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Universidad de Granada

Facultad de Farmacia

Departamento de Microbiología

“Caracterización de los exopolisacáridos producidos


por microorganismos halófilos pertenecientes a los
géneros Halomonas, Alteromonas, Idiomarina,
Palleronia y Salipiger”

Juan Antonio Mata Gómez


Tesis Doctoral, 2006
Editor: Editorial de la Universidad de Granada
Autor: Juan Antonio Mata Mata Gómez
D.L.: Gr. 1109 - 2006
ISBN: 84-338-3861-x
Universidad de Granada
Facultad de Farmacia
Departamento de Microbiología

Memoria presentada por el Licenciado en Farmacia


D. Juan Antonio Mata Gómez para aspirar al grado de Doctor

Granada, 2006

VºBº Los directores

Fdo. Dra. Emilia Quesada Arroquia Fdo. Dra. Victoria Béjar Luque
Catedrática de Microbiología Profesora Titular de Microbiología
Facultad de Farmacia Facultad de Farmacia
Universidad de Granada Universidad de Granada

Fdo. Inmaculada Llamas Company


Doctora contratada
Facultad de Farmacia
Universidad de Granada

El Doctorando

Fdo. Juan Antonio Mata Gómez


Esta Tesis Doctoral ha sido subvencionada por las ayudas del Plan Nacional de Biotecnología:

Título: “Taxonomía polifásica de bacterias halófilas productoras de exopolisacáridos”


Investigador principal: Victoria Béjar Luque
Entidad financiadota: CICYT; BOS2000-1519.

Así mismo, durante la realización de la Tesis Doctoral, el doctorando ha disfrutado de una beca de
Formación de Personal Investigador otorgada por el Ministerio de Ciencia y Tecnología.
De la presente Tesis Doctoral se han extraído las siguientes publicaciones y comunicaciones a
congresos:

Publicaciones

Mata, J.A., Béjar, V., Llamas, I., Arias, S., Bressollier, P., Tallon, R., Urdaci, M., Quesada, E.
Characterisation of exopolysaccharides produced by the halophilic bacteria Halomonas ventosae and
Halomonas anticariensis. Res. Microbiol. En prensa.

Comunicaciones a congresos

Martínez-Checa, F., Béjar, V., Llamas, I., Mata, J.A., Quesada, E. Saline habitats provide a source of
bacteria which produce new exopolysaccharides. Biomicroworld. Badajoz 2005.

Mata, J.A., Quesada, E., Molina, I. Actividad antiproliferativa sobre células T de EPS sulfatados
producidos por microorganismos halófilos moderados. XXXI Congreso de la Sociedad Española de
Inmunología. Córdoba 2005.

Béjar, V., Mata, J.A., Llamas, I., Quesada, E. Characterization of fucose-rich polysaccharides produced by
nd
three halophilic bacteria. FEMS 2006. 2 Congress of European Microbiologist. Madrid 2006.
AGRADECIMIENTOS 

Una vez llegados a este punto, no puedo más que dedicar mi más sincero agradecimiento a todas 

las personas que me han permitido llegar hasta aquí, a toda la buena gente que me ha rodeado durante 

estos años, a todos los que me hacéis sentir afortunado y feliz. 

En  primer  lugar,  quiero  dar  gracias  a  mis  directoras  de  Tesis,  la  Dra.  Emilia  Quesada,  la  Dra. 

Victoria  Béjar  y  la  Dra.  Inmaculada  Llamas,  por  todo  el  tiempo  que  han  invertido  en  mí,  por  todo  el 

esfuerzo  que  han  dedicado  a este  trabajo.  Emilia  y  Victoria,  sois  dos  personas  excepcionales,  científica  y 

personalmente  hablando;  gracias  por  vuestra  comprensión  todos  estos  años,  parafraseando  a  mi  amigo 

Páez,  este  trabajo  ha  salido  adelante  gracias  a  vosotras  y  a  pesar  de  mí.  Inma,  no  tengo  palabras  para 

agradecerte todo lo que has hecho por mí en los últimos meses; sin tu aliento y sin tus conocimientos todo 

habría  sido  un  poco  más  complicado.  Mil  gracias,  de  corazón.  Eres  una  máquina,  y  tendrás  pronto  tu 

recompensa, seguro; yo estaré allí para celebrarlo contigo. 

  

A mis otras “jefas”, la Dra. Ana del Moral y la Dra. Marita Ferrer; cada una a vuestra manera, con 

vuestro propio estilo, habéis sido un ejemplo para mí. 

Continuando  el  repaso  mental  al  Departamento,  llego  al  laboratorio  de  Exopolisacáridos 

Microbianos,  lleno  de  gente  maravillosa  que,  por  supuesto,  no  son  sólo  compañeros  de  trabajo,  son 

amigos, y de los buenos. Gracias a Fernando, por facilitarme siempre que lo he necesitado las cosas…con 

la informática, con la Taxonomía, con el coche…Ánimo, en poco tiempo alcanzarás tus objetivos, ya verás; 

espero que  pronto Elenita tenga un hermanito…A Carmen María, futura Ministra; no dejes la Tesis (je, je), 

que falta muy poco, sin darte cuenta en breve te verás en estos menesteres, no hay duda. Mientras sigue 

disfrutando de la Taxonomía, de las visitas fuera de horario, del wok, de tus salidas los Jueves…has sido 

una gran compi de labo, hemos pasado muy buenos momentos juntos, así que gracias por todo, eres un 

primor. 

No puedo olvidarme de todos los que estuvieron en el laboratorio, y me precedieron en el duro 

paso de asomar la cabeza en el mundo real una vez terminada la Tesis; a Samir, mi primer jefe; gracias por 

tus consejos, espero que nos sigas visitando de vez en cuando. A María José, nuestra murcianica, que me 

acogió  como  pupilo  durante  la  Tesina,  compartimos  mucho  durante  esas  horas  en  las  que  poníamos 

tapones  de  algodón  a  los  tubitos,  gracias  por  recibirme  en  todo  momento  con  una  sonrisa.  A  Paquita, 
siempre  hemos  tenido  un  feeling  especial,  gracias  por  todo  tu  apoyo  desde  el  Instituto  del  Agua.  A 

Cristina,  con  la  que  también  sufrí  los  rigores  de  las  pruebas  fenotípicas,  y  a  Montse,  que  continúa  su 

vocación  genética  en  Sevilla.  Un  recuerdo  especial  para  los  que  habéis  abandonado  el  nido  más 

recientemente; muchas gracias a Yolanda, con la que tanto he compartido y con la que tanto me he reído, 

suerte  también  en  tu  etapa  de  reencuentro  con  el  estudio,  pronto  mis  impuestos  financiarán  una  nueva 

funcionaria; espero visitar pronto Antequera…como dirían en Un, Dos, Tres, tarjetita por aquí, hasta ahí 

puedo  leer…Mil  gracias  a  Rafa  Páez,  “polisacarídico”  como  un  servidor,  compañero  de  conciertos  de 

música  Indie,  y  que  también  parece  que  se  ha  apuntado  a  la  moda  de  cobrar  del  Estado…siempre  supe 

que  eras  un  tío  listo…Insisto,  mil  gracias  por  todo,  suerte  en  tu  inminente  matrimonio.  Mi  más  sincero 

agradecimiento  a  Sole,  mi  “comae”;  podría  escribir  páginas  y  páginas  recordando  mil  detalles,  tanto 

profesionales como personales, pero aguantaré la tentación; sólo gracias por estar ahí, bien sabes todo lo 

que te debo, no hace falta dejarlo patente por escrito; no te preocupes que de vez en cuando me presentaré 

en  Bordeaux  para  visitarte,  no  te  librarás  de  mí  tan  fácilmente…el  23  de  Septiembre  disfrutaré  como  un 

enano viéndote feliz en San Pedro… 

Gracias  también  a  todos  los  que  han  formado  parte  de  nuestro  grupo:  Juan  Ignacio,  María  José 

Sánchez,  Jose  Manuel,  Jorge,  Mª  Carmen,  Tesi,  Manolo  (gracias  por  el  descubrimiento  de  Piñar),  Asun, 

Carmen  Bosch,  Patricia  (suerte  en  tu  nueva  etapa  de  residente),  y  por  supuesto  también  a  las  nuevas 

adquisiciones, Eutimio, nuevo aprendiz de Fernando, y Jose, por participar de forma activa en algunos de 

los resultados obtenidos en este trabajo. 

Fuera ya de las cuatro paredes de nuestro laboratorio, muchas gracias a todos los compañeros del 

Departamento, presentes y pasados: Virginia, Bea, Elena, Carmen, Quico, Paco, Mathias, Araceli, Esteban, 

Jose Romera, Belén, Laura, Cathy, Victor, Marga, Rafa, Jose Antonio (espero que termines pronto, ánimo), 

Tere Quesada, Tere Cuerda, Susana, Raquel Ferrer, Piru, Ana y María. Un recuerdo muy especial para la 

pequeña  Magdalena,  gracias  por  todo  lo  bueno  que  hemos  compartido  dentro  y  fuera  del  laboratorio, 

gracias  por  todas  las  salidas  autodestructivas,  gracias  por  ser  como  eres,  suerte  en  todo  lo  que  te 

propongas. Mi profunda gratitud a Lourdes y a Gloria, el miembro más entrañable de esta gran familia. A 

todos los profesores del Departamento por el interés mostrado, en especial a José Martínez y Teresa de la 

Rubia, por dejarme utilizar vuestro FPLC, y por interesaros por mí en todo momento. 

Gracias  a  todos  los  compañeros  del  Departamento  de  Bioquímica,  en  especial  a  Rafael  Salto  y 

Loles Girón, por vuestro interés, vuestro ánimo, y por la centrífuga. A Jesús Porres, del Departamento de 
Fisiología,  por ayudarme  en  la  determinación  del contenido  en  cenizas  de  los  exopolisacáridos,  y  por tu 

simpatía  y  apoyo.  A  todo  el  personal  del  Centro  de  Instrumentación  de  la  Universidad  de  Granada,  en 

especial Juan Moliz por la determinación del contenido en sulfatos y fosfatos, Bendi, por la celeridad en 

realizar  los  ensayos  de  captación  de  metales  pesados,  y  a  Conchi,  David  y  Ambrosio  por  las  fotos  de 

microscopía electrónica. Al Dr. Trout, nuestro corrector de publicaciones, por su paciencia y dedicación.  

A toda la Unidad de Inmunología de la Facultad de Medicina de la Universidad de Granada, mil 

gracias. A Ignacio por permitirme trabajar en su laboratorio unos meses, y por introducirme en un mundo 

que  me  ha  fascinado.  A  Mª  Carmen  y  Enrique,  los  otros  jefes  inmunólogos,  por  su  trato  cordial,  y  por 

interesarse en todo momento por el microbiólogo. A todos los doctorandos, Irene, Raquel, Osmany, Bea, 

Miguel, Zulema, Guirish, y en especial, a JuanDi, no solo compañero de laboratorio. 

A  la  Dra.  María  C.  Urdaci  del  Departamento  de  Microbiologie  et  Biochimie  Appliquée  de  la 

ENITA de Bordeaux, por acogerme en su laboratorio, y por intentar en todo momento que mi estancia en 

sus instalaciones fuera lo más agradable posible; gracias por preocuparte por los derroteros que tomaba mi 

vida durante esos meses, a pesar de que no fuera agradable. A Richard Tallon, mi escudero durante ese 

tiempo, por explicarme todas las técnicas, por estar pendiente de mí, por hacer de paño de lágrimas, por 

todo. Todavía te debo unas cuantas Alambra 1925 para pagar todo lo que hiciste por mí; suerte en EEUU. 

A Muriel, Benoît y Anne‐Marie, por su agradable compañía. A Phillipe Bressollier, del Departamento de 

Biologie Appliquée del INSTITUT UNIVERSITAIRE DE TECHNOLOGIE de Limoges, el Salvador Dalí de 

la cromatografía, parte activa de este trabajo, un gran bioquímico y una mejor persona. A Caroline, a pesar 

de todo. 

Al margen del ámbito científico, son muchas las personas a las que tengo bastante que agradecer, 

empezando por mi familia. Papá, mamá, no tuvisteis la oportunidad de estudiar; ahora, gracias a vosotros, 

aspiro al más alto grado académico que otorga la Universidad, y es gracias a vuestro apoyo. Mil gracias, os 

quiero.  A  mi  hermana  Maribel,  la  mejor  abogada  penalista  del  mundo  mundial  (con  permiso  del  clan 

Ceres),  y  a  mi  hermana  pequeña  Susana,  que  lleva  la  vocación  de  la  educación  en  las  venas,  y  que 

comparte conmigo la ansiedad/ilusión de haber adquirido un mini piso, gesto valiente en los tiempos que 

corren. También gracias a Raúl, que en todo momento ha mostrado mucho interés por mi Tesis. A Richi, la 

alegría de la casa, el perro más bonito y más coñacete que nadie podría imaginar. 

 
Gracias  a  mis amigos,  a  los de  Farmacia,  y  a  los de los  Maristas.  Si  la  riqueza  de  un  hombre  se 

mide  por  la  calidad  de  sus  amigos,  yo  debo  ser  más  rico  que  el  más  rico  de  los  jeques  árabes  de  este 

mundo.  

Gracias  a  Luis  y  Curra,  que  ahora  comparten  su  vida  y  sus  ilusiones  en  Boston,  a  Rafita, 

compañero  de  carrera,  de  fiestas  y  de  laboratorio,  y  a  Sophie,  suerte  en  vuestra  aventura  belga,  no  os 

olvidéis  de  nosotros,  volved  pronto  a  la  madre  patria,  os  esperamos.  Gracias  a  Alberto  Lamenca  y  Ana 

Rosa, siempre os estaré agradecido por la boda que nos regalasteis, inolvidable. Gracias a Edu, que casi es 

un miembro más de nuestro laboratorio, ánimo, ya te queda muy poco, vales mucho. A Carlos, suerte con 

tu bebito, todavía tenemos que tomarnos unas copas para contarnos la vida. Gracias también a Chemari, el 

más listo de la clase, que ya hacía negocios cuando nuestra única preocupación era pegarnos una buena 

fiesta. Gracias a Asier y Paco, que ahora continúan su formación con los hijos de la Gran Bretaña, por las 

fiestas, las risas, por todo. 

Mil  gracias  a  Alberto,  Goretti,  Jose,  Amelia,  Antonio,  Javi,  Sonsoles,  José  Tuno,  Ainhoa,  Nacho, 

María  del  Mar,  Carlos,  Elvira,  Ismael,  María,  Alfonso,  Eugenia,  Patricia,  Edu,  Ángela,  Silverio,  Carolina, 

Inma, Nela, Susana, Cristina, Antonio, Aurea, Vicky, Pablo, Ángela, Miguel, Antonio Jesús y a cualquier 

otro  que  se  me  pueda  olvidar,  que  somos  el  ciento  y  la  madre.  Ya  quisiera  mucha  gente  un  grupo  de 

amigos de esta calidad a estas alturas de la vida; espero que siempre sigamos así de unidos, aunque los 

churumbeles  nos  van  quitando  un  poco  de  tiempo  a  más  de  uno.  A  toda  la  gente  de  los  Grupos  de 

Amistad  y  los  Grupos  de  Vida  Cristiana,  en  especial  a  mis  niños,  y  a  José  Carlos,  José  Luis,  Antonio 

Quintanal,  José  Manuel,  Juan  Pablo  y  JuanVi.  Me  habéis  hecho  mejor  persona.  El  destino  quiso  que  mis 

padres no me dieran hermanos, aunque luego la vida se encargó de ponerlos en mi camino. Mil gracias a 

Pepito, Alberto, y Yul; me quito el sombrero ante vosotros, no tengo palabras, es más, las palabras sobran, 

os quiero hermanos. 

Por último mil millones de gracias a Belén, mi niña, que después de todo lo que me ha pasado, se 

ha encargado en el último año y pico de volver a llenar mi vida de esperanza e ilusiones; a ti especialmente 

dedico este trabajo, también es tuyo, eres lo mejor que me ha pasado en esta vida, no cambies nunca. 

A TODOS, MIL GRACIAS, OS QUIERO. 

 
 

A Belén
A mi familia
A todos los que me han ayudado a llegar hasta aquí
INTRODUCCIÓN

1. Microorganismos halófilos 1
1.1. Ambientes salinos. Generalidades 1
1.2. Clasificación de los microorganismos según sus requerimientos salinos 2
1.3. Adaptación de los microorganismos a los ambientes salinos 3
a) Osmoadaptación 3
b) Modificación en la morfología celular y estructura 7
1.4. Taxonomía de los microorganismos halófilos 8
a) Taxonomía de las arqueas halófilas 8
b) Taxonomía de las bacterias halófilas 9

2. Los polisacáridos
2.1. Polisacáridos vegetales 12
2.2. Polisacáridos de algas marinas 13
2.3. Polisacáridos microbianos 14

3. Exopolisacáridos microbianos 16
3.1. Concepto de exopolisacárido 16
3.2. Funciones biológicas 17
3.3. Composición química 21
3.3.1. Carbohidratos 21
3.3.2. Sustituyentes orgánicos 22
3.3.3. Sustituyentes inorgánicos 23
3.4. Estructura 25
3.4.1. Homopolisacáridos 25
3.4.2. Heteropolisacáridos 27
3.5. Conformación molecular 31
3.6. Biosíntesis de los exopolisacáridos 32
3.7. Genética de los exopolisacáridos 34
3.8. Ingeniería genética aplicada a la mejora de cepas productoras de exopolisacáridos 37
3.9. Propiedades físicas 40
3.9.1. Masa molecular 40
3.9.2. Actividad emulgente 41
3.9.3. Propiedades reológicas 43
3.9.4. Formación de geles 47
3.9.5. Captación de metales pesados 51
3.10. Relación entre la composición/estructura química y propiedades físicas 52
3.11. Producción de exopolisacáridos microbianos 53
3.11.1. Fermentación industrial 53
3.11.2. Recuperación 54
3.11.3. Factores determinantes en la producción 55
3.11.4. Influencia de las condiciones de cultivo sobre la masa molecular 62
3.12. Aplicaciones de los exopolisacáridos microbianos 63
3.12.1. Industria alimentaria 64
3.12.2. Industria farmacéutica y medicina 66
3.12.3. Aplicaciones en la industria cosmética 68
3.12.4. Exopolisacáridos microbianos como fuente de L-fucosa 69
3.12.5 Otras aplicaciones 70

OBJETIVOS 73

MATERIAL Y MÉTODOS 77
1. Cepas bacterianas 77
2. Mantenimiento de las cepas 77
3. Estudio filogenético de las cepas 79
4. Proceso de extracción de los EPS 79
5. Optimización de la producción de los EPS 81
5.1. Tiempo de incubación 81
5.2. Concentración de sales 81
5.3. Fuente de Carbono y Nitrógeno 81
5.4. Concentración de la fuente de Carbono 82
5.5. Temperatura 82
5.6. Agitación 82
6. Composición química de los exopolisacáridos 82
6.1. Análisis colorimétricos 83
6.2. Determinación del contenido en cenizas 83
6.3. Purificación de los exopolisacáridos 87
6.3.1. Determinación del contenido en sulfatos y fosfatos 87
6.3.2. Análisis de los monosacáridos constituyentes de los EPS 88
7. Determinación de la masa molecular 88
8. Estudios de microscopía electrónica 88
9. Propiedades físicas de los exopolisacáridos 89
9.1. Propiedades reológicas 89
9.1.1. Viscosidad de las preparaciones acuosas 89
9.1.2. Factores que influyen en la viscosidad de las preparaciones acuosas del
exopolisacárido producido por la cepa B100 de Halomonas maura 89
9.1.3. Características reológicas de las preparaciones acuosas del exopolisacárido
producido por la cepa B100 de Halomonas maura 91
9.1.4. Efecto sinérgico del exopolisacárido producido por la cepa B100 de Halomonas
maura con otros agentes viscosizantes 93
9.2. Propiedades emulgentes 93
9.2.1. Controles 93
9.2.2. Actividad emulgente 94
9.2.3. Determinación del poder tensioactivo 94
9.2.4. Grado de dispersión 95
9.2.5. Desproteinización de los exopolisacáridos 95
9.2.6. Electroforesis de proteínas 95
9.3. Captación de metales pesados 96
10. Actividad antiproliferativa sobre células hematopoyéticas de exopolisacáridos microbianos 97
sulfatados
10.1. Desulfatación de los EPS 97
10.2. Sulfatación de los EPS 98
10.3 Cultivos celulares 98
10.4. Test de proliferación celular 98
11. Estudio de la participación de los EPS en la formación de biofilms 99
11.1. Cuantificación de la formación de biofilms mediante tinción con cristal violeta 99
11.2. Microscopía electrónica de barrido 100
11.3. Obtención de mutantes deficientes en la síntesis de EPS 100
a) Protocolo de mutagénesis insercional con el transposón mini-Tn5 Km2 100
b) Mutagénesis dirigida 107

RESULTADOS Y DISCUSIÓN 109

SECCIÓN I. ESTUDIO FILOGENÉTICO DE LAS CEPAS 113

SECCIÓN II. CARACTERIZACIÓN DE LOS EPS 119

Capítulo 1. Optimización de la producción de los exopolisacáridos 121


Tiempo de incubación 122
Concentración de sales 131
Fuente de carbono y nitrógeno 139
Concentración de la fuente de carbono 147
Temperatura de incubación y agitación de los cultivos 156
Capítulo 2. Composición química y masa molecular de los exopolisacáridos 159
2.1. Análisis colorimétricos de los exopolisacáridos obtenidos en condiciones de cultivo
óptimas. Determinación de cenizas 160
2.2. Purificación por cromatografía de intercambio aniónico 162
2.3. sulfatos y fosfatos 164
2.4. Monosacáridos constituyentes de los EPS 166
2.5. Determinación de la masa molecular 168
Capítulo 3. Estudios de microscopía electrónica 171

SECCIÓN III. POTENCIALES APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LOS EPS 179

Capítulo 1. Propiedades reológicas de los exopolisacáridos 181


1.1. Viscosidad de las preparaciones acuosas de los exopolisacáridos 183
1.2. Factores que influyen en la viscosidad del polímero B100 184
1.3. Características reológicas de las preparaciones acuosas del polímero B100 191
Pseudoplasticidad 191
Tixotropía 193
1.4. Estudio de las propiedades viscoelásticas del polímero B100. Ensayos de oscilación 194
1.5. Efecto sinérgico con otros agentes viscosizantes 199

Capítulo 2. Estudio de las propiedades emulgentes de los exopolisacáridos 203


2.1. Actividad emulgente 204
2.2. Poder tensioactivo 213
2. 3. Desproteinización de los exopolisacáridos Al12 y Al16. Electroforesis de proteínas 214
Capítulo 3. Estudio de la captación de metales pesados 217
Capítulo 4. Actividad antiproliferativa sobre células tumorales de EPS sulfatados 223
4.1. Desulfatación e hipersulfatación de los exopolisacáridos 225
4.2. Actividad antiproliferativa sobre células hematopoyéticas de los exopolisacáridos con
distinto grado de sulfatación 226
Capítulo 5. Exopolisacáridos microbianos como fuente de L-fucosa 237

SECCIÓN IV. FUNCIONES FISIOLÓGICAS DE LOS EPS 241

Capítulo 1. Estudio de la participación de los EPS en la formación de biofilms 243


1.1. Tinción con cristal violeta 246
1.2. Obtención de mutantes deficientes en la síntesis de EPS: participación de los
exopolisacáridos en la estructura de los biofilms 248

CONCLUSIONES 255

BIBLIOGRAFÍA 259
ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1. Mar Muerto (A) y Gran Lago Salado (B). 1


