspecto a analizar es la caracterización


botánica del material vegetal, con la finalidad de conocer si, realmente, se trata de la
especie a estudiar y establecer los parámetros de aquellos estudios para los cuales no
existan antecedentes.

III.1.1. EVALUACIÓN MACROMORFOLÓGICA DE LAS HOJAS

La evaluación macromorfológica permitió observar una disposición decusada de las


hojas sobre el tallo, las mismas presentaron una textura coriácea, peciolo corto, base
acorazonada, aunque otros autores suelen usar el término de cordada (González,
2013). El ápice, se identificó como obtuso, aunque en ocasiones este se torna más
redondeado, por lo que es aceptable clasificarlo entre obtuso y redondo. La venación
es del tipo cerrada, se corresponde con un sistema reticular, muy frecuente en las
dicotiledóneas, en este caso, del tipo penninervia, el cual es uno de los sistemas más
avanzados que asegura la nutrición a todas las partes de la hoja (González, 2013). Los
bordes se presentan ligeramente ondulados, con tendencia a ser festonados en
determinadas secciones. La lámina foliar se puede establecer como aovada-elíptica.
En la figura 5 se muestran los detalles macroscópicos de las hojas y en la tabla I se
resumen sus características con las descritas en la literatura.

Figura 5. Características macromorfológicas de la hoja de G. calyptrata

~ 28 ~
Resultados y discusión

Resulta llamativo la presencia de pelos o tricomas en toda la superficie de las hojas


(caras adaxial y abaxial), incluyendo los bordes, para lo cual no se han encontrado
referencias en la bibliografía consultada, pues Roig (1974) describe a las hojas como
lampiñas en su cara superior, aspecto que contrasta con las observaciones realizadas.
Como esta especie resulta ser endémica de Cuba, y existen pocos reportes sobre su
morfología, se sugiere para nuevas investigaciones que la misma sea estudiada con
individuos cosechados en diferentes ecosistemas, tratando de dilucidar la posible
influencia de elementos componentes del medio sobre la morfología de la planta, o si
existen cambios géneticos que han motivado la presencia de pelos o tricomas en las
hojas. En términos generales, los caractéres macromorfológicos estudiados coinciden
en lo fundamental con los planteados en la literatura (Roig, 1974; Bisse, 1988).

Tabla I. Características macromorfológicas de las hojas de G. calyptrata


y lo reflejado en la literatura
Parámetros Resultados Bisse (1988); Roig (1974)
Disposición de las hojas
decusada -
sobre el tallo
aovada-elíptica, peciolo corto, aovada - elíptica, brevemente
Forma borde ondulado a festonado, pecioladas, base acorazonada,
base acorazonada, ápice ápice obtuso
obtuso-redondeado
Nervadura Pelosa, penninervia Pelosa, penninervia
Textura Coriácea Coriácea
pelosa en haz (cara adaxial) y Glabrescente en el haz y
Superficie envés (abaxial) tomentosa (pelosa) en el envés
Verde-grisáceo oscuro por el verde oscuro por el haz y verde
Color
haz y verde claro por el envés pálido por el envés
Olor Característico -
_
Largo (cm) ( X / S ) 6,79/1,05
Intervalo de confianza [6,49;7,08] 3,5-13
_
Ancho (cm) ( )
X / S 4,21/0,70
Intervalo de confianza [4,01;4,41] 2-7

III.1.2. EVALUACIÓN MICROMORFOLÓGICA DE LA DROGA EN POLVO

El análisis micromorfológico se realizó a la droga seca. Se presentaron estructuras


internas y externas de una sección del sistema del tejido vascular xilemático con
espesamiento de la pared secundaria en forma de espiral, también llamados
helicoidales (Gattuso M y Gatusso S, 1999). Otra imagen permitió observar un conjunto

~ 29 ~
Resultados y discusión

de tricomas o pelos del tipo unicelulares, los que también fueron identificados en el
análisis macroscópico.

Se apreciaron estomas (estructuras que permiten el intercambio de agua y CO 2 con el


medio ambiente), posiblemente del tipo del tipo paracíticos, donde los ejes
longitudinales de las células subsidiarias son paralelos a los de las células estomáticas
y a la apertura del estoma. También se pudieron visualizar células epidérmicas de
paredes ligeramente gruesas, de forma y tamaño variable. En la figura 6 se muestran
las características microscópicas observadas.

Figura 6. Detalles microscópicos de la droga en polvo de G. calyptrata

El examen microscópico o análisis micrográfico a veces revela detalles significativos, no


sólo para confirmar la identidad de la planta sino también para identificar la naturaleza
de adulterantes mezclados, intencionalmente o no. En muchas drogas, la descripción
microscópica de la disposición de los diferentes tipos de tejidos, estomas, tricomas y/o
fibras, células epidérmicas, etc., brinda un medio valioso que asegura la calidad del
material vegetal. Los resultados micromorfológicos de la droga en polvo de G.
calyptrata no han sido informados con anterioridad, por lo que constituyen un aporte
interesante para el estudio de la especie.

