ÍNDICE

Índice…………………………………………………………………………pág.01
Introducción………………………………………………………………….pág.02
I. Aspectos de la problemática.
1.1 Descripción de la realidad problemática…………………………….pág.03
1.2 Formulación del problema de investigación……...…………………pág.04
1.2.1. Problema General……………………………………...……pág.04
1.3 Justificación…………………………………………….……………pág.04
1.4 Objetivos………………………………..……………………………pág.04
1.4.1. Objetivo general…………………...………………………...pág.04
2. Marco Teórico.
2.1 Antecedentes de la investigación…………………………………….pág.04
2.2 Bases teóricas…………………………………………………...……pág.05
2.3 Glosario de términos básicos…………………………………………pág.06
2.4 Hipótesis………………………………………………………...……pág.06
2.4.1. Hipótesis general…………………………………….….pág.06
3. Marco Metodológico.
3.1 Enfoque……………………………………………………………….pág.06
3.2 Diseño…………………………………...……………………………pág.06
3.3 Nivel……………………………………………………………….….pág.07
3.4 Tipo…………………………………………………………………...pág.07
3.5 Sujetos de la investigación……………………………………………pág.07
3.6 Métodos y procedimientos……………………………………………pág.07
3.7 Técnicas e instrumentos………………………………………………pág.07
3.8 Aspectos éticos………………………………………………………..pág.08
4. Aspectos administrativos.
4.1. Cronograma de ejecución…………………………………………......pág.08
4.2. Presupuesto…………………………………………………...………pág.09
4.3. Financiamiento……………………………………………………….pág.10
5. Referencias bibliográficas………………………………………………………...pág.10

1
 INTRODUCCIÓN.
Las bacterias marinas son por su naturaleza psicrotróficas y halotolerantes; poseen
procesos metabólicos adaptados a bajas temperaturas y realizan sus actividades en altas
concentraciones de sales, elevadas presiones hidrostáticas, pH alcalinos e incluso
condiciones anóxicas. Bajo estas condiciones moderadamente «extremas» pueden producir
una serie de metabolitos, entre ellas las enzimas extracelulares (Féller et al., 1996). Entre las
enzimas extracelulares producidas por bacterias marinas se incluyen amilasas, glucamilasas,
glucosaisomerasas, pectinasas (Stanley & Stanley, 1986) y otras como agarasas, quitinasas,
alginasas, lipasas, DNasas, esterasas y proteasas (Fenical & Jensen, 1993; León et al., 2000).
En la actualidad, las bacterias productoras de proteasas han adquirido especial relevancia, ya
que pueden ser utilizadas en procesos productivos como la industria de los detergentes,
alimentos y bebidas, así como la clarificación de cerveza fría y otras bebidas, ablandamiento
de carnes rojas, industria del cuero, entre otras (Schmidt, 1981).
Entre los aspectos que estudia la Microbiología Marina se encuentra el conocimiento
de la distribución, abundancia y actividad metabólica de las bacterias heterótrofas que
contribuyen al reciclaje de los elementos biogénicos de los mares y océanos. Las bacterias
heterótrofas constituyen uno de los grupos más importantes en el funcionamiento de los
ecosistemas, ya que son capaces de degradar o mineralizar la materia orgánica presente en el
medio, transfiriendo energía hacia los otros niveles tróficos (Kirchman, 2000). Su mayor o
menor abundancia constituye un elemento orientador de la cantidad de materia orgánica
presente capaz de ser oxidada por la actividad bacteriana (Lugioyo, 2003). Este grupo en
particular, ha sido insuficientemente estudiado a pesar de que se reconoce el papel
fundamental que juegan en los ecosistemas y de constituir una fuente de amplia
biodiversidad.
Asimismo, la tecnología enzimática microbiana ocupa un papel importante dentro de
la biotecnología, específicamente en el sector alimentario, farmacéutico y salud. Alrededor
del 65% de las enzimas que se producen industrialmente están de una u otra manera
relacionadas con la industria alimentaria. Sólo las proteasas alcalinas empleadas en la
industria de detergentes ocupan el 25% del total, las restantes corresponden a aplicaciones
en las áreas farmacéuticas, industrial y analítica (Bárzana & López-Murguía, 1995).
El estudio y explotación de los recursos microbianos es realizado a través de la
conservación en colecciones “ex-situ” que garantizan el mantenimiento y accesibilidad de
cultivos puros, viables, y con estabilidad genética (Borem, Santos y Bowen, 2003). Estas
colecciones son consideradas como centros de recursos biológicos (bancos de germoplasma)
y constituyen fuentes para las investigaciones biotecnológicas y el desarrollo de
bioproductos. Entre sus funciones principales se encuentran el depósito, la conservación y
distribución de cultivos que serán empleados con fines docentes, industriales o
investigativos. La adecuación de las buenas prácticas de laboratorio a las condiciones de
trabajo propias de cada colección microbiana permitirá la mantención de la pureza, viabilidad
y estabilidad genética de los cultivos que custodian (Smith, 2003).