Figura 2. Movimiento de iones en las arqueas aerobias halófilas de la familia Halobacteriaceae 4
Figura 3. Algunos solutos compatibles encontrados en los microorganismos halófilos y
halotolerantes 5
Figura 4. Fotografía de microscopía electrónica de bacterias productoras de EPS en un biofilm 18
Figura 5. Celulosa sintasa 25
Figura 6. Estructura de los dextranos 26
Figura 7. Estructura química del xantano 28
Figura 8. Molécula del gelano 29
Figura 9. Distintos tipos de conformación molecular de los exopolisacáridos microbianos. (A)
Laminar, (B) doble hélice y (C) triple hélice 32
Figura 10. Etapas generales de la biosíntesis de exopolisacáridos, cápsulas y lipopolisacáridos
en bacterias Gram negativas. 33
Figura 11. Clúster de genes gumB-M de Xanthomonas campestris 36
Figura 12. Biosíntesis del gelano 38
Figura 13. Reogramas de los principales tipos de fluídos en función de su comportamiento
reológico 44
Figura 14. L-fucosa. 69
Figura 15. Unidad repetitiva del clavano 69
Figura 16. Salinas de Asilah, al Norte de Marruecos, y humedal de Rambla Salada, en Murcia 77
Figura 17. Aspecto de las colonias de Halomonas maura B100 tras 48 horas de la siembra en
medio MY sólido al 7,5% (p/v) de sales 78
Figura 18. Proceso de extracción del EPS 80
Figura 19: Reómetro Bohlin CSR-10 y detalle del sistema de medida para pequeñas muestras 89
Figura 20. Fotografía de una placa microtitter empleada en la cuantificación de la formación de
biofilms 99
Figura 21. Plásmido pUT portador del transposón mini-Tn5Km2. 102
Figura 22. Esquema del protocolo de mitagénesis insercional 103
Figura 23. Construcción del mutante X2 epsA::lacZ 108
Figura 24. Relaciones filogenéticas entre las cepas M4, X8, X2, B40, B100, N12, A16 y otras
cepas pertenecientes al género Halomonas. 117
Figura 25. Relaciones filogenéticas entre la cepa B35 y otras cepas pertenecientes a los géneros
Idiomarina, Alteromonas y otros géneros relacionados de la clase γ-Proteobacteria. 118
Figura 26. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de H. maura X2 y sobre la
producción de EPS 123
Figura 27. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de H. maura B40 y sobre la
producción de EPS 123
Figura 28. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de H. maura B100 y sobre la 123
producción de EPS
Figura 29. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de H. maura N12 y sobre la
producción de EPS 124
Figura 30. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de H. maura A16 y sobre la
producción de EPS 124
Figura 31. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de H. eurihalina M4 y sobre la
producción de EPS 124
Figura 32. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de H. eurihalina X8 y sobre la
producción de EPS 125
T
Figura 33. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de H. ventosae Al12 y sobre la
producción de EPS 125
Figura 34. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de H. ventosae Al15 y sobre la
producción de EPS 125
Figura 35. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de H. ventosae Al16 y sobre la
producción de EPS 126
Figura 36. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de H. anticariensis FP35T y
sobre la producción de EPS. 126
Figura 37. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de H. anticariensis FP34 y sobre
la producción de EPS 126
Figura 38. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de H. anticariensis FP36 y sobre
la producción de EPS 127
Figura 39. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de H. almeriensis M8T y sobre la
producción de EPS 127
T
Figura 40. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de S. mucosus A3 y sobre la
producción de EPS 127
Figura 41. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de P. marisminoris B33T y sobre
la producción de EPS 128
Figura 42. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de I. fontislapidosi F23T y sobre
la producción de EPS 128
Figura 43. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de I. ramblicola R22T y sobre la
producción de EPS 128
Figura 44. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de A. hispanica F32T y sobre la
producción de EPS 129
Figura 45. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de A. hispanica B35 y sobre la
producción de EPS 129
Figura 46. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular
en H. maura X2 132
Figura 47. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular
en H. maura B40 132
Figura 48. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular
en H. maura B100 132
Figura 49. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular
en H. maura N12 133
Figura 50. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular
en H. maura A16 133
Figura 51. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular
en H. eurihalina M4 133
Figura 52. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular
en H. eurihalina X8 134
Figura 53. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular
en H. ventosae Al12T. 134
Figura 54. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular
en H. ventosae Al15 134
Figura 55. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular
en H. ventosae Al16 135
Figura 56. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular
T
en H. anticariensis FP35 . 135
Figura 57. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular
en H. anticariensis FP34 135
Figura 58. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular
en H. anticariensis FP36 136
Figura 59. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular
T
en H. almeriensis M8 136
Figura 60. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular
en S. mucosus A3T 136
Figura 61. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular
T
en P. marisminoris B33 137
Figura 62. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular
en I. fontislapidosi F23T 137
Figura 63. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular
en I. ramblicola R22T 137
Figura 64. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular
en A. hispanica F32T 138
Figura 65. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular
en A. hispanica B35 138
Figura 66. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en H.maura X2 140
Figura 67. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en H. maura B40 140
Figura 68. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en Halomonas maura B100 140
Figura 69. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en Halomonas maura N12 141
Figura 70. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en Halomonas maura A16 141
Figura 71. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en Halomonas eurihalina M4 141
Figura 72. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en Halomonas eurihalina X8 142
Figura 73. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en Halomonas ventosae Al12T 142
Figura 74. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en Halomonas ventosae Al15 142
Figura 75. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en Halomonas ventosae Al16 143
Figura 76. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en Halomonas anticariensis FP35T 143
Figura 77. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en Halomonas anticariensis FP34 143
Figura 78. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en Halomonas anticariensis FP36 144
Figura 79. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en Halomonas almeriensis M8T 144
Figura 80. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en Salipiger mucosus A3T 144
Figura 81. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en Palleronia marisminoris B33T 145
Figura 82. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en Idiomarina fontislapidosi F23T 145
Figura 83. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en Idiomarina ramblicola R22T. 145
Figura 84. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en Alteromonas hispanica F32T 146
Figura 85. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en Alteromonas hispanica B35 146
Figura 86. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en Halomonas maura X2. 148
Figura 87. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en H. maura B40 148
Figura 88. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en H. maura B100 148
Figura 89. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en H. maura N12 149
Figura 90. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en H. maura A16 149
Figura 91. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en H. eurihalina M4 149
Figura 92. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en H. eurihalina X8. 150
Figura 93. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en H. ventosae Al12T 150
Figura 94. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en H. ventosae Al15 150
Figura 95. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en H. ventosae Al16 151
Figura 96. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en H. anticariensis FP35T 151
Figura 97. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en H. anticariensis FP34 151
Figura 98. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en H. anticariensis FP36 152
Figura 99. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en H. almeriensis M8T 152
Figura 100. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en Salipiger mucosus A3T 152
Figura 101. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa
T
celular en Palleronia marisminoris B33 153
Figura 102. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en Idiomarina fontislapidosi F23T 153
Figura 103. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en I. ramblicola R22T 153
Figura 104. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa
T
celular en Alteromonas hispanica F32 154
Figura 105. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa
celular en A. hispanica B35 154
Figura 106. Cromatogramas obtenidos en la purificación de los exopolisacáridos Al15 de
Halomonas ventosae, M8 de Halomonas almeriensis, F23 de Idiomarina fontislapidosi y R22 de
Idiomarina ramblicola, a un gradiente de elución de 0-1,5 M de NaCl 163
Figura 107. Fotografías de microscopía electrónica de transmisión de la cepa B100 de
Halomonas maura en medio MY líquido al 7,5% (p/v) de sales tras incubación durante 18-24 (A)
y 120 horas (B) 172
Figura 108. Fotografía de microscopía electrónica de transmisión de la cepa M4 de Halomonas
eurihalina en medio MY líquido al 7,5% (p/v) de sales tras una incubación de 18-24 horas 172
Figura 109. Fotografías de microscopía electrónica de transmisión de la cepa Al12T de
Halomonas ventosae en medio MY líquido al 7,5% (p/v) de sales tras incubación durante 18-24
(A) y 120 horas (B) 173
T
Figura 110. Fotografías de microscopía electrónica de transmisión de la cepa FP35 de
Halomonas anticariensis en medio MY líquido al 7,5% (p/v) de sales tras incubación durante 18-
24 (A) y 120 horas (B) 173
Figura 111. Fotografías de microscopía electrónica de transmisión de la cepa M8T de
Halomonas almeriensis en medio MY líquido al 7,5% (p/v) de sales tras incubación durante 18-
24 (A) y 120 horas (B) 173
T
Figura 112. Fotografía de microscopía electrónica de transmisión de la cepa A3 de Salipiger
mucosus en medio MY líquido al 7,5% (p/v) de sales tras una incubación de 18-24 horas 174
T
Figura 113. Fotografías de microscopía electrónica de transmisión de la cepa B33 de Palleronia
marisminoris en medio MY líquido al 7,5% (p/v) de sales tras incubación durante 18-24 (A) y 120
horas (B) 174
Figura 114. Fotografías de microscopía electrónica de transmisión de la cepa F23T de
Idiomarina fontislapidosi en medio MY líquido al 7,5% (p/v) de sales tras incubación durante 18-
24 (A) y 120 horas (B) 175
T
Figura 115. Fotografías de microscopía electrónica de transmisión de la cepa R22 de
Idiomarina ramblicola en medio MY líquido al 7,5% (p/v) de sales tras incubación durante 18-24
(A) y 120 horas (B) 175
T
Figura 116. Fotografía de microscopía electrónica de transmisión de la cepa F32 de
Alteromonas hispanica en medio MY líquido al 7,5% (p/v) de sales tras una incubación de 18-24
horas 176
Figura 117. Fotografía de microscopía electrónica de una solución acuosa al 1% (p/v) de
polímero B100 de Halomonas maura 177
Figura 118. Viscosidad de las preparaciones acuosas al 0,5% (p/v) de los polímeros objeto de
estudio a un gradiente de deformación de 59,5 s-1. 183
Figura 119. Efecto de la concentración del EPS B100 de H. maura sobre la viscosidad de sus
preparaciones acuosas 184
Figura 120. Efecto de la temperatura (25, 35, 45 y 55ºC) sobre la viscosidad de soluciones al
0,5% (p/v) del exopolisacárido B100 de H. maura 185
Figura 121. Efecto de la temperatura sobre la viscosidad de las soluciones al 0,5% (p/v) del EPS
B100 186
Figura 122. Recuperación que experimenta la viscosidad de las soluciones al 0,5% (p/v) del EPS
B100 de H. maura tras enfriamiento a 25ºC (E25) y 4ºC (E4), a un gradiente de deformación de
59,5 s-1 186
Figura 123. Efecto del pH sobre la viscosidad de soluciones al 0,5% (p/v) del exopolisacárido
B100 de H. maura a un esfuerzo de cizalla de 3 Pa 188
Figura 124. Viscosidad de preparaciones al 0,5% (p/v) del polímero B100 en agua destilada
adicionadas con distintas cantidades de NaCl 189
Figura 125. Evolución de la viscosidad de soluciones al 0,5% (p/v) del exopolisacárido B100 de
H. maura en un ciclo de gradiente de deformación creciente (90 s-1) y decreciente (3 s-1) 193
Figura 126. Ensayo de “stress sweep”. Evolución del módulo elástico (G´) y modulo viscoso
(G´´) de una solución al 1% (p/v) de polisacárido B100 de H. maura en un intervalo de esfuerzo
de cizalla de 0,1-20 Pa a una frecuencia de 1 Hz 195
Figura 127. Espectro mecánico de soluciones al 1 y 1,5 % (p/v) del polímero B100 de H. maura
en un intervalo de frecuencia 0,01 -20 Hz y a un esfuerzo de cizalla de 6 Pa 195
Figura 128. Espectro mecánico de soluciones al 1 y 1,5% (p/v) del polímero B100 adicionadas
con 0,1M NaCl en un intervalo de frecuencia 0,007-20 Hz a una esfuerzo de cizalla de 6 Pa 196
Figura 129. Espectro mecánico de soluciones al 1% (p/v) de maurano a temperaturas de 25, 45 y
70ºC en un intervalo de frecuencia 0,007-20 Hz a un esfuerzo de cizalla de 6 Pa 198
Figura 130. Viscosidad de soluciones al 0,5% (p/v) de polímero B100 (B100), goma guar (GG) y
las mezclas B100/GG a un gradiente de deformación de 2 s-1 199
Figura 131. Viscosidad de soluciones al 0,5% (p/v) de polímero B100 (B100), carragentato (C) y
las mezclas B100/C a un gradiente de deformación de 85 s-1 200
Figura 132. Viscosidad de soluciones al 0,5% (p/v) de polímero B100 (B100),
hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) y las mezclas B100/HPMC a un gradiente de deformación de
-1
85 s 200
Figura 133. Viscosidad de soluciones al 0,5% (p/v) de polímero B100 (B100), pectina (P) y las
mezclas B100/P a un gradiente de deformación de 10 s-1 200
Figura 134. Viscosidad de soluciones al 0,5% (p/v) de polímero B100 (B100), goma de Plantago
Ovata (PO) y las mezclas B100/PO a un gradiente de deformación de 30 s-1 201
Figura 135. Emulsión aceite de oliva-agua (A) y keroseno-agua (B) estabilizada por el EPS B100
de Halomonas maura 212
Figura 136. Emulsión estabilizada por el EPS M4 utilizando keroseno 213
Figura 137. SDS-PAGE de los exopolisacáridos en estado nativo y tras ser sometidos a
T
desproteinización por el método del fenol caliente (Apo-EPS) producidos por las cepas Al12 y
Al16 de Halomonas ventosae 216
Figura 138. Sulfatación de polisacáridos con el complejo piridina-SO3 225
Figura 139. Test de proliferación celular empleando MTT 226
Figura 140. Efecto sobre la proliferación de células Jurkat de los EPS de Halomonas
anticariensis FP34 227
Figura 141. Efecto sobre la proliferación de células CEM de los EPS de Halomonas anticariensis
FP34 227
Figura 142. Efecto sobre la proliferación de células HEL de los EPS de Halomonas anticariensis
FP34 228
Figura 143. Efecto sobre la proliferación de células Jurkat de los EPS de Halomonas maura
B100 228
Figura 144. Efecto sobre la proliferación de células CEM de los EPS de Halomonas maura B100 229
Figura 145. Efecto sobre la proliferación de células HEL de los EPS de Halomonas maura B100 229
Figura 146. Efecto sobre la proliferación de células Jurkat de los EPS de Halomonas maura N12 230
Figura 147. Efecto sobre la proliferación de células CEM de los EPS de Halomonas maura N12 230
Figura 148. Efecto sobre la proliferación de células HEL de los EPS de Halomonas maura N12 231
Figura 149. Influencia de los grupos sulfato en la actividad antiproliferativa del EPS FP34 de
Halomonas anticariensis, tras 72 horas de incubación, a una concentración de 500 µg/ml 231
Figura 150. Influencia de los grupos sulfato en la actividad antiproliferativa del EPS B100 de
Halomonas maura, tras 72 horas de incubación, a una concentración de 500 µg/ml 232
Figura 151. Influencia de los grupos sulfato en la actividad antiproliferativa del EPS N12 de
Halomonas maura, tras 72 horas de incubación, a una concentración de 500 µg/ml 232
Figura 152. Esquema mostrando las etapas en el proceso de formación del biofilm 244
Figura 153. Formación de biofilms a las 16, 24, 40 y 48 horas de incubación en medio MY al 5%
(p/v) de sales 246
Figura 154. Formación de biofilms en medio MY al 3, 5, 7,5 y 10% (p/v) de sales tras 40 horas
de incubación 247
Figura 155. Formación de biofilms en medio MY al 5% (p/v) de sales y medio Koser al 5% (p/v)
de NaCl tras 40 horas de incubación 247
Figura 156. Fotografía del crecimiento de Halomonas eurihalina TK95 (A), mostrando su
fenotipo colonial liso, y Halomonas eurihalina M4 (B) en medio sólido MY 7,5% (p/v) de sales tras
3 días de incubación a 32ºC 249
Figura 157. Comprobación de la recombinación del gen epsA::lacZ-pVIK112 en Halomonas
maura X2 por PCR 250
Figura 158. Fotografía del crecimiento de Halomonas maura X2 (A) y Halomonas maura X2
epsA::lacZ, mostrando su fenotipo colonial liso, en medio sólido MY 7,5% (p/v) de sales tras 3
días de incubación a 32ºC 251
Figura 159. Formación de biofilms por las cepas X2 y X2 epsA::lacZ de Halomonas maura y M4
y TK95 de Halomonas eurihalina en medio MY 5% (p/v) de sales, tras 40 horas de incubación 252
Figura 160. Microfotografías electrónicas de barrido de Halomonas maura X2 (A) y Halomonas
eurihalina M4 (B) 252
Figura 161. Microfotografías electrónicas de barrido en las que se muestra la formación de
microcolonias por Halomonas maura cepa X2 (A) y el mutante deficiente en la síntesis de EPS
X2 epsA::lacZ (B) 253
ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1. Miembros del género Halomonas 11


Tabla 2. Principales polisacáridos de origen vegetal 13
Tabla 3. Principales familias de algas marinas y polisacáridos producidos por ellas 13
Tabla 4. Principales polisacáridos microbianos de interés comercial 15
Tabla 5. Sustituyentes orgánicos e inorgánicos más frecuentes de los exopolisacáridos
microbianos 24
Tabla 6. Principales agentes emulgentes producidos por microorganismos 42
Tabla 7. Aplicaciones de los exopolisacáridos microbianos 64
Tabla 8. Cepas productoras de exopolisacáridos objeto de estudio, hábitat de aislamiento e
identificación 77
Tabla 9. Sales metálicas y concentraciones (ppm) utilizadas en el estudio de captación de
metales pesados por el exopolisacárido 97
Tabla 10. Cepas donadora y receptoras utilizadas en este trabajo 102
Tabla 11. Sonda utilizada en la hibridación 107
Tabla 12. Porcentajes de semejanza y divergencia filogenética entre las cepas M4, X8,
Halomonas eurihalina y Halomonas elongata 115
Tabla 13. Porcentajes de semejanza y divergencia filogenética entre las cepas X2, B40, B100,
T
N12, A16 y Halomonas maura S31 116
Tabla 14. Efecto de la temperatura de incubación sobre la producción de EPS y la biomasa
celular 156
Tabla 15. Efecto de la agitación de los cultivos sobre la producción de exopolisacárido y la
biomasa celular 157
Tabla 16. Composición química de los exopolisacáridos obtenidos en condiciones óptimas 160
Tabla 17. Masa molecular y monosacáridos constituyentes (% p/p) de los exopolisacáridos
166
Tabla 18. Parámetros reológicos (K, índice de consistencia; n, índice de pseudoplasticidad) del
ajuste al modelo de Ostwald-de-Waele de los reogramas a las diferentes concentraciones de
polímero B100 192
Tabla 19. Parámetros reológicos (K, índice de consistencia; n, índice de pseudoplasticidad) del
ajuste al modelo de Ostwald-de-Waele de los reogramas de soluciones de polímero B100 al
0,5% (p/v) a diferentes temperaturas 192
Tabla 20. Frecuencia de transición (Hz) de las preparaciones acuosas del exopolisacárido B100
en función de la concentración de polímero, la presencia de sales y la temperatura 196
Tabla 21. Actividad emulgente de los controles sobre el aceite de oliva, aceite de girasol, aceite
mineral y keroseno 205
Tabla 22. Actividad emulgente de los controles sobre el miristato de isopropilo, tetradecano y
octano 205
Tabla 23. Actividad emulgente de los exopolisacáridos producidos por las bacterias halófilas X2,
B40, B100, N12, A16, M4, X8, Al12, Al15 y Al16 sobre el aceite de oliva, aceite de girasol, aceite
mineral y keroseno 206
Tabla 24. Actividad emulgente de los exopolisacáridos producidos por las bacterias halófilas X2,
B40, B100, N12, A16, M4, X8, Al12, Al15 y Al16 sobre el miristato de isopropilo, tetradecano y
octano 207
Tabla 25. Actividad emulgente de los exopolisacáridos producidos por las bacterias halófilas
FP35, FP34, FP36, M8, A3, B33, F23, R22, F32 y B35 sobre el aceite de oliva, aceite de girasol,
aceite mineral y keroseno 208
Tabla 26. Actividad emulgente de los exopolisacáridos producidos por las bacterias halófilas
FP35, FP34, FP36, M8, A3, B33, F23, R22, F32 y B35 sobre el miristato de isopropilo,
tetradecano y octano 209
Tabla 27. Tensión superficial (mN/m) de las preparaciones acuosas de los EPS X2, B40, B100,
M4 Al12 y F23, y del surfactante químico utilizado como control Polisorbato 60 213
Tabla 28. Actividad emulgente de los exopolisacáridos Al12 y Al16 de Halomonas ventosae en
estado nativo y tras ser sometidos a desproteinización química y enzimática sobre diversos
sustratos 215
Tabla 29. Captación de metales pesados por los exopolisacáridos. Los resultados indican los
miligramos de metal captados por gramo de EPS 219
RESUMEN

En esta Tesis Doctoral se describen los exopolisacáridos (EPS) producidos por distintas cepas
de microorganismos halófilos que se han caracterizado como pertenecientes a los géneros Halomonas,
Alteromonas, Idiomarina, Palleronia y Salipiger, aislados por nuestro grupo de investigación en diferentes
hábitats hipersalinos.

La primera etapa del trabajo consistió en optimizar la producción de los distintos EPS; en
general, la síntesis de polímero es un proceso parcialmente asociado al crecimiento bacteriano, pues
aunque comienza en la fase exponencial de crecimiento, alcanza el máximo durante la fase estacionaria,
entre 72 y 120 horas de incubación, según el microorganismo. En general, las condiciones que
condujeron a la máxima producción de exopolisacárido fueron las mismas que permitieron el mayor
crecimiento de los microorganismos.

La caracterización química de los EPS puso de manifiesto que todos los biopolímeros son
heteropolisacáridos constituidos fundamentalmente por carbohidratos, aunque en su composición también
encontramos distintos sustituyentes orgánicos e inorgánicos. El carácter ácido de los EPS se debe a la
presencia de ácidos urónicos, grupos fosfato, piruvato y a los restos sulfato, inusuales entre los EPS de
origen microbiano. En este trabajo hemos puesto de manifiesto la actividad moduladora sobre la
proliferación de células tumorales humanas de los heteropolisacáridos FP34 de Halomonas anticariensis,
B100 y N12 de Halomonas maura, y hemos demostrado la importancia de los grupos sulfato en dicha
actividad biológica, comparando la acción de dichos polímeros con sus análogos sulfatados y
desulfatados químicamente. Entre los EPS ensayados destaca el producido por Halomonas maura cepa
B100, el cual, tras ser sometido a un proceso de sulfatación química disminuye dramáticamente la
proliferación de las líneas celulares ensayadas.

En relación a sus propiedades funcionales, el polímero B100 de Halomonas maura destaca


entre los estudiados en este trabajo por ser un poderoso agente viscosizante. Este hecho, junto a su
comportamiento pseudoplástico, tixotrópico y viscoelástico, lo hace comparable a otros exopolisacáridos
como el maurano o el xantano. Todos los polímeros ensayados fueron capaces de estabilizar mezclas
oleoacuosas en las que la fase oleosa era un hidrocarburo o un aceite vegetal o mineral, destacando los
exopolisacáridos B100 de Halomonas maura y B33 de Palleronia marisminoris. Los exopolisacáridos Al12
y Al16 producidos por Halomonas ventosae, con una considerable actividad emulgente, y que no actúan
estabilizando emulsiones por un aumento de la viscosidad, deben en gran medida sus buenas
propiedades como bioemulgentes al contenido en proteínas que presentan en su composición química,
como hemos demostrado por eliminación química y enzimática del contenido proteico de los mismos. Por
tanto, nuestros EPS podrían encontrar aplicaciones en la industria alimentaria, cosmética o en
biorremediación. Por último, todos los EPS sintetizados por nuestras bacterias halófilas fueron capaces de
captar considerables cantidades de plomo, cobre y cobalto, debido a su carácter ácido, destacando el
EPS X2 de Halomonas maura, capaz de captar más de 53,5 mg Pb2+/g EPS, lo cual es de gran interés en
procesos de biorremediación.

Durante la última fase del estudio, se ha realizado una aproximación preliminar al papel
fisiológico desempeñado por los exopolisacáridos sintetizados por nuestros microorganismos halófilos,
determinando la propensión de los mismos a formar biofilms bajo diferentes condiciones ambientales.
Todas las cepas ensayadas fueron capaces de formar biofilms. A continuación, estudiamos la
participación de los exopolisacáridos en la estructura de los biofilms. Para ello elegimos las cepas X2 de
Halomonas maura y M4 de Halomonas eurihalina, es decir, aquellas que daban lugar a una mayor
formación de biofilms en todas las condiciones ensayadas, comparando su capacidad para formar estas
biopelículas con la de mutantes de ambas cepas deficientes en la síntesis de exopolisacárido,
demostrando que la presencia de exopolisacáridos en el medio es fundamental para la formación de
biofilms por parte de nuestros microorganismos.
INTRODUCCIÓN
Introducción

1. MICROORGANISMOS HALÓFILOS

1.1. Ambientes hipersalinos. Generalidades

Un medio ambiente extremo es aquel en el que existen condiciones físico-químicas extremas e


inusuales (Brock, 1969). A los microorganismos que viven en estos ambientes se les denomina
extremófilos (Horikoshi, 1997). Un tipo de ambiente extremo son los hábitats hipersalinos, que contienen
una elevada concentración de sal.

Las aguas hipersalinas se definen por tener una


A B
concentración de sales inorgánicas más elevada
que la del agua del mar. Se pueden dividir en
talasosalinas (del término griego “thalasso”, mar)
y atalasosalinas. Las primeras poseen una
composición semejante a la del agua del mar,
como el Gran Lago Salado (Figura 1B) o las
lagunas costeras hipersalinas (Javor, 1989), que
Figura 1. Mar Muerto (A) y Gran Lago Salado (B).
se encuentran distribuidas por todas las zonas
cálidas del planeta. Por el contrario, los medios atalasosalinos se caracterizan por tener una
concentración de sales cualitativamente diferente a la del mar, como el Mar Muerto (Figura 1A) o los lagos
alcalinos de Gran Valle de Rift africano (Tindall, 1988).

Dentro de los hábitats hipersalinos se encuentran también los desiertos de sal que cubren
enormes áreas de mundo, en los que la evaporación del agua es mucho mayor que la precipitación (Fitter
y Hay, 1987). En estos suelos hay una gran concentración de sales solubles neutras, suficiente para
interferir seriamente en la actividad microbiana y en la fertilidad de los suelos (Sarig y col., 1993), y
también en el crecimiento de la mayoría de las plantas (Zahran, 1989).

Pero los ambientes hipersalinos son también aprovechados e incluso provocados por el hombre,
como es el caso de las salinas, donde se extrae sal, mediante la evaporación de agua rica en sales. En
estos lugares, los suelos próximos también son hipersalinos.

Los medios hipersalinos presentan una baja actividad de agua (aw). Esta es una medida de la
disponibilidad de agua que, debido a la elevada cantidad de sales está muy limitada. Ello implica una
adaptación de los organismos que se desarrollen en estos ambientes, ya que hay menos agua para
disolver los nutrientes, para los procesos metabólicos generales, y para la hidratación de proteínas y
ácidos nucleicos (Litchfield, 1998).

1
Introducción

Además de la actividad del agua, la composición iónica es un parámetro importante que define
los ambientes hipersalinos. Esta composición influye en las necesidades que presentan los
2+
microorganismos. Así, por ejemplo, debido a que el Ca empieza a precipitar a una concentración de
sales totales de 6-8% (p/v), la mayoría de los microorganismos halófilos no requieren elevadas
+ 2+
concentraciones de este ión para desarrollarse. Por el contrario, los cationes K y Mg se encuentran en
concentraciones elevadas, especialmente en sistemas talasosalinos, por lo que muchos microorganismos
halófilos requieren altas concentraciones de estos iones para crecer en medios artificiales (Litchfield,
1998).

+
En ambientes atalasosalinos predominan otros iones además del Na . Por ejemplo, en el Mar
2+ + 2+
Muerto los cationes principales son Mg , Na y Ca (Larsen, 1980). Por lo tanto, las arqueas halófilas del
Mar Muerto presentan su óptimo de crecimiento a concentraciones elevadas de estos cationes (Grant y
Larsen, 1989).

Además de la elevada cantidad de sales, los medios hipersalinos se suelen caracterizar por
registrar generalmente temperaturas elevadas, una luz intensa, un pH alcalino, y la presencia de otros
aceptores de electrones alternativos al oxígeno (Litchfield, 1998). De este modo, los seres vivos que
habitan estos lugares, normalmente arqueas halófilas, bacterias halófilas y algas como Dunaliella, se
encuentran adaptados a esas condiciones.

1.2. Clasificación de los microorganismos según sus requerimientos salinos

Los microorganismos que requieren elevadas concentraciones de sal se denominan halófilos.


Kushner y Kamekura, en 1988, propusieron las siguientes categorías de microorganismos teniendo en
cuenta sus requerimientos de NaCl:

No halófilos: Su crecimiento óptimo se produce a una concentración de NaCl inferior a 0,2 M (1%
p/v). Existen microorganismos no halófilos capaces de crecer en medios hasta con 2,5 M de NaCl (15%
p/v), denominándose halotolerantes.

Halófilos débiles: También llamadas bacterias marinas. Su crecimiento óptimo se produce a una
concentración de NaCl de 0,2-0,5 M (1-3% p/v).

Halófilos moderados: Crecen de forma óptima a concentraciones de NaCl comprendidas entre


0,5 y 2,5 M (3-15% p/v).

Halófilos extremos: Tienen un crecimiento óptimo entre 2,5 y 5,2 M (15-32% p/v) de NaCl.

2
Introducción

1.3. Adaptación de los microorganismos a los ambientes salinos

a. Osmoadaptación

Las bacterias adaptadas a vivir en ambientes hipersalinos han de enfrentarse a un medio con
una fuerza iónica elevada (Galinski y Truper, 1994). Debido a que las envueltas celulares son permeables
al agua, las células que no están adaptadas no pueden mantener una aw del citoplasma mayor que la del
medio externo, ya que se produciría una deshidratación y la consiguiente muerte de la célula (Brown,
1990). La adaptación al medio ambiente hipersalino consiste en equilibrar la presión osmótica interna con
la externa, a fin de mantener la integridad celular y las funciones vitales.

Nos referimos al término osmoadaptación, mejor que osmorregulación, ya que este último se
refiere a una respuesta inmediata frente a la acción de un sensor o agente desencadenante, mientras que
osmoadaptación es un término más extenso. Se refiere tanto a los cambios fisiológicos como a los
genéticos que se producen frente a la escasa actividad del agua (Galinski, 1995).

Los microorganismos que viven en ambientes hipersalinos han adoptado dos estrategias de
osmoadaptación: mediante la acumulación de grandes cantidades de sal, en concreto KCl, en el interior
de la célula, y mediante el empleo de solutos compatibles orgánicos.

La adaptación a la elevada fuerza iónica exterior significa un gasto energético para el


microorganismo. La estrategia del KCl es menos costosa que la acumulación de solutos compatibles pero
requiere grandes adaptaciones de la maquinaria celular, de modo que se lleva a cabo por un proceso más
complejo y largo desde el punto de vista evolutivo (Dennis y Shimmin, 1997). Esta opción sólo la realizan
los grupos de procariotas especializados, como las arqueas halófilas y las bacterias anaerobias halófilas,
que obtienen cantidades limitadas de energía debido a su metabolismo fermentador. El resto de los
microorganismos utilizan solutos compatibles orgánicos, que son más costosos energéticamente (Oren,
1999).

Los microorganismos que acumulan KCl son las arqueas halófilas del orden Halobacteriales
(Kushner, 1985), y las bacterias halófilas del orden Haloanaerobiales (Oren, 1999; Oren y col., 1997).
También acumulan esta sal Acetohalobium (Oren, 1991), y algunas bacterias sulfato reductoras (Ollivier y
col., 1994). En este caso, todos los enzimas y componentes estructurales de la célula se encuentran
adaptados a la elevada salinidad del citoplasma. Estas modificaciones incluyen un exceso de
aminoácidos ácidos, y pequeñas cantidades de aminoácidos hidrofóbicos. De esta forma, la molécula se
rodea de mayor cantidad de agua, es decir, se forma una capa de hidratación alrededor de ella, para
compensar la escasa aw del medio circundante (Sleator y Hill, 2001).