~ 30 ~
Resultados y discusión

III.2. PARÁMETROS FARMACOGNÓSTICOS DEL MATERIAL VEGETAL

III.2.1. ESTUDIO DE SECADO

El secado es un aspecto fundamental dentro de los estudios farmacognósticos


encaminados a establecer la calidad de una droga, por lo que aplicar un método de
secado apropiado evita que se activen procesos enzimáticos (fermentativos) que
modifiquen la estructura de los posibles principios activos (Miranda y Cuéllar, 2001;
Acosta y Rodríguez, 2006).

Al someter las muestras a un secado en estufa (con recirculación de aire a temperatura


de 40 oC) se pudo constatar que el material vegetal secó completamente a los 4 días
(96 horas), con una pérdida en peso de agua o pérdida por desecación del 10,57/0,31
% (valor medio/desviación estándar). El bajo contenido de agua perdido pudo estar
relacionado con la consistencia coriácea de la hoja; por lo general, esta característica
hace que dicho órgano tenga menos agua en su contenido y por tanto menos agua que
perder durante el proceso de secado.

Se conoce que el secado artificial es el más recomendado en todos los casos. Se


empleó la estufa porque, para la mayoría de las especies vegetales, es el método más
eficiente y rápido para eliminar el alto contenido de agua que se acumula en los
materiales naturales. En este sentido, resulta conveniente estudiar el tiempo que
demora en secar el material bajo esas condiciones y la pérdida en peso de agua del
material vegetal, aspectos imprescindibles a la hora de definir las condiciones de
secado de la planta.

Con relación a la temperatura de secado hay que señalar que su control es fundamental
y constituye una seria limitante en el proceso; temperaturas demasiado altas
descomponen los metabolitos responsables de la acción terapéutica de las plantas
medicinales y muy bajas hacen más largo y costoso el proceso, además de ocasionar
daños en el material por el desarrollo de hongos. Por regla general la temperatura de
secado no debe exceder los 40 oC (Acosta y Rodríguez, 2006).

~ 31 ~
Resultados y discusión

En cuanto al tiempo de secado influyen numerosos factores, entre ellos están la


consistencia de la planta o del órgano vegetal cosechado, donde la relación masa
fresca/masa seca es sumamente variable (pérdida en peso de agua), la humedad
relativa, la cantidad de agua acumulada en la planta antes del proceso de colecta, entre
otros factores.

III.2.2. PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS

Dentro del estudio farmacognóstico de una droga se encuentra la determinación de un


conjunto de índices numéricos, los cuales son indispensables para garantizar su calidad
y pureza, lo cual se traduce en el valor intrínseco de la misma. A continuación se
presentan en la tabla II algunos de los parámetros que le fueron evaluados al material
vegetal.

Tabla II. Parámetros físico-químicos de la droga cruda de G. calyptrata


Parámetros (%) Resultados
_
X/ S

Humedad residual 8,00/0,0


Sustancias solubles en agua 10,57/0,14
Sustancias solubles en etanol al 30 % 15,47/0,07
Sustancias solubles en etanol 50 % 19,29/0,13
Sustancias solubles en etanol 80 % 20,55/0,08
Cenizas totales 3,26/0,11
Cenizas solubles en agua 1,41/0,16
Cenizas insolubles en HCl al 10 % 1,81/0,10

Determinar el contenido de agua es de suma importancia, ya que un exceso de este


contenido en la droga, puede dar lugar a la proliferación de microorganismos e insectos,
la oxidación e hidrólisis de los constituyentes químicos de la muestra durante el
almacenamiento. Sus límites deben ser predeterminados durante el estudio de la droga
vegetal, principalmente para aquellas que se comportan higroscópicas o en aquellos
casos que el deterioro puede ser promovido por la presencia de un alto contenido de
agua.

El método azeotrópico, que es uno de los más aceptados por la norma que rige el
trabajo con las plantas, fue el seleccionado durante este estudio por ser general y

~ 32 ~
Resultados y discusión

apropiado. Se observó que el porcentaje de humedad está dentro de los límites


establecidos, es decir, entre un 8 y 14 % (Lou-Zhi-cen, 1980; WHO, 1998; Miranda y
Cuéllar 2001).

La determinación de sustancias extraíbles o solubles es uno de los índices numéricos


más importantes para seleccionar los mejores disolventes en el proceso de extracción.
Se utilizaron como disolventes agua y diferentes mezclas hidroalcohólicas,
evidenciándose mayor cantidad de extractivos para las mezclas hidroalcohólicas al
80 % y 50 %.

Las cenizas totales representan un indicativo de la calidad de la materia a emplear y


constituye un elemento determinante para juzgar la identidad y pureza de la droga,
brindando una información con relación a la posible adulteración con materia inorgánica
o cuerpos extraños que posea la misma o cantidad de dichos elementos en su
contenido (Miranda y Cuellar, 2001). En la experiencia realizada el valor de cenizas
totales estuvo enmarcado por debajo del límite máximo establecido que es un 5 % (Lou-
Zhi-cen, 1980).