2
 I. ASPECTOS DE LA PROBLEMÁTICA.

1.1.Descripción de la realidad problemática.

Pese a ser una de las zonas marinas de mayor diversidad en Perú, la bahía de Paita muere
lentamente por el descuido y la contaminación. El diagnóstico socio económico y ambiental
de la zona marino costera de la provincia de Paita, realizado en el año 2014, indicaba que
“el problema más agudo en Paita es la contaminación marina debido a que funciona como el
receptor de los vertimientos de los efluentes líquidos y residuos sólidos urbanos e
industriales”, una situación que lleva décadas sin solución definitiva. El problema tiene tal
magnitud que el último 24 de abril, el Consejo Regional de Piura aprobó, por unanimidad,
solicitar ante el Ministerio del Ambiente el estado de emergencia ambiental de la Bahía de
Paita. En efecto, las causas que han llevado a Paita a esta situación crítica tienen sus orígenes
en las empresas pesqueras ubicadas en la bahía, la antigüedad del sistema de desagüe y la
actividad pesquera que arroja sus desechos directamente al mar (Mongabay, 2018).

Los parámetros de contaminación bacteriológica son los principales a tener en cuenta cuando
se trata de alcanzar objetivos de calidad para agua de baño o cultivos marinos frente a vertidos
urbanos. Los organismos filtradores actuan como acumuladores de la contaminación
bacteriológica, con el consiguiente peligro para el hombre si los ingiere. En 1973 un brote de
cólera en Italia fue causado por la ingestión de mejillones. La persistencia de los gérmenes
patógenos en el medio marino viene condicionada por numerosos fenómenos y factores que
se tratarán con mayor profundidad en apartados posteriores. El conocer la evolución y
persistencia de la contaminación bacteriológica es fundamental cuando se diseñan
instalaciones de vertido de aguas residuales al medio marino (Suárez, J. Tejero, I. Jácome,
A. 1997)

Las bacterias marinas son por su naturaleza psicrotróficas y halotolerantes; poseen procesos
metabólicos adaptados a bajas temperaturas y realizan sus actividades en altas
concentraciones de sales, elevadas presiones hidrostáticas, pH alcalinos e incluso
condiciones anóxicas. Bajo estas condiciones moderadamente «extremas» pueden producir
una serie de metabolitos, entre ellas las enzimas extracelulares (Féller et al., 1996). Entre las
enzimas extracelulares producidas por bacterias marinas se incluyen amilasas, glucamilasas,
glucosaisomerasas, pectinasas (Stanley & Stanley, 1986) y otras como agarasas, quitinasas,
alginasas, lipasas, DNasas, esterasas y proteasas (Fenical & Jensen, 1993; León et al., 2000).
En la actualidad, las bacterias productoras de proteasas han adquirido especial relevancia, ya
que pueden ser utilizadas en procesos productivos como la industria de los detergentes,
alimentos y bebidas, así como la clarificación de cerveza fría y otras bebidas, ablandamiento
de carnes rojas, industria del cuero, entre otras (Schmidt, 1981).