3
Introducción

Aminoácidos

Figura 2. Movimiento de iones en las arqueas aerobias halófilas de la familia Halobacteriaceae (Oren y col., 1999). 1:
Eliminación de protones por la cadena respiratoria de transporte de electrones; 2: Expulsión de protones mediada por
+ +
bacteriorodopsina; 3: Formación de ATP por la ATP sintasa; 4: Bomba antiporter Na /H ; 5: Gradiente de sodio
asociado al transporte de aminoácidos; 6: Transporte de potasio generado por el potencial de membrana; 7: Transporte
de cloruro independiente de la luz, probablemente asociado al transporte de sodio; 8: Halorodopsina, una bomba que
incorpora cloruro a la célula gracias a la luz.

+
En la familia Halobacteriaceae, este aumento de la concentración intracelular de K se consigue
+ + +
por una eliminación de Na de forma activa, mediante un antiporter con H , y una entrada pasiva de K . El
-
ión Cl penetra sin consumo de energía para compensar las cargas (Hochstein y Bogomolni, 1999) (Figura
2).

La estrategia de los solutos compatibles orgánicos la han adoptado la mayoría de las bacterias
halófilas y halotolerantes, y algunas arqueas halófilas, como las metanógenas (Robertson y col., 1992;
Lai y col., 1991). Se trata de pequeñas moléculas polares sintetizadas por el microorganismo o
capturadas del medio exterior, con alta solubilidad y que no presentan carga a pH fisiológico (Galinski,
1995). Se acumulan en gran cantidad en la célula (más de 1 mol/kg de agua) (Galinski y Trüper, 1994).
Este mecanismo no requiere que las proteínas celulares estén adaptadas, como ocurre en el caso de la
acumulación de KCl en el citoplasma.

Los solutos compatibles actúan aumentando la fuerza iónica intracelular y estabilizando


macromoléculas celulares (Csonka y Hanson, 1991; Lippert y Galinski, 1992). Su mecanismo de acción
está relacionado con la estabilización de la capa de hidratación de las proteínas, al localizarse en zonas

4
Introducción

más alejadas de la superficie molecular, y permitiendo una unión más fuerte del agua con la molécula
(Arakawa y Timasheff, 1985; Sleator y Hill, 2001).

En cuanto a la naturaleza química de los solutos compatibles (Figura 3), pueden ser polioles
(glicerol y arabitol), azúcares y derivados (sacarosa, trehalosa, glucosilglicerol), aminoácidos (prolina y
glutamina), derivados de aminoácidos (N-acetilisina, N-acetilornitina) que se han detectado en algunos
Gram positivos (Wohlfarth y col., 1993), y aminas cuaternarias (glicina betaína) (Galinski, 1995).

Cada microorganismo tiene unos solutos compatibles característicos, y unas rutas para
conseguir su osmoadaptación. Hay bacterias no halófilas, como las enterobacterias, que tienen
mecanismos de transporte eficaces para algunos omolitos como ectoína y glicina betaína. Por lo tanto,
un microorganismo puede adquirir un cierto grado de tolerancia a la sal al capturar solutos compatibles
presentes en sedimentos marinos, liberados por otras bacterias al medio ambiente, o cuando estos
solutos se adicionan al medio de cultivo (Koo y col., 1991; Cayley y col., 1992; Jebbar y col., 1992; Kempf
y Bremen, 1998; Poolman y Glaasker, 1998; Nagata y Wang, 2001; García-Estepa y col., 2006).

Glicina betaína
Glicerina Ectoína
Glucosilglicerol

Sacarosa Trehalosa
2-Sulfotrehalosa

Figura 3. Algunos solutos compatibles encontrados en los microorganismos halófilos y halotolerantes (Oren y col.,
1999).

La glicina betaína (Figura 3) es un compuesto importante. Lo sintetizan las bacterias halófilas


fotosintéticas (Galinski, 1995) y las cianobacterias halófilas (Reed y col., 1984). También puede ser
capturada del medio por muchos heterótrofos para conseguir el equilibrio osmótico (Ventosa y col., 1998),
o sintetizada, junto con otros compuestos por las arqueas metanógenas halófilas (Robertson y col., 1992).

5
Introducción

Finalmente, también puede ser obtenida por síntesis de novo por algunos heterótrofos como
Actinopolyspora halophila (Galinski, 1995).

Otro compuesto interesante es la ectoína (Figura 3). Se trata de un aminoácido cíclico que se
detectó por primera vez en el género Ectothiorhodospira (Galinski, 1991). Junto con la hidroxiectoína es
el soluto compatible más ampliamente localizado en el dominio Bacteria (Ventosa y col., 1998). Se ha
encontrado en bacterias fotosintéticas del género Halorhodospira (Galinski, 1995), en metanotrofos
halotolerantes como Methylomicrobium alcaliphilum 20Z (Reshetnikov y col., 2006), en Vibrio cholerae
(Pflughoeft y col., 2003), y está presente en altas concentraciones en especies del género Halomonas y
otros géneros relacionados. En Halomonas elongata se ha estudiado la síntesis de novo de ectoína e
hidroxiectoína, que tiene lugar en ausencia de otros agentes protectores en el medio (Cánovas y col.,
1997). Se han caracterizado los genes implicados en esta síntesis en dos cepas de H. elongata (Cánovas
y col., 1998a; Göller y col., 1998). Esta bacteria también acumula glicina betaína y otros solutos
semejantes estructuralmente. La glicina betaína capturada del medio inhibe parcial o totalmente la síntesis
de novo de ectoína, dependiendo de la concentración de NaCl del medio (Cánovas y col., 1996). Además
de captar glicina betaína del medio externo, la baceria es capaz de sintetizarla, a partir de su precursor, la
colina. Este sistema se encuentra regulado por la salinidad y por la disponibilidad de glicina betaína
(Cánovas y col., 1998b). Estos genes han sido caracterizados (Cánovas y col., 2000).

La acumulación de solutos compatibles depende de la fuerza osmótica, de la fase de crecimiento


del cultivo, de la fuente de carbono y de la presencia de osmolitos en el medio de cultivo (Smith y col.,
1994). Las condiciones de crecimiento son muy importantes; por ejemplo, Chromohalobacter israelensis
acumula principalmente trealosa cuando crece a concentración de NaCl inferior a 0,6 M, pero a mayores
concentraciones el soluto principal es la ectoína (Regev y col., 1990).

Muchas bacterias que acumulan solutos orgánicos también contienen altas concentraciones
+ +
intracelulares de Na y K (Ventosa y col., 1998; Kraegeloh y col., 2005). No está claro si esto implica una
combinación de ambas estrategias o se debe a problemas técnicos en la medida de la concentración
iónica intracelular (Imhoff, 1993; Ventosa y col., 1998). Además, las proteínas celulares de Halomonas
elongata son algo más ricas en aminoácidos ácidos que las de los microorganismos no halófilos
(Gandbhir y col., 1995), lo que puede significar un cierto grado de adaptación de la maquinaria intracelular
a la sal, aunque se trate de bacterias que principalmente utilizan solutos compatibles.

En otro orden de cosas, los solutos compatibles pueden utilizarse como estabilizadores y
agentes protectores de células y de enzimas de interés industrial (Galinski y Lippert, 1991; Ventosa y
Nieto, 1995; Lamosa y col., 2000; Faria y col., 2003; Neelon y col., 2005). In vivo, las aplicaciones
biotecnológicas de los solutos compatibles se han centrado en el desarrollo de plantas transgénicas
resistentes a la desecación. Así, por ejemplo, se está trabajando con los genes que codifican para la
ectoína en Chromohalobacter salexigens (Calderon y col., 2004), transfiriendo de dichos genes a las

6
Introducción

plantas y a las bacterias de interés agrícola, como Rhizobium, con el fin de aumentar la tolerancia a las
condiciones de stress osmótico. Su aplicación más inmediata es la mejora en la fijación biológica de
nitrógeno para la recuperación de suelos áridos y semiáridos mediante el cultivo de estos organismos
transgénicos (Nieto y col., 2001). También se han realizado estudios para conferir tolerancia a la salinidad
a la planta del tabaco (Nakayama y col., 2000; Rai y col., 2006) y al maíz (Barkla y col., 1999;
Paranychianakis y Chartzoulakis, 2005).

Se ha estudiado en Halomonas elongata un proceso de extracción de ectoína conocido como


“bacterial milking” (Sauer y Galinski, 1998). Consiste en alternar el cultivo del microorganismo en medios
con alta y baja concentración de sales, con el fin de provocar la salida de ectoína de la célula. Se pueden
obtener hasta 155 mg de ectoína por gramo de peso seco celular en cada ciclo.

b. Modificación en la morfología celular y estructura

Las bacterias que normalmente crecen en condiciones no salinas pueden mostrar grandes
modificaciones cuando se someten a una elevada concentración de sal. El engrosamiento, el
alargamiento y la reducción del volumen de las células son las modificaciones más frecuentes. Se trata de
una respuesta común en algunas bacterias Gram negativas como Escherichia coli (Baldwin y col., 1988),
Pseudomonas fluorescens (Parente y Silva, 1984) y Rhizobium (Zahran y col., 1993). Las bacterias del
género Rhizobium aisladas de suelos afectados por la sal presentan una alteración de la forma de las
células, de la ruta de síntesis de proteínas y LPS, así como una modificación de la estructura genómica
(Zahran, 1991; 1992a,b). Estas alteraciones pueden afectar a la simbiosis entre Rhizobium y la
leguminosa correspondiente.

Las bacterias Gram positivas como Bacillus y Staphylococcus también modifican su estructura. Al
10% (p/v) de NaCl, las células de Bacillus presentan un alargamiento, un engrosamiento y un aumento en
la formación de cadenas de estreptobacilos. Además, el volumen celular se reduce con un 10-20% (p/v)
de NaCl (Zahran, 1997).

Por otro lado también se han encontrado modificaciones estructurales en las bacterias halófilas.
Un aspecto importante es el cambio en la pared celular y en las membranas. Las adaptaciones
estructurales de la membrana principalmente se refieren a alteraciones en la composición y síntesis de
proteínas, lípidos y ácidos grasos (Russell, 1989; Thiemman e Imhoff, 1991). Sin embargo sólo ocurren
cambios profundos en la estructura y composición química de las bacterias a concentraciones de sal
superiores a 2M de NaCl (Kogut, 1991).

Las propiedades de las membranas bacterianas dependen en gran medida, de su composición


lipídica. Una característica común de la respuesta adaptativa a la elevada salinidad es el aumento de los
fosfolípidos cargados negativamente (Russell y Adams, 1991; Thiemman e Imhoff, 1991) Este hecho se

7
Introducción

ha observado en las bacterias del género Ectothiorhodospira (Thiemman e Imhoff, 1991), y en Halomonas
elongata. Dicha bacteria es capaz de vivir en una amplia variedad de concentraciones salinas (0,05-3,4M)
debido a la alteración de la fisiología de la célula, que consiste en una mejora de la integridad estructural
de las paredes y un aumento de lípidos cargados negativamente (Vreeland y col., 1984; 1991). Sin
embargo, la bacteria halófila Haloanaerobium prevalense muestra una respuesta diferente, ya que el
contenido en lípidos de la célula no varía bajo una elevada concentración salina (Zeikus y col., 1983).

La composición de ácidos grasos de los fosfolípidos también se regula por la salinidad del medio
de cultivo y es importante en el mantenimiento de la estructura de la bicapa (Imhoff y Thiemman, 1991;
Sutton y col., 1991). En Halomonas salina se produce un descenso de la proporción de ácidos grasos
monoinsaturados, aumentando los ácidos grasos con cadenas de ciclopropano, en situaciones de elevada
salinidad. Se cree que de este modo, se mantiene la fluidez de la membrana y se contribuye a preservar
la integridad de la misma (Valderrama y col., 1998). Este comportamiento coincide con el de otras
bacterias relacionadas como H. halophila (Monteoliva-Sánchez y col., 1988) y Pseudomonas
halosaccharolytica (Monteoliva-Sánchez y col., 1993). Sin embargo, en el caso de Salinivibrio costicola, la
elevada salinidad no favoreció la ciclación de los ácidos grasos (Hanna y col., 1984).

1.4. Taxonomía de los microorganismos halófilos

a. Taxonomía de las arqueas halófilas

La mayoría de las arqueas halófilas se consideran halófilas extremas, ya que su óptimo de


crecimiento se encuentra a 3,5-4,5 M de NaCl. Se denominaban comúnmente halobacterias (actualmente
haloarqueas), y quedan agrupadas en el orden Halobacteriales (Grant y Larsen, 1989), con una sola
familia, Halobacteriaceae (Gibbons, 1974; Tindall, 1992). Este grupo incluye cocos, bacilos, y multitud de
formas pleomórficas como las triangulares y cuadradas. Requieren al menos un 1,5 M de NaCl, y las
colonias de la mayoría de las cepas tienen colores rojizos debido a la presencia de carotenoides C50
(bacterioruberina), que proporcionan dichas tonalidades a las aguas donde se desarrollan. La temperatura
óptima de crecimiento para la mayoría de las arqueas halófilas es de 35-50º C. Son quimioorganotrofos,
capaces de usar aminoácidos o carbohidratos como fuente de carbono y energía (Grant y col., 2001).
Algunos de estos microorganismos contienen un pigmento derivado del retinal, denominado
bacteriorodopsina, capaz de producir movimientos de iones a través de la membrana celular por acción de
la luz, o funcionar como fotosensores (Figura 2). Dicha sustancia se ha detectado en Halobacterium
salinarium y parece ser una característica excepcional entre estos microorganismos (Oren, 1999).

También se han descrito algunas arqueas metanógenas halófilas extremas pertenecientes a los
géneros Methanohalobium (Zhilina y Zavarin, 1987) y Methanohalophilus (Paterek y Smith, 1988), que se
incluyen en la familia Methanosarcinaceae.

8
Introducción

b. Taxonomía de las bacterias halófilas

Bacterias halófilas extremas

La mayoría de las bacterias halófilas se clasifican como moderadas o débiles. Es difícil encontrar
verdaderas bacterias halófilas extremas, entre ellas podemos nombrar Acetohalobium arabaticum (Zhilina
y Zavarzin, 1990), y también las especies del género Halorhodospira (Imhoff y Süling, 1996). Otro
microorganismo halófilo extremo es el actinomiceto Actinopolyspora halophila (Gochnauer y col., 1975;
Skerman y col., 1980). Sin embargo, en 2002, Antón y colaboradores describieron Salinibacter ruber, que
necesita al menos un 15% (p/v) de sal para crecer, y que se considera una de las bacterias conocidas con
unos requerimientos salinos más elevados, y que es muy frecuente en aguas hipersalinas de Alicante y
Mallorca.

Bacterias halófilas moderadas

El orden Halanaerobiales incluye bacilos Gram negativos anaerobios. Este orden reúne la familia
Halanaerobiaceae, con los géneros Halanaerobium, Halothermothrix y Halocella, y la familia
Halobacteriodaceae, que incluye los géneros Halobacteroides, Acetohalobium, Haloanaerobacter,
Sporohalobacter y Orenia (Rainey y col., 1995). Excepto Acetohalobium, formado por bacterias halófilas
extremas, todos agrupan a bacterias halófilas moderadas.

Otros representantes anaerobios se incluyen en los géneros Clostridium (Fendrich y col., 1990),
Desulfohalobium (Ollivier y col., 1991), Desulfotomaculum (Tardy Jacquenod y col., 1998) y Desulfovibrio
(Caumette y col., 1991a), entre otros. También hay microorganismos fotosintéticos anoxigénicos, entre
ellos Chromatium (Caumette y col., 1988), Ectothiorhodospira (Oren y col., 1989) y Thiocaspa (Caumette
y col., 1991b).

En relación a los microorganismos aerobios, hay bacterias halófilas moderadas que se


encuadran en géneros que agrupan únicamente especies halófilas moderadas, aunque la mayoría de las
especies forman parte de géneros que incluyen también bacterias marinas (halófilas débiles) y en algunos
casos bacterias no halófilas (Ventosa y col., 1998).

Con respecto a las bacterias Gram positivas, excepto el género Bacillus, el resto de géneros
incluye sólo microorganismos con requerimientos salinos. Estos géneros son Salibacillus, Gracibacillus,
Halobacillus, Marinococcus, Nesterenkonia, Salinicoccus y Tetragenococcus. La mayoría de estos
microorganismos pertenecen al grupo de Gram positivos de bajo contenido en G+C, excepto
Nesterenkonia halobia que se incluye en los de alto contenido en G+C (Mota y col., 1997).

9
Introducción

Los representantes Gram negativos aerobios o anaerobios facultativos parecen ser mucho más
frecuentes en los ambientes hipersalinos (Quesada y col., 1982; del Moral y col., 1987; Martínez-Cánovas
y col., 2004a). La familia Halomonadaceae (Franzmann y col., 1988), que se incluye a su vez en la clase
γ-Proteobacteria, incluye tres géneros de bacterias halófilas, Halomonas (Vreeland y col., 1980; Dobson y
Franzmann, 1996; Ventosa y col., 1998), Chromohalobacter (Ventosa y col., 1989) y Cobetia (Arahal y
col., 2002a), junto a Zymobacter (Dobson y Franzmann, 1996), que no presenta requerimienos salinos.

Uno de los grupos de microorganismos halófilos moderados más ampliamente distribuido en las
aguas y suelos salinos, independientemente de su situación geográfica, lo constituyen los miembros del
género Halomonas. Las especies de dicho género son bacilos quimioheterótrofos Gram negativos,
catalasa positivos y no formadores de esporas. Tienen un metabolismo respiratorio y utilizan el oxígeno
como último aceptor de electrones, aunque algunos de ellos crecen en anaerobiosis en presencia de
nitrato. Las especies del género Halomonas no constituyen un grupo monofilogenético; estudios recientes
han demostrado que se pueden distinguir varios grupos filogenéticos con especies de líneas evolutivas
diferentes como por ejemplo H. marisflavi (Arahal y col., 2002b). Desde el punto de vista fenotípico, el
género Halomonas es también heterogéneo. En los últimos años se ha podido demostrar que las
especies de este género pueden dividirse en tres grupos según la capacidad de producir ácidos de los
azúcares y su versatilidad nutricional (Mata y col., 2002).

En total, el género Halomonas está formado por 35 especies, la mayoría halófilas moderadas,
aunque también se encuentran algunas halotolerantes como la propia especie tipo H. elongata (Dobson y
Franzmann, 1996; Vreeland y col., 1980), H. halodurans (Hebert y Vreeland, 1987) y H. meridiana (James
y col., 1990). Este género engloba microorganismos haloalcalófilos como H. pantellerensis (Romano y
col., 1996) o H. campisalis (Mormille y col., 1999), bacterias desnitrificantes como H. halodenitrificans
(Robinson y Gibbons, 1952), bacterias productoras de enzimas como H. elongata (Vreeland y col., 1980) y
bacterias productoras de EPS entre las que destacan H. eurihalina (Quesada y col., 1990), H. maura
(Bouchotroch y col., 2001), H. anticariensis (Martínez-Cánovas, 2004b), H. ventosae (Martínez-Cánovas,
2004c), la recientemente descrita H. almeriensis (Martínez-Checa y col., 2005a) y la cepa CRSS de
Halomonas (Poli y col., 2004). También se incluyen bacterias de muy diversa procedencia como H.
alimentaria, aislada de alimentos fermentados (Yoon y col., 2002), H. muralis, aislada de biofilms
microbianos procedentes de pinturas murales y paredes (Heyrman y col., 2002) y H. halocynthiae, aislada
de las branquias del invertebrado marino Halocynthia aurantium (Romanenko y col., 2002). Muchas de las
especies del género Halomonas, y en general, muchas bacterias halófilas moderadas son productoras de
enzimas hidrolíticas como amilasas, DNasas, lipasas, proteasas y pululanasas (Sánchez-Porro y col.,
2003). En la actualidad se continúan aislando y caracterizando nuevos microorganismos halófilos
moderados, por lo que es probable que este género sufra en el futuro nuevas reordenaciones.

10
Introducción

Recientemente, el grupo de investigación Exopolisacáridos Microbianos, ha descrito dos nuevos


géneros de bacterias halófilas moderadas, pertenecientes a la clase α-Proteobacteria, Salipiger (Martínez-
Cánovas y col., 2004d), con una única especie, Salipiger mucosus, y Palleronia (Martínez-Checa y col.,
2005b), que también incluye sólo a la especie Palleronia marisminoris. Ambas especies incluyen bacilos
quimioheterótrofos Gram negativos inmóviles, con un metabolismo aerobio estricto, baja versatilidad
nutricional, y capacidad de producir exopolisacáridos.

Tabla 1. Miembros del género Halomonas.

TAXÓN REFERENCIA

Halomonas alimentaria Yoon y col., 2002


Halomonas almeriensis Martínez-Checa y col., 2005a
Halomonas anticariensis Martínez-Cánovas y col., 2004b
Halomonas aquamarina ZoBell y Upham, 1944; Dobson y Franzmann, 1996
Halomonas axialensis Kaye y col., 2004
Halomonas boliviensis Quillaguamán y col., 2004
Halomonas campaniensis Romano y col., 2005
Halomonas campisalis Mormile y col., 1999
Halomonas cupida Baumann y col., 1972; Dobson y Franzmann, 1996
Halomonas desiderata Berendes y col., 1997
Halomonas elongata Vreeland y col., 1980
Halomonas eurihalina Quesada y col., 1990; Mellado y col., 1995
Halomonas halmophila Dobson y col., 1990
Halomonas halocynthiae Romanenko y col., 2002
Halomonas halodenitrificans Robinson y Gibbons, 1952; Dobson y Franzmann, 1996
Halomonas halodurans Hebert y Vreeland, 1987
Halomonas halophila Quesada y col., 1984; Dobson y Franzmann, 1996
Halomonas hydrothermalis Kaye y col., 2004
Halomonas koreensis Lim y col., 2004
Halomonas magadiensis Duckworth y col., 2000
Halomonas marisflavi Yoon y col., 2001
Halomonas maura Bouchotroch y col., 2001
Halomonas meridiana James y col., 1990
Halomonas muralis Heyrman y col., 2002
Halomonas neptunia Kaye y col., 2004
Halomonas organivorans García y col., 2004
Halomonas pacifica Baumann y col., 1972; Dobson y Franzmann, 1996
Halomonas pantellerensis Romano y col., 1996
Halomonas salina Valderrama y col., 1991; Dobson y Franzmann, 1996
Halomonas subglaciescola Franzmann y col., 1987
Halomonas sulfidaeris Kaye y col., 2004
Halomonas taeanensis Lee y col., 2005
Halomonas variabilis Fendrich, 1988 Dobson y Franzmann, 1996
Halomonas ventosae Martínez-Cánovas y col., 2004c
Halomonas venusta Baumann y col., 1972; Dobson y Franzmann, 1996

11
Introducción

Bacterias halófilas débiles

Se encuentran ampliamente distribuidos en ambientes marinos, denominándose generalmente


bacterias marinas. Desde el punto de vista taxonómico, se distinguen géneros de bacterias anaerobias
facultativas fermentadoras como Vibrio, Photobacterium, Moritella y Colwellia, no fermentadoras o
débilmente fermentadoras como Shewanella y Ferrimonas, y aerobios estrictos, distribuidos en géneros
que incluyen microorganismos halófilos y halotolerantes como Alcanivorax, Alteromonas, Cycloclasticus,
Fundibacter, Gelidibacter, Glaciecola, Halomonas, Idiomarina, Marinobacter, Marinomonas,
Marinospirillum, Neptunomonas, Oceanospirillum, Pseudoalteromonas, Pseudomonas y Thalassomonas.

2. LOS POLISACÁRIDOS

Los polisacáridos son moléculas complejas formadas por unidades simples repetitivas de
azúcares, unidas mediante enlaces glicosídicos, dando lugar a una estructura lineal o ramificada que
puede llegar a estar constituida por miles de unidades de monosacáridos.

2.1. Polisacáridos vegetales

Los polisacáridos procedentes de plantas presentan una gran variabilidad en cuanto a su


composición química, propiedades y procedencia.

Estos compuestos pueden actuar como material de reserva o almacenamiento, tal es el caso del
almidón, goma guar o goma garrofín; contribuir a la integridad estructural del tejido vegetal, entre ellos la
celulosa y pectinas, o tener función protectora frente a infecciones bacterianas, papel que desempeñan
los exudados vegetales. Respecto a su origen, existen gomas procedentes de semillas, de exudados de
plantas o de subproductos vegetales (Lapasin y Pricl, 1995; Doublier y col., 1992).

La principal propiedad de los polisacáridos de origen vegetal es su poder espesante y gelificante,


aunque también deben a su capacidad de estabilización de emulsiones o de retención de agua algunas
de sus aplicaciones industriales. En la Tabla 2 se relacionan algunos de los principales polímeros de
origen vegetal así como su número CEE (denominación asignada por la Comunidad Económica Europea
a cada uno de los aditivos alimentarios aceptados según las normas del Codex Alimentarius consistente
en el prefijo E seguido de un número de 3 cifras).

La celulosa constituye la cadena polisacarídica por excelencia del reino vegetal y representa la
fuente natural renovable más abundante del mundo. Además tiene interés porque a partir de ella se ha
obtenido diversos derivados aceptados como aditivos alimentarios. Generalmente, estos derivados
proceden de una modificación química de la glucosa por esterificación con objeto de lograr una
macromolécula hidrosoluble que le confiera propiedades espesantes (Doublier y col., 1992).

12
Introducción

Tabla 2. Principales polisacáridos de origen vegetal (Doublier y col., 1992).

Origen Polímero Especie Aplicación nº CEE


Extractos de goma guar Cyamopsis tetragonoloba Espesante E412
semillas goma garrofín Ceratonia siliqua Espesante E410
goma arábiga Acacia sp. Estabilizante E414
Exudados de goma tragacanto Astragalus sp. Espesante _
plantas goma karaya Sterculia ureus Espesante _
goma índica Anogeissus latifolia Espesante _
Extractos de
subproductos pectinas Estabilizante E440 a y b
vegetales
metilcelulosa Espesante E461
Derivados de la carboximetilcelulosa Espesante E466
celulosa hidroxipropilcelulosa Espesante _
hidroxipropilmetilcelulosa Espesante _

2.2. Polisacáridos de algas marinas

En las algas marinas, los polisacáridos llevan a cabo un papel estructural parecido al de la
celulosa en las plantas. Así, estas moléculas confieren a las algas una estructura más flexible que les
permite soportar las fuerzas y movimientos a los que se encuentran sometidas por la acción de las
corrientes de agua (Lapasin y Pricl, 1995).

Las numerosas especies de algas marinas existentes se clasifican en cinco categorías


fundamentales en función de sus pigmentos y cada familia produce polisacáridos de diferentes tipos
(Tabla 3).

Tabla 3. Principales familias de algas marinas y polisacáridos producidos por ellas (Doublier y col., 1992).

Familia Compuestos polisacarídicos


Cyanophyceae (algas verde azuladas) Glucógeno, Lipopolisacáridos
Xanthophyceae (algas amarillo verdosas) Laminarano, Celulosa, 1,6 β-D glucanos, Xilanos
Almidón, Laminarano, Celulosa, Glucomananos,
Chlorophyceae (algas verdes)
Xilanos
Rhodophyceae (algas rojas) Agar, Carragenatos, Furcelarano
Phaeophyceae (algas marrones) Alginatos, Heteroglicanos sulfatados, Laminarano

13
Introducción

Desde el punto de vista industrial, cabe destacar a los carragenatos y alginatos producidos por
algas rojas y algas marrones, respectivamente. Ambos polisacáridos se emplean en la industria
alimentaria gracias a su capacidad para formar geles y estabilizar emulsiones.

En cuanto a los alginatos, estos compuestos se comercializan en forma de sal sódica o como
derivado esterificado, como por ejemplo el alginato de propilenglicol (PGA, E405) que se emplea en
alimentación y en la industria farmacéutica (Espevick y col., 1993; Clementi, 1997).

Los carragenatos son polisacáridos lineales con un alto contenido en sulfatos, y según el grado
de sulfatación se distinguen distintos tipos. La presencia de estos sustituyentes es determinante en la
mayoría de sus aplicaciones.