Los ensayos de cenizas solubles en agua y cenizas insolubles en ácido clorhídrico,


permiten determinar los posibles metales pesados presentes y por consiguiente la
factibilidad de toxicidad que ellos pudieran inferir. En el caso de las cenizas insolubles
en ácido, los valores indican un contenido de metales alcalino térreos aceptables
(inferiores al 2 %) (Lou-Zhi-cen, 1980). Por su parte, las cenizas solubles en agua,
también mostraron valores pequeños, los mismos deben corresponder a iones de
metales alcalinos y/o alcalinos térreos que no afectan al organismo.

III.3. IDENTIFICACIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS POR TAMIZAJE


FITOQUÍMICO

Es considerado de interés en el estudio de una droga, conocer de forma preliminar su


composición química general, la cual se obtiene mediante métodos de tamizaje
fitoquímico. En la tabla III se exhiben los resultados de los tres extractos ensayados.

~ 33 ~
Resultados y discusión

Los resultados positivos para la prueba de fenoles y taninos, coincide con los reportes
de la literatura para el género Guettarda (Naressi y col., 2015); dichos compuestos,
confieren propiedades fungicidas y son utilizados como defensa química, ya que
gracias a su capacidad de precipitar proteínas actúan como antinutricionales ante el
ataque de predadores (Asquith y Butler, 1986). Entre la gran variedad de compuestos
secundarios existentes en las plantas, los fenoles representan a los principales agentes
alelopáticos que se conocen en la actualidad (Lizalda, 2008). Por sus propiedades
antioxidantes estos compuestos han demostrado efectos beneficiosos a la salud
humana como antinflamatorios, antiescleróticos y antivirales (Mendes y col., 2010;
Wannes y col., 2010; Gupta y col, 2014; Coimbra y col., 2015).

Tabla III. Tamizaje fitoquímico de los tres extractos


Extracto Extracto Extracto
Ensayos Metabolitos
etéreo alcohólico acuoso
Sudan Compuestos grasos + NR NR
Baljet Lactonas y/o coumarinas - + NR
Lieberman-Burchard Triterpenos y/o esteroides + + NR
Dragendorff Alcaloides - - +
Mayer Alcaloides - - +
Wagner Alcaloides - - +
Espuma Saponinas NR + ±
Resina Resinas NR + NR
Ninhidrina Aminoácidos NR - NR
Fehling Sustancias reductoras NR + +
Shinoda Flavonoides NR ++ ++
FeCl3 Fenoles y/o taninos NR ++ ++
Borntrager Quinonas NR + NR
Antocianidinas Antocianidinas NR + NR
Mucílagos Mucílagos NR NR -
Kedde cardiotónicos NR - NR
Leyenda: + ensayo positivo; ++ ensayo muy positivo; - ensayo negativo; ± ensayo dudoso; NR no realizado

Fue notoria la presencia de flavonoides en los extractos alcohólico y acuoso. Se ha


demostrado que estos metabolitos exhiben un amplio rango de acciones farmacológicas
y acciones bioquímicas tales como: actividades antioxidantes, antimicrobiana,
antitrombótica, antimutagénico, anticarcinogénico y antiepiléptico (Gupta, 2014;
Salvamani y col., 2014; Coimbra y col., 2015). Los resultados positivos también están
en correspondencia con antecedentes del género, donde se plantean flavonoides del

~ 34 ~
Resultados y discusión

tipo quercetin-3-O-B-D-galactopiranósido y quercetin-3-O-B-D-glucopiranósido (Naressi


y col., 2015).

Se presentaron alcaloides (solamente en el extracto acuoso), los mismos han sido


citados para la familia Rubiácea (Delprete, 2004) y el género Guettarda (Capasso y
col., 1998). Se ha descrito que estos compuestos han mostrado una gran variedad de
propiedades biológicas, como son: actividad antibacteriana, anticancerígena,
antiprotozoaria, antioxidante, antialérgica, hipotensoras, estimulantes y anti-VIH (Virus
de Inmunodeficiencia Humana) (Basco y col., 1994; Fujiwara y col., 1999; Quader y col.,
1999; Islam y col., 2002; Ahua y col., 2004; Chukaew y col., 2008; Koba y Baczek,
2011; Rajendra y col., 2011; Raza y col., 2012; Wang y col., 2013). Otros estudios
revelan que los alcaloides se emplean para tratar vómitos y náuseas, colitis,
entumecimiento nocturno de pierna y Alzheimer (Okoye y Chukwu, 2014).

Los compuestos lactónicos, en especial coumarinas también fueron detectadas. Son


considerados como estructuras privilegiadas debido a su amplia gama de propiedades
biológicas, incluyendo anticoagulante, anti-neurodegenerativa, antioxidante,
anticancerígeno y actividades antimicrobianas (Mirunalini y Krishnaveni, 2011; Torres y
col., 2014).

La presencia de triterpenoides está en correspondencia con lo referido para el género


(Aquino y col., 1988). Se ha informado para estos compuestos efectos farmacológicos
tales como antiinflamatorio, anti-ulceroso, antibacteriano, antiviral (incluyendo anti-VIH),
hepatoprotector, inmunomodulador, hipolipidémico y para reducir el colesterol,
anticoagulante, anticancerígeno, etc. (Szakiel y col., 2012). También se ha reportado
actividad antitripanosomal (Hoet y col., 2007).