3
 1.2.Formulación del problema de la investigación.

1.2.1. Problema General

¿Será posible que bacterias marinas aisladas de aguas contaminadas de los efluentes de la
playa Toril - Paita produzcan proteasas extracelulares?

1.3. Justificación.

El proyecto se realizará para reconocer la cantidad de cepas de bacterias marinas que

producen proteasas extracelulares en las aguas contaminadas de la playa Toril en la provincia
de Paita, debido a que las proteasas tienen un importante fin en la industria por lo tanto en
nuestra vida diaria.

1.4.Objetivos.

1.4.1. Objetivo General.

Identificar proteasas extracelulares producidas por bacterias marinas aisladas de aguas

contaminadas con efluentes en la Playa Toril en la Provincia de Paita de Paita, Piura, 2019.

II. MARCO TEÓRICO.

2.1. Antecedentes de la investigación.
Las bacterias fueron aisladas de efluentes pesqueros emitidos por la fábrica del
consorcio APROPISCO en Playa Lobería – Paracas, las fábricas pesqueras de Chancay (200
m al norte del muelle de Chancay) y efluentes del Terminal Pesquero de Ventanilla (Callao)
(Sánchez et al., 2004).
Un total de 30 muestras de agua de mar contaminadas por efluentes pesqueros se
colectaron en frascos estériles de 250 mL de capacidad a una distancia entre 5 a 50 metros
de la orilla. Las muestras fueron refrigeradas y transportadas al laboratorio de Microbiología
Ambiental y Biotecnología de la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional
Mayor de San Marcos. Aislamiento de bacterias Las muestras colectadas fueron procesadas
en el laboratorio realizando diluciones seriadas al décimo (10-1,10-2 ...10-5) y utilizando
como diluyente agua de mar filtrada y esterilizada. El aislamiento y el recuento de bacterias
marinas se realizó según la metodología indicada por León et al. (2000), sembrando alícuotas

