OBTENCIÓN DE BIOETANOL A PARTIR DE CASCARILLA

DE CAFÉ MEDIANTE FERMENTACIÓN CON

Saccharomyces cerevisiae.

Lizeth C. García, Laura A. Pernett, Ivana P. Ayala, Yanith Cuellar, Hernán Saumeth
Facultad de Ingenierías y Tecnológicas.
Universidad popular del cesar, Valledupar.
Correo-e: gslizeth@gmail.com; cuellaryanith@gmail.com;
laurapernett25@hotmail.com; ivanazapata-12@hotmail.com;
hernan_sp@outlook.com

RESUMEN

El presente trabajo tuvo como objetivo principal la producción de etanol a partir de cascarilla de café,
mediante una fermentación alcohólica con Saccharomyces cerevisiae. Se le realizo una reducción de
partículas a las cascarillas de café para la obtención de partículas más pequeñas, luego de conseguir
la cantidad necesaria en gramos posteriormente se ejecutó un pretratamiento de ácido diluida
terminada esta se hizo prueba de humedad y cantidad de celulosa presente en la cascarilla, para
después efectuar una hidrolisis enzimática. Se preparó la activación del inoculo 2g/L de levadura
(Saccharomyces cerevisiae) por 6 horas a una temperatura de 35°C, se llevó a cabo la fermentación
con el sustrato de levadura activada, se mantuvo por 48 horas, en ausencia de oxígeno, se prosiguió
un monitoreo, donde se tomó muestras para °Brix al inicio y al final a partir de este determinar
alcohol promedio en la fermentación, se determinó la cantidad de azúcares reductores al inicio y al
final de la fermentación, se realizó una medición del crecimiento microbiano a la mitad del proceso,
y por último, se concluyó con una destilación para medir los grados de alcohol finales con un
alcoholímetro.

Palabras claves: Bioetanol, biorreactor, Fermentación, Saccharomyces cerevisiae.

OBTAINING BIOETHANOL FROM COFFEE HUSK BY FERMENTATION WITH
Saccharomyces cerevisiae.
The main objective of this study was the production of ethanol from coffee husks, by means of an
alcoholic fermentation with Saccharomyces cerevisiae. It was made a reduction of particles to the
coffee husks for the obtaining of smaller particles, after obtaining the necessary quantity in grams
subsequently a pretreatment of diluted acid finished was executed this one was tested of humidity
and amount of cellulose present in the husk, and then make an enzymatic hydrolysis. It was prepared
the activation of the innocuous 2g/L yeast (Saccharomyces cerevisiae) for 6 hours at a temperature of
35 °c, fermentation was carried out with the yeast substrate activated, was maintained for 48 hours,
in the absence of oxygen, a monitoring was continued , where samples were taken for ° Brix at the
beginning and end of this To determine average alcohol in the fermentation, the quantity of reducing
sugars was determined at the beginning and at the end of the fermentation, a measurement of
microbial growth was made in the middle of the process, and finally, it was concluded with a
distillation to measure the Final alcohol grades with a breathalyzer.

Key words: bioethanol, bioreactor, fermentation, Saccharomyces cerevisiae.