Otros compuestos como coumarinas y saponinas fueron encontrados, los cuales


también están referidos para el género (Revathi y Rajeswari, 2015). Los resultados
hasta el momento brindan los primeros hallazgos de composición química preliminar
para la especie G. calyptrata.

~ 35 ~
Resultados y discusión

III.4. OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS

Se elaboró un extracto acuoso por decocción, considerando los antecedentes del uso
popular dado a la planta. También se obtuvieron extractos hidroalcohólicos (por
maceración), teniendo en cuenta una mayor posibilidad de aplicación y estabilidad de
las preparaciones a partir de la droga.

III.4.1. PARÁMETROS FÍSICO-QUÍMICOS DE CALIDAD DE LOS EXTRACTOS

Con el propósito de determinar la calidad de los extractos, se procedió al análisis de los


parámetros físico-químicos. Fueron considerados los aspectos siguientes: propiedades
organolépticas (olor y color), análisis del pH, sólidos totales, índice de refracción,
densidad relativa y análisis capilar. En la tabla IV se presentan los resultados del
estudio.

Desde el punto de vista de las propiedades organolépticas los extractos se mostraron


como líquidos de color ámbar, siendo traslúcidos los hidroalcohólicos y opalescente el
extracto acuoso. Respecto al olor, todos tuvieron un olor característico a té.

Tabla IV. Parámetros físico-químicos de los extractos de


G. calyptrata
Resultados obtenidos
_
X / S
Parámetros Extracto Extracto Extracto Extracto
acuoso hidroalcohólico hidroalcohólico hidroalcohólico
al 30 % al 50 % al 80 %
pH 4,01/0,04a 4,25/0,06b 4,60/0,01c 4,97/0,01d
Sólidos totales
(%) 1,61/0,05e 1,85/0,0f 2,03/0,01g 2,51/0,00h
Índice de
refracción 1,3297/0,0001i 1,3439/0,0005j 1,3519/0,0003k 1,3600/0,0007l
Densidad
relativa (g/mL) 0,9811/0,0006m 0,9789/0,0002n 0,9522/0,0005o 0,8782/0,0002p
Imagen capilar
(altura en cm) 14,3q 13,8r 11,1s 9,3t
Leyenda: Letras iguales muestran que no existen diferencias significativas y letras diferentes que si existen
diferencias significativas para un 95% de confianza.

La determinación del pH brinda el comportamiento del carácter ácido o básico de una


solución, haciéndose necesario su control para garantizar la estabilidad de un extracto.

~ 36 ~
Resultados y discusión

Los resultados obtenidos oscilaron entre 4,01 y 4,97; mostrándose las características
ácidas de los extractos. El carácter ácido puedo estar dado por la presencia de
diferentes metabolitos secundarios tales como: fenoles, flavonoides, taninos,
triterpenoides y esteroides detectados en el tamizaje fitoquímico, fundamentalmente
fenoles y taninos en cuyas estructuras presentan grupos funcionales como los
hidroxilos fenólicos que aportan esta característica al medio. Se encontraron diferencias
significativas en la determinación de dicho parámetro.

Se asigna el término de sólidos totales a la variación de la masa, debido a la pérdida o


eliminación de sustancias volátiles por acción del calor, mediante un proceso de
evaporación de la porción de ensayo (Miranda y Cuéllar, 2000). Sirve de base para el
ajuste de dosis, en estudios farmacológicos y toxicológicos, cuando no se conoce la
concentración del principio activo que ejerce la acción.

El análisis de varianza mostró diferencias significativas entre los extractos, lográndose


mayor contenido de sólidos totales con los extractos hidroalcohólicos al 80 y 50 %. Los
resultados están en correspondencia con las sustancias extraíbles donde los valores
más altos se alcanzaron con dichos disolventes.

El índice de refracción representa la relación entre el seno del ángulo de incidencia de


la luz y el seno del ángulo de refracción cuando la luz pasa oblicuamente a través del
medio. El análisis de varianza también determinó que existen diferencias significativas
entre los extractos.

La densidad relativa da criterio del peso específico de cada extracto. Los resultados de
esta determinación muestran la presencia de sustancias extraídas a partir de cada
disolvente utilizado. El análisis estadístico evidenció diferencias significativas,
observándose que a medida que aumenta el grado alcohólico, disminuye el valor de
densidad.

Finalmente, se llevó a cabo el análisis capilar, el cual se basa en el fenómeno de


repartición de sustancias a través de los espacios capilares del material inerte
que constituye el papel de filtro (Miranda y Cuéllar 2000). Constituye un método

~ 37 ~
Resultados y discusión

ingenioso e interesante para la caracterización de extractos, permitiendo obtener una


huella de los mismos. Como se puede observar en la tabla IV, la altura de la imagen
capilar varía significativamente en dependencia del grado alcohólico, siendo
inversamente proporcional, o sea, a mayor contenido de agua, mayor altura, debido a
una mayor afinidad de este disolvente por las fibras de celulosa que constituyen el
papel de filtro. También se apreciaron variaciones en las tonalidades de las imágenes y
complejidad de las mismas, aspecto que pudiera estar relacionado con la concentración
y tipo de metabolito. En la figura 7 se muestran las imágenes capilares de los extractos
ensayados.