4
de 0,1 mL de las diluciones en Agar Marino (AM) 2216 (Difco), a pH 8,0, e incubados a 25
ºC por 5 días (Sánchez et al., 2004).
Para determinar la capacidad proteolítica de las cepas se tomaron 10 mL de los cultivos
de 48 h y se repicaron en AM suplementado con caseína al 1%, pH 8,0. Los cultivos fueron
incubados a 25 ºC hasta por 5 días. La capacidad hidrolítica de las cepas se reconoció
mediante la formación de halos transparentes alrededor de las colonias; los cuales se midieron
cada 24 horas hasta por un periodo de 5 días. Las cepas fueron mantenidas en AM semisólido
con adición de 10% de glicerol para realizar las pruebas experimentales posteriores (Sánchez
et al., 2004).
Para estimular la actividad enzimática de las cepas aisladas, éstas se reactivaron en CM
bajo las condiciones ya indicadas, y luego se sembraron 1 mL de estos cultivos (106 UFC/
mL aproximadamente) en frascos conteniendo 100 mL de CM suplementados con caseína al
1%, a pH 8,0 e incubados a 25 ºC con agitación constante de 120 rpm hasta por 96 horas. La
actividad enzimática (U/mL) y actividad específica (U/mg de proteína) de las cepas fueron
determinadas según la metodología recomendada por Nieto y Ellis (1986) y Takahashi y
Osaka (1970). Para ello, se tomaron los sobrenadantes de cultivos obtenidos luego de una
centrifugación a 2500 rpm por 10 minutos a 4 °C. Estas pruebas se ejecutaron cada 24 h hasta
completar las 96 h. La mezcla de reacción se preparó en tubos conteniendo 1 mL de la
solución de caseína (Difco) al 1%, pH 8,0 y agregando alicuotas de 0,2, 0,5 y 1 mL de los
sobrenadantes. La mezcla se incubó en baño maría por 20 minutos a 25 ºC agitando
suavemente y se detuvo dicha reacción adicionando 2 mL de Ácido Tricloroacético (ATC)
al 10% (p/v); luego se centrifugó a 2500 rpm por 10 minutos a temperatura ambiente, y a
cada sobrenadante se le midió su Densidad Óptica a 280 nm comparándose los resultados
con la curva estándar del aminoácido tirosina. Se realizó el mismo experimento con las cinco
cepas en estudio. La unidad de actividad fue definida como la cantidad de enzima que libera
un micromol de aminoácidos por minuto por mL o miligramo de proteína. Por otro lado, el
contenido proteico de los extractos obtenidos se realizó por el método de Lowry empleando
el reactivo Folin Ciocalteau (Sigma) y Seroalbúmina de bovino (mg/mL) (Sigma) como
estándar (Sánchez et al., 2004).
La caracterización fenotípica de las cepas CM43, CM44, CM45, CM46 y CM48 se
realizó mediante métodos convencionales en tubos y placas. Como medio base para todas las
pruebas se utilizó el CM o AM a pH 8,0. La temperatura de incubación fue en todos los casos
a 25 °C hasta por 5 días. Las cepas en estudio fueron sometidas a observaciones
microscópicas y pruebas conducentes a la caracterización morfológica, fisiológica y
bioquímica según procedimientos descritos por Baumman et al. (1972), Oliver (1982),
Ortigoso et al. (1994) (Sánchez et al., 2004).
2.2. Bases teóricas.
El baño en el agua de mar puede representar riesgo para la salud de los bañistas debido
a que puede estar contaminada con excretas humanas que contienen microorganismos
patógenos. La contaminación puede ser ocasionada principalmente por la descarga de tubos
de desagüe domésticos, cursos de agua contaminada provenientes de la lluvia o de subsuelo,
5
descarga de ríos con agua contaminada y defecación de los bañistas directamente en el agua
de mar (Fleisher, 1985; Pruss, 1998; Galv, 2003; PAHO, 2003). Para evaluar la calidad
microbiana del agua de mar existen guías y normas que utilizan microorganismos indicadores
que sugieren la presencia de gérmenes patógenos de origen fecal (Cabelli et al., 1983; Salas,
1989; Vergaray y Méndez, 1998; Cortes-Lara, 2003). Muchas de estas bacterias pueden ser
de mucha utilidad por su capacidad enzimática, esta es la razón por la que el ser humano ha
fijado sus ojos en el mundo bacteriano para su aprovechamiento.
2.3. Glosario de términos.
Efluente: Líquido residual que fluye de una instalación.
Patógeno: Que causa o produce enfermedad.
Tirosina: Aminoácido cuya oxidación produce pigmentos negros o melanina.
Proteólisis: La proteólisis es la degradación de proteínas ya sea mediante enzimas
específicas, llamadas peptidasas, o por medio de degradación intracelular.
Proteasas: Las peptidasas o proteasas son enzimas que rompen los enlaces peptídicos
de las proteínas.
Ex-situ: La conservación ex situ consiste en el mantenimiento de algunos componentes
de la biodiversidad fuera de sus hábitats naturales.
Psicotróficos: organismos capaces de vivir a temperaturas por debajo de los 5 °C. A
veces se llaman criófilos (amantes del hielo) o psicrótrofos (crecen en el frio), y científicos
no están de acuerdo sobre exactamente cómo difieren estos términos. En su mayor parte, sin
embargo, sus temperaturas mínimas de desarrollo van de −5 a +5 °C, sus temperaturas
óptimas de desarrollo se encuentran entre 12 y 15 °C y sus temperaturas de desarrollo
máximas son de 15 a 20 °C.
Halotolerancia: La halotolerancia es la adaptación por osmorregulación de los
organismos vivos a condiciones de alta salinidad. Las especies halotolerantes tienden a vivir
en zonas como los lagos hipersalinos, dunas costeras, desiertos salinos, mares de sal
interiores y manantiales.
2.4. HIPÓTESIS.
2.4.1. Hipótesis general.
Sí posible que bacterias marinas aisladas de aguas contaminadas de los efluentes de la
playa Toril - Paita produzcan proteasas extracelulares