 INTRODUCCIÓN.
A causa de la alta demanda mundial de
energía, el agotamiento y uso
indiscriminado de los combustibles
fósiles; además de su producción que
provoca contaminación al medio
ambiente a través de sus gases de emisión,
principalmente el CO2, se están
desarrollando alternativas que
reemplacen a los combustibles no
renovables, como es el bioetanol que es
una forma limpia de energía proveniente
de fuentes renovables, a partir de la
biomasa lignocelulósica residual. (Abril &
Abril, 2009).
Actualmente se han realizado diferentes
estudios sobre diversos materiales
lignocelulósicos para la producción de
biocombustibles, a partir de diversos
sustratos como la cascarillas o pajas de
arroz, trigo, cebada, el bagazo de caña de
azúcar y de agave, algunas cascaras de
frutas; además de ciertas cortezas
maderosas de diversas especies, así como
pastos fibrosos de rápido crecimiento
(Sandoval, 2010).
El bioetanol se considera como una
bioenergía derivada de la biomasa
residual, además es un biocombustible
que se ha obtenido a partir de diferentes
polisacáridos derivados de diferentes
tipos de biomasa como el almidón
contenido en semillas o legumbres (sorgo,
papa, yuca,) y de altos contenidos en
azucares presentes en la caña o diversas
frutas; pero en la actualidad se está
estudiando biomasa con alto contenido en
celulosa, siendo este último material el
considerado para desarrollar
biocombustibles de segunda generación, a
través de diversos procesos de hidrólisis y
fermentaciones (Cardona, 2006).
Para lograr tecnologías sustentables, se
fijó la mirada en residuos agrícolas, como
la cascarilla de café ya que es
prácticamente lignocelulosa; la cual
podría ser utilizada en la producción de
etanol lignocelulósico.
Considerando lo anterior, el presente
trabajo busca realizar una obtención de un
biocombustible de segunda generación a
nivel laboratorio, a través de diferentes
procesos, siguiendo una metodología
específica y parámetros ya establecidos,
se logra la generación de etanol
lignocelulósico.
METODOLOGÍA.
Para la producción de Bioetanol se
seleccionó como materia la cascarilla de
café, donde se le realizo una serie de
procedimientos que se presentan a
continuación:
Adecuación de la cascarilla de café
o pretratamiento mecánico.
La cascarilla de café fue extraída y
comprada de fábrica ubicado en el
municipio de Pueblo Bello/Cesar,
Colombia. Posteriormente se realizó una
reducción de partículas, donde se efectuó
molienda, picadora y un tamiz obtención
de partículas más pequeñas, luego de
conseguir la cantidad necesaria en
gramos.
Pretratamiento.
Para este proceso se escogió un
pretratamiento de ácido diluido con ácido
sulfúrico H2SO4 al 2.5 % a una
temperatura 121°C, 15 psi durante 20 min.
Luego se secó la muestra por 12 horas a
65°C.
Determinación de humedad
Para esta prueba se lavó y peso un crisol,
posteriormente se secó a una temperatura
de 105°C durante 30 min y luego volver a
pesar, se repite hasta obtener un peso
constante. Se pesa 1 gr de muestra y se
transfiere al crisol previamente secado y
pesado. El crisol se lleva al horno de
secado durante 5 horas, pasado el este
tiempo se lleva a un desecador por 30 min,
luego se pesa y se vuelve a llevar al horno
por 30 min a 105°C, este proceso se repite
hasta la obtención de peso constante. La
humedad se determina mediante la
siguiente formula:
𝐻𝑢𝑚𝑒𝑑𝑎𝑑(%) =
𝑃𝑚− (𝑃𝑐+𝑚 −𝑃𝑐 )
𝑥100 EC. 1
𝑃𝑚
Dónde: Pm (peso de la muestra en, g) Pc
(peso del crisol vacío en, g) y Pc+m (peso del
crisol más la muestra seca en, g)
Determinación del contenido de
celulosa.
Se pesó un 1 gr de muestra y se añadió a
una mezcla de etanol y se adiciono ácido
nítrico concentrado en relación 4:1,
posteriormente se realizó un reflujo
durante 30 min, se filtró y se repitió dos
veces.
Se realizó un lavado con agua destilada
caliente por una hora, luego se sometió a
un lavado con una solución saturada de
acetato de sodio, y se finalizó con un
lavado de agua destilada.
El residuo se secó durante 5 horas a una
temperatura 105°C se enfrió en un
desecador y se pesó.
El contenido de glucosa se determina
mediante la siguiente formula:
𝑃𝑜𝑟