Figura 7: Análisis capilar de los extractos de G. calyptrata

III.5. PERFIL FITOQUÍMICO DE LOS EXTRACTOS DE G. calyptrata

III.5.1. CROMATOGRAFÍA EN CAPA DELGADA

La cromatografía en capa delgada, dada su sencillez y recursos necesarios para su


desarrollo, resulta de gran utilidad para ser aplicada en los laboratorios o entidades que
trabajan con productos naturales, ya que suministra un perfil visible e intuitivo de los
constituyentes químicos (Kartik y col., 2010; Neeraj y Bhupinder, 2011).

El desarrollo cromatográfico de los extractos se realizó con la fase móvil n-butanol:


ácido acético: agua (65:25:10 v/v/v), luego de varias experiencias con otros sistemas de

~ 38 ~
Resultados y discusión

disolventes y el empleo de varias condiciones de revelado. En la figura 8 se muestra el


cromatograma de los cuatro extractos.

Al visible (figura 8A) se apreció poca complejidad cromatográfica, lo notorio fue una
mancha de color amarillo de Rf 0,67 en los cuatro extractos que coincidía con el patrón
de rutina ensayado. En el revelado físico mediante luz UV (figura 8B) se observó en
todas las muestras evaluadas, fluorescencia en un gran número de manchas, lo cual
confirma la presencia de moléculas con grupos cromóforos conjugados en su
estructura. Las coloraciones entre parda-amarillenta y naranja pudiera estar relacionada
con compuestos de naturaleza fenólica, entre ellos flavonoides.

Figura 8. Cromatografía en capa delgada de los extractos de


G. calyptrata
Leyenda: R: rutina; Q: quercetina; E A: extracto acuoso; E 30%: extracto hidroalcohólico al 30 %;
E 50%: extracto hidroalcohólico al 50 %; E 80%: extracto hidroalcohólico al 80 %;
Fase estacionaria: gel de sílice (sobre soporte de aluminio); Fase móvil: n-butanol: ácido acético: agua
(65:25:10); A: cromatograma al visible; B: revelado a la luz UV 254 nm ;
C: revelado frente a vapores de NH 3 ; D: revelado con FeCl3 ; E: revelado con AlCl3 ;
F: revelado con AlCl 3 /luz UV 254nm ; G: revelado con H 2 SO 4 /calor;
H: revelado con vainillina/ H 2 SO 4 /calor

~ 39 ~
Resultados y discusión

Al exponer la cromatoplaca a los vapores de amoníaco (figura 8C), todas las manchas
intensificaron su color y algunas se mostraron amarillas, entre ellas, la de Rf 0,67, algo
indicativo de compuestos con presencia de grupos fenólicos libres. Algo similar ocurrió
con el revelado frente al tricloruro de aluminio (figura 8E) y al exponer la placa a la luz
UV después del revelado con dicha solución (figura 8F), evidenciándose tonalidades
entre amarillo intenso y amarillo-naranja.

El revelado con tricloruro férrico al 5 % en agua (figura 8D) mostró manchas de color
verde negruzco, lo que sugiere compuestos fenólicos derivados del catecol, así como
otras de color pardo-rojizo en el punto de aplicación, propio también de este tipo de
compuesto, fundamentalmente, glicosilados (Lock, 1988; Miranda y Cuéllar, 2001).

Con ácido sulfúrico al 5 % en etanol y la posterior exposición al calor, se observó una


buena visualización de todas las manchas presentes en los extractos (figura 9G),
destacándose manchas amarillas y amarillo-naranja, especialmente, la de Rf 0,67. Al
valorar el revelado con vainillina/ H 2 SO 4 /calor, resulta muy llamativa la variedad de
colores entre rosado intenso y amarillo que presentan todas las muestras. Según la
literatura (Lock, 1988), este comportamiento pudiera estar relacionado con estructuras
de tipo flavonoides.

Respecto al comportamiento cromatográfico de los extractos, es de señalar que la fase


móvil empleada logró separar de alguna manera los componentes según su polaridad,
pudiendo sugerir un perfil similar y la presencia de compuestos de naturaleza fenólica,
entre ellos, el flavonoide rutina, por el comportamiento en cuanto Rf y respuesta a los
reveladores empleados.

III.5.2. MÉTODOS DE ANÁLISIS ESPECTROSCÓPICOS


III.5.2.1. ESPECTROSCOPIA ULTRAVIOLETA VISIBLE (UV)

El análisis por espectroscopía ultravioleta visible de los extractos, mostró absorciones


entre 270 y 285 nm y otra entre 325 y 330. Este comportamiento pudiera estar
relacionado con la presencia de compuestos fenólicos en los extractos, especialmente,
flavonoides, los cuales exhiben dos bandas en la región del ultravioleta/visible, la banda

~ 40 ~
Resultados y discusión

I que aparece en un rango de los 300 a 400 nm y la banda II, ubicada entre los 200 y
285 nm (Lock, 1988; Markham, 1989; Abad-Garcia, 2009; Martínez y col., 2012). En la
figura 9 se representan los espectros UV-visibles de las muestras evaluadas.