III. MARCO METODOLÓGICO.

3.1 Enfoque: Mixto
3.2 Diseño: Cuantitativo: Experimental

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 Cualitativo: De Investigación-Acción.
3.3 Nivel: Descriptivo
3.4 Tipo: Básico/Aplicado.
3.5. Sujetos de Investigación:
3.5.1. Universo: Comprenderá a las bacterias marinas presentes en las playas
toril y Colán en la provincia de Paita.
3.5.2. Población: Comprenderá a todas las bacterias marinas productoras de
proteasas extracelulares.
3.5.3. Muestra: Comprenderá 30 muestras (250 ml) de agua de mar
contaminada recolectadas a una distancia entre 5 -15 metros de
la orilla.
3.6. Métodos y procedimientos:
A) Recolección de Muestras: Se recolectará 30 muestras de
agua de mar en frascos estériles de 250 ml de capacidad a una
distancia entre 5-15 metros de la orilla. Luego serán trasladadas
al laboratorio de Microbiología de la Universidad Nacional de
Piura.
B) Aislamiento de Bacterias: Las muestras colectadas serán
procesadas en el laboratorio, realizando diluciones sucesivas
(10-1,...,10-5) utilizando agua con sal marina disuelta
previamente esterilizada., e procederá a sembrar alícuotas de
0,1 ml de las diluciones en Agar Marino a pH de 8,0, e
incubados a 25 0C por 5 días, Modificado de León et al. (2000).
C)Elección de Cepas Proteolíticas: Se tomará 10 ml de los
cultivos de 48 h y se repicaran en Agar marino suplementado
con gelatina, a pH 8,0, luego se incubarán durante 5 días . la
capacidad proteolítica se reconocerá mediante la formación de
halos transparentes alrededor de las colonias, las cuales se
tomará medida cada 24 h durante los 5 días de incubación

3.7. Técnicas e Instrumentos:

3.7.1. De Muestreo: Compuesto (Se realizará dentro de los días establecidos en el
cronograma).
3.7.2. De recolección de Datos: En laboratorio

7
 3.7.3. Instrumentos: Frascos colectores con capacidad de 250 ml, Agar marino,
gelatina, Incubadora, tubos de ensayo, pipetas, cabo de 30 metros.
3.7.4. De Análisis: Agar marino suplementado con gelatina y medición posterior
de halos generados.

3.8. Aspectos Éticos:

El trabajo de Investigación se realizará respetando el Artículo No 411 del
código penal concordante con el Art No 32 de la ley No 27444 y la ley del
procedimiento administrativo general y las normas legales de protección a los
derechos de autor.
Se tomará en cuenta en cuenta el valor obtenido de la información importante
para una correcta actividad social en del lugar de estudio.

IV. ASPECTOS ADMINISTRATIVOS.

4.1. Cronograma ejecución.

Semanas
Actividades

01° 02° 03° 04° 05° 06° 07° 08° 09° 10º 11°

Revisión Bibliográfica X X X X X X X X X X

Presentación del anteproyecto X

Adquisición de Material Físico X X X

Adquisición de Material
X X
Biológico

Toma de datos X X X X X X
Análisis de resultados X X X X X

Elaboración del Informe Final X X X

Presentación del Informe Final X

8
 Horas semanales dedicadas al proyecto:

6 horas semanales
4.2. Presupuesto:

4.2.1. Recursos disponibles:

4.2.1.1. Personal:
 Alumnos encargados del proyecto
 Asesor.

4.2.2. Recursos no disponibles:

4.2.2.1.Materiales y Equipos:

4.2.2.1.1. Materiales
 30 Frascos de vidrio de 250ml. 60.00
 Agar marino.

4.2.2.2.Recursos físicos:
 01 Laptop Hp.
 01 Impresora Hp DeskJet GT serie 5820.
 01 Cámara fotográfica SONY 7.2 MP.
 02 Memorias USB Kingston.