𝑝𝑜𝑟𝑐𝑒𝑛𝑡𝑎𝑗𝑒 𝑑𝑒 𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑜𝑠𝑎 = ∗ 100% EC.
𝑃𝑜
2
Por: es el peso del residuo
Po: es el peso de la muestra
Determinación de actividad
enzimática.
Se realizó por el método de papel filtro
(watman 1), se preparó un buffer de citrato
de pH 4.8 en el cual se realizaron varias
diluciones. Se prepararon patrones de
glucosa a partir de una solución de
glucosa, en tampón de citrato 0.05 M, de
10 mg/ml de concentración. La reacción
enzimática se lleva a cabo en tubos de
ensayo de 25 ml de capacidad. En la
siguiente tabla se mostrara el volumen de
reactivo para cada solución:
Muestra Blanco Estándar Cero.
(2) enzima. (4)
Tapón 1 ml 1 ml 1 ml 1.5
de ml
citrato.
Solución 0.5 ml 0.5 ml
de la
enzima.
Glucosa. 0.5 ml
Papel 1
filtro.
Las muestras problemas se atemperan a
50°C antes de añadir la tira de papel filtro.
Es importante que el papel quede
sumergido, en su mayor parte, en la
mezcla de reacción. La incubación de las
muestras se realiza durante 60 min a
50°C.
Una vez transcurrido el tiempo de
incubación, se añaden 3 ml de reactivo de
DNS a todos los tubos de ensayo,
incluyendo en la muestra problema,
patrones de glucosa, blanco de enzima y
cero. Después de agitar se introducen
durante 5 minutos en el baño con agua
hervida y se transfiere posteriormente a
un baño de agua fría. Se añaden 20 ml de
agua destilada a cada tubo y, se agitan
interviniéndolo varias veces hasta que la
mezcla sea uniforme.
Luego se deja reposar durante 20
minutos, para que la pulpa de papel se
deposite en el fondo de los tubos y se lee la
absorbancia a 540 nm.
CÁLCULO DE UFP. Y se llevó hasta una temperatura de 35°C.
Pasado 6 horas se mezcló el 30% y el 70%
Ajustar los valores de absorbancia de la solución.
obtenidos para los distintos patrones
de glucosa a una recta. Fermentación.
Calcular sobre la ecuación de esa recta
los valores de glucosa que La fermentación empezó cuando se
corresponderían a las absorbancias mezcló el 30% y el 70% y se realizo el
para las muestras problema. montaje para una fermentación alcohólica
Representar en papel semilogarítmico bajo condiciones anaerobia, temperatura
los valores de glucosa obtenidos frente de 38°C, pH 4.0, 200 rpm durante 48
a las concentraciones (inversa de las horas.
diluciones) de solución de enzima Durante la fermentación se efectuaron
correspondiente, y estimar el valor de una serie de pruebas que se verán a
la concentración que liberaría continuación.
exactamente 2 mg de azucares
reductores. Curva patrón de glucosa.
Esta se realizó preparando las
concentraciones de glucosa mostradas en
𝑈𝐹𝑃 la siguiente tabla, estas soluciones e
𝑑𝑒 𝑙𝑎 𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑑𝑒 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎 𝑜𝑟𝑖𝑔𝑖𝑛𝑎𝑙
𝑚𝑙 agitaron en el vortex y se le adiciono 1 ml
0.37 de DNS a cada solución, se calentó agua a
= 𝐸𝐶. 3
𝐶 90°C por 5 minutos, después se realizó el
Hidrolisis enzimática. choque térmico con escarcha de hielo por
5 minutos, y se procedió a tomar las
Para la hidrolisis se preparó un buffer de lecturas de absorbancia con el
500 ml, con citrato de sodio y ácido cítrico espectrofotómetro.
con un pH de 4.0. Se tomó 50 gr de la
muestra obtenida después del secado y se Esquema de estándares de glucosa.
añadieron al buffer, para realizar la Volúmenes
hidrolisis se separó el 70% del volumen Volumen de
glucosa en ml
total del jugo y se añadió la enzima H2O destilada.
(0,4 mg/ml).
accellerase 1500 a la solución y la 0,0 1,0
hidrolisis empieza con sus respectivas 0,1 0,9
condiciones, temperatura de 50 °C, pH 0,2 0,8
4.0, 150rpm durante una hora. 0,3 0,7
0,4 0,6
Activación de levadura.
0,5 0,5
Una vez que se pesaron las sales de 0,6 0,4
Fosfato de potasio (KH2PO4) y Sulfato de 0,7 0,3
magnesio (MgSO4), se le adiciono al 30% 0,8 0,2
del volumen y se pasterizo a una 0,9 0,1
temperatura de 75°C durante 15 minutos, 1,0 0,0
posteriormente se preparó un inoculo de
2g/L de levadura (Saccharomyces
cerevisiae)
Determinación de azucares
reductores en la fermentación.
Para la realización de esta prueba, se tomó
una pequeña muestra del producto que
estaba en el proceso de fermentación,
luego de esto se tomó 0,1 ml y se adiciono