Los polisacáridos sufatados, muy frecuentes entre los producidos por algas, presentan la
capacidad de interferir en la adsorción y penetración de algunos virus, por lo que potencialmente se
podrían emplear como antivirales (Nakashima y col., 1987; Bagasra y Lischner, 1988; Hasui y col., 1995;
Hayashi y Hayashi, 1996; Hayashi y col., 1996; Witrouw y de Clercq, 1997; Hoshino y col., 1998). En
estos polímeros se ha detectado asimismo actividad antitumoral (Itoh y col., 1993; Riou y col., 1996;
Haroun-Bouhedja y col., 2000; Patel y col., 2002).

En relación directa con la presencia de grupos sulfato en estas moléculas, también se ha puesto
de manifiesto una actividad anticoagulante (Farias y col., 2000; Shanmugam y col., 2001). Por otra parte,
estos polímeros sulfatados parecen ser útiles en clínica, concretamente en el tratamiento de la
glomerulonefritis (Ogawa y col., 2002) y cuadros de cistitis (Ho y col., 1999).

2.3. Polisacáridos microbianos

Aunque los productos de origen microbiano se han utilizado desde siempre, con el paso de los
años los microorganismos han pasado a ser considerados como una fuente renovable de sustancias útiles
como los polisacáridos y se han utilizado para la obtención de metabolitos empleados en la industria
(Pace, 1987; Tombs y Harding, 1997).

Los polisacáridos microbianos ofrecen una serie de ventajas frente a los de origen vegetal o los
biopolímeros de algas. Entre ellas podemos citar la gran versatilidad de los microorganismos para
sintetizar polisacáridos neutros o con carga, con una gran variedad en cuanto a su composición y
propiedades funcionales, a lo que habría que sumar que su producción es a partir de una fuente
renovable e inagotable y puede llevarse a cabo bajo condiciones controladas (Pace, 1987; Tombs y
Harding, 1997). Otra ventaja a tener en cuenta es la posibilidad de manipulación genética que permite la
obtención de productos de mejores propiedades funcionales e incluso mayor calidad (Van Kranenburg y
col., 1999).

14
Introducción

Estos polisacáridos de origen microbiano constituyen una alternativa a los polímeros de plantas
(pectina, goma guar o goma garrofín) o algas (carragentatos y alginatos) usados tradicionalmente como
agentes viscosizantes en la industria y que presentan el inconveniente de no estar disponibles siempre en
la calidad y con las propiedades requeridas a causa de la variabilidad estacional (Harvey y Mc Neil, 1998).
Ello se ha intentado suplir mediante la modificación química de estas moléculas para mejorar su
estructura y propiedades reológicas (Roller y Dea, 1992; Tombs y Harding, 1997); sin embargo el uso de
estos compuestos modificados se encuentra muy restringido, de ahí el creciente interés por los
biopolímeros producidos por microorganismos.

El interés por el estudio de los polisacáridos microbianos se ha basa en tres razones


fundamentales. En primer lugar, los polisacáridos son un componente estructural de las células
microbianas, por lo que su investigación tiene un interés teórico. En segundo lugar, los polisacáridos son
reconocidos como determinantes antigénicos de la superficie celular de muchas bacterias, con lo que el
conocimiento de su estructura es de gran importancia en medicina. Por último, los microorganismos son
una fuente de polímeros con propiedades únicas. Estos son argumentos de peso para justificar el estudio
de la estructura, propiedades y producción a escala piloto e industrial de estos compuestos (Neu y
Lawrence, 1999).

Sin embargo, sólo una pequeña parte de los exopolisacáridos microbianos conocidos son
explotados en el ámbito industrial y gozan de un nicho de mercado, bien con aplicaciones exclusivas o
compitiendo con otros productos de origen vegetal o sintético (Harvey y McNeil, 1998). Dichos
polisacáridos están recogidos en la tabla 4.

Tabla 4. Principales polisacáridos microbianos de interés comercial.

Poliscáridos Microorganismos Referencia


HOMOPOLISACÁRIDOS
Celulosa Acetobacter xylinum Delmer y Amor, 1995
Colquhoun y col., 1995
Acetobacter sp. Son y col., 2000
Curdlano Alcaligenes faecalis var. myxogenes Harada y col., 1966
Lawford y Rousseau, 1992
Agrobacterium spp. Hisamatsu y col., 1978
Nakanishi y col., 1976
Dextranos Leuconostoc mesenteroides Jeanes, 1974
Lactobacillus spp.
Streptococcus spp.
Elsinano Elsinoe leucospila Sutherland, 1990
Escleroglucano Rhizobium trifolii J60 Ghai y col., 1981
Sclerotium rolfsii Sutherland, 1990
Schyzophyllum commune “
Levano Bacillus polymixa Keith y col. 1991
Erwinia herbicola “
Streptococcus salivarius Gancel y Novel, 1994a y b
Pululano Aureobasidium pullulans Shin y col., 1989

15
Introducción

Tabla 4. Continuación

Polisacáridos Microorganismos Referencia


HETEROPOLISACÁRIDOS
Ácido hialurónico Pseudomonas aeruginosa Kendall y col., 1937
Estreptococos grupo A y C “
Alginatos Azotobacter vinelandii Gorin y Spencer, 1996
Skjak-Braek y col., 1986
Azotobacter chroococcum Peciña y Paneque, 1994
Pseudomonas spp. Linker y Jones, 1964; 1966
Conti y col., 1994
Desulfatoheparina Escherichia coli K5 Sutherland, 1990
Emulsano Acinetobacter calcoaceticus Rosemberg y col., 1979b
Zuckerberg y col., 1979
Kaplan y Rosemberg, 1982
Kaplan y col., 1985
Rosemberg y Kaplan, 1987
Marín y col., 1996
Esquizofilano Schizophyllum commune Sutherland, 1990
Misaki y col., 1993
Gelano Sphingomonas paucimobilis Lobas y col., 1992
Pollock, 1993
Rhamsano Alcaligenes sp. Sutherland y Kennedy, 1996
Succinoglicano Sinorhizobium sp. Ghai y col., 1981
Agrobacterium spp. “
Alcaligenes spp. “
Zevenhuizen, 1997
Xantano Xanthomonas campestris Lilly y col., 1958
Jansson y col., 1975
Melton y col., 1976
Stankowski y col., 1993
XM6 Enterobacter XM6 Nisbet y col., 1984
Welano Sphingomonas sp. Sutherland y Kennedy., 1996
Otros Rhizobium sp. Dantas y col., 1994
Zoogloea ramigera Stauffer y col., 1980
Rha y col., 1989
Azotobacter beijerinckia Ogawa y col., 1996
Alteromonas sp. Bozzi y col., 1996a y b

3. EXOPOLISACÁRIDOS MICROBIANOS

3.1. Concepto de exopolisacárido

Muchos microorganismos producen polisacáridos que son excretados al medio o bien quedan
adheridos a la célula en forma de cápsula. El término “exopolisacárido” ha sido ampliamente usado para
aquellos polisacáridos localizados en la superficie externa de las células microbianas, entre los que se ha
encontrado polímeros de diversa composición química y propiedades físicas. Para designar a este tipo de
sustancias se ha acuñado el término EPS, que se usa para hacer referencia a los “polisacáridos
extracelulares”, “exopolisacáridos” o “exopolímeros” (Wingender y col., 1999).

16
Introducción

Los exopolisacáridos que forman cápsulas se encuentran unidos a la superficie de la célula


bacteriana mediante interacciones no covalentes, aunque en ocasiones, pueden unirse covalentemente a
los fosfolípidos o moléculas de lípido A de la membrana celular (Roberts, 1996). En aquellos casos en los
que las uniones del EPS con la célula son débiles, éste se encuentra originando cápsulas periféricas
difusas, o bien, es vertido al medio en forma de una sustancia amorfa y mucilaginosa (Costerton y col.,
1992; Tombs y Harding, 1997).

Resulta interesante establecer una diferencia entre el término “exopolisacárido” y otros como
“glicocálix” o “mucílago”. El término “glicocálix” fue introducido por Costerton y colaboradores (1981) y
describe a una sustancia de origen microbiano localizada en la superficie celular; pero que, a diferencia
del término EPS, abarca a un complejo de moléculas entre los que se incluyen componentes
extracelulares y de la pared bacteriana, de naturaleza polisacarídica o no. De modo similar, en
procariotas, el término “mucílago” es más general, y define a aquellos agregados coloidales presentes
alrededor de bacterias, que habitan fundamentalmente en ecosistemas acuáticos, constitutidos por
diversos compuestos entre los que se encuentran los de naturaleza polisacarídica (Leppard, 1995).

La presencia de exopolisacáridos asociados a las células bacterianas se reconoce por la


formación de colonias mucosas en el crecimiento del microorganismo en medio sólido, o bien por un
aumento de viscosidad e incluso a veces la formación de un gel en medios líquidos (Sutherland, 1988).

Para la detección y visualización de los exopolisacáridos se utilizan diversas técnicas. Mediante


microscopía óptica es posible distinguir estas estructuras utilizando colorantes apropiados teniendo en
cuenta la naturaleza aniónica de muchos de estos polisacáridos. En otros casos se realizan tinciones
negativas que ofrecen la ventaja de poder distinguir entre los polisacáridos capsulares y aquellos más
dispersos. Otras técnicas utilizadas con éxito son la microscopía electrónica de barrido (SEM) y la
microscopía electrónica de transmisión (TEM). Las metodologías empleadas para llevar a cabo la
detección de exopolisacáridos microbianos por cualquiera de las técnicas ha de salvar el problema
añadido del alto contenido de agua de estos compuestos (de hasta un 99%), lo cual dificulta la
preparación de las muestras (Sutherland, 1994).

3.2. Funciones biológicas

Los polímeros extracelulares producidos por los microorganismos desempeñan múltiples


funciones que generalmente se traducen en acciones beneficiosas para los mismos (Chen y col.,
1995a,b).

Los exopolímeros intervienen en la adhesión microbiana a superficies (Allison y Sutherland,


1987). En medios acuosos se ha descrito la participación de los polisacáridos extracelulares en la
adhesión microbiana de bacterias aisladas de agua dulce (Sutherland, 1980) y de bacterias marinas

17
Introducción

(Corpe, 1970; Floodgate, 1972), provocando la unión de éstas a un determinado material y su posterior
crecimiento en él, o promoviendo la formación de una compleja película viscosa alrededor de las células
microbianas. Estas biopelículas o biofilms constituyen un entorno dinámico en el que las células
bacterianas parecen alcanzar un estado de homeostasis y una óptima organización para hacer uso de
todos los nutrientes disponibles (Sutherland, 2001b).

La mayoría de los microorganismos presentes en el cuerpo humano se encuentran adheridos a


alguna superficie. Así, el cuerpo de un individuo sano presenta tres tipos principales de superficies a las
cuales pueden adherirse las bacterias: mucosas, piel y dientes. Asimismo, las prácticas médicas y
quirúrgicas modernas emplean un gran número de materiales tales como catéteres, juntas artificiales y
válvulas cardíacas que son susceptibles de sufrir la adhesión bacteriana (Wilson y col., 2002). La
formación de biofilms sobre estas superficies es uno de los mayores problemas asociados al uso de estos
dispositivos, ya que las biopelículas confieren a los microorganismos una gran resistencia a los
2+
antibióticos. Así, la presencia de alginato asociado con Ca en Pseudomonas aeruginosa y del EPS de
Pseudomonas cepacia reduce la actividad antimicrobiana de la tobramicina y en menor grado, de la
ciprofloxacina frente a estas especies (Mah y col., 2003; Moskowitz y col., 2004). Este hecho tiene
importantes implicaciones clínicas en lo que se refiere a tratamientos de infecciones provocadas por
microorganismos productores de exopolisacárido, cuya presencia se relaciona con el carácter virulento de
los mismos (Allison y Matthews, 1992; Ichimiya y col., 1994; Kumon y col., 1994).

Figura 4. Fotografía de microscopía electrónica de bacterias productoras de EPS en un biofilm (www.asm.org)

De modo similar, los exopolisacáridos pueden promover la adhesión de microorganismos a


ciertos materiales específicos (Costerton y col., 1987), como ocurre con Pseudomonas fluorescens, con

18
Introducción

capacidad de unirse rápidamente a las superficies de acero inoxidable (Hood y Zottola, 1997). Este hecho
puede proporcionar a las células el acceso a mayores concentraciones de sustrato y a su vez protección
frente a la fagocitosis (Bitton y Marshall, 1980).

Legionella pneumophila es el agente causal de la legionelosis, una enfermedad respiratoria


aguda, que se produce cuando la bacteria penetra hasta los alvéolos pulmonares introduciéndose en el
citoplasma de las células respiratorias produciendo su lisis. Legionella vive en ambientes acuáticos
naturales de agua dulce (Fliermans y col., 1981) y tiende a colonizar los sistemas de distribución de agua
que utilizan para su funcionamiento las torres de refrigeración, los condensadores evaporativos, aparatos
de enfriamiento evaporativo, humectadores, etc (Martín Bourgon y Pelaz, 1992). En estos casos, si estas
instalaciones funcionan produciendo aerosoles, los microorganismos se dispersan transportados por las
pequeñas partículas acuosas (Ishimatsu y col., 2001), y las que tienen un tamaño inferior a 5 µ pueden
penetrar en los alvéolos pulmonares, infectando a las personas que respiran el aire contaminado.

Legionella persiste en los sistemas hídricos en los que encuentra temperaturas adecuadas para
su reproducción, nutrientes y protección, especialmente en los biofilms de las torres de refrigeración
(Rogers y Keevil, 1992; Wright y col., 1992), preferentemente si existe presencia de determinados
protozoos (Barbaree y col., 1986; Nahapetian y col., 1991) con los que se comporta de forma
endobióntica (Winiecka-Krusnell y Linder, 1999) y frente a los que puede desarrollar diferentes
mecanismos de entrada y salida celular (Harb y col., 1998; Cirillo y col., 2002).

La legionelosis se pone de manifiesto en forma de casos esporádicos, pero también de brotes


epidémicos. Ello ha condicionado que desde 1996 sea considerada como enfermedad de declaración
obligatoria en España, donde se han producido importantes brotes en los últimos años.

Para la desinfección de las torres de refrigeración, recomendada al menos dos veces al año,
existen diversos métodos, ninguno de los cuales asegura la eliminación total de Legionella. La mayoría de
estos métodos son eficaces a corto plazo, pero con el tiempo van perdiendo efectividad debido a las
limitaciones asociadas a cada método (Lin y col., 1998). En cualquier caso, antes de proceder a la
desinfección de este tipo de instalaciones, es imprescindible efectuar una limpieza mecánica de las
mismas, para combatir la protección que la suciedad y los biofilms proporcionan a Legionella, lo que
implica una mayor demanda de biocida, y dificulta el contacto entre éste y el microorganismo.

En la industria alimentaria, la formación de biofilms es también un proceso que preocupa, ya que


puede llegar a causar serios problemas higiénicos y grandes perdidas económicas (Carpentier y Cerf,
1993); por tanto, resulta fundamental encontrar formas de prevenir y/o eliminar la aparición de biofilms en
cañerías, torres de refrigeración, sistemas de lubricación, etc (Meyer, 2003). Una estrategia para prevenir
la formación de biofilms es la desinfección regular de todas las instalaciones, antes de que el biofilm
aparezca. En el caso de que la biopelícula ya haya aparecido, la superficie afectada debe tratarse con un

19
Introducción

biocida suficientemente agresivo. El cloro es el agente de elección en la lucha contra la formación de


biofilms (Alasri y col., 1992), ya que no solo mata a los microorganismos, también elimina los
exopolisacáridos de las superficies afectadas debido a su carácter oxidante, por lo que la adhesión de
nuevos microorganismos y la consiguiente formación de nuevos biofilms está menos favorecida. Otra
manera de luchar contra los biofims bacterianos, es la utilización de superficies que impiden la adhesión
microbiana, y por tanto la aparición de estas biopelículas. En cualquier caso, ninguna de estas estrategias
es efectiva al 100%, y es que cada biofilm es casi único, por lo que en cada caso habrá que estudiar la
posible solución del problema, con una sola estrategia o con la combinación de varias (Meyer, 2003).

Los EPS participan en procesos de morfogénesis, entre ellos, la formación de cuerpos


fructificantes de mixosporas, en las cuales el exopolisacárido parece tener una doble función: como
lubricante de las células vegetativas y posterior adhesivo para facilitar la cohesión entre éstas (Sutherland,
1988).

Otra función de los exopolisacáridos microbianos es la de proteger la célula bacteriana frente a


la desecación y fluctuaciones potenciales del agua, ya que pueden actuar como reservorios de agua
en condiciones drásticas (Robertson y Firestone, 1992; Whitfield y Valvano, 1993) y ralentizan la
desecación de las bacterias del suelo o de las hifas de los hongos (Evans y col., 1991; Whitfield y
Valvano, 1993). A ello hay que añadir su efecto protector frente a agentes antimicrobianos y
cationes metálicos tóxicos. En función de la naturaleza iónica del exopolisacárido, éste será eficaz para
unirse a un determinado tipo de agente antimicrobiano. Así lo demuestran los estudios realizados con el
alginato producido por Pseudomonas aeruginosa y el gelano de Pseudomonas elodea frente a
2+
gentamicina (Kumon y col., 1994). En cuanto a la capacidad de adsorber cationes tóxicos como Cd ,
2+ 2+ + 2+
Pb , Cu , Zn y Sr , existen multitud de exopolisacáridos con esta propiedad, que pueden aplicarse en
biorremediación a la vez que son agentes protectores frente a estos compuestos (Geddie y Sutherland,
1993).

Los exopolímeros bacterianos pueden actuar como una barrera funcional para las células del
sistema inmune, aumentando la resistencia frente a mecanismos mediados por anticuerpos y
complemento. De ahí que muchos microorganismos capsulados deban su patogenicidad a la presencia
de una cápsula polisacarídica alrededor de la célula. Entre ellos podemos citar a Streptococcus
pneumoniae y Streptococcus agalactiae (De Vuyst y Degeest, 1999; Wingender y col., 1999).

En muchas de las bacterias patógenas de plantas, la producción de polisacárido resulta crucial y


en gran medida determinante en el proceso de infección de la planta. Concretamente, el
exopolisacárido excretado por el microorganismo, en forma de un fluído viscoso, puede alterar el
suministro del agua y nutrientes solubles para la planta y con ello disminuir su biodisponibilidad
(Sutherland, 2001a). En este sentido, se han realizado estudios con Xanthomonas campestris var.
phaseoli. En el caso de Sinorhizobium meliloti, el EPS juega un papel importante en el proceso de

20
Introducción

simbiosis con la planta así como en la formación de nódulos y por lo tanto en la fijación de N2 (Keller y
col., 1988; Kannenberg y Brewin, 1994; González y col., 1996).

Los exopolisacáridos microbianos son utilizados en casos muy limitados como reserva de
nutrientes y energía. La mayor parte de las bacterias productoras no son capaces de catabolizar el EPS
que ellas mismas producen (Cerning, 1990), sin embargo estos compuestos pueden favorecer la
retención de nutrientes. De hecho, la acumulación en la matriz del EPS de nutrientes que posteriormente
pueden ser utilizados como fuente de carbono y energía, es un proceso común entre los microorganismos
(Freeman y col., 1995; Wolfaardt y col., 1995); por ejemplo, pueden unir proteínas cuya posterior hidrólisis
puede constituir un suministro de aminoácidos y péptidos necesarios para el crecimiento bacteriano.

3.3. Composición química

Los EPS están compuestos principalmente por carbohidratos, formando homo o heteropolímeros,
que además pueden contener diversos sustituyentes orgánicos e inorgánicos. Los homopolisacáridos son
EPS compuestos por un sólo tipo de monosacárido, aunque difieran en su estructura y propiedades.
Estos EPS pueden ser de origen bacteriano como el curdlano o fúngico como el escleroglucano. Los
heteropolisacáridos presentan en su estructura de 2 a 5 monosacáridos diferentes y son mayoritarios
dentro de los EPS microbianos.

3.3.1. Carbohidratos

Existe una gran diversidad entre los carbohidratos constituyentes de los polisacáridos de origen
microbiano. En la mayor parte de los EPS bacterianos están presentes los azúcares D-glucosa, D-
galactosa y D-manosa; y se encuentran también con gran frecuencia los monómeros L-fucosa, L-ramnosa
y las 6-desoxihexosas (Lindberg, 1990).

La ausencia generalizada de pentosas en los polímeros producidos por organismos procariotas


puede ser una propiedad característica de éstos y una clara distinción con los productos procedentes de
eucariotas. No obstante, se han encontrado algunas excepciones, entre ellas las cianobacterias (De
Philippis y col., 1993) y más recientemente algunos polisacáridos producidos por especies de
Sinorhizobium entre cuyos monosacáridos se encontraron D-ribosa y ácido D-riburónico (Hisamatsu y col.,
1997).

Además de los monosacáridos más comunes que se han citado, algunos polisacáridos pueden
contener azúcares más raros, entre los que podemos citar las L-hexosas o la glucosa y galactosa en su
forma furanosa. Dentro de este grupo de azúcares menos extendidos se encuentran también los
aminoazúcares de algunos polisacáridos de Escherichia coli. La presencia de N-acetilaminoazúcares
también se ha puesto de manifiesto en determinados casos, aunque estas moléculas no han sido

21
Introducción

detectadas en ninguno de los exopolisacáridos microbianos de interés industrial o comercial. Entre los
más comunes se encuentran las N-acetilhexosaminas, N-acetil-D-glucosamina y N-acetil-D-
galactosamina; siendo más inusuales la N-acetil-manosamina y otros aminoazúcares como la fucosamina
y talosamina. El polímero extracelular de Sthaphylococcus aureus cepa M contiene 2-cetoamido-desoxi-D-
fucosa y ácido acetamida-2-desoxi-D-galacturónico (Okutani y Tandavanitj, 1991). Otros EPS como los
extraídos de los géneros Xanthomonas y Klebsiella entre otros, carecen de aminoazúcares.

La mayor parte de los exopolisacáridos microbianos son de naturaleza polianiónica, debido a la


presencia en muchos de ellos de ácidos urónicos, componentes habituales de las moléculas
polisacarídicas. El más frecuentemente encontrado es el ácido D-glucurónico, mientras que en menor
número de polímeros se han detectado los ácidos D-manurónico y D-galacturónico. Aún más inusual es el
ácido L-idurónico, descrito en el EPS de Butyrivibrio fibrisolvens. Por último habría que citar a los ácidos
hexosaminurónicos, dado que se han venido identificando en bastantes exopolímeros bacterianos
(Sutherland, 2001a).

Aunque la mayor parte de los exopolisacáridos contienen un solo tipo de ácido urónico, los
alginatos bacterianos representan una excepción al encontrarse en ellos ácido D-manurónico y ácido L-
gulurónico. De igual forma, en algunos polisacáridos de Rhizobium se ha encontrado ácido D-glucurónico
y ácido D-galacturónico (Lindberg, 1990). Esta singular característica también se ha observado en
polisacáridos aislados de bacterias marinas (Guezennec y col., 1994).

Un último azúcar bastante inusual encontrado como constituyente de algunos exopolisacáridos


microbianos es el ácido cetodeoxioctónico (KDO), componente universal de la porción core o central de
los lipopolisacáridos de la pared de bacterias Gram negativas. Ha sido identificado en varios polisacáridos
extracelulares de cepas de Escherichia coli (Sutherland, 1990).

3.3.2. Sustituyentes orgánicos

En la composición de los EPS microbianos aparecen diferentes sustituyentes unidos mediante


enlace éster o cetal (Tabla 4). Entre los primeros se encuentran los restos acetato, que no contribuyen a
la carga total de la macromolécula, aunque están implicados en su conformación molecular. Además se
han encontrado otros grupos unidos de igual forma como propionato, glicerato, succinato o 3-
hidroxibutanoato. Estos sustituyentes contribuyen, como el acetato, a la naturaleza lipofílica del
polisacárido, lo cual le permitirá ser útil para determinadas aplicaciones industriales. El succinoglicano
producido por especies de Sinorhizobium y Agrobacterium presenta además de sustituyentes O-acetato y
piruvato, grupos O-succinato (Sutherland, 1999; 2001a).

En muchos exopolisacáridos, los grupos acetilo se encuentran en proporción estequiométrica con


los monosacáridos presentes, aunque no siempre ocurre así. En el caso concreto de los alginatos

22
Introducción

bacterianos o xantano, un determinado monosacárido puede encontrarse multiplemente acetilado, lo cual


determina un contenido total de acetilos bastante elevado. Los alginatos presentan del orden del 15-20%
(p/p) de acetilos y únicamente se encuentran acetilados los restos de ácido manurónico.

Los restos piruvato se unen mediante enlace cetal y junto a los ácidos urónicos confieren
naturaleza aniónica al exopolisacárido. Normalmente estos restos están presentes en proporción
estequiométrica con los azúcares integrantes del polímero y usualmente se encuentran unidos a una
hexosa neutra. De forma ocasional se han localizado unidos a un resto urónico o una metilpentosa; este
último caso en un EPS de Klebsiella aerogenes (Lindberg, 1976).

Si bien lo más común es que la carga aniónica total de la molécula polisacarídica se deba a la
presencia de ácidos urónicos y restos piruvato, en algunos casos el piruvato es el único responsable de
este carácter, lo cual ha podido ser constatado para los polisacáridos de algunas especies de Escherichia
coli, Sinorhizobium y el material polimérico producido por Zoogloea ramigera (Sutherland, 1994).

Por último, entre los sustituyentes orgánicos habría que citar algunos aminoácidos. Así, se ha
detectado la presencia de serina o ácido L-glutámico en exopolisacáridos de Escherichia coli K40 y
Klebsiella aerogenes tipo 82, respectivamente. En otros exopolímeros se ha puesto de manifiesto la
presencia de taurina (Sutherland, 1994). Más recientemente, se ha descrito un heteropolisacárido de
naturaleza ácida producido por una especie de Paenibacillus, en el que se ha detectado la presencia de
tirosina (Weon-Taek y col. 1999).

3.3.3. Sustituyentes inorgánicos

Los sustituyentes inorgánicos cuya presencia se encuentra más extendida, son los grupos
fosfato. Muchos de estos exopolisacáridos fosforilados se asemejan a los ácidos teicoicos de la pared
celular de bacterias Gram positivas. Estos sustituyentes no se han encontrado en polisacáridos
producidos por bacterias Gram negativas como Klebsiella, Sinorhizobium, Xanthomonas o Pseudomonas,
aunque sí se han identificado en polímeros de Escherichia coli así como en el EPS de Streptococcus
pneumoniae (Sutherland, 1994).

Aunque hasta hace unos años se pensaba que la presencia de grupos sulfato era exclusiva de
los polisacáridos de organismos eucariotas, se ha demostrado la existencia de estos grupos en algunos
exopolisacáridos microbianos. Así, además de estar presentes en polímeros de ciertas especies de
cianobaterias, también se han encontrado en el polisacárido producido por la arquea halófila Haloferax
mediterranei, que se caracteriza por una elevada masa molecular, además de por originar soluciones
viscosas, presentando un 6% (p/p) de sulfatos (Antón y col., 1988; Rodríguez-Valera y col., 1991) así
como en un EPS de Staphylococcus epidermis (Arvaniti y col., 1994). Algunas bacterias marinas del

23
Introducción

género Pseudomonas (Matsuda y col, 1993) también se caracterizan por la detección de sulfatos en sus
exopolisacáridos.

Nuesto grupo de investigación ha puesto de manifiesto la presencia de elevadas cantidades de


sulfato en los exopolisacáridos producidos por tres bacterias halófilas moderadas como son Halomonas
eurihalina (Béjar y col., 1998; Calvo y col., 1998), Halomonas maura (Arias y col., 2003; Bouchotroch y
col., 2001) y Halomonas ventosae (Martínez-Cánovas y col., 2004c).

Tanto los grupos sulfato como fosfato se unen a la molécula del polisacárido mediante enlaces
tipo éster (Lindberg, 1990).