La apariencia espectral de los cuatro extractos es similar, permitiendo sugerir la


presencia de compuestos fenólicos, en especial flavonoides. Es importante destacar
que esta técnica aunque es útil para la caracterización fitoquímica de extractos,
solamente ofrece una orientación respecto a la posible presencia de grupos
funcionales.

Figura 9. Espectros ultravioleta visibles de los extractos de


G. calyptrata

III.6.2.2. ESPECTROSCOPIA INFRARROJA (IR)

Al analizar los extractos por espectroscopía infrarrojo, se observó una banda ancha e
intensa entre 3500 y 3200 cm-1, indicativa de las vibraciones de valencia de

~ 41 ~
Resultados y discusión

alcoholes o fenoles asociados. Entre 2980 y 3000 cm-1, se apreciaron bandas múltiples
indicativas de vibraciones de valencia C-H. También se visualizaron bandas de 1500-
1600-cm-1 que pudieran estar relacionadas con las vibraciones de valencia de C–C de
compuestos con agrupamiento aromático. Se constató una banda alargada y estrecha
muy cercana a los 1050 cm-1, aproximadamente, indicativa de la presencia de enlaces
C-O (Silverstein, 1977; Lock, 1988; Siebert y Hildebrandt, 2007). En la figura 10 se
muestran los espectros infrarrojos de los cuatro extractos evaluados.

Es de notar, que los extractos manifestaron un perfil IR con varias bandas coincidentes,
pero con diferencias en la intensidad y ancho de las mismas; pudiendo sugerir en todos
los casos la presencia de compuestos de naturaleza fenólica.

Figura 10. Espectros infrarrojos de los extractos de


G. calyptrata

~ 42 ~
Resultados y discusión

III.5.3. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO DE FENOLES TOTALES

En la figura 11 se muestra la curva de calibración del estudio. Se logró una buena


correlación entre las concentraciones ensayadas de la sustancia de referencia (ácido
gálico) y las absorbancias, obteniendo una ecuación de la recta: Y=0,0123X+0,0376,
con un coeficiente de correlación de 0,9997 (≥0,99).

0,8

0,6
Absorbancia

0,4

0,2

0
0 10 20 30 40 50
Concentración de ácido gálico (mg/100 mL)

Figura 11. Curva de calibración para la determinación de fenoles totales por el


método de Folin-Ciocalteu

El análisis estadístico de los resultados permitió constatar diferencias significativas en el


contenido de dichos metabolitos en los extractos evaluados, siendo mayor la
concentración para el extracto hidroalcohólico al 80 %. En la tabla V se evidencian las
cuantificaciones efectuadas.

Tabla V. Contenido de fenoles totales en los extractos de G. calyptrata


Concentración de
fenoles totales
Extractos
mg/mL
_
(X/S)

Extracto acuoso 2,83/0,04a


Extracto hidroalcohólico al 30 % 3,92/0,04b
Extracto hidroalcohólico al 50 % 4,37/0,05c
Extracto hidroalcohólico al 80 % 5,33/0,02d
_
Leyenda: (X/S) : valor medio de las determinaciones/desviación estándar
Letras iguales muestran que no existen diferencias significativas y letras diferentes que si existen diferencias
significativas para un 95 % de confianza.

El contenido de fenoles totales en los extractos fue determinado por el método de Folin-
Ciocalteau, donde el reactivo utilizado es una mezcla de ácidos de coloración amarilla

~ 43 ~
Resultados y discusión

(fosfowolfrámico y fosfomolíbdico), que al reaccionar con los compuestos fenólicos


presentes en una preparación, dan lugar a óxidos de color azul (óxidos de wolframio y
molibdeno) que exhiben un máximo de absorción a 765 nm, lo cual permite su
cuantificación por espectroscopía de UV/VISIBLE. La intensidad de la absorción de luz
a esa longitud de onda, es proporcional a la concentración de compuestos fenólicos, la
cual se expresa en equivalentes de ácido gálico (Martínez, 2000).

III.5.4. FLAVONOIDES TOTALES

Los flavonoides totales en los extractos fueron determinados por el método


colorimétrico del tricloruro de aluminio. En esta prueba los flavonoides reaccionan con el
cloruro de aluminio en etanol, produciendo un complejo de color amarillo que posee un
pico de absorción de luz a 415 nm. La concentración se expresa equivalente a
quercetina. En la figura 12 se muestra la curva de calibración obtenida para la
sustancia de referencia.

Figura 12. Curva de calibración para la determinación de flavonoides expresados


como quercetina

Se logró una buena correlación entre las concentraciones ensayadas del patrón de
quercetina y las absorbancias, obteniendo una ecuación de la recta Y=
0,0036X+0,0270, con un coeficiente de correlación de 0,9995 (≥0,99); esto es indicativo
del buen ajuste de la ecuación del modelo de los datos experimentales. En la tabla VI
se presentan los resultados del contenido de flavonoides para cada extracto.