a una balón aforado de 100 ml
completando con agua destilada hasta el
aforo, esto se realizó para dos balones
aforados más, luego de esto de cada uno
de los balones aforados se tomó 1 ml y se
adiciono a tubos de ensayos
respectivamente, a cada uno de los 3 tubos
de ensayo se le agrego 1 ml del reactivo
DNS, a un cuarto tubo se le agrego agua
destilada y DNS, 1 ml de cada sustancia.
Después de esto se calentó agua en un
Beaker hasta 90°C, alcanzada esta
temperatura se introdujeron los 4 tubos
de ensayos por 5 minutos, y luego se llevó
a choque térmico por 5 minutos también,
esto con el fin de que la muestra
reaccionara con el reactivo para su
posterior lectura, en el espectrofotómetro
a 540 nm.
Crecimiento microbiano.
Durante la fermentación se extrajeron
muestras del material fermentando,
donde se llevaron al laboratorio de
microbiología y se prepararon distintas
diluciones, donde se hizo el respectivo
conteo a medida que iban incrementando
las levaduras, se utilizaron las diluciones.
Con una pipeta automática se agregó la
dilución correspondiente a la cámara de
neubauer, luego se analizó en el
microscopio enfocando en 10x y 40x, una
vez enfocado se empezó el conteo de
Saccharomyces cerevisiae.
Σ𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠
Nª levadura/mol [ ]=
𝐹𝐷∗10−𝑋
EC. 4
Dónde: Σ𝑐𝑒𝑙𝑢𝑙𝑎𝑠: es el número de célula
contada.
𝐹𝐷𝑥10−𝑋 : El número de concentración
utilizada
Curva patrón de etanol.
Para la realizar esta esta prueba se preparó
diferentes diluciones del etanol al 96% en
2 en 2 hasta 12, y se aforo hasta llegar a
100ml, en 6 tubos de ensayo se adiciono
agua destilada y etanol en las siguientes
concentraciones: (0.2; 0.4; 0.6; 0.8; 1.0;
1.2) ml, siendo este el eje X luego se
tomaron °Brix a las diferentes
disoluciones para el eje Y.
Alcohol probable.
Para la realización de esta prueba se
tomaron 2 muestras de °Brix durante la
fermentación, para cada muestra se
realizaron 3 lecturas donde se obtuvo el
°Brix promedio de la muestra, estos
resultados fueron reemplazados en la
fórmula de alcohol probable que es la
siguiente:
Alcohol probable: (0,6757 * °Brix) –
2,0839 (García & Vayreda, 2014) EC. 5
Determinación del grado alcohólico
por el método de destilación y
alcoholimetría.
Se preparó un montaje para destilación y
se destilaron 200 ml, teniendo en cuenta
la temperatura de ebullición del etanol
(78ºC). Donde el etanol obtenido se utilizó
para medir con la ayuda de una probeta de
25 ml los grados de alcohol, se introdujo el
alcoholímetro manual dentro de la
probeta y se realizó la respectiva medición
de alcohol.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
Pretratamiento.
En este proceso se escogió un
pretratamiento de ácido diluido con ácido
sulfúrico H2SO4 al 2.5 % dando buenos
resultados dado que el ácido es un agente El autor (Vázquez O., 2015) reporto un
poderoso que hidroliza la celulosa. La contenido de celulosa de 22.82 % por cada
cantidad a utilizar de éste ácido se 2 g. cascarilla de café.
determinó de la siguiente manera:
100 𝑚𝑙 → 900 𝑚𝑙 𝐻2 𝑆𝑂4
0,025 ∗ 900 𝑚𝑙 = 22,5𝑔
Determinación de la actividad
100 𝑔 𝑠𝑙𝑛 98% 1 𝑚𝑙 enzimática.
22,5 𝑔 ∗ ∗
98 𝑔 1,84 𝑔 𝑠𝑙𝑛 98%
Los siguientes datos fueron los obtenidos
= 12,5 𝑚𝑙 en la realización de la curva patrón para
posteriormente obtener la actividad
enzimática, gracias a la ecuación obtenida
Determinación de humedad: de ésta.
La humedad encontrada en la muestra de Concentración
cascarilla de café dio como resultado: Absorbancia.
de glucosa.
0,00 0,000
Humedad del 6.0%
0,04 0,035
La cascarilla de café presenta 0,08 0,110
características de un sustrato que posee 0,12 0,229
baja capacidad de retención de humedad. 0,16 0,388
0,20 0,666
Según (Rodríguez, 2007), la cascarilla de 0,24 0,703
café tiene una humedad entre 11.45 % y 0,28 0,915
11.85 % en base seca y de acuerdo a lo 0,32 1,027
reportado (Orozco S., Cantarero P., & 0,36 1,136
Rodríguez M., 1992), la cascarilla de café 0,40 1,278
tiene un contenido de humedad de 7,6%
en base seca y 92% de materia seca. (Arias
R. & López D., 2016) reportaron que la CURVA PATRÓN.
cascarilla de café tiene una humedad de
8.60 % 0.5
Concentración de glucosa.