Los cationes también forman parte de la estructura de los EPS y se encuentran especialmente en
2+
polímeros polianiónicos. Así, algunos alginatos llevan fuertemente unidos cationes divalentes como Ca ,
2+
Ba y Sr2+; mientras que el polisacárido XM6 de Enterobacter presenta cationes mono y bivalentes como
+ 2+
Na y Ca . Estos iones quedan adheridos al polisacárido durante su producción, pero pueden ser
desplazados por procesos tales como intercambio iónico, electrodiálisis, etc.

Tabla 5. Sustituyentes orgánicos e inorgánicos más frecuentes de los exopolisacáridos microbianos


(Sutherland, 2001a).

Sustituyentes Unión Microorganismo


ORGÁNICOS
Acetato Éster Klebsiella spp.
Glicerato Éster Sphingomonas paucimobilis
Hidroxibutanoato Éster Rhizobium trifolii, R. leguminosarum.
Propionato Éster Algunas cepas de Escherichia coli
Piruvato Cetal Xanthomonas campestris, Klebsiella spp.
Succinato Éster Rhizobium spp., Agrobacterium spp.
INORGÁNICOS
Fosfato Éster Bacterias Gram positivas
Cianobacterias, Haloferax mediterranei,
Sulfato Éster Halococcus, Staphylococcus epidermidis,
Halomonas spp.

24
Introducción

3.4. Estructura

Las causas de la enorme variedad de exopolisacáridos son la diversidad de las unidades básicas
que los constituyen, la cantidad en que están presentes y los distintos tipos de enlaces que determinan la
configuración final.

Los homopolisacáridos se pueden clasificar en función del tipo de enlace en β-D-glucanos y α-


D-glucanos. Los β-D-glucanos son polímeros lineales formados por moléculas neutras unidas mediante un
sólo tipo de enlace (curdlano y celulosa) y polímeros que presentan ramificaciones y dos tipos de enlaces
(escleroglucano y levano). Los α-D-glucanos son polímeros que presentan ramificaciones en sus
estructuras y tres o más tipos de uniones (dextranos).

Los heteropolisacáridos están constituídos por unidades repetidas que varían en cuanto a
naturaleza y tamaño (disacáridos, tetrasacáridos, pentasacáridos, etc.). En las unidades repetidas, cada
hexosa puede presentar un enlace de tipo α o β, o los dos a la vez (heparina), además de estar presente
en su forma piranósica o furanósica. El punto de enlace de los azúcares varía también entre las
posiciones 2, 3, 4 ó 6.

3.4.1. Homopolisacáridos

3.4.1.a. β-D-glucanos

• Celulosa
Tradicionalmente se ha considerado como un polímero exclusivo
de plantas y algas, pero hay algunas bacterias Gram negativas
como Acetobacter xylinum que también lo producen (Colquhoun y
col., 1995; Delmer y Amor, 1995). Este exopolisacárido,
constituido por moléculas de D-glucosa unidas por enlaces β-1,3,
se excreta al medio y rápidamente se agrega formando micro
fibrillas (Sutherland, 1988), como puede apreciarse en la Figura
5. La celulosa bacteriana es un producto de alto valor por sus
aplicaciones y usos específicos (Ross y col., 1991; Vandamme y
col., 1998). Comercialmente, se produce en la forma llamada
I-celulosa, polímero de alta pureza y libre de lignina.
Figura 5. Celulosa sintetasa

25
Introducción

• Curdlano

Un gran número de bacterias, incluyendo Alcaligenes faecalis var. myxogenes (Harada y col.,
1966), distintas especies del género Agrobacterium (Nakanishi y col., 1976; Hisamatsu y col., 1978) y la
cepa Rhizobium trifolii J60 (Ghai y col., 1981) sintetizan este polímero.

El curdlano presenta una estructura simple con una baja masa molecular y enlaces β-1,3 entre
las moléculas de D-glucosa que lo constituyen. Es insoluble en agua y forma geles en solución (Harada y
col., 1966). Lawford y Rousseau (1992) patentaron la producción de curdlano por Alcaligenes faecalis var.
myxogenes (ATCC 31749), utilizando una fermentación aeróbica seguida de una limitación de nitrógeno
asimilable.

• Escleroglucano

Con este nombre se designa a una serie de polisacáridos neutros producidos por varias especies
de hongos, particularmente del género Sclerotium (Sutherland, 1990). Su estructura primaria es una
cadena lineal de unidades de D-glucosa unidas mediante enlace β-1,3 con cadenas ramificadas de un
único monómero de D-glucosa, cada 3 unidades azucaradas de la cadena principal. La diferencia entre la
gran variedad de β-D-glucanos fúngicos radica en el número de ramificaciones y en la longitud de las
5 6
cadenas laterales. La masa molecular de la mayor parte de ellos se encuentra entre 3,2x10 y 1x10 Da.

3.4.1.b. α-D-glucanos

• Dextrano
Los dextranos están constituidos por residuos de D-glucosa
unidos por enlaces α-1,6 en su mayoría, aunque hasta un
50% pueden ser enlaces α-1,2, α -1,3 y α-1,4 (Figura 6).
Los que se comercializan contienen principalmente enlaces
α-1,6. La mayoría son exopolímeros de alto peso molecular
y su producción industrial se realiza principalmente a partir
de Leuconostoc mesenteroides (Jeanes, 1974), que origina

Figura 6. Estructura de los dextranos un EPS con un 95% de enlaces α-1,6 y un 5% de uniones
5
α-1,3. Tiene una masa molecular aproximada de 6-9x10 Da.

26
Introducción

• Elsinano y Pululano

El elsinano es un exopolisacárido producido por Elsinoe leucospila (Sutherland, 1990) muy


parecido estructuralmente al pululano, exopolisacárido sintetizado por el hongo dimórfico Aureobasidium
pullulans compuesto por unidades repetidas de maltotriosa unidas por enlaces α-1,6. La única diferencia
entre ellos radica en el tipo de enlace mediante el que se unen los monosacáridos ya que en el elsinano
encontramos enlaces α-1,3. Recientemente se ha estudiado la producción de pululano a partir de residuos
hidrolizados de almidón de patata (Barnett y col., 1999). Otras especies de hongos, como Tremella
mesenterica, originan unos productos muy similares (de Baets y col., 2002).

3.4.2. Heteropolisacáridos

• Alginatos bacterianos

La producción de alginato no es exclusiva de las algas. Entre las bacterias capaces de sintetizar
polímeros del tipo de los alginatos (alginatos bacterianos) podemos citar a Pseudomonas aeruginosa
(Linker y Jones, 1964; 1966) y Azotobacter vinelandii (Gorin y Spencer, 1966). Más recientemente se ha
descrito la producción de este exopolisacárido en A. chroococcum (Peciña y Paneque, 1994), P.
fluorescens y P. putida (Conti y col., 1994) y otras especies de Pseudomonas, incluídas algunas
patógenas de plantas (Fett y col., 1986; Osman y col., 1986).

Los alginatos bacterianos se caracterizan por presentar una estructura muy irregular, sin una
unidad repetitiva determinada. En su molécula no existen monosacáridos neutros, encontrándose
compuestos por ácido D-manurónico (M) (unidos por enlaces β-1,4) y ácido L-gulurónico (L) (unidos por
enlaces α-1,4) (Clare, 1993). A lo largo de la cadena se localizan tres tipos de secuencias: de ácido D-
manurónico, de ácido L-gulurónico y mixtas. Es bastante frecuente que los restos manosil se encuentren
acetilados, siendo la presencia de los grupos O-acetilo una característica de los alginatos bacterianos que
les distingue de los producidos por algas (Sime, 1990). Precisamente el grado de acetilación y el
contenido en ácido D-manurónico y L-gulurónico es lo que determina las diferencias estructurales y
funcionales de los distintos alginatos bacterianos (Sutherland, 1994; Clementi y col., 1997).

• Emulsano y polisacáridos relacionados

Acinetobacter calcoaceticus, bacteria Gram negativa degradadora de hidrocarburos, produce


exopolisacáridos con alta capacidad emulsionante. Esta propiedad es característica de la especie pues se
han descrito en biopolímeros de distintas cepas de la misma (Rosemberg y col., 1979a).

27
Introducción

En concreto, la cepa A. calcoaceticus RAG-1 produce un heteropolímero aniónico (emulsano),


que contiene N-acetil-D-galactosamina, ácido N-acetil-aminurónico y un aminoazúcar (Zuckerberg y col.,
1979). Este emulsano, además de una potente actividad emulsionante, tiene la capacidad de fijar uranio.

En el estudio de los polímeros similares al emulsano producidos por otras cepas de A.


calcoaceticus, como la cepa BD413 y la BD4, se comprobó que la distinta actividad emulsionante de estas
moléculas no era debida a diferencias en las estructuras químicas, ya que estas moléculas son muy
similares. No obstante, la presencia en el emulsano de ácidos grasos de elevado peso molecular unidos
covalentemente parece estar relacionada con su capacidad emulgente (Kaplan y col., 1987).

• Xantano

Este polímero, el de origen microbiano de mayor interés, es de naturaleza aniónica y es secretado


exocelularmente por Xanthomonas campestris (Lilly, 1958). Su estructura primaria se basa en una cadena
lineal de moléculas de D-glucosa unidas por enlace β-1,4. En la posición C3 de los residuos D-
glucosídicos alternos existe una cadena lateral trisacarídica constituida por ácido D-glucurónico y D-
manosa en proporción molar 1:2 (Jansson y col., 1975; Melton y col., 1976). Esta ramificación es una
cadena del tipo β-D-manosa-(1,4)-β-D-glucurónico-(1,2)-α-D-manosa. La manosa terminal presenta
grupos piruvato en las posiciones 4 y 6; y la unidad de manosa interna se encuentra acetilada en la
posición 6. El grado de acetilación y piruvatación de la molécula puede variar dependiendo de la cepa de
X. campestris productora así como de las condiciones de producción. La estructura del xantano está
representada en la Figura 7.

Figura 7. Estructura química del xantano

28
Introducción

• Gelano y polímeros relacionados

Este exopolisacárido producido por Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461 (Pollock, 1993),
antes Pseudomonas elodea (Lobas y col., 1992), es un heteropolisacárido lineal constituido por D-
glucosa, ácido D-glucurónico y L-ramnosa en proporción 2:1:1; siendo la unidad de repetición un
tetrasacárido (Figura 8). A lo largo de la cadena principal están presentes grupos O-acetilo y O-L-glicerilo.
La presencia o no de los restos acetilo en la molécula es crucial ya que determina las propiedades del gel
originado por este polímero. Otros polímeros relacionados estructuralmente con el gelano son el welano y
el rhamsano (Sutherland y Kennedy, 1996).

Figura 8. Molécula de gelano

• Exopolisacáridos de Halomonas eurihalina

El EPS V2-7 es producido por la cepa F2-7 de Halomonas eurihalina (Quesada y col., 1993). Es
un heteropolisacárido con carácter ácido cuya producción y composición química varía en función de los
nutrientes presentes en el medio de cultivo (Béjar y col., 1996). Sus soluciones acuosas presentan una
viscosidad intermedia bastante termoestable. Esta propiedad, junto con la capacidad de formar
verdaderos geles a pH ácido y su poder emulgente, le confiere unas cualidades óptimas para diversos
usos industriales (Calvo y col., 1995). Respecto a su composición química, está formado por glucosa,
manosa y ramnosa en proporción 2,9:2,5:1. Es importante resaltar la presencia en este polímero de un
porcentaje superior al 10% (p/v) de restos sulfato (Béjar y col., 1996; 1998), algo inusual entre los
polisacáridos microbianos. Su composición química podría ser responsable de su efecto
inmunomodulador; de hecho, se ha comprobado su capacidad de estimular la proliferación de linfocitos T
humanos extraídos de sangre periférica cuando se utiliza como estímulo antigénico de anticuerpo
monoclonal AntiCD3 (Pérez y col., 2000).

El exopolisacárido H96 es producido por la cepa H96 de Halomonas eurihalina (Quesada y col.,
1993), este polímero es obtenido con un rendimiento de 1,3 g EPS/l y origina soluciones de viscosidad
intermedia a néutro (pH=7). Sin embargo, a pH ácido (pH=3) presenta un comportamiento similar al

29
Introducción

polímero V2-7, produciéndose un incremento de la viscosidad hasta unos 30.000 mPa.s, lo que ocasiona
la formación de un gel (Béjar y col., 1998). La máxima viscosidad se obtiene en presencia de KCl 10-4 M
(Calvo y col., 1998). Otra propiedad de este polímero es su poder emulgente sobre hidrocarburos y otras
sustancias lipídicas (Calvo y col., 1998). En su composición también se ha detectado la presencia de
restos sulfato además de un elevado contenido de ácidos urónicos (Béjar y col., 1998; Calvo y col., 1998).

• Maurano, exopolisacárido producido por Halomonas maura

El maurano (Arias y col., 2003) es producido por Halomonas maura cepa S-30 (Bouchotroch y
col., 2001). Se caracteriza por su poder viscosizante y propiedades emulgentes (Bouchotroch y col.,
2000). Así, sus soluciones acuosas son altamente viscosas y muestran un comportamiento
pseudoplástico, viscoelástico y tixotrópico. La viscosidad se mantiene estable a un amplio rango de
valores de pH (3-11), tras procesos de congelación y descongelación y en presencia de sacarosa, sales y
surfactantes. Presenta una alta capacidad de captación de plomo y otros cationes, lo que permitiría su uso
potencial en procesos de biorremediación. De su composición química destaca su alto contenido en
6
restos sulfato. Su masa molecular es de 4,7x10 Da, y está compuesto por manosa, galactosa, glucosa y
ácido glucurónico en proporciones 34,8%, 14%, 29,3% y 21,9% (p/p), respectivamente.

Otros heteropolisacáridos microbianos de diversa procedencia son:

Polisacáridos capsulares producidos por Burkholderia pseudomallei. Se trata de tres


polisacáridos diferentes sintetizados por B. pseudomallei. En medios sin glicerol se producen los tipos
CP1a y CP1b, tratándose de un glucano con uniones 1-4 el primero y un polímero de galactosa y ácido 3-
desoxi-D-manooctulosómico el segundo. En medios con glicerol al 5% (p/v) se produce el tercer
polisacárido, el CP2. Éste presenta en su composición galactosa, ramnosa, manosa, glucosa y ácido
urónico en proporciones 3:1:0,3:1:1 (Kawahara y col., 1998).

Polisacárido de Lactococcus lactis subsp. cremoris B891. Es un heteropolisacárido


compuesto por galactosa y glucosa en proporción 2:3 (Van Casteren y col., 2000).

Polisacárido producido por especies del género Pseudomonas. En 1996, Watanabe y


colaboradores identificaron la producción de EPS por bacterias del género Pseudomonas capaces de
utilizar hidrocarburos del petróleo como fuente de carbono. La función de este exopolisacárido parece ser
la de proteger a la célula de los componentes tóxicos del medio.

Alasano. Producido por la cepa Acinetobacter radioresistens KA53 (Juni y Janick, 1969; Juni,
1978). Este heteropolisacárido está formado por monómeros de galactosa, galactosamina, alanina,
glucosamina, glucosa, proteínas y presenta una gran actividad emulgente cuando crece en medios con
etanol como fuente de carbono (Navon-Venezia y col., 1995).

30
Introducción

Polisacárido WN9, producido por Paenibacillus sp. (Weon-Taek y col., 1999). Está formado
6
por D-glucosa y D-manosa (1:1,4) y posee una masa molecular de 31,5x10 Da. Los estudios reológicos
han demostrado que su comportamiento pseudoplástico y la viscosidad de sus soluciones permanecen
estables a diferentes valores de temperatura y pH.

Jamilano. Producido por Paenibacillus jamilae (Aguilera y col., 2001). Está formado por glucosa,
manosa, galactosa, fucosa y ramnosa. Tras someterse a estudios reológicos mostró una marcada
capacidad viscosizante y un comportamiento pseudoplástico. Asimismo, este polisacárido mostró
capacidad para captar metales pesados, especialmente plomo (García-Ribera, 2003).

Polisacáridos producidos por Aerobasidium pullulans (Cescutti y col., 2002). Este


microorganismo, al crecer sobre glucosamina como fuente de carbono, no sólo sintetiza pululano, sino
también una mezcla compleja de otros dos polisacáridos constituídos de forma mayoritaria por manosa y
galactosa. Un estudio mediante RMN mostró que uno de los polímeros estaba formado exclusivamente
por manosa mientras que el otro contenía restos galactofuranosilos y manopiranosilos.

Polisacáridos producidos por Lactobacillus plantarum EP56 (Tallon y col., 2003). Este
microorganismo, aislado de un silo de maíz, cuando es cultivado en medio definido, es capaz de producir
dos tipos de exopolisacárido: una fracción que permanece unida a la célula, y otra que es liberada al
medio de cultivo. La fracción unida a la célula está constituida por un único exopolisacárido de una masa
5
molecular de 8,5 x 10 Da, y está constituido por glucosa, galactosa y N-acetilgalactosamina. La fracción
liberada en el medio de cultivo está constituida a su vez por dos exopolisacáridos, uno igual al que
4
constituye la fracción unida a la célula, más otro de menor masa molecular (4 x 10 Da) y compuesto de
glucosa, galactosa y ramnosa. Ambas fracciones contienen grupos fosfato, lo que les confiere carga
negativa, y potenciales aplicaciones en medicina, ya que estos sustituyentes son necesarios para la
activación de los linfocitos (Kitazawa y col., 2000; Nishimura-Uemura y col., 2003) y para la actividad
antitumoral (Ebina y col., 1995; Kitazawa y col., 1998).

3.5. Conformación molecular

A pesar de existir muchos polímeros con estructuras químicas primarias similares, se ha


comprobado que difieren en solubilidad y algunas propiedades físicas; de ahí que el análisis de la
estructura terciaria o superestructura de la molécula polisacarídica, así como el de las interacciones
intermoleculares, sea de gran importancia para encontrar los determinantes de ciertas propiedades
fisicoquímicas de los exopolisacáridos (Sutherland 1994).

Las cadenas lineales de los polisacáridos pueden asociarse de diversos modos, dando lugar a la
formación de un entramado complejo que vendrá condicionado por la flexibilidad y rigidez de las cadenas.
Así, se encuentran diferentes conformaciones moleculares como la laminar y la doble o triple hélice

31
Introducción

(Figura 9). El tipo de estructura terciaria adoptada es, en gran medida, dependiente de los tipos de
sustituyentes presentes en la molécula y su disposición.

En muchos de los EPS examinados, la conformación más favorable presenta las fracciones
cargadas de las moléculas en la periferia, donde pueden interaccionar con las moléculas de agua y con
distintos iones (Atkins y col., 1973). Estos grupos cargados determinan la solubilidad del polímero en
agua.

A B C

Figura 9. Distintos tipos de conformación molecular de los exopolisacáridos microbianos. (A) Laminar, (B) doble hélice
y (C) triple hélice.

Para determinar la estructura y la conformación de un polisacárido bacteriano, se puede utilizar la


técnica de difracción de rayos X de las formas cristalinas de los polímeros (Atkins y col., 1973; Sutherland,
1990). Asimismo se emplean técnicas de dispersión de luz o “light scattering” que aportan datos acerca
del estado ordenado o desordenado de los polisacáridos e indican la temperatura a la cual ocurre la
transición de uno a otro estado (Sutherland, 1988). Los estudios reológicos, fundamentalmente los
ensayos de oscilación, además de la determinación de la viscosidad de las soluciones de exopolímero,
contribuyen en cierto grado al conocimiento de los dos tipos de conformación y acerca de la temperatura a
la que se produce la transición de un estado ordenado a otro desordenado, denominada “temperatura de
transición conformacional” o Tm (Macosko, 1994; Pelletier y col., 2001).

3.6. Biosíntesis de los exopolisacáridos

La biosíntesis de los exopolisacáridos microbianos en bacterias Gram negativas es un proceso


que en líneas generales se asemeja al de la síntesis del peptidoglicano o del lipopolisacárido de la pared
celular bacteriana. Se pueden distinguir cinco etapas (Figura 10):

32
Introducción

a) Síntesis de precursores activados: UDP-glucosa, UDP-glucurónico, GDP-manosa, etc.


Las enzimas responsables están localizadas en el citoplasma (Whitfield, 1988).
b) Ensamblaje de las unidades: Tiene lugar la formación de un glicolípido intermediario por
acción de glicosil-transferasas específicas, situadas probablemente sobre la cara interna de
la membrana citoplasmática donde los precursores se encuentran disponibles (Reuber y
Walker, 1991). Se produce una transferencia secuencial de los correspondientes
precursores activados a un lípido aceptor intermediario, localizado en la membrana
plasmática (Leigh y Coplin, 1992). Este lípido es un isoprenoide monofosforilado del tipo
undecaprenol fosfato (C55-P), similar al descrito para la síntesis del LPS y del peptidoglicano
(Whitfield, 1988).

Exportaci ón
MEMBRANA
EXT ERNA
Pol imeri zación

PERIPLASMA
Ensamblaje de P P
las unidades
C55 Li gación a mo lécula
lipídi ca t erminal

Defosfo rila ció n y MEMB RANA


reciclaje del lípido CITOPLASMÁT ICA
transportador

C55 C 55 P

P P
Síntesi s CI TOPLA SMA
de
precursores
P

P azúcar activado C5 5 lípido Molécula lipídica


transportador terminal

Figura 10. Etapas generales de la biosíntesis de exopolisacáridos, cápsulas y lipopolisacáridos en bacterias Gram
negativas.

33
Introducción

c) Adición de sustituyentes: El acetato y el piruvato son transferidos a partir de acetil-CoA y


fosfoenolpiruvato (PEP) mediante la acción de las enzimas acetiltransferasas I y II, y
cetalpiruvato-transferasas (Ielpi y col., 1981; 1983; Stankowski, 1993).

d) Polimerización: Estudios in vitro indican que este proceso se realiza por transferencia de la
cadena en crecimiento al extremo reductor de una nueva unidad básica que se encuentra
unida al transportador (Ielpi y col., 1993). El transportador lipídico es eliminado de la
molécula en crecimiento durante la reacción de adición por desfosforilación, proporcionando
así energía para la polimerización. Estas reacciones tienen lugar en la cara interna de la
membrana citoplasmática.

e) Exportación del polisacárido a la superficie celular: Esta etapa es la menos conocida.


Algunos autores creen que existen sistemas de traslocación específicos como proteínas
transportadoras (Fath y Kolter, 1993), a través de las cuales los polímeros son conducidos
en sus formas más extendidas o casi lineales (Palmen y col., 1994). Sin embargo, otros
autores consideran que la secreción del EPS ocurre al mismo tiempo que la polimerización
de sus unidades, ya que ésta última se vería impedida por el tamaño del mismo (Ielpi y col.,
1993). Existen modelos propuestos de complejos de proteínas implicadas en la biosíntesis y
transporte para el ensamblaje de las cápsulas de Escherichia coli (Whitfield y Roberts,
1999).

3.7. Genética de los exopolisacáridos

Los estudios genéticos llevados a cabo en esta área indican que los genes implicados en la
biosíntesis de los EPS se encuentran generalmente en el cromosoma bacteriano, y se organizan en
clústers con más de una unidad transcripcional (Whitfield y Valdano, 1993). No obstante, se han
encontrado determinantes genéticos de producción de EPS en plásmidos (Vedamuthu y Neville, 1986;
Vescoso y col., 1989; Von Wright y Thinkkynen, 1987). Algo similar ocurre en la disposición de los genes
que codifican para la síntesis y exportación de los polisacáridos capsulares (CPS) (Roberts, 1996).
Muchos de esos genes ya se encuentran caracterizados.

En los últimos años, la investigación en exopolisacáridos también se dirige a la búsqueda de los


genes implicados en la despolimerización, asimilación y transporte de los mismos al interior de las
bacterias, cuando son utilizados como fuente de carbono y energía (Hashimoto y col., 1999). Se han
caracterizado y purificado distintas enzimas con actividad liasa específicas que degradan el xantano,
producidas por Paenibacillus alginolyticus XL-1 (Ruijssenaars y col., 1999) y por algunas especies de
Bacillus (Nankai y col., 1999) y otra que despolimeriza los alginatos, producida por Azotobacter
chroococcum (Pecina y col., 1999).

34
Introducción

Actualmente, los estudios sobre el acetano (Griffin y col., 1996a,b; 1997a,b), el succinoglicano
(Glucksmann y col., 1993; Reuber y Walter, 1993a,b; Leigh y Walter, 1994; González y col., 1996; 1998;
Mendrygal y González, 2000; Niemeyer y Becker, 2001; Quester y Becker, 2004; Yao y col., 2004), el
emulsano (Bayer y col., 1983; Nakar y Gutnick, 2001), el metanolano (Yoshida y col., 2003), algunas
bacterias ácido lácticas como Lactobacillus delbruckii subsp. bulgaricus (Lamothe y col., 2002) y
especialmente el xantano, como detallamos a continuación, constituyen los modelos más complejos de la
biosíntesis y regulación genética de los exopolisacáridos.

Aspectos genéticos de la biosíntesis del xantano

Xanthomonas campestris es un microorganismo patógeno de plantas causante de la


podredumbre negra, que ocasiona marchitamiento por oclusión de los vasos del xilema e interfiere en el
transporte de agua. Esta bacteria produce un exopolisacárido extracelular conocido como xantano, que
interviene en dicha infección y presenta un enorme interés industrial (Coplin y Cook., 1990; Leigh y Coplin,
1992). Su estudio se ha visto estimulado por el éxito alcanzado en su comercialización, ya que es utilizado
en la preparación de adhesivos, alimentos, cosméticos, productos farmacéuticos, pinturas, etc., como ya
hemos indicado anteriormente. Tiene particular importancia en la industria del petróleo, para la
recuperación secundaria de los yacimientos.

En los estudios genéticos realizados en este microorganismo, se ha demostrado que los genes
involucrados en la síntesis de azúcares activados (regiones xpsIII, IV y VI), están físicamente separados
de los que codifican el ensamblaje de los intermediarios lipídicos, polimerización y secreción del xantano
(región xpsI o genes gum). La región xpsIII contiene los genes xanA y xanB: xanA codifica una enzima
con actividad fosfoglucomutasa y fosfomanomutasa y xanB codifica para una enzima bifuncional con
actividad fosfomanosaisomerasa y GDP-manosa pirofosforilasa. Mutaciones en la región xpsIV afectan la
actividad de la enzima UDP-glucosa pirofosforilasa, mientras que mutaciones en la región xpsVI elimina
por completo los niveles de UDP-glucosa deshidrogenasa (Harding y col., 1993). Los genes que codifican
estas actividades se han secuenciado y los distintos mutantes han sido caracterizados (Lin y col., 1995;
Wei y col., 1996). Todos ellos originan el mismo fenotipo: no producen xantano in vivo, pero producen
intermediarios lipídicos y oligosacáridos cuando se adicionan azúcares activados en sistemas in vitro
(Harding y col., 1993).

Los genes responsables de la síntesis de intermediarios lipídicos, ensamblaje y exportación del


xantano, se encuentran agrupados en una región de 16kb denominada xpsI o gum. Dicha región ha sido
secuenciada y en ella se identifican 12 marcos abiertos de lectura u ORF (Open Reading Frame) (Figura
11), denominados gumB, C, D, E, F, G, H, I, J, K, L y M (Harding y col., 1987), cuyas funciones se
describen a continuación (Katzen y col., 1998).

35
Introducción

gumB gumC gumD gumE gumF gumG gumH gumI gumJ gumK gumL gumM

Polimerización y transporte
Formación del intermediario lipídico
Adición de grupos acetilo
Adición de grupos piruvato

Figura 11. Clúster de genes gumB-M de Xanthomonas campestris.