~ 44 ~
Resultados y discusión

Tabla VI. Contenido de flavonoides totales en los extractos de


G. calyptrata
Concentración de
flavonoides totales
Extractos
mg/mL
_
(X/S)

Extracto acuoso 1,14/0,005a


Extracto hidroalcohólico al 30 % 1,43/0,01b
Extracto hidroalcohólico al 50 % 1,70/0,01c
Extracto hidroalcohólico al 80 % 2,33/0,01d
_
Leyenda: (X/S) : valor medio de las determinaciones/desviación estándar
Letras iguales muestran que no existen diferencias significativas y letras diferentes que si existen diferencias
significativas para un 95% de confianza.

También se constaron diferencias estadísticamente significativas, alcanzándose el


mayor valor parta el extracto hidroalcohólico al 80 %. Las diferencias pudieran estar
asociadas con el poder extractivo de los disolventes empleados.

III.6. ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE DE LOS EXTRACTOS

La capacidad de un compuesto de inhibir la tasa de oxidación de los nocivos radicales


libres o secuestrar los mismos, constituye un aspecto de gran importancia, ya que se
protegería al organismo de las infecciones, del deterioro celular, del envejecimiento
prematuro y, probablemente del cáncer.

Tomando como base que la especie G. calyptrata ha sido utilizada tradicionalmente


para aliviar la causticación cutánea y de mucosas producida por el látex de Comocladia
dentata Jacq. (Guao) y que dicho proceso lleva implícito un daño oxidativo causado
por radicales libres, se decidió determinar la actividad antioxidante de varios extractos
de la planta, para de alguna manera justificar las propiedades medicinales de esta
especie endémica.

III.6.1. TÉCNICA FRAP

El análisis de FRAP fue introducido por Benzie y Strain (1996) para medir la actividad
antioxidante total y se basa en el poder reductor de un antioxidante que reduce el ion
férrico (Fe3+) al ion ferroso (Fe2+), formando un complejo azul. Una absorción alta a

~ 45 ~
Resultados y discusión

una longitud de onda de 593 nm indica un poder de reducción alto del fitoquímico, es
decir, una actividad antioxidante alta (Roginsky y Lissi, 2005).

De acuerdo a los resultados de la prueba FRAP, realizada a diferentes concentraciones


de los extractos de G. calyptrata, descritos en la tabla VII y representados en la figura
13, se puede establecer que los extractos más activos fueron los hidroalcohólicos al 80
% y 50 %, los cuales manifestaron mayor valor de absorbancia.

Tabla VII. Actividad antioxidante por la técnica FRAP de los extractos de G.


calyptrata
Concentración Densidad óptica a 590 nm
de extracto _
X /S
(µg/mL) EAc EH-30 % EH-50 % EH-80 %
2 0,039/0,002a 0,067/0,001b 0,089/0,00c 0,101/0,002d
10 0,050/0,004e 0,096/0,00f 0,117/0,001g 0,139/0,002h
20 0,102/0,004d 0,128/0,001i 0,184/0,002j 0,203/0,003k
30 0,171/0,002l 0,275/0,003m 0,316/0,002n 0,372/0,002o
40 0,230/0,002p 0,356/0,004q 0,409/0,003r 0,498/0,002s
Letras iguales indican que no existen diferencias significativas y letras diferentes que existen diferencias
significativas para un 95 % de confianza
Leyenda: EAc: extracto acuoso; EH-30 %: extracto hidroalcohólico al 30 %;
EH-50 %: extracto hidroalcohólico al 50 %; EH-80 %: extracto hidroalcohólico al 80 %

Del análisis estadístico, se desprende que existen diferencias significativas entre los
valores de densidad óptica, los cuales aumentaron a medida que aumentaba la
concentración de cada extracto evaluado. En todos los casos se formó un complejo de
color azul, cuya intensidad aumentaba con la concentración de la muestra.

Figura 13. Poder reductor de los extractos de G. calyptrata


~ 46 ~
Resultados y discusión

Lo anterior demuestra que los extractos, al presentar poder reductor,


consecuentemente, tienen la capacidad de donar electrones al Fe3+ para convertirlo en
Fe2+. Esto conlleva, finalmente, a decir que dichos extractos tienen actividad
antioxidante, manifestando mayor actividad los de mayor porcentaje de etanol.

III.6.2. TÉCNICA DE DPPH

En la técnica del DPPH ocurre una reducción de dicho radical, que se monitorea por la
disminución en la absorbancia a una longitud de onda característica. En su forma de
radical libre, el DPPH• absorbe a 517 nm y cuando sufre reducción por un antioxidante,
esta absorción desaparece. En consecuencia, la desaparición del DPPH• proporciona
un índice para estimar la capacidad del compuesto de prueba para atrapar radicales.

En la figura 14 se muestra una curva dosis-respuestas de la capacidad secuestradora


del DPPH para cada uno de los extractos evaluados. Existe una tendencia al aumento
de la capacidad de inhibición de dicho radical a medica que aumenta la concentración
de cada extracto, siendo mayor la actividad antioxidante para el extracto hidroalcohólico
al 80 %, incluso, a concentraciones más pequeñas.