0.4 y = 0.2841x + 0.0324

La disimilitud de humedad en los 0.3 R² = 0.9837
diferentes autores y nuestra muestra 0.2
puede deberse a la variedad de café de 0.1
donde proviene el residuo y el tipo de 0
0 0.5 1 1.5
secado que se le dio al grano de café.
Absorbancia.
Determinación del contenido de
celulosa.
A partir de la ecuación fueron conseguidos
La celulosa encontrada en la muestra de los datos de la concentración de azucares
cascarilla de café dio como resultado: reductores para cada una de las diluciones
de enzimas realizadas en la prueba de
Una cantidad de celulosa del 12.35 %
papel filtro.
Luego de esto se escogieron dos datos, que
fueron reemplazados en la ecuación
obtenida de la gráfica, para calcular la
concentración de enzimas necesaria para
liberar 2 mg/ml de glucosa.
Conc. Conc. Glucosa
Enzima
0,01
0,1
Hidrólisis enzimática.
Durante la hidrolisis enzimática, la
celulosa es degradada por diferentes en
enzimas en forma secuencial. El complejo
enzimático Accellerase 1500 genencor
international inc hidroliza la molécula de
celulosa de acuerdo a las siguientes
(g/L) reacciones:
1,77
4,96

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA.
6
concentración glucosa.

5
Curva patrón de glucosa.
4
3 Se obtuvo los siguientes datos de
2 absorbancia para cada una de las
1 diluciones de glucosa.
0
0 0.05 0.1 0.15 Concentración
Absorbancia.
concentración de enzima. de glucosa.
0,00 0,000
Series1 Linear (Series1) 0,04 0,035
0,08 0,110
0,12 0,229
Con la EC. 3 se obtuvo una actividad de la
0,16 0,388
enzima Accellerase 1500 de 23,1 FPU/ml.
0,20 0,666
A comparación con el trabajo realizado 0,24 0,703
por Hader, C., Juan, R., & Jose, Z. (2013). 0,28 0,915
En el cual se alcanzó una actividad 0,32 1,027
enzimática de 13,3FPU/ml. Se puede decir 0,36 1,136
que dicha variación significativa se 0,40 1,278
pudieron dar por las condiciones de Estos datos obtenidos se llevaron a
trabajo dadas para el proceso. graficar para obtener la curva patrón.
Luego es hallada la cantidad de enzima en
ml a utilizar.
𝐹𝑃𝑈
13 ∗ 50 𝑔 = 650 𝐹𝑃𝑈
𝑔
1 𝑚𝑙 → 23,1 𝐹𝑃𝑈
𝑍 → 650 𝐹𝑃𝑈
𝑍 = 28 𝑚𝑙 𝐸𝑛𝑧𝑖𝑚𝑎.
 CURVA PATRÓN. AZÚCARES REDUCTORES
Concentración de glucosa. 0.5 100