La biosíntesis de xantano tiene lugar a partir de precursores de azúcares activados, acetil-CoA y


fosfoenol piruvato presentes en el citoplasma, y un lípido poli-isoprenol fosfato localizado en la membrana
citoplasmática que actúa como aceptor de azúcares (Ielpi y col., 1981; 1983; 1993). La síntesis de las
unidades básicas comienza con la transferencia de glucosil-1-P desde UDP-glucosa hasta el poli-
isoprenol fosfato por acción de la proteína GumD. A continuación, la proteína GumM cataliza la adición de
una segunda glucosa enlazada por unión β-1,4 y seguidamente se transfiere una manosa por enlace α-
1,3 mediante GumH, para continuar con ácido glucurónico formando un enlace β-1,2, gracias a GumK y
finalizar con la adición de una segunda molécula de manosa en enlace β-1,4 por GumI. El pentasacárido
adherido al lípido es adicionado de residuos acetilo y pirúvico, donados por las moléculas acetil-CoA y
fosfoenolpiruvato respectivamente. GumL incorpora residuos piruvato a la manosa externa, mientras que
los grupos acetilos son incorporados a la manosa interna por GumF y a la externa mediante GumG. El
estudio del proceso de polimerización indica que el xantano crece a nivel del extremo reducido (Ielpi y
col., 1993). El mecanismo de liberación del EPS no ha sido bien determinado pero parece estar asociado
al proceso de polimerización. Mutaciones en los genes gumB, gumC y gumE dan lugar a la acumulación
intracelular de unidades de xantano, lo cual indica que estos genes son necesarios para la polimerización
y el transporte del polímero. El papel de la proteína GumJ aún no se ha determinado.

Mediante análisis transcripcional se ha demostrado que los genes gum se expresan como un
operón, desde un único promotor localizado corriente arriba del primer gen, gumB, aunque se han
identificado promotores secundarios delante del gen gumK (Katzen y col., 1996) y gumD (Pollock y col.,
1994; Vanderslice y col., 1990).

Con respecto a la regulación de la biosíntesis de xantano, no se conocen sistemas de control


específicos. Los conocimientos que se tienen derivan de estudios de fitopatogenicidad. Aunque el xantano
no es esencial para la virulencia sobre la planta (Katzen y col., 1998), las etapas iniciales de su biosíntesis
parecen estar reguladas como parte de un regulón de patogenicidad (Coplin y Cook, 1990).

36
Introducción

3.8. Ingeniería genética aplicada a la mejora de cepas productoras de exopolisacáridos

Las propiedades funcionales de un exopolisacárido determinan su aplicación en el ámbito


industrial. Dichas propiedades, a su vez, vienen determinadas por su masa molecular, enlaces
establecidos entre los distintos azúcares, grado de ramificación y composición química. La aplicación de
la ingeniería genética en el campo de los exopolisacáridos va dirigida a la obtención de cepas con un
mayor rendimiento en la síntesis de EPS, o que sinteticen polisacáridos con distinta composición química,
estructura o de longitud de cadena diferente.

Una buena posibilidad para la obtención de cepas con mayor producción de EPS es posible en
aquellos casos en los que la eficiencia de conversión de la fuente de carbono en polisacárido sea baja. Un
ejemplo lo encontramos en Sphingomonas paucimobilis ATCC 31461 en el que la tasa de conversión de
azúcar en gelano es tan sólo del 40-50% (Vartak y col., 1995) comparado con el 60-80% obtenido por
Xanthomonas campestris en la síntesis de xantano (Linton, 1990). La aplicación industrial de los EPS
producidos por bacterias ácido-lácticas está fuertemente reñida con los bajos niveles de producción que
varía entre 50 y 500 mg/l. Concretamente, la cantidad de EPS sintetizada por Streptococcus termophilus
es normalmente menor del 1% de la fuente de carbono presente en el medio (De Vuyst y Degeest, 1999).

En Sphingomonas paucimobilis ATCC31461 se han realizado esfuerzos para aumentar la


eficiencia de síntesis de gelano a partir de azúcares. Una de las estrategias seguidas fue el bloqueo de la
ruta de síntesis de poli-β-hidroxibutirato, mediante mutagénesis al azar, ya que este compuesto se
sintetiza a partir de los mismos azúcares que el gelano; sin embargo, no se obtuvo un efecto positivo en la
eficiencia de producción (Baird y Cleary, 1994). Por otro lado, mediante mutagénesis dirigida se
interrumpió el gen zwf, que codifica para glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, con el fin de dirigir el flujo de
carbono hacia la síntesis de gelano, pero no se obtuvieron los resultados esperados (Vartak y col., 1995).

También mediante mutagénesis al azar con el transposón mini-Tn5, se ha obtenido un mutante


superproductor de maurano (mutante TK26), EPS sintetizado por la cepa S-30 de Halomonas maura
Dicho mutante produjo un EPS, denominado maurano 26, con un 28% más de redimiento que la cepa
salvaje. El maurano 26 presentó la misma composición química y propiedades reológicas que el maurano.
Por ello, la cepa TK26 ha sido protegida bajo patente (Arias y col., 2002).

Se ha intentado controlar la producción de gelano a nivel de la biosíntesis de azúcares activados.


En la Figura 12 se muestra la ruta propuesta para la biosíntesis de este polímero (Martins y Sá-Correia,
1993), donde la enzima crucial en el proceso es la fosfoglucomutasa (PGM) que cataliza la síntesis de
glucosa-1-fosfato (G1P) a partir de glucosa-6-fosfato (G6P). La G6P es utilizada en procesos de glucolisis
para la obtención de biomasa, poder reductor y energía, mientras que la G1P se emplea en la biosíntesis
de azúcares precursores para la formación de polisacáridos celulares. A partir de G1P, en una reacción

37
Introducción

catalizada por UDP-glucosa pirofosforilasa (UGP), se sintetiza UDP-glucosa que indirectamente está
implicada en la síntesis de otros azúcares activados, como UDP-ácido glucurónico mediante la enzima
UDP-glucosa deshidrogenasa. El aumento de la expresión individual de los genes que codifican para
ambas enzimas (PGM y UGP), así como para la glicosiltransferasa que cataliza la adición de la primera
molécula de azúcar al lípido transportador, no causó un efecto positivo en la producción de gelano
(Martins y Sá-Correia, 1993). Sin embargo, el incremento simultáneo de los niveles de PGM y UDP-
glucosa pirofosforilasa dio lugar a un aumento del 20% de la producción de gelano y sus preparaciones
acuosas presentaron además mayor viscosidad. Un resultado similar fue obtenido para el esfingano S7
producido por Sphingomonas S7 (Thorne y col., 2000). En Sphingomonas termophilus LY03, la expresión
simultánea de ambos genes también dio lugar un aumento significativo de la producción de EPS
(Levander y col., 2002).

UDP-Glucosa UDP-Ácido glucurónico


UGP
Fructosa PGI Glucosa PGM Glucosa
6-fosfato 6-fosfato 1-fosfato GELANO

TGP
TDP-Glucosa TDP-Ramnosa
TRS

Biomasa
ATP
Poder reductor

Figura 12. Biosíntesis del gelano (Martins y Sá-Correia, 1993). PGI, fosfoglucosa isomerasa; PGM, fosfoglucosa
mutasa; UGP, UDP-glucosa pirofosforilasa; UDP-glucosa, uridina 5-difosfato D-glucosa; UDP-ácido glucurónico, uridina
5-difosfato ácido D-glucurónico; TGP, timidina 5-difosfato D-glucosa pirofosforilasa; TDP-glucosa, timidina 5-difosfato
D-glucosa; TRS, timidina 5-difosfato L-ramnosa sintetasa; TDP-ramnosa, timidina 5-difosfato L-ramnosa.

La posibilidad de obtener incrementos considerables en la producción de xantano parece


improbable ya que, como acabamos de comentar, el proceso de síntesis de xantano es muy eficiente
debido a la gran tasa de conversión a partir de fuente de carbono. Por lo tanto, la mejora en la cantidad y
calidad del xantano se basa en el diseño de nuevos equipos de fermentación y medios de cultivo. X.
campestris no usa eficientemente la lactosa debido a que presenta niveles bajos de actividad β-
galactosidasa, por lo tanto, el suero lácteo no es una fuente de carbono indicada para la producción de
xantano. Fu y Tseng (1990) introdujeron un plásmido que portaba un gen que codifica para una β-
galactosidasa en el genoma de X. campestris. La cepa resultante fue capaz de sintetizar xantano en
medio que contenía suero lácteo, pero el plásmido no se mantuvo sin presión selectiva. También es de
interés la obtención de nuevas cepas que faciliten el proceso de extracción y purificación del xantano.
Algunas cepas productoras de xantano sintetizan diversas enzimas extracelulares como celulasas (Gough
y col., 1988; 1990) que degradan el xantano cuando se encuentra en forma desordenada (Sutherland,
1984). El xantano a veces es adicionado a productos que contienen celulosa o derivados de la misma.
Estas enzimas se destruyen mediante tratamiento con calor o con productos químicos (Empey y Pettit,

38
Introducción

1978); no obstante, la obtención de mutantes a los que les faltara esta enzima podía simplificar los
procesos de obtención y purificación.

Otra línea de investigación está destinada a producir xantano con sustratos de bajo costo. En
este sentido, se han empleado compuestos petroquímicos como hidrocarburos, alcoholes y ácidos como
medios de fementación, cuando el petróleo era más barato, aunque prácticamente no se emplearon de
forma significativa (Ward, 1989). En la actualidad, las fuentes de carbono y energía más importantes en
los procesos de fermentación son materias primas renovables que contienen azúcares y, en menor grado,
grasas y aceites, como cereales enteros (cebada, maiz, avena, etc.); derivados de plantas (pulpa de
remolacha, harina integral de semillas de algodón, extractos de destilerías secos, etc.); derivados de
animales (harina de pescado, harina de hueso, etc.); y derivados de microorganismos (hidrolizados de
levaduras). En un estudio llevado a cabo por nuestro grupo de investigación, se ha ensayado la
producción de xantano y gelano a partir de coproductos de la industria azucarera, siendo la melaza de
remolacha el coproducto que mejor resultado dio y obteniéndose rendimientos superiores a 7 g/l para
ambos productos. La composición química del xantano y del gelano fue similar a la de los polímeros
comercializados, al igual que sus propiedades funcionales, siendo las más importantes la capacidad
viscosizante y gelificante respectivamente (Páez, 2004).

Las investigaciones para generar exopolisacáridos “de diseño” son aún preliminares y la
mayoría de ellos se basan en el control de la estructura del EPS mediante el estudio de las
glicosiltransferasas, ya que éstas determinan la composición química y enlaces establecidos entre los
azúcares. Betlach y colaboradores (1987) construyeron un mutante que producía xantano sin residuos de
ácido glucurónico, ni sustituciones de piruvato. Las soluciones del xantano obtenido fueron muy viscosas.
También se introdujo en X. campestris un plásmido que portaba parte de la región gum (Harding y col.,
1987); la cepa resultante sintetizó un xantano con un elevado contenido en restos piruvato. Además se
han obtenido mutantes que producen xantano con ausencia de grupos piruvato (Hassler y Doherty, 1990;
Wernau, 1979; 1980). La expresión heteróloga de glicosiltransferasas podría permitir la adición de
azúcares distintos en posiciones concretas para generar EPS con nuevas propiedades.

Es de gran interés la obtención de polisacáridos con gran viscosidad, bien porque posean una
masa molecular elevada, o bien porque sus cadenas polisacarídicas tengan una gran rigidez. Aún no se
ha establecido claramente la relación entre la composición de un polisacárido y la rigidez de sus cadenas,
pero sí se sabe que los enlaces β-1,4 entre los monosacáridos dan lugar a cadenas más rígidas
comparado con los enlaces β-1,2 o β-1,3, así como que los enlaces α dan mayor flexibilidad a la cadena
que los enlaces tipo β. Además, las ramificaciones y sustituciones influyen en la rigidez de la cadena
(Lapasin y Pricl, 1995).

39
Introducción

3.9. Propiedades físicas

3.9.1. Masa molecular

La masa molecular es uno de los factores determinantes de las propiedades funcionales de los
exopolisacáridos microbianos (Cerning y col., 1992; van den Berg y col., 1995) ya que tiene una influencia
directa sobre su comportamiento reológico y especialmente sobre su viscosidad (Rizzoti, 1994); de ahí
que sea una de las propiedades más importantes para decidir la comercialización de un determinado
polímero (Gilbert, 1995).

Los valores de la masa molecular de los biopolímeros de origen microbiano están comprendidos
3 7
entre 1x10 y 5x10 Da (Sutherland, 1994; Lapasin y Pricl, 1995).

La masa molecular para un determinado exopolisacárido puede variar en función de las


condiciones de cultivo así como del método de aislamiento y purificación del polímero (De Vuyst y
Degeest, 1999). Por otra parte, en una misma especie bacteriana, los polímeros producidos por las
distintas cepas pueden presentar masas moleculares diferentes. Este hecho se ha puesto de manifiesto
entre la mayoría de exopolisacáridos ya conocidos como el escleroglucano, pululano o xantano
(Sutherland, 1994) así como en otros de más reciente descripción como el polímero producido por
Enterobacter cloacae (Isobe y col., 2001).

La determinación de la masa molecular de los exopolisacáridos bacterianos se ha llevado a cabo


tradicionalmente mediante cromatografía de exclusión de tamaño molecular (GPC: Gel Permeation
Chromatography) empleando polímeros de masa molecular conocida como patrones (dextrano, pululano).
Sin embargo, esta determinación presenta problemas debido a que los polisacáridos en solución tienen
una elevada viscosidad que dificulta la cromatografía. La tendencia de muchos polisacáridos a asociarse
en solución origina grandes variaciones en los valores registrados y todo ello puede conducir a errores
que en definitiva impiden que la determinación de la masa molecular sea exacta (Sutherland, 1990; 1994).

En el xantano, la determinación de su masa molecular se ve dificultada enormemente por la


elevada viscosidad de sus soluciones e incluso la formación de microgeles. Algunos autores afirman que
ello conduce a una gran variabilidad de resultados en las determinaciones, pudiéndose considerar un
6
intervalo de masa molecular muy amplio: 1,1-47 × 10 Da (Sutherland, 1994), o expresado como peso
molecular (Mw ): 4-12 ×106 g/mol (Born y col., 2002).

Existen otras técnicas para conocer la masa molecular de un polímero que no presentan estos
inconvenientes, como la técnica de “light scattering” y GPC-MALLS. Esta última consiste en una
cromatografía de exclusión de tamaño que presenta acoplado un equipo láser de luz dispersa (“light

40
Introducción

scattering”) y permite la estimación de la masa molecular de un polímero sin necesidad de utilizar


controles, ni un método de calibración de la columna (Mourey y Coll, 1995).

3.9.2. Actividad emulgente

Un gran número de especies microbianas sintetizan exopolisacáridos con actividad emulgente,


también denominados bioemulgentes.

Se han propuesto tres funciones para los bioemulgentes en general: (i) incrementar el área de
superficie entre dos fases inmiscibles, el agua y una fase oleosa o substrato insoluble; (ii) incrementar la
biodisponibilidad de sustratos hidrofóbicos mediante el aumento de su solubilidad; (iii) regular la adhesión
y separación de los microorganismos a / de las superficies (Rosenberg y Ron, 1999).

Los emulgentes se caracterizan por presentar en su estructura una parte hidrofílica


(aminoácidos, péptidos, cadena polisacarídica, cationes mono o divalentes) y una parte no polar
hidrofóbica constituida por ácidos grasos saturados o insaturados (Desai y Banat, 1997). Los
exopolisacáridos constituyen un grupo dentro de los compuestos con actividad emulgente de origen
bacteriano y pueden deber su actividad emulgente a su capacidad viscosizante o a una simple asociación
de una fracción proteica al polímero.

En base a su masa molecular los bioemulgentes, en general, pueden ser divididos en i)


bioemulgentes de pequeña masa molecular y ii) bioemulgentes de elevada masa molecular.

Dentro de los bioemulgentes de pequeña masa molecular se encuentran glucolípidos,


lipopéptidos y fosfolípidos. Su mecanismo de acción se basa generalmente en la disminución de la
tensión superficial e interfacial de las emulsiones, y por ello son compuestos con actividad surfactante o
tensioactiva y pueden ser considerados biosurfactantes.

El grupo de los de mayor masa molecular, está integrado por lipopolisacáridos y compuestos
polisacarídicos en general. Pueden provocar una disminución de la tensión superficial de las interfases
aunque no tan marcada como los emulgentes de menor masa molecular. Fundamentalmente actúan
estabilizando las emulsiones y por ello se consideran más bioemulgentes estabilizadores que
compuestos surfactantes (Rosenberg y Ron, 1999).

Algunos de los principales bioemulgentes (de naturaleza polisacarídica o no) producidos por
microorganismos se han recogido en la Tabla 6.

Entre los bioemulgentes de elevada masa molecular, donde se encuadran la mayor parte de los
exopolisacáridos microbianos con actividad emulgente, destaca el emulsano por ser el más estudiado

41
Introducción

actualmente. Este compuesto es un complejo constituido por un heteropolisacárido aniónico y una


fracción proteica, en el que también se encuentran presentes ácidos grasos (en un 15% p/p) (Rosenberg y
Kaplan, 1987); tiene una producción máxima en medios mínimos con un 2% de etanol como única fuente
de carbono y energía. Presenta gran actividad emulgente a bajas concentraciones (0,01-0,01% p/v),
aunque no emulsiona hidrocarburos alifáticos, aromáticos o cíclicos puros, sino únicamente mezclas de
hidrocarburos alifáticos y aromáticos en adecuadas proporciones (Rosenberg y Ron., 1999; 2002).

En los últimos años, mediante técnicas de ingeniería genética, se está intentando mejorar sus
propiedades a través de la construcción de análogos obtenidos a partir de mutantes del microorganismo
productor, en los que se pretende controlar la sustitución de la cadena polisacarídica por ácidos grasos
(Gorkovenko y col., 1997; Johri y col., 2002).

Tabla 6. Principales agentes emulgentes producidos por microorganismos (adaptado de Rosenberg y


Ron, 1999; Banat y col., 2000)

Emulgente Microorganismo Referencia


productor
Baja Masa Molecular
Glucolípidos
Ramnolípidos Pseudomonas spp. Rendell y col., 1990; Sim y col., 1997; Lang y
Wullbrandt, 1999
Trehalolípidos R. erythropolis Ristau y Wagner, 1983; Kim y col., 1990
Arthrobacter sp. Li y col., 1984
Soforolípidos Candida sp. Hommel y col., 1994
T. bombicola Inoue y Itoh, 1982; Davila y col., 1997
Lipopéptidos
Surfactina B. subtilis; B. pumilus Arima y col., 1968; Wei y Chu, 1998;
Morikawa y col., 1992; Kim y col., 1997
Viscosina P. fluorescenes Neu y Poralla, 1990; Laycock y col., 1991
Liquenisina B. licheniformis Yakimov y col., 1995; Lin y col., 1994
Polimixina B. polymyxa Suzuki y col., 1965
Gramicidina B. brevis Katz y Demain, 1977

Fosfolípidos Acinetobacter spp. Kaeppeli y Finnerty, 1980

Elevada Masa Molecular


Emulsano RAG-1 A. calcoaceticus RAG1 Rosemberg y col., 1979a y b
Emulsano-BD4 A. calcoaceticus BD413 Kaplan y Rosemberg, 1982
Alasano A. radioresistens KA53 Navon-Venecia y col., 1995
Biodispersano A. calcoaceticus A2 Rosemberg, 1993
Liposano C. lipolítica Cirigliano y Carman, 1994
EPS acetilados P. tralucida Appaiah y Karanth, 1991
S. paucimobilis Ashtaputre y Shah, 1995
EPS sulfatados Halomonas eurihalina Calvo y col., 1998; Martínez-Checa y col.,
2002
Halomonas maura Bouchotroch y col., 2000; Arias y col., 2003

En el alasano y otros muchos polímeros con actividad emulgente no se ha detectado la presencia


de ácidos grasos. En estos casos existe una fracción proteica que tiene un papel esencial en la actividad

42
Introducción

de la molécula como emulgente, ya que son precisamente las proteínas las que inicialmente se unen a los
hidrocarburos y es la cadena polisacarídica la responsable de estabilizar la emulsión. Se ha podido
comprobar que en el caso concreto del alasano, la desproteinización conduce a una pérdida importante
de su capacidad para emulsionar sustratos hidrofóbicos (Navon-Venezia y col., 1998).

Dada su naturaleza polimérica y el tamaño de sus moléculas, los exopolisacáridos microbianos,


al igual que otros muchos hidrocoloides utilizados en la industria, actúan como emulgentes
estabilizadores, tal y como se ha comentado. La mayor parte de ellos estabilizan las emulsiones al
provocar un aumento de la viscosidad y reducir la movilidad de las gotículas. De hecho, parece ser que
forman una especie de gel rodeando las gotículas de fase oleosa que actúa a modo de barrera impidiendo
la coalescencia y rotura de la emulsión (Garti y Leser, 2001).

3.9.3. Propiedades reológicas

Entre las propiedades físicas de los exopolisacáridos microbianos, las características reológicas
de sus soluciones determinan muchas de las aplicaciones de estos biopolímeros, generalmente usados a
nivel industrial gracias a su poder viscosizante y gelificante (Sutherland, 1999; 2001a). La mayoría de
ellos se caracterizan por originar soluciones de elevada viscosidad, dado el tamaño de sus moléculas así
como las interacciones existentes entre las mismas.

Las propiedades reológicas de los EPS microbianos dependen en gran medida de la masa
molecular de los polímeros así como de determinados grupos funcionales presentes en la molécula
polisacarídica (Van den Berg y col., 1995). A su vez, la viscosidad de un exopolisacárido en solución se ve
influenciada por multitud de factores tales como la concentración de polímero, temperatura, pH así como
la fuerza iónica.

El xantano es el exopolisacárido mejor estudiado desde el punto de vista reológico dadas sus
interesantes propiedades, y por ello constituye un modelo o referencia para el estudio de las propiedades
reológicas de otros muchos polímeros.

a. Comportamiento reológico de los exopolisacáridos en solución

Los fluídos pueden clasificarse en función de su comportamiento reológico en newtonianos y no


newtonianos.

Son fluídos newtonianos, aquellos que cumplen la ley de Newton en la que σ = μ × γº, y donde
μ es una constante característica de la naturaleza y condiciones físicas del fluído llamada viscosidad. En
los fluídos newtonianos, la fuerza o esfuerzo de cizalla (σ, shear stress) aplicado es directamente

43
Introducción

proporcional a la velocidad o gradiente de deformación (γº, shear rate) y por tanto la viscosidad es igual,
independientemente de la deformación provocada.

Los fluídos no newtonianos a diferencia de los anteriores, no presentan una relación lineal
entre el esfuerzo y el gradiente de deformación. Dentro de ellos existen fluídos que requieren un valor
umbral de esfuerzo de cizalla para comenzar a fluir (fluídos plásticos Bingham) y otros que no lo precisan.
Entre los fluídos no newtonianos sin umbral de fluencia, los fluídos pseudoplásticos se caracterizan por
experimentar una disminución de la viscosidad con un incremento del gradiente de deformación (al
aumentar la fuerza, la velocidad de deformación aumenta más rápidamente), mientras que en los fluídos
dilatantes se produce un incremento de la viscosidad al aplicar velocidades de deformación crecientes (un
aumento de la fuerza da lugar a un aumento proporcionalmente menor de la velocidad de deformación)
(Ferguson y Kemblowski, 1991; Barnes y col., 1993; Macosko, 1994).

Fluídos sin umbral Fluídos con umbral


de fluencia de fluencia

plástico Bingham
Esfuerzo de cizalla ( σ)
Esfuerzo de cizalla ( σ)

dilatante newtoniano

pseudoplástico plásticos no Bingham

Gradiente de deformación (γº) Gradiente de deformación (γº)

Figura 13. Reogramas de los principales tipos de fluídos en función de su comportamiento reológico.

En la Figura 13 se han representado los reogramas o curvas de flujo característicos de los


principales tipos de fluídos en función de su comportamiento reológico.

Una de las propiedades de mayor interés del xantano es que en solución presenta un
comportamiento pseudoplástico, como la mayoría de los exopolisacáridos microbianos. Dicho carácter
pseudoplástico es muy marcado al producirse una fuerte disminución de la viscosidad al aumentar el
gradiente de deformación (Milas y Rinaudo, 1986; Richardson y Ross-Murphy, 1987; Nolte y col., 1992).
Existen numerosos polímeros con excelentes propiedades pseudoplásticas, como los EPS de bacterias
ácido-lácticas (Van den Berg y col., 1995) o algunos producidos por bacterias de origen marino, como el
producido por Vibrio alginolyticus (Muralidharan y Jayachandran, 2003).

44
Introducción

El comportamiento pseudoplástico de las soluciones puede ser descrito matemáticamente


mediante la ley de Ostwald-de Waele o de la Potencia, según la cual σ = K × (γº) , siendo K el índice
n

de consistencia y n el índice de pseudoplasticidad (menor de 1 para fluídos pseudoplásticos). Las


soluciones de xantano se caracterizan por presentar valores elevados para K y valores bajos para n
(Amanullah y col., 1996), típico de moléculas semirígidas (Andrews y col., 1998). Para el xantano
comercial (Kelco), K y n presentan valores aproximados de 34,5 y 0,23, respectivamente.

Mediante la aplicación de este modelo matemático se ha podido estudiar la influencia de algunos


parámetros sobre la pseudoplasticidad del xantano, y se ha podido comprobar que este comportamiento
puede variar dependiendo de la concentración del polímero o la adición de sales y el sistema se puede
comportar como un fluído newtoniano o pseudoplástico (Born y col., 2002). Por tanto, las soluciones muy
diluídas tienden a un comportamiento newtoniano, al igual que al incrementar la temperatura en ausencia
de sales (Dolz y col., 2002).

La pseudoplasticidad a su vez determina el que muchos biopolímeros bacterianos puedan ser


empleados eficazmente en la industria alimentaria al contribuir a una textura y propiedades sensoriales
del producto adecuadas (Lapasin y Pricl, 1995). En los exopolisacáridos producidos por bacterias ácido-
lácticas esta propiedad es esencial y determinante para utilizar el EPS como viscosizante de productos
lácteos, ya que en reposo el producto ha de mantener una consistencia que impida que haya
sedimentación de algunas partículas y en el momento del consumo se requiere una disminución de la
viscosidad para favorecer una textura cremosa (Tuinier y col., 1999).

El xantano además se caracteriza por presentar un determinado valor de esfuerzo de cizalla


umbral (conocido como “yield stress”) que ha de ser alcanzado para que se produzca el flujo de la
muestra (Sutherland, 1994; García-Ochoa y Casas, 1994). Este esfuerzo de cizalla umbral disminuye al
aumentar la temperatura de las soluciones (Hannote y col., 1991).

Otra propiedad del xantano en solución es su naturaleza tixotrópica, o capacidad de


recuperación inmediata de la viscosidad tras retirada del esfuerzo de cizalla. Esta tendencia de las
soluciones de xantano a recuperar su estado original tras la deformación, puede ser reflejo de la
combinación de un comportamiento típico elástico (de un sólido) y viscoso (de un fluído) lo cual también
es determinante del carácter viscoelástico de las soluciones de este polímero (Sutherland, 1998; 1999).

b. Efecto de la temperatura

La conformación molecular de los exopolisacáridos microbianos y la transición entre un estado


ordenado y desordenado determina las propiedades reológicas de los mismos. La influencia de los

45
Introducción

diversos factores sobre la viscosidad de las soluciones viene determinada por los cambios
conformacionales que se produzcan (Ferguson y Kemblowski, 1991; Sutherland, 1994).

Así, el estado de agregación de las moléculas de los exopolisacáridos microbianos, y por tanto
sus propiedades reológicas, pueden verse afectadas por tratamientos térmicos (Oviatt y Brant, 1993;
1994), sobre todo si se supera la temperatura de transición conformacional (Tm).