Figura 14. Comportamiento de la capacidad secuestradora del radical DPPH de


los extractos de G. calyptrata
Leyenda: EAc: extracto acuoso; EH-30 %: extracto hidroalcohólico al 30 %;
EH-50 %: extracto hidroalcohólico al 50 %; EH-80 %: extracto hidroalcohólico al 80 %

Como se puede observar en la tabla VIII, existen diferencias estadísticamente


significativas entre las muestras; el mayor porcentaje de inhibición de DPPH lo presenta

~ 47 ~
Resultados y discusión

el extracto hidroalcólico al 80 %. Según esta técnica, se considera de interés las


muestras que en una concentración cercana a 20 µg/mL inhiben el 50 % de la
decoloración del DPPH, por lo que se pude considerar que en estas condiciones de
trabajo, dicho extracto es el de mayor actividad antioxidante, pues con concentraciones
de 12,5 y 25 µg/mL logra inhibir al radical en un 49,26 y 57,41 %, respectivamente. No
obstante, los otros extractos también manifestaron propiedades antioxidantes
superiores al 50 %, aunque a concentraciones más elevadas.

Tabla VIII. Actividad antioxidante por la técnica DPPH de los extractos de G.


calyptrata
Concentración Porciento de secuestro del radical
de extracto DPPH (%)
(µg/mL) _
X /S
EAc EH-30 % EH-50 % EH-80 %
5 22,86/0,24a 26,36/0,13b 27,57/0,26b 37,08/0,31c
12,5 28,23/0,40d 39,17/0,47e 29,00/0,13d 49,26/0,18f
25 40,19/0,32g 39,62/0,16e 36,73/1,72c 57,41/0,19h
37,5 42,14/0,16i 47,98/0,89j 60,93/0,21k 66,18/0,22l
50 52,82/0,38m 61,38/0,42k 66,82/0,22l 73,86/0,24n
Letras iguales indican que no existen diferencias significativas y letras diferentes que existen diferencias
significativas para un 95 % de confianza
Leyenda: EAc: extracto acuoso; EH-30 %: extracto hidroalcohólico al 30 %;
EH-50 %: extracto hidroalcohólico al 50 %;EH-80 %: extracto hidroalcohólico al 80 %

Desde el punto de vista cualitativo se pudo apreciar en la mezcla de la reacción el


cambio rápido de color púrpura a color amarillo pálido, proporcionado por los extractos.
Esto solamente es debido a la presencia de sustancias antirradicales que redujeron el
radical 2,2-difenil-1-picrilhidracilo (DPPH) con la concomitante pérdida de absorbancia
en la solución.

En la evaluación antioxidante efectuada, se puede señalar, que el extracto


hidroalcohólico al 80 % fue el de mayor actividad, lo cual está en correspondencia con
el mayor contenido fenoles totales y flavonoides. Lo anterior sugiere, que dichos
compuestos, están relacionados de manera muy directa con la actividad antes descrita,
y en concordancia con reportes reflejados en la literatura donde describen que la
actividad antioxidante determinada por FRAP y DPPH tiene una correlación
directamente proporcional al contenido de compuestos fenólicos (Michalak, 2006;

~ 48 ~
Resultados y discusión

Thaipong y col., 2006, Echavarría y col., 2009; Ljiljana y col., 2009; Faustino y col.,
2010; Dejan y col., 2011). Dentro de esta gran familia suelen encontrarse tres grupos
principales: los ácidos fenólicos, los polifenoles y los flavonoides (Ochoa y Ayala, 2004).
Otros estudios reflejan, que las propiedades biológicas y farmacológicas de los
flavonoides, en gran medida, depende de la actividad antioxidante (Bosetti y col., 2005;
Rossi y col., 2006; Walle y col., 2007; Majewska y col., 2011).

~ 49 ~
CONCLUSIONES
Conclusiones

CONCLUSIONES

 El estudio farmacognóstico de G. calyptrata permitió establecer las


especificaciones de calidad del material vegetal y sus extractos, siendo
trascendental las características micromorfológicas de la droga en polvo y sus
parámetros físico-químicos.

 Los métodos de análisis empleados para establecer el perfil químico de los


extractos permitió observar algunas similitudes entre ellos; sugirieron la
presencia de flavonoides y fenoles en general, con diferencias en la
concentración de los mismos según el tipo de extracto.

 Los extractos manifestaron propiedades antioxidantes por las técnicas FRAP y


DPPH bajo las condiciones ensayadas. La mayor actividad se obtuvo para el
extracto hidroalcohólico al 80 %, lo cual a su vez, está en correspondencia con
los mayores contenidos de compuestos fenólicos y flavonoides.

~ 50 ~
RECOMENDACIONES
Recomendaciones

RECOMENDACIONES

 Profundizar en el estudio químico de la especie, donde se incluyan varias


épocas y lugares de colecta del material vegetal.

 Continuar las evaluaciones antioxidantes de extractos de la planta mediante


el empleo de otros métodos y la utilización de sustancias de referencias, para
medir el alcance de las determinaciones.

 Evaluar otras potencialidades terapéuticas, como la actividad anti-irritante de


la especie, para establecer o comprobar su uso tradicional.

~ 51 ~
REFERENCIAS
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