ACTIVIDAD

ENZIMÁTICA
Docente:
Guillermo Arzate Martínez
Alumnos
Arriaga García Andrea
Cárdenas González Brenda Nayeli
Segura Palma Daniela Karina
◦ La actividad catalítica de la enzima depende tanto de su capacidad de adsorción sobre
el sustrato, como de la formación del complejo activo enzima- sustrato.
 CELULASAS

◦ Las celulasas son enzimas derivadas de los procesos naturales de fermentación, capaces
de degradar la celulosa, debido a eso son de gran importancia en la industria, sus
diferentes aplicaciones, por ejemplo en la producción de alimentos y de papel.
Tres complejos enzimáticos básico celulolíticas:
◦ Endoglucanasas
◦ Exoglucanasas nombradas celobiohidrolasas
◦ Glucosidasas
Ensayos

a) velocidad inicial de la reacción enzimática

b) Cantidades de concentraciones
c) Variables temperaturas
d) Diferencias de sustratos
 unidades
◦ 
  
◦ 
objetivo

Obtener la actividad enzimática de una celulasa comercial

aplicando el protocolo reportado por la IUPAC.
Actividad de celulasa
◦ Preparación de Soluciones:
◦ Se preparó 50 mL de una solución de buffer de citrato con un pH=4.8 ( con
6.45 g de citrato de sodio y 4.38 g de ácido cítrico en 500 mL de agua
destilada)
◦ Se preparó soluciones estándar de 25 mL con las siguientes concentraciones:
0, 0.5, 1, 1.5 y 2 g/L de D-glucosa (imagen 1)

◦ Se preparó el reactivo de DNS: Medir 150 mL de agua destilada, añadir los

reactivos en el siguiente orden: Imagen 1. soluciones
estándar
◦ a) 1.12 g de ácido 3,5 dinitrosalicílico,
◦ b) 2.09 g de NaOH
◦ c) 32.41 g de tartrato de sodio y potasio
◦ d) 0.8 mL de fenol calentado a 50oC
◦ e) 0.879 g de metabisulfito de sodio
Preparación de la Curva de
Calibración:
◦ Se numero 5 tubos cónicos del 1 al 5
◦ A cada tubo se añadió:
◦ a) 0.5 mL de cada una de las soluciones estándar; (es decir, al tubo 1 se añadió 0.5 mL de la solución
con concentración 0 g/L de glucosa, al tubo 2, 0.5 mL de la solución a 0.5 g/L y así sucesivamente).
◦ b) 1 mL de buffer
◦ c) 0.75 mL de DNS.
◦ Se cerró los tubos a 100ºC por 5 minutos
◦ Se dejó enfriar y se le agrego 5ml de agua destilada a cada tubo.
◦ Se leyó la absorbancia de cada tubo a 550 nm
 Ensayo de actividad enzimática:
◦ Numere tres tubos cónicos del 1 al 3.
◦ Coloque en cada tubo

µL de Dilución µL de buffer mg de papel

Tubo (µL enzima/500 µL)
enzima de citrato filtro
1 125 D1=0.25 1375 50 Celulasa con papel filtro como
2 60 D2=0.12 1440 50 sustrato
3 30 D3=0.06 1470 50

◦ Tape los tubos y manténgalos a 50oC por 60 minutos.

◦ Añada a cada tubo 0.75 mL del reactivo de DNS y caliente el contenido de los tubos a ebullición por 5
minutos.
◦ Al terminar el calentamiento, enfriar y añadir 5 mL de agua destilada a cada tubo, leer en el
espectrofotómetro UV-Visible a una longitud de onda de 550 nm.
Preparación de soluciones
◦ Para la obtención de concentración de proteína para celulasa y amilasa.
1. Reactivo a ( 25 mL Na2Ca3 al 2%)
2. Reactivo b1 (25 mL CuSO4 al 1%)
3. Reactivo b2 (25 mL de tartato de sodio 2%)
4. Reactivo c (25mL de reactivo a con 0.25 mL de re activo b1 y 0.25 mL de reactivo b2)
5. 50mL de buffet (0.645g de citrato de sodio y 0.438g de ácido cítrico)
6. 25mL de solución patrón de albumina 2mg/ mL
7. 25 mL NaOH 2 N
◦ Se colocó en tubos:

0 1 2 3 4 5 6 7
Solución 0 15 25 50 125 250 Muestr 100 100
patrón a
albumina (µL)
Buffer(µL) 500 485 475 450 375 250 Buffer 400 400

• A cada tubo se le añadieron 500 µL de NaOH y calentaron en termoblock a 100°c por 10 minutos
• Se dejo enfriar y añadieron 5 mL de reactivo c, se agotaron para homogeneizar y dejaron reposar
durante 15 minutos.
• Se añadieron 250 μL de folin y 250 µL de buffer, dejando reposar por 30 minutos
• Finalmente se leyó a 750nm
Metodología actividad amilasa
◦ Se prepararon soluciones de glucosa con las siguientes concentraciones
1 2 3 4 5
Agua 25 25 25 25 25
destilada
en ml
Concentr 0 0.5 1 1.5 2
ación en
g/L
• En tubos de digestión se añadieron 0.5mL de glucosa con 0.75 mL de reactivo DNS
• Se calentó a 100°c Por 5 minutos
• Se dejo enfriar y añadieron 5 mL de agua para finalmente leer a 550 nm
Metodología reacción de hidrólisis

◦ Realizar soluciones de amilasa en las diferentes concentraciones:

◦ Para la solución D: se disolvio 0.25g de almidón en 25mL de buffer

μL amilasa 125 60 30
μL solución d 1500 1500 1500

• Se sometieron a reacción por 60 minutos a 50°c

• Luego, protocolo de curva
CURVA DE CALIBRACIÓN DE
GLUCOSA

 
Resultados celulasas
mg de glucosa liberada (x)
Dilución (y)

Mg de glucosa liberada

 
Dilución
  

Dilución

D1= 0.06

D2=0.12

D3=0.25
 
◦ 
Lowry

Muestra Absorbancias % proteína

𝛼-AMILASA 1.86 8.56 µg/mL

CEULASAS 2.34 10.78µg/mL

 Conclusión
◦ Al finalizar la presente práctica logra nos cuantificar la actividad enzimática de la
celulasa y amilasa mediante la determinación de moles de producto liberado por minuto
por mililitro del extracto utilizado en la actividad enzimática es decir los moles liberados
de azúcares reductores.
◦ Mediante los ensayos realizado y en comparación a los datos obtenidos por lo demás
equipos logramos observar que, al momento de medir las absorbancias, es omitir la
adicción de un buffer ya que al añadirlo los colores de las muestras son prácticamente
los mismos
 Bibliografías

◦ Vonne Gutiérrez-Rojas, Nubia Moreno-Sarmiento, Dolly Montoya. 2015.Mecanismos y regulación de la

hidrólisis enzimática de celulosa en hongos filamentosos: casos clásicos y nuevos modelos. Revista
Iberoamericana de Micología. Vol. 32. Núm. 1.páginas 1-62.
◦ Liliana mejía. 2016. Enzimas modificadas de la pared celular vegetal. Celulosas de interés biotecnológico
papelero. Tesis de Doctorado, Universidad de Barcelona.
◦ G. Cielo. M. Mercedes, C. Aurelia, Á. Teresa. 2016. Evaluación de la actividad enzimática del Trichoderma
inhamatum (BOL-12 QD) como posible biocontrolador. Vol.7. Journal of the Selva Andina Research
Society