[Glucosa]g/L
0.4 y = 0.2841x + 0.0324 80
R² = 0.9837 60
0.3
40
0.2
20
0.1 0
0 0 20 40 60
0 0.5 1 1.5 tiempo
Absorbancia.

En el gráfico se observa como a la medida

Determinación de azucares
que transcurre el tiempo, la glucosa va
reductores en la fermentación:
siendo degradada convirtiéndose gracias a
Los datos obtenidos por el
espectrofotómetro son los siguientes: la levadura en etanol y CO2.

To Absor Absor Absor prom Crecimiento microbiano:

ma bancia bancia bancia edio
. 1 2 3 Se contabilizaron las células que se
1 0,216 0,225 0,194 0,211 encontraron dentro de cada uno de los
2 0,039 0,053 0,021 0,03 cuadros subdividido en 16 recuadros
7 pequeños, en total se contaron 4 cuadros
en cada muestra que se realizó una sola
vez.
Una vez obtenida la absorbancia se
reemplazó en la formula y= ax + b, y se Tiempo (hora) N°
obtuvo el valor de (y) que es la levadura/mol
concentración de glucosa, luego se 16 4,032𝑥106
multiplico por el factor de dilución. Se Por cuestiones adversas no se lograron
graficó (glucosa-tiempo). hacer varios recuentos de Saccharomyces
cerevisiae.
Absorbanci
a (X) tiempo y g/L Curva patrón de etanol:
0,092345
0,211 12 1 92,3451 Se obtuvo los siguientes datos de °Brix
0,042911 para cada una de las diluciones de etanol.
0,037 48 7 42,9117 °Brix (y) % Etanol (x)
0.9 2
1.5 4
2.0 6
2.8 8
3.8 10
4.3 12

Se llevó a graficar estos datos obteniendo

la siguiente curva patrón.
 al final del proceso fue bajo, quizás a causa
CURVA PATRÓN. del corto tiempo de hidrolisis enzimática
5 además que solo fue hidrolizado el 70% de
y = 0.3529x + 0.08 la solución total a fermentar.
4
R² = 0.9887
3 El pretratamiento con ácidos mejora la
°BRIX

hidrolisis de la celulosa razón por la cual

2
elegimos este método de ácido diluido
1 pero a la vez es peligroso, corrosivo dado
0 que requiere de reactores que resistan la
0 5 10 15 corrosión y para la producción de etanol a
ETANOL gran escala es mucho más costoso a
comparación con otros pretratamientos
investigados.
Alcohol probable.
De acuerdo a los resultados obtenidos, se
Los datos obtenidos en las muestras para puede dar certeza que a partir del residuo
la toma de °Brix son los siguientes: lignocelulósico como la cascarilla de café
°Brix. 1 TOMA. 2 TOMA.
se puede obtener bioetanol de segunda
generación y el empleo de sustratos
2.0 1.7
lignocelulósicos para producir etanol
2.0 1.6
combustible constituye un paso de avance
2.1 1.8
en la sustitución de combustibles fósiles
Promedio 2.o 1.7
como fuente de energía.
Con los °Brix obtenidos se pasaron a la
ecuación de alcohol probable y se
obtuvieron los siguientes resultados con BIBLIOGRAFÍA.
respecto a cada °Brix.
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