A temperaturas superiores a la Tm se produce una disociación de las cadenas que se traduce en


una disminución de la viscosidad de las soluciones. Para soluciones concentradas, cuando se supera esta
temperatura, puede producirse incluso un aumento de la viscosidad como consecuencia de un aumento
del volumen hidrodinámico de las moléculas al producirse una proyección de las cadenas laterales hacia
el exterior al inicio de la desorganización molecular (Capron y col., 1998). En caso de verse afectada la
viscosidad a elevadas temperaturas, las soluciones tienden a recuperar su viscosidad inicial tras el
enfriamiento de las muestras como consecuencia de una nueva reorganización y ensamblaje molecular
que incluso puede originar soluciones más viscosas que antes del calentamiento (Capron y col., 1998;
Pelletier y col., 2001).

c. Interacción con cationes

En general, la adición de sales determina un aumento de la viscosidad de casi todos los


exopolisacáridos microbianos estudiados. En cuanto a la naturaleza de las sales, la presencia de cationes
divalentes es la responsable en la mayoría de los casos de dicho incremento ya que además,
generalmente los EPS presentan una mayor afinidad para interaccionar con sales divalentes.

La mayoría de los polisacáridos con potencial interés comercial presentan restos de ácidos
carboxílicos procedentes tanto de ácidos urónicos como de cetales de piruvato, que pueden originar
complejos con cationes (Morris y col., 1975). En algunas preparaciones, la interacción está
particularmente marcada con iones de un radio determinado, pero también puede tener lugar con otros
iones.

Algunos EPS, incluyendo los producidos por distintas especies del género Zoogloea, parecen
unirse fuertemente a iones que intervienen en la floculación (Sutherland, 1988). Sin embargo, el
mecanismo exacto de unión a cationes por este grupo de polímeros no está todavía claro.

El polisacárido producido por Alteromonas cepa 1644 muestra una gran selectividad entre iones
bivalentes y monovalentes, con afinidad hacia los primeros. Sin embargo, esta afinidad se ve reducida en
2+
el caso del Mg (Bozzi y col., 1996a).

46
Introducción

d. Efecto del pH

La modificación del pH produce una variación de la carga iónica de las soluciones de los
exopolisacáridos, que es responsable de cambios en la viscosidad.

En el caso de exopolisacáridos de naturaleza aniónica, la concentración de polímero es


determinante en el efecto del pH sobre la viscosidad de las soluciones. En estudios llevados a cabo con el
xantano, se ha puesto de manifiesto que para concentraciones de polímero inferiores al 0,2% (p/v) se
produce un cierto aumento de viscosidad con el incremento del pH; mientras que para soluciones más
concentradas (superiores al 0,35-0,4% p/v), las soluciones con pH ácido son más viscosas que las de pH
6 (Clark, 1992; Pastor y col., 1994). La explicación de este fenómeno es similar a lo que ocurre con la
fuerza iónica y radica en alteraciones en las fuerzas de atracción o repulsión entre las cadenas.

Aún así, al igual que ocurre con la temperatura y fuerza iónica, se puede considerar que la
viscosidad de las soluciones de xantano es prácticamente independiente del pH en un amplio intervalo (1-
13). El carácter compacto de las dobles hélices, protegidas por el repliege de las cadenas laterales impide
la penetración del ácido o álcali y evita la degradación por hidrólisis (Sutherland, 1998; 1999).

El comportamiento observado entre otros exopolímeros frente al pH difiere bastante, aunque en


varios de ellos (la mayoría de naturaleza ácida) se ha podido observar que a pH extremos (de extrema
acidez o basicidad) se produce una disminución de la viscosidad, consecuencia de una alteración de la
carga neta del polímero. El EPS producido por Bacillus circulans, aislado de una muestra de suelo,
presenta su viscosidad máxima a un pH de 5,5 (Isobe y col., 1992) y tiene esta tendencia al disminuir o
aumentar bruscamente el pH. Un comportamiento similar se observó en los polímeros producidos por
Paenibacillus spp. o Vibrio alginolyticus (Weon-Taek y col., 1999; Muralidharan y Jayachandran, 2003).

3.9.4. Formación de geles

La capacidad de formar geles de muchos exopolisacáridos microbianos es una propiedad


enormemente atrayente desde el punto de vista industrial.

La gelificación puede ser una propiedad inherente de un polisacárido o puede requerir la


presencia de cationes mono o multivalentes. En otros casos, puede tratarse de una gelificación sinérgica
con otro polímero, como ocurre con polisacáridos como el xantano que únicamente forma geles en
mezclas con galacto o gluco-mananos (Sutherland, 1999).

Las características de un gel vienen determinadas por el tipo de uniones que se establecen entre
las cadenas poliméricas. Ross-Murphy y Shatwell (1993) clasificaron los geles de exopolímeros en tres

47
Introducción

categorías fundamentales: i) geles en los que las uniones se establecen con enlaces covalentes; ii) geles
con uniones físicas fáciles de disgregar y iii) geles que originan redes compactas.

Entre los exopolisacáridos microbianos con capacidad gelificante cuya estructura y propiedades
han sido más ampliamente estudiadas se encuentran el gelano, el curdlano y los alginatos.

Más recientemente se han descrito nuevos exopolisacáridos microbianos con esta propiedad.
Entre ellos, habría que citar el polímero producido por Sinorhizobium meliloti, que origina geles
termorreversibles en presencia de cationes mono, di o trivalentes (Heyraud y col., 1994; Dantas y col.,
1994), o al “beijerano”, producido por Azotobacter beijerinckia YNM1 (Ogawa y col., 1996). Por último, el
polímero XM6, de Enterobacter, también forma geles tras desacetilación (Nisbet y col., 1984).

Gelano

El gelano es uno de los exopolímeros de origen bacteriano más interesantes desde el punto de
vista comercial e industrial.

En su forma comercial, los grupos acetilo presentes en su estructura son eliminados mediante un
tratamiento alcalino, ya que las propiedades gelificantes de este polímero se intensifican tras la
desacetilación además de la eliminación de los grupos O-gliceril de la molécula (Jay y col., 1998). Ambos
sustituyentes (O-acetil y O-gliceril) se encuentran unidos a la unidad de glucosa adyacente al ácido D-
glucurónico de la cadena.

El polímero en su estado nativo origina geles débiles y elásticos mientras que tras la eliminación
de estos grupos se obtienen geles firmes, transparentes y de mejores propiedades (Kang y col., 1982;
Sutherland, 1999).

La presencia de cationes mono o divalentes es determinante en el proceso de formación del gel;


de hecho, el gelano no forma geles en agua destilada sin sales (Chandrasekaran y col., 1992; Tang y col.,
1994, Manna y col., 1996). En solución acuosa las moléculas de gelano aumentan de volumen y las
estructuras helicoidales tienden a agregarse y a establecer uniones entre ellas en presencia de sales
metálicas. Ello conduce a la formación de un gran entramado molecular en el que quedan atrapadas
además de los cationes metálicos, moléculas de agua, produciéndose finalmente la gelificación (Yuguchi y
col., 1993). Mediante microscopía electrónica se ha podido observar esta estructura microcíclica (Stokke y
col., 1993).

Las propiedades gelificantes del gelano, por tanto, se ven mejoradas en presencia de cationes
metálicos, ya que el número de uniones entre las cadenas se incrementa, y es posible la construcción de

48
Introducción

una estructura más resistente a la temperatura y otros factores (Yuguchi y col., 1993; Giavasis y col.,
2000).

La dureza y propiedades del gel varían en función del catión presente. Entre los cationes
+ + + +
monovalentes la dureza disminuye desde el cesio al litio (Cs > K >Na > Li ). En el caso de los cationes
divalentes, la firmeza del gel es muy similar para el Mg2+, Ca 2+ 2+
y Sr ; aunque menor que la conseguida
2+ 2+ 2+ 2+ 2+ 2+
con el Zn , Cu y Pb (Pb > Cu > Zn ) (Chandrasekaran y Rhada, 1995; Larwood y col., 1996;
Sutherland, 1999).

Concretamente, los cationes divalentes son más eficaces para lograr geles de mayor dureza.
Incluso a baja concentración de gelano (0,2% p/v), se obtiene un gel de alta fuerza y consistencia cuando
la máxima concentración de calcio o magnesio es de 0,004% (p/v) ó 0,005% (p/v), respectivamente. En
igualdad de condiciones, se obtienen geles de propiedades similares requiriéndose mayores
concentraciones de cationes monovalentes, alrededor del 0,16% (p/v) de sodio ó 0,12% (p/v) de potasio;
lo cual, a nivel industrial resulta menos rentable (Sanderson y Clark, 1983; Giavasis y col., 2000).

Entre las propiedades más importantes del gelano, destaca su estabilidad y la de sus geles en un
amplio intervalo de pH (2-10) así como frente a elevadas temperaturas (Morris, 1994). La temperatura de
fusión de los geles puede encontrarse alrededor de los 100 ºC; aunque a elevadas concentraciones de
sales o de polímero puede incrementarse (Moritaka y col., 1992). La apariencia cristalina de sus geles,
incluso con un elevado porcentaje de azúcares (15%) ha determinado también gran parte de su éxito. Por
todo ello, el gelano ofrece un amplio abanico de propiedades funcionales (Pszczola, 1993; Crescenci,
1995; Harvey y McNeil, 1998).

Ninguno de los polisacáridos relacionados estructuralmente con el gelano forman geles, sólo
originan soluciones viscosas con termoestabilidad considerable (Sutherland, 1999).

Curdlano

Este polímero puede dar lugar a dos tipos de geles diferentes sin necesitar la presencia de iones
(Harada y col., 1994): i) geles de bajo punto de fusión y ii) geles de elevado punto de fusión.

Aquellos de bajo punto de fusión se obtienen a partir de soluciones alcalinas de curdlano, tras
neutralización de las mismas o calentamiento de sus soluciones acuosas hasta 60ºC y posterior
enfriamiento. En el segundo caso, se produce la formación del gel tras calentamiento de las soluciones
acuosas de curdlano por encima de 80ºC, de modo que durante el enfriamiento las cadenas de polímero
adoptan una estructura triple helicoidal que origina un gel muy resistente. El mecanismo de formación de
estos geles se fundamenta en que, en solución alcalina, el curdlano presenta un estado conformacional al

49
Introducción

azar y tras la neutralización, el polímero adopta una estructura de hélice de una sola cadena ó bien de
triple hélice (Lee y col, 2000).

El curdlano difiere de otros exopolisacáridos microbianos en su capacidad para formar geles a


elevadas temperaturas. Estos geles presentan mayor fuerza así como mayor resistencia a la hidrólisis por
1,3-β-D-glucanasas y ácidos, al incrementarse la temperatura y el tiempo de calentamiento en el proceso
de gelificación (Sutherland, 1999).

Alginatos

Las propiedades gelificantes de los alginatos se deben a su capacidad para unirse a cationes
2+
mono o divalentes; siendo los más comunes los geles obtenidos con iones Ca . La gelificación tiene
2+
lugar mediante el conocido modelo de “egg-box”; que consiste en una interacción del Ca con las
secuencias de ácido L-gulurónico (G) (de más de 20 unidades) de la molécula, de modo que las cadenas
de reorganizan y encierran a los iones en una especie de caja similar a las que se usan en el comercio
para los huevos (Grant y col., 1973; Steginsky y col., 1992). La firmeza de los geles depende del número
de uniones que se establezcan con los cationes, y en definitiva aquellos alginatos con una proporción
manurónico/gulurónico baja (predominio de secuencias de ácido gulurónico) darán lugar a geles de
mayor fuerza (Clare, 1993; Moe y col., 1995; Clementi y col., 1997).

Gelificación sinérgica

El xantano constituye un claro ejemplo de gelificante sinérgico. Cuando se calientan y


posteriormente se enfrían soluciones acuosas de mezclas de xantano y gluco o galacto-mananos de
origen vegetal se obtienen geles a causa del efecto sinérgico entre estas gomas (Sutherland, 1999;
2001a). Hemos de decir que en el ámbito industrial a los hidrocoloides como el xantano se les llama
gomas.

Los sustituyentes acetilo de la cadena de xantano son responsables de la interacción del xantano
con la goma guar, LBG (locust bean gum) y manano Konjac, y el proceso de formación de geles se
favorece cuando el xantano se encuentra desacetilado (Ross-Murphy y col., 1996). En ausencia de estos
residuos, la concentración de xantano requerida para la formación de gel es menor (Sutherland, 2001a).
No obstante, el xantano en estado nativo también presenta un efecto sinérgico cuando se asocia con LBG
o manano Konjac, obteniéndose soluciones de elevada viscosidad (Goycoolea y col., 1995).

Para las asociaciones xantano-LBG, se consigue la máxima viscosidad cuando la proporción de


ambos hidrocoloides es 2:4, obteniéndose el gel con las mejores propiedades cuando se calientan las
soluciones de xantano y LBG hasta 40 y 80ºC, respectivamente (Casas y García-Ochoa, 1999). En cuanto

50
Introducción

a las mezclas xantano-goma guar, el efecto sinérgico es máximo para una proporción 3:3 de estas gomas
(Casas y col., 2000).

3.9.5. Captación de metales pesados

Existe un gran número de exopolisacáridos microbianos capaces de interaccionar con cationes


metálicos (Kaplan y col., 1987; Geesey y Jang, 1989; Chen y col., 1995 a y b)

La unión de los metales con los EPS se establece mediante interacciones electrostáticas con
grupos funcionales con carga negativa. Es por ello que los exopolisacáridos capaces de retener iones
metálicos se caracterizan por ser de naturaleza ácida.

Los principales responsables de estas interacciones son los grupos carboxilo de los ácidos
urónicos. La presencia de estos sustituyentes es común entre los exopolisacáridos microbianos, con un
porcentaje muy variado, aproximadamente entre un 5 y 25% (p/p). Se ha comprobado que juegan un
papel esencial en polímeros como los producidos por distintas especies de Pseudomonas, con gran
capacidad de captación de metales, donde se ha llegado a detectar hasta un 21% (p/p) de ácidos
urónicos (Uhlinger y White, 1983; Kang y col., 1982). En P. putida, el ácido glucurónico determina la
retención de plomo y cadmio por este polímero (Kachlany y col., 2001). Los ácidos urónicos también son
los responsables pricipales de la capacidad de quelar metales (cadmio, cobre y cobalto) por parte del
exopolisacárido producido por Enterobacter cloaceae (Iyer y col., 2004; 2005)

Otros grupos funcionales que contribuyen a la interacción con cationes metálicos, aunque en
menor grado, son los restos piruvato, fosfato o sulfato (Chen y col., 1995a).

Por otra parte, los grupos hidroxilo, portadores de átomos de oxígeno donadores débiles de
electrones, también pueden contribuir a la formación de enlaces que hacen más estable el complejo
catión-polímero, tal y como se ha visto en los alginatos (Geddie y Sutherland, 1993).

La interacción de los exopolisacáridos con metales también está influenciada por otros factores
como el grado de acetilación de los EPS. En el caso de los alginatos, la desacetilación favorece la unión
con metales a la vez que puede determinar la selectividad de unión con determinados cationes divalentes
o monovalentes (Geddie y Sutherland, 1993; 1994).

Las propiedades químicas y físicas de los metales, cantidad de metal en proporción con los sitios
de unión en el exopolímero, así como la conformación molecular de los polisacáridos, también son
factores a considerar en estos mecanismos de interacción (Manzini y col., 1984; Lion y col., 1988).

51
Introducción

En cuanto al efecto de condiciones ambientales como la temperatura o el pH; hay que señalar
que tanto a temperaturas elevadas como a pH extremadamente ácidos, la retención de metales por los
EPS se ve dificultada (Geddie y Sutherland, 1993).

3.10. Relación entre la composición/estructura química y propiedades físicas

Las propiedades físicas de cualquier EPS microbiano vienen determinadas por su estructura
química, conformación y masa molecular.

La solubilidad es una de las propiedades más dependientes de la composición química y de la


estructura de los exopolisacáridos. La presencia de cadenas laterales, generalmente con grupos cargados
(urónicos, sulfatos, etc.), condiciona, en gran medida, la solubilidad del polímero en agua, mientras que la
cadena lineal de azúcares libre de sustituyentes tiende a ser insoluble (Sutherland, 1994). Las
ramificaciones en las cadenas polisacarídicas lineales promueven una desorganización conformacional e
impiden alcanzar un estado de mayor orden, lo que permite la solubilización del polímero.

La estructura primaria de un exopolisacárido microbiano tiene una gran influencia sobre la


capacidad de formación de geles. El gelano presenta una estructura lineal que le permite la formación de
geles; en cambio, los demás polisacáridos de su grupo contienen mono o disacáridos en sus cadenas
laterales que interaccionan entre sí e impiden su formación.

En cuanto a la naturaleza de los enlaces entre los monosacáridos de la cadena polisacarídica,


los enlaces β-1,4 confieren mayor rigidez al polímero mientras que las uniones α-1,2 determinan una
mayor flexibilidad, como ocurre en los dextranos (Sutherland, 2001a).

El efecto de los grupos acetato y piruvato sobre las propiedades físicas y funcionales de los
polímeros bacterianos es especialmente importante y ha sido estudiado en multitud de ocasiones (Gamini
y col., 1991). Asimismo, el grado de acetilación es un factor importante en el proceso de gelificación de
muchos exopolisacáridos (Ross-Murphy, 1995; 1996). En numerosos exopolímeros de naturaleza ácida,
la acetilación afecta a la selectividad de unión de este polímero con cationes metálicos, de tal forma que,
generalmente, el polímero desacetilado presenta mayor afinidad con cationes monovalentes y en su
2+
estado nativo son más selectivos en su unión con Ca y Mg2+ (Geddie y Sutherland, 1993). Parece ser
que los alginatos constituyen una excepción a este hecho y su desacetilación favorece la unión con
2+
cationes divalentes como el Ca y el Sr2+ (Geddie y Sutherland, 1994).

Otros grupos como los succinatos determinan, mediante su eliminación, un incremento de la


pseudoplasticidad de las soluciones de succinoglicano (Ridout y col., 1997).

52
Introducción

3.11. Producción de exopolisacáridos microbianos

3.11.1. Fermentación industrial

Al igual que cualquier otro proceso microbiano, la producción de exopolisacáridos


requiere una fuente de carbono barata, fermentadores esterilizables, aire estéril y un medio de
cultivo. El éxito del proceso de fermentación se basa, en gran medida, en el control del entorno.
Así, la elección del medio de crecimiento y las condiciones ambientales determinan la calidad
del producto y la máxima eficiencia de conversión obtenible (gramos de polímero por gramo de
fuente de carbono). Los procesos de fermentación industrial deben ser diseñados de tal forma
que la velocidad global, la eficiencia y la concentración de producto estén limitadas, en último
término, por la capacidad de transferencia de masa y de calor del fermentador, de forma que se
aproveche al máximo la energía disponible (Kennedy y col., 1984).

Las propiedades reológicas de los cultivos de polímeros microbianos se deben al propio


producto disuelto en la fase líquida continua. Esto puede conducir a marcadas diferencias en el
efecto de la reología sobre la difusión del oxígeno y de los nutrientes en estos tipos de
fermentación.

La influencia de la reología sobre los fenómenos de transporte en las fermentaciones de


exopolisacárido no se ha determinado completamente y no es fácil obtener ecuaciones de
diseño.

La principal característica reológica que tienen la mayor parte de los fluidos de cultivos
de polisacáridos es su extrema viscosidad a una concentración de producto relativamente baja y
su comportamiento pseudoplástico. A medida que aumenta la concentración del producto
durante el crecimiento, tanto la viscosidad como la naturaleza pseudoplástica del caldo
aumentan. En algunos casos, como en las fermentaciones de pululano y de alginato con
Azotobacter vinelandii, la viscosidad del fluido del cultivo pueden descender hacia el final de la
fermentación debido a actividad enzimática (Peña y col., 2002).

Los fermentadores utilizados para la producción comercial de polisacáridos microbianos


consisten en recipientes aireados dotados de agitación mecánica que proporciona la turbulencia
necesaria para la formación de pequeñas burbujas y el mezclado, lo que garantiza una buena
transferencia de masa. El diseño de un fermentador eficiente incluye un equilibrio entre la energía
suminstrada para la aireación y la destinada a la capacidad de bombeo del impulsor (o flujo de masa)
que determina la transferencia de calor y el mezclado en el fermentador (Kennedy y col., 1982).

53
Introducción

3.11.2. Recuperación

La recuperación y el procesamiento de los exopolisacáridos microbianos utilizan una


tecnología parecida a la empleada para muchos otros polímeros solubles en agua como las gomas
de algas o de plantas. Son numerosas las técnicas disponibles para conseguir el aislamiento y la
purificación de las gomas y los métodos usados actualmente dependen del objetivo del procedi-
miento y de su coste.

Las células pueden ser eliminadas utilizando la centrifugación o la filtración, aunque, a


veces, el cultivo tiene que ser diluido o calentado para disminuir los efectos de la viscosidad sobre la
separación. Alternativamente se usan métodos químicos o enzimáticos para degradar las células,
que pueden ser complementados con posteriores operaciones de purificación y concentración. La
retirada de las células se lleva a cabo cuando su presencia puede afectar al comportamiento del
producto, su aspecto en solución o su toxicología. Por ejemplo, la presencia de células de
Azotobacter en alginatos microbianos utilizados en la obtención de pasta de imprenta puede dar
lugar a precipitados (López-Munguía y col., 1993).

El método de elección para la recuperación primaria de los polímeros microbianos es la


precipitación utilizando isopropanol, etanol, metanol o acetona. La precipitación constituye un punto
crítico en la rentabilidad económica del proceso, por ello, el solvente empleado se recupera mediante
destilación. Después, el precipitado se separa, se deshidrata mecánicamente y se seca.

El producto seco se muele y luego se empaqueta en recipientes con una baja permeabilidad
al agua. El tamaño de partícula del producto molido tiene una influencia considerable sobre su
dispersabilidad y su velocidad de hidratación.

Se han descrito diferentes métodos alternativos para la recuperación primaria de los


polisacáridos microbianos. Estos se centran principalmente en la producción de una forma insoluble
del polímero por adición de ciertas sales o por ajuste del pH. Por ejemplo, el alginato puede ser
recuperado por formación de una sal cálcica insoluble o por acidificación, para precipitar ácido
algínico. También pueden secarse directamente los extractos acuosos que contienen la goma. Sin
embargo, debido a que solamente se elimina el agua, el producto resultante es relativamente impuro
comparado con el cosechado utilizando un método de precipitación.

El proceso de obtención, la exposición al calor y la tensión mecánica pueden modificar o


degradar el producto. Por ejemplo, la desecación rápida a alta temperatura puede dar lugar a un
producto poco soluble y con propiedades reológicas muy deficientes. Asimismo, los polisacáridos
pueden ser tratados física o químicamente durante la recuperación con el fin de modificar su pureza,
reología y otras propiedades.

54
Introducción

3.11.3. Factores determinantes en la producción

Numerosas condiciones ambientales y nutricionales pueden influir sobre la producción de


exopolisacáridos microbianos. Algunas de las más significativas son la fuente de carbono o nitrógeno y su
concentración en el medio de cultivo, la temperatura de incubación, el pH, la relación C/N o la limitación
de ciertos nutrientes. Estas condiciones, que determinan la producción óptima de los EPS, varían de unas
especies microbianas a otras e incluso entre cepas bacterianas de la misma especie (Farres y col., 1997).

a. Composición del medio de cultivo

La mayoría de los microorganismos productores de exopolisacáridos utilizan los hidratos de


carbono como fuente de carbono y energía (Sutherland, 2001a). Muchos de estos carbohidratos se
pueden convertir directamente en polisacáridos, pero lo más frecuente es que en la biosíntesis, los
microorganismos utilicen metabolitos derivados de ellos.

Las fuentes de nitrógeno más frecuentemente utilizadas son las sales de amonio o los
aminoácidos y rara vez los nitratos. Algunas especies emplean los aminoácidos como fuente de carbono y
de nitrógeno simultáneamente. Determinadas bacterias fijadoras de nitrógeno son capaces de producir
EPS y su crecimiento es más elevado si el nitrógeno procede de una fuente de sales de amonio (Ahmad y
McLaughlin, 1985).

Influencia de la fuente de carbono

La utilización de diferentes fuentes de carbono puede afectar no sólo a la producción sino a la


composición de azúcares neutros, acilación del polímero, su calidad y sus propiedades físicas.

La glucosa y la sacarosa son los azúcares que permiten una producción de EPS más rentable en
la mayoría de los casos (Roseiro y col., 1992; García-Ochoa y col., 1997; Lo y col., 1997; Leela y Sharma,
2000; Rao y Sureshkumar, 2001).

Para algunos microorganismos, el tipo de hidrato de carbono presente en el medio influye en el


tipo de exopolisacárido sintetizado. Así, un exceso de sacarosa incrementa la producción del levano en el
caso de Pseudomonas syringae var. glycinae. Por el contrario, si la bacteria crece en presencia de
glucosa, el polímero sintetizado es el alginato. Para las bacterias lácticas formadoras de exopolisacárido
se puede generalizar que la composición de sus polímeros es independiente de la fuente de carbono
presente en el medio (Cerning, 1990). Streptococcus thermophilus (Cerning y col., 1988) y Lactobacillus
casei CG11 presentan una máxima producción de polisacárido en un medio con glucosa y menor cuando
los sustratos hidrocarbonados son lactosa y sacarosa (Cerning y col., 1994).

55
Introducción

Asimismo, la producción de heteroglicano por Sporobolomyces alborubescens aumenta si se


utiliza glucosa como fuente de carbono (Ananeva y col., 1998). Sin embargo, en el caso del
succinoglicano producido por Agrobacterium tumefaciens, se obtienen unos niveles óptimos de
producción si se emplea sacarosa (Stredansky y col., 1998).

La cepa F2-7 de Halomonas eurihalina, que es capaz de desarrollarse sobre un amplio número
de sustratos, presenta una mayor productividad cuando la fuente de carbono es el citrato o la glucosa.
Asimismo, la composición del polímero varía según el sustrato utilizado en el medio de cultivo (Béjar y
col., 1996). La adición de citrato puede aumentar la producción de EPS por un efecto estimulador, debido
a un aumento en la solubilización de componentes del medio como las sales de calcio y hierro o por la
estimulación de la actividad del ciclo de Krebs (Kennedy y Bradshaw, 1984).

La cepa S30 de Halomonas maura también es capaz de crecer y producir su exopolisacárido, el


maurano, a partir de una gran variedad de fuentes de carbono, aunque la mayor productividad la
encontramos cuando el sustrato empleado es la glucosa (Arias y col., 2003). Además, la viscosidad de las
preparaciones acuosas de maurano no se ve afectada de manera significativa por la sustitución de la
glucosa por otros azúcares, por lo que ésta es la fuente de carbono de elección para la producción de
este exopolisacárido de interés en biotecnología, biorremediación y medicina.

El empleo de fuentes de carbono alternativas para la producción de exopolisacáridos ha sido


ensayado en numerosas ocasiones con el fin de disminuir los costes y aumentar la rentabilidad global del
proceso. Así, las melazas de remolacha y caña de azúcar, coproductos de la industria azucarera,
constituyen unas fuentes de carbono muy atractivas desde el punto de vista industrial. Recientemente,
nuestro Grupo de Investigación ha estudiado la producción de xantano y gelano a partir de este tipo de
sustratos, gracias a la colaboración establecida con la empresa Azucarera Ebro S.L., obteniendo
productos de considerable calidad, en un proceso que a expensas de futuros y más profundos estudios,
parece rentable desde el punto de vista económico y empresarial (Páez, 2004).

Finalmente, hemos de señalar que la concentración de la fuente de carbono en el medio de


cultivo es un factor crucial para el crecimiento y producción de los exopolisacáridos y en líneas generales,
a concentraciones crecientes de ésta, la producción de EPS se ve aumentada. No obstante, es muy
importante seleccionar cuidadosamente la concentración de fuente de carbono ya que un exceso de la
misma puede conducir a una inhibición tanto del crecimiento bacteriano como de la producción de
biopolímero (Sutherland y col., 1993). Así, se ha demostrado que un aumento de la concentración de
azúcar puede conducir a una utilización menos eficiente de la misma al aumentar la síntesis de otros
metabolitos en detrimento de la producción de exopolisacárido (Farres y col., 1997). Este hecho se
observa en otros microorganismos como Acetobacter xylinum (Bielecki y col., 2002). Así, cuando la
oxidación de la glucosa 6P se encuentra activada, la acumulación de gluconato disminuye enormemente

56
Introducción

el pH del medio de cultivo con un efecto inhibitorio de la producción de celulosa. Este efecto ocurre a
porcentajes de glucosa superiores al 4% (p/v) (Son y col., 2001).