4.2.2.3.Bienes de Consumo:
4.2.2.3.1. Materiales, útiles y equipos menores de oficina.
 04 Lapices mongol 5.00
 04 Libretas de campo 7.00
 04 Boligrafos Nº 031 4.00
 04 Tajador metalico Artesco 4.00
 04 Borrador Faber Castell 4.00
 01 Marcador Faber Castell 2.00
 01 Marcador indeleble Faber Castell 3.00
 06 Folder manilla 7.00

4.2.2.3.2. Servicio de apoyo administrativo copiado e impreso.

 02 juegos de informe final 16.00
4.2.2.3.3. Servicios de acceso a internet, redes y procesamiento de
información.

9
  30 horas de servicio de internet 30.00

TOTAL: 142.00.

4.3. Financiamiento:
 Autofinanciamiento.

V. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.

Bárzana, E. y López-Murguía. 1995. La Tecnología Enzimática. En: Biotecnología

Alimentaria, pp. 103-123. Limusa, México D.F.
Baumann, L.; M. Baumann, M. Mandel and R. Allen, 1972. Taxonomy of aerobic marine
Eubacteria. J. Bacteriol 110: 402-429.
Borem, A., F.R. Santos and D.E. Bowen. 2003. Understanding Biotechnology Chapter 12
Biodiversity. Prentice Hall PTR, ISBN 0-13-101011 240 p.
Cabelli, V.J., A.P. Dufours, L.J. Mc Cabe & M.A. Levin (1983). A Marine Recreational
Water Quality Criterion consisten with indicator concepts and Risk analysis. Journal
WPCF, 55 (10): 1306-1314.
Cortés-Lara M. del C. (2003). Importancia de los Coliformes fecales como indicadores de
contaminación en la Franja Litoral de Bahía de Banderas Jaliso-Nayarit. Rev. Biomed.
14: 121-123.
Feller, G.; E. Narinx, J. A. Arpingny, M. Haleb, E. Baise, S. Genicot and Ch. Gerday. 1996.
Enzymes from psychrophylic organism. FEMS Microbiol. Rev. 18: 189-202.
Fenical, W. and PR. Jensen. 1993. Marine microorganisms: a new biomedical resource. In:
Marine Biotechnology. Pharmaceutical and Bioactive Natural Products. Ed. D. H.
Attaway, O.R. Zaborsky. New York Plenum Press, 1:419-457.
Fleisher, J. M. (1985). Implications of Coliform variability in the assessment of Sanitary
quality of recreational waters. J. Hyg. 94: 193-200.
Galv, L. (2003). A Water Pollution crisis in the Americas. Habitat Debate. 9 (3): 10.
Kirchman, D.L. 2000. Uptake and Regeneration of Inorganic Nutrients by Marine
Heterotrophic Bacteria (Chapter 9). In: Microbial Ecology of the Oceans. Ed. D.L.
Kirchman, Wiley-Liss, New York. 262-288.
León, J.; F. Pellón, V. Unda, J. David, C. Anaya, y V. Mendoza. 2000. Producción de enzimas
extracelulares por bacterias aisladas de invertebrados marinos. Rev. Peru. Biol. 7(2):
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10
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Ciencias Biológicas, 2003, 140 p.

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contaminacion/

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Res. 29: 795-798
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negative bacteria associated with oysters and surrounding seawater of the
Mediterranean coast System. Appl. Microbiol. 17: 589-600
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recreational waters. Rev. Panam. Salud Pública. 14 (5): 364-9.
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Bacterias Patógenas. VII Reunión Científica. ICBAR. Libro de Resúmenes, p. 116.

11