Influencia de la fuente de nitrógeno

El equilibrio entre los diferentes sustratos y la deficiencia en nutrientes es de gran importancia en


la producción del polisacárido. De hecho, la fuente de nitrógeno es necesaria para el crecimiento de los
microorganismos y para la síntesis de exopolisacáridos, pero un exceso de la misma puede hacer
disminuir la conversión del sustrato carbonado en EPS (Duguid y Wilkinson, 1953). Pese a ello, se han
descrito excepciones tales como la producción de celulosa por Acetobacter xylinum y de gelano por
Sphingomonas paucimobilis E2 (DSM 6314), que disminuye en medios deficientes en nitrógeno (Dudman,
1960; Lobas y col., 1992).

La elección de una fuente de nitrógeno orgánica o inorgánica depende de su efecto sobre la


producción de exopolisacárido y de la capacidad de los microorganismos para metabolizar dichos
sustratos. De hecho, algunas especies de Acetobacter productoras de celulosa no pueden utilizar fuentes
de nitrógeno inorgánicas (Son y col., 2001). La producción de polisacárido se ve aumentada en el caso de
Sporobolomyces albo rubescens al emplear una fuente de nitrógeno orgánica (Ananeva y col., 1998).

Una fuente de nitrógeno poco común para la producción de exopolímeros microbianos aunque
con excelentes resultados en el caso del succinoglicano, es la lisina. Con este sustrato se obtienen los
mayores niveles de producción de este polisacárido en presencia de CaCO3 que actúa como tampón
evitando la acidificación del medio (Stredansky y col., 1998).

En los medios de producción de exopolisacáridos también se pueden utilizar compuestos


nitrogenados más complejos como peptonas, extractos de carne o malta, hidrolizados de caseína,
levadura, soja o derivados solubles de destilería, entre otros (Sutherland, 1990; Becker y col., 1998). La
utilización de estas fuentes de nitrógeno de mayor complejidad permite obtener, en multitud de ocasiones,
mayores tasas de crecimiento y mejores rendimientos de EPS. Sin embargo, para algunos
microorganismos el uso de fuentes de nitrógeno complejas tiene un efecto negativo sobre la producción y
crecimiento bacteriano, posiblemente debido a una escasa actividad proteolítica de la cepa bacteriana
(Stredansky y col., 1998).

Una de las fuentes de nitrógeno complejas más comúnmente utilizadas es el extracto de


levadura. Este sustrato contiene abundantes componentes nitrogenados así como multitud de factores de
crecimiento; de ahí que su adición estimule, en muchos casos, la producción de exopolisacárido (de
Souza y Sutherland, 1994). Así, al adicionar extracto de levadura al 0,1% (p/v) al medio de cultivo para la
producción de celulosa (Son y col., 2001) se produce un efecto estimulante, también descrito para el
gelano (West y Strohfus, 1999). Sin embargo, puesto que este factor nutricional es de coste relativamente

57
Introducción

elevado, se ha cuestionado la necesidad de esta suplementación, fundamentalmente en la producción de


los polímeros a escala industrial, ya que en determinados casos no resulta económicamente rentable.

b. Balance fuente de carbono-nutriente limitante

El balance entre sustrato-utilizable y nutriente-limitante es de suma importancia en la producción


de exopolisacáridos microbianos y de hecho la síntesis de la mayor parte de estos biopolímeros se
encuentra favorecida por un desequilibrio de los nutrientes.

En general, la producción del polímero se favorece con una alta relación carbono/ nitrógeno,
mientras que la relación inversa estimula el crecimiento (Souw y Demain, 1979; Sutherland, 2001a). Tal
es el caso de la producción de maurano (Arias y col., 2003), xantano (Lo y col., 1997), curdlano (Lee,
2002), alginatos (Clementi, 1997) o de los polisacáridos de Pseudomonas, Rhizobium (Sutherland, 2001a)
o Klebsiella (Farres y col., 1997), entre otros.

Una excepción a este hecho la constituyen las bacterias ácido lácticas,en las que la producción
de exopolisacáridos no parece estimularse por una limitación de nitrógeno (Degeest y col., 1997; De Vuyst
y col., 1998; Kimmel y col., 1998).

La concentración de fosfato influye significativamente y de forma variable en el crecimiento


bacteriano y en la síntesis de numerosos exopolisacáridos. Así, en medios con concentraciones limitantes
de fosfato, se ha obtenido el máximo rendimiento de producción de alginato. El fosfato en el medio actúa
impidiendo una brusca fluctuación del pH y por ello una disminución de este componente se ha de
contrarrestar con la incorporación de otro tampón como la sal sódica del ácido propano sulfónico
(Clementi y col., 1995). Del mismo modo, bajo limitación de fosfato se incrementa la producción del
polímero sintetizado por Klebsiella I-714 (Farres y col., 1997). Para el curdlano, la ausencia de fosfatos
conduce a la obtención de niveles muy bajos de polímero, mientras que a bajas concentraciones tiene
lugar el óptimo de producción de exopolisacárido (Lee, 2002).

Asimismo, la producción de celulosa únicamente es eficaz en presencia de un 0,8% (p/v) de


sales de fosfato (Son y col., 2001). Por otra parte, en distintas cepas de Pseudomonas productoras de
alginato, el proceso es más rentable a elevadas concentraciones de fosfato (Conti y col., 1994).

c. Requerimientos iónicos

La concentración de magnesio, potasio y calcio en el medio afecta en distinta medida a la


producción de EPS (Sutherland, 1990). Aunque los requerimientos salinos de muchos microorganismos
son muy bajos, la presencia de trazas de sales puede provocar un aumento en la producción del EPS.

58
Introducción

Se ha visto que un incremento en la concentración de las sales magnésicas está asociado con
un mayor rendimiento en la producción de polímero por Azotobacter vinelandii, en medios con ácidos 4-
hidroxibenzoico (Vargas-García y col., 2001). En este mismo trabajo se comprobó que modificaciones de
2+
otras sales inorgánicas no afectan a la síntesis de EPS, lo cual es indicativo del papel relevante del Mg
en este proceso frente a otros iones.

La presencia de sales minerales también afecta a la producción de exopolisacáridos por


bacterias ácido lácticas (Mozzi y col., 1995; Gamar y col., 1997).

d. Efecto de otros parámetros

Tiempo de incubación

La síntesis de los exopolisacáridos puede estar asociada al crecimiento o no. Cuando existe esa
asociación, generalmente comienza la síntesis del EPS al iniciarse el crecimiento exponencial, con un
máximo al final de la fase activa de crecimiento. En esta cinética, el exopolímero es considerado un
metabolito primario (Abbad Andaloussi y col., 1995; De Vuyst y col., 1998).

La asociación del proceso de producción de EPS y el crecimiento bacteriano se ha descrito en


bacterias ácido lácticas termófilas, de modo que la producción de polímero tiene lugar bajo las
condiciones óptimas de crecimiento (De Vuyst y col., 1998), a diferencia de lo que ocurre en bacterias
ácido lácticas mesófilas (De Vuyst y Degeest, 1999).

Existen otros muchos casos en los que el crecimiento celular y producción de polisacárido tienen
requerimietos nutricionales diferentes (Petronella y Hugenholtz, 1999; Cheirsilp y col., 2001; Davey y
Amos, 2001).

Por otra parte, algunos EPS son sintetizados a lo largo de todas las etapas de crecimiento, y no
sólo durante la fase exponencial o estacionaria tardía (Sutherland, 1990; 2001a).

Temperatura

La gran mayoría de polímeros microbianos presentan óptimos de producción a una temperatura


de 30ºC, siendo ésta la temperatura de elección en el xantano (Leela y Sharma, 2000), gelano (Giavasis,
2000) y celulosa (Son y col., 2001), entre otros. Los alginatos presentan una temperatura óptima de
producción ligeramente superior (34-35ºC) (Clementi, 1997). Recientemente se ha descrito que
Pseudoalteromonas CAM025, microorganismo aislado en el Antartico, produce su exopolisacárido con un
rendimiento 30 veces superior a -2ºC y 10ºC que a 20ºC (Mancuso-Nichols y col., 2005).

59
Introducción

Varios autores coinciden en afirmar que la producción de exopolisacáridos se induce a estas


temperaturas debido a que el crecimiento bacteriano se enlentece. Ello determina una síntesis menor de
los constituyentes de la pared celular y por consiguiente, una mayor disponibilidad de transportadores
para los compuestos intermediarios y precursores del EPS (Whitfield, 1988). Este hecho argumenta, de
igual forma, la mayor producción de exopolisacárido en la fase estacionaria de crecimiento de algunas
bacterias (Petry y col., 2000; Sutherland, 2001a).

Por otra parte, la temperatura óptima que permite una máxima producción de EPS puede
coincidir con aquella temperatura a la que se incrementa la actividad de enzimas envueltas en la síntesis
de precursores del polisacárido, tal y como se ha comprobado en Klebsiella pneumoniae (Mengistu y col.,
1994). A temperaturas superiores, puede además favorecerse la utilización del sustrato carbonado del
medio para la síntesis de otro producto extracelular, con la consiguiente disminución del exopolisacárido
producido.

pH

El pH del medio de cultivo indiscutiblemente influye en el crecimiento y metabolismo bacteriano


afectando a la síntesis de enzimas y al transporte de sustratos implicados en la producción de EPS
(Sutherland, 1990).

El óptimo de producción para la mayoría de biopolímeros microbianos se da a valores de pH


próximos a la neutralidad (6,5-7,5). Sin embargo, existen algunas excepciones en las que en condiciones
de neutralidad la síntesis de polímero no se favorece, como en el caso del pululano, que requiere un pH
entre 5 y 6,1 para su máxima producción (Lacroix y col., 1985) o el del escleroglucano, cuyo pH óptimo
está comprendido entre 3,5-4,5 (Wang y McNeil, 1995). Incluso a pH extremadamente ácido, se estimula
el proceso de producción de determinados exopolisacáridos como el de la levadura Rhodotorula
acheniorum que requiere un pH entre 1,7 y 2 (Grigorova y col., 1999).

En algunos microorganismos, el valor del pH en el medio de cultivo se incrementa


transitoriamente al final de la fase exponencial del crecimiento y principio de la fase estacionaria, variación
que coincide con el aumento en el contenido en grupos acilo y en la viscosidad (Tait y col., 1986).

En la mayoría de los casos, no sólo es esencial proporcionar el pH óptimo al inicio del proceso de
fermentación, sino que la producción de polímero es mayor bajo condiciones de pH controlado, por ello
determinados medios llevan adicionada una sustancia tamponante como las sales de fosfato, empleadas
en el medio de producción del alginato (Clementi y col., 1995). En este sentido, la utilización del
fermentador es enormemente ventajosa pues el control de pH se encuentra monitorizado y su ajuste es
permanente mediante la adición de ácido o álcali.

60
Introducción

La producción de EPS es también significativamente mayor bajo control de pH en las bacterias


ácido lácticas (Mozzi y col., 1996; Gassem y col., 1997), así como en la obtención de curdlano. En este
caso, el control de pH se realiza en dos etapas. Puesto que el pH óptimo para el crecimiento de
Agrobacterium es 7 y la producción de curdlano es mayor a pH 5,5, en una primera etapa ha de
mantenerse la neutralidad y en una segunda, provocar una ligera acidificación para obtener la máxima
cantidad de polímero. Además, la elevada viscosidad de los cultivos puede ser minimizada operando a pH
ácido en la segunda parte del proceso de fermentación ya que el curdlano es insoluble bajo estas
condiciones (Lee, 2002).

Disponibilidad de oxígeno

La mayor parte de los microorganismos productores de EPS son aerobios o anaerobios


facultativos, aunque en estos últimos la síntesis de exopolisacárido ocurre cuando el microorganismo
crece aerobicamente. Por ello, la aireación del medio de cultivo juega un papel fundamental en la síntesis
de los exopolisacáridos (Sutherland, 1990).

Sin embargo, Rau y colaboradores (1992) observaron una mejora en la producción de


exopolisacárido en cultivos de Schizophyllum commune y Sclerotium glucanicum bajo limitación de
oxígeno. En condiciones similares también se obtiene una adecuada producción de polímero por
Sinorhizobium meliloti (Sutherland, 1990), al igual que ocurre con las bacterias ácido lácticas, que
producen polímero tanto en presencia de bajas tensiones de oxígeno como en condiciones de
anaerobiosis (De Vuyst y Degeest, 1999).

Para el resto de los microorganismos aerobios, uno de los mayores problemas asociados con el
proceso de fermentación es el aumento de la viscosidad de los cultivos que afecta enormemente a la
biodisponibilidad del oxígeno y nutrientes, cuya disminución repercute directamente en la producción del
EPS (Becker y col., 1998; Amanullah y col., 1997; Flores y col., 1994). De modo especial este hecho
supone una importante limitación en la producción de xantano y gelano, entre otros, y es esencial
garantizar una aireación y agitación del cultivo adecuada que evite la existencia de zonas estanco de
anaerobiosis (Nakajima y col., 1990; Amanullah y col., 1998b).

A ello se suma el hecho de que bajo condiciones de limitación de oxígeno, puede favorecerse la
síntesis de otros productos como los poli-β-hidroxialcanoatos (PHA), lo cual justifica también una
disminución en los rendimientos de producción del exopolisacárido tal y como ocurre con el alginato
(Brivonese y Sutherland, 1989).

En el gelano resulta adecuada una agitación de los cultivos (alrededor de 250 rpm). Se ha podido
comprobar que una agitación menor resulta insuficiente, y niveles de agitación muy elevados (600-800

61
Introducción

rpm) pueden originar zonas estanco de aire que hacen el cultivo muy heterogéneo, dificultándose la
transferencia de calor y sustratos (Dreveton y col., 1994).

La agitación mecánica en el xantano resulta crucial e incluso permite un proceso de producción


mucho más rápido y eficaz que cuando únicamente se utilizan otros sistemas de aireación en los
biorreactores. Por ello, en la producción industrial se utilizan tanques con agitación mecánica. Algunos
autores establecen un valor fijo para la velocidad de agitación durante todo el proceso (Pinches y Pallent,
1986; Shu y Yang, 1990) mientras que otros aumentan la agitación a medida que la viscosidad del cultivo
se hace mayor. A medida que la concentración de xantano en el medio aumenta, se produce una
acumulación de polímero en forma de una película alrededor de la célula que impide la difusión de los
nutrientes y el oxígeno al interior celular, disminuyendo la productividad específica de xantano (Amanullah
y col., 1998a). Por tanto, la velocidad de agitación no debe mantenerse constante sino que se ha de
incrementar gradualmente para compensar la caída del oxígeno disuelto debido al aumento de viscosidad
(García-Ochoa y col., 1997). La velocidad de agitación idónea oscila entre un mínimo de 250-300 rpm,
pudiendo alcanzar un máximo de hasta 1000 rpm (Umashankar y col., 1996; García-Ochoa y col., 1995;
Azuaje y Sanchez, 1999).

En relación a los niveles de oxígeno disuelto, la concentración de xantano así como su calidad y
propiedades vienen determinadas por este factor. En la fase de producción del polímero los niveles de
oxígeno crítico se encuentran entre el 6 y 10% (v/v), de modo que a porcentajes de oxígeno inferiores al
6% (v/v) la producción específica de xantano se encuentra disminuída significativamente (Amanullah y
col., 1998b).

Para el maurano, se ha descrito que la producción óptima de exopolisacárido se produce cuando


la agitación de los cultivos es de 100 rpm, de manera que una aireación menor es insuficiente, mientras
que niveles superiores de agitación (200 rpm) pueden originar zonas estanco de aire, viendose dificultada
la producción del polímero por parte de la bacteria (Arias y col., 2003).

3.11.4. Influencia de las condiciones de cultivo sobre la masa molecular

Una de las propiedades físicas más influenciadas por las condiciones de cultivo es la masa
molecular de los exopolisacáridos.

La masa molecular del zooglano, exopolisacárido producido por Zoogloea ramigera, puede
modificarse según la composición del medio de cultivo (Guillouet y col., 1999). Para ello, se estudiaron las
propiedades del polímero producido en un medio definido con y sin extracto de levadura. Aunque la
composición del zooglano en ambos medios es idéntica, los componentes presentes en el medio tienen
un gran efecto sobre su grado de polimerización y concretamente en el medio adicionado de extracto de
levadura, el zoogalno tiene una masa molecular superior. Esto se explica porque el extracto de levadura

62
Introducción

contiene una enorme variedad de componentes que pueden provocar la inducción de la síntesis y
actividad de polimerasas o despolimerasas. En el caso de Zoogloea, se ha comprobado que se produce
un mayor grado de polimerización.

La naturaleza de la fuente de carbono también puede llegar a condicionar la masa molecular de


un determinado polímero. En medios con almidón, Aureobasidium pullulans produce pululano de menor
masa molecular que cuando la fuente de carbono es glucosa o sacarosa (Silman y col., 1990).

Otros factores que afectan a la masa molecular de los polímeros son la concentración de fosfatos
y la osmolaridad del medio, tal y como ocurre con el pululano o el succinoglicano producido por
Sinorhizobium meliloti (Breedveld y col., 1990; McNeil y Harvey, 1993). Por otra parte, la adición de un
®
surfactante no iónico como el Brij 76 al medio de producción de succinoglicano permitió obtener un
producto de mayor masa molecular (Stredansky y col., 1998).

Por último, resulta muy interesante el caso de aquellos microorganismos en los que tiene lugar la
producción simultánea de dos exopolisacáridos. En Lactobacillus lactis subsp. cremoris LC 330,
productora de dos EPS de diferente masa molecular, una limitación de nitrógeno en el medio determina
preferentemente la producción del polímero de mayor tamaño de modo que se puede inducir la
producción de la fracción polisacarídica de mayor interés modificando tanto las condiciones de cultivo
como la composición del medio (Marshall y col., 1995).

3.12. Aplicaciones de los exopolisacáridos microbianos

Desde el punto de vista comercial, los exopolisacáridos microbianos han despertado gran interés.
Actualmente han sido comercializados algunos exopolisacáridos microbianos con aplicación en múltiples
sectores industriales. Estos productos incluyen la celulosa bacteriana, el curdlano, el gelano y el xantano,
entre otros (Tabla 7).

De entre estos exopolisacáridos producidos a nivel industrial, la legislación únicamente ha


aprobado para su uso alimentario en Europa y Estados Unidos al xantano y gelano; mientras que el
curdlano sólo se encuentra aceptado como aditivo alimentario en Japón (Sutherland, 1998; 2001a).

Dadas sus interesantes propiedades, el xantano sigue siendo considerado como el polímero de
referencia para el amplio grupo de exopolisacáridos microbianos existentes y de nueva aparición. En 1969
fue aprobado por la FDA (Food and Drug Administation) y en 1980 recibió su aprobación por la Unión
Europea, a la vez que se le asignó el número E-415.

63
Introducción

Tabla 7. Aplicaciones de los exopolisacáridos microbianos (adaptado de Sutherland, 1990; 1998; 2001a).

Propiedades Aplicación Polímero


Naturaleza antigénica que origina Agentes antitumorales, antivirales, β-D-glucanos
respuesta de anticuerpos inmunomoduladores

Anticoagulantes La misma de la heparina EPS de Escherichia coli K5

Naturaleza polisacarídica Sustratos de enzimas EPS de Escherichia colii K5


Preparación de oligosacáridos Curdlano, pululano,
escleroglucano

Estabilizantes de emulsiones Helados, aderezos de ensaladas Xantano

Formadores de fibras elásticas Membranas acústicas Celulosa bacteriana

Formadores de películas Cubiertas protectoras de alimentos Pululano


y de formas farmacéuticas Celulosa bacteriana

Agentes floculantes Extracción de minerales Varios


Estabilizantes de espumas Cerveza, extintores de incendios Xantano
Agentes gelificantes Tecnología celular y enzimática Gelano
Pastelería, postres lácteos, gelatina Curlano, gelano
Recuperación de petróleo Curlano, xantano

Agentes hidratantes Cosméticos y productos Acido hialurónico


farmacéuticos
Inhibidores de la formación de Alimentos congelados, pastillas y Xantano
cristales jarabes azucarados
Agentes suspensores Formulación de pesticidas y sprays Xantano
Agentes viscosizantes Tintas de impresoras, tintes textiles, Xantano
pinturas
Mermeladas, salsas y jarabes

3.12.1. Industria alimentaria

El uso de los exopolisacáridos microbianos en alimentación se debe principalmente a su


capacidad para alterar las propiedades reológicas del agua presente en los productos alimenticios así
como para modificar su textura. De hecho, la mayor parte de los EPS empleados en este sector se
comportan como agentes espesantes o gelificantes.

Existe un gran número de exopolisacáridos microbianos que pueden ser utilizados como agentes
gelificantes, no obstante, cada uno de ellos presenta propiedades gelificantes específicas y por tanto,
sólo serian válidos para determinados alimentos. Son de especial importancia en alimentación los geles
de gelano, curdlano, así como geles de xantano-galactomananos.

En relación con su poder viscosizante y en particular con el comportamiento pseudoplástico de


muchos biopolímeros, estos compuestos originan una sensación agradable en el paladar en aquellos

64
Introducción

alimentos a los que son adicionados. En definitiva, algunas características organolépticas de los alimentos
como su apariencia, sabor o color pueden estar influenciadas por la presencia de polisacáridos
microbianos. El almidón de maíz y xantano producen, por ejemplo, un agradable sabor dulce.

En la industria alimentaria, las bacterias ácido-lácticas (BAL) se incorporan intencionadamente


a una gran variedad de productos como leche, carnes o derivados cárnicos y verduras, con el propósito
de conseguir un producto final estable y seguro con características sensoriales únicas y un valor nutritivo
adecuado (Caplice y Fitzgerald, 1999; Gilliland, 1985). La industria láctea ha logrado desarrollar una gran
variedad de productos derivados de la leche con distintas texturas y propiedades organolépticas usando
diferentes tecnologías y gracias a la fermentación llevada a cabo por las BAL. Estos microorganismos
provocan una acidificación rápida del producto por la fermentación de la lactosa, lo cual preserva a la
leche de la proliferación de otros microorganismos y permite la obtención de productos fermentados como
el yogur o el queso (Ruas-Madiedo y col., 2002). La textura y viscosidad de los derivados lácteos
fermentados se debe en gran parte a la síntesis de exopolisacáridos por la mayoría de bacterias ácido-
lácticas. Por ello, la producción de EPS resulta crucial y de gran significado tecnológico en la obtención de
estos productos, debido a sus propiedades viscosizantes, estabilizantes y a su capacidad de retención de
agua. La utilización de cepas BAL productoras de EPS en la elaboración de derivados lácteos
fermentados es una práctica habitual incluso en países en los que la incorporación de aditivos de origen
vegetal o animal está prohibida. En la fabricación de yogur se utilizan cepas de Streptococcus
thermophilus y Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus que son productoras de EPS y mejoran la
textura, evitando la sinéresis e incrementando la viscosidad del yogur. Otras cepas productoras de EPS,
como distintas especies de Lactococcus, son de uso común en la elaboración de un lácteo similar al
yogur, el viili, en Escandinavia (Ruas-Madiedo, y col., 2002).

Algunos exopolisacáridos microbianos se adicionan a los alimentos como agentes


estabilizadores de emulsiones (Sutherland, 1990). Las emulsiones de aceite en agua o de agua en
aceite son muy comunes en alimentación. Existen muchos productos (salsas, cremas, patés, etc.), en los
que aceites, compuestos lipídicos, agua y otros ingredientes se incorporan conjuntamente. En ocasiones
estos sistemas multifásicos son desecados para una reconstitución en el momento de ser consumidos;
como ocurre con las sopas instantáneas, postres o salsas, entre otros. El xantano se emplea para la
elaboración de este tipo de productos alimenticios desecados; puesto que se disuelve en agua fría o
caliente dando lugar a dispersiones de naturaleza tixotrópica que pueden ser calentadas o refrigeradas
sin sufrir ninguna alteración. La adición de este tipo de polímeros impide la separación de las fases
constituyentes del producto asegurando una prolongada estabilidad del mismo. La estabilidad del xantano
en un amplio rango de pH, así como su compatibilidad con la mayor parte de los ingredientes, lo hacen
especialmente útil en este tipo de productos, salsas, cremas o yogur, en los que normalmente el pH es
ácido (Sutherland, 1998; 2001a; Yilmazer y col., 1991).

65
Introducción

Los exopolisacáridos son fuente de 6-desoxiazúcares para la síntesis de agentes saborizantes


como el furaneol y sus derivados (Graber y col., 1988). El furaneol confiere sabor a caramelo, aunque
mediante una serie de modificaciones puede originar distintos sabores. Debido a su elevado coste, la
búsqueda de nuevas fuentes para la obtención de estos compuestos, entre ellas los biopolímeros
microbianos, es de gran interés (Sutherland, 1990).

3.12.2. Industria farmacéutica y medicina

Los exopolisacáridos tienen un gran número de aplicaciones relacionadas directa o


indirectamente con la medicina, que se basan en sus propiedades funcionales y/o sus propiedades
biológicas.

Los dextranos son utilizados como sustitutos del plasma a una concentración del 6 % (p/v), lo
que origina una viscosidad y comportamiento osmótico similar al del plasma sanguíneo humano. Estos
compuestos no se degradan rápidamente y causan menor daño hepático que otros sustitutivos del
plasma.

Una aplicación de los alginatos procedentes de algas consiste en utilizar las fibras de alginato
cálcico en la elaboración de vendas destinadas a absorber los exudados de una herida, pues además de
ser hemostáticas, no irritan la piel. Con esta misma finalidad se pueden emplear los alginatos microbianos
de similar composición a los procedentes de algas (Crescenzi y col., 1989).

Asimismo, se está empleando la celulosa de origen bacteriano que es capaz de formar una
especie de “piel artificial” sobre quemaduras graves (Bielecki y col., 2002).

Con interés en clínica citaremos también el ácido hialurónico, de utilidad en cirugía ocular,
donde encuentra aplicación por su gran similitud con el material encontrado en el humor vítreo. Este
compuesto, además de poder incluirse en lágrimas artificiales, se utiliza como ingrediente de varias
preparaciones farmacéuticas (Sutherland, 1998).

La heparina se emplea como fármaco antitrombótico y antilipémico; son numerosos los


estudios que tratan de mejorar la eficacia terapéutica de este polímero y reducir sus efectos secundarios
mediante la modificación de su estructura química y tamaño molecular.

Los alginatos y otros polisacáridos, como el gelano, tienen potenciales aplicaciones en el


desarrollo de productos encapsulados para la liberación retardada de fármacos y hormonas (Benedetti
y col., 1989; Craig y col., 1997).

66
Introducción

Por otra parte, los oligosacáridos derivados de fuentes microbianas como los β-glucanos de
Rhizobium parecen ser útiles para la síntesis de nuevos productos con actividad farmacológica.

Los polisacáridos capsulares de bacterias patógenas son responsables de la mayor parte de


interacciones hospedador-patógeno y activan el sistema inmunológico de defensa. La respuesta de los
anticuerpos frente a un antígeno polisacarídico varía según las propiedades físicas y químicas del mismo
(Sutherland, 1990). En función a estas características se han llegado a diseñar vacunas con EPS
microbianos que ofrecen ventajas sobre las obtenidas con microorganismos completos. Un problema
asociado con las vacunas elaboradas con exopolisacáridos de bacterias Gram negativas es la presencia
de pequeñas cantidades de lipopolisacárido procedente de la pared bacteriana. La retirada de este
componente es un paso crucial y crítico para prevenir reaaciones de shock en los pacientes (Adam y col.,
1995). Existe otro problema relacionado con el uso de estos polisacáridos bacterianos como vacunas y es
la escasa respuesta que provoca en niños menores de 2 años, casualmente el grupo de mayor riesgo
frente a estas infecciones. Para solventar este problema se han llevado a cabo numerosos estudios y se
ha realizado la unión de los polisacáridos a un transportador de naturaleza proteica, por lo que
actualmente las vacunas conjugadas han sustituido en algunos casos a las constituídas únicamente por
polisacáridos (O’Brien y Santosham, 2004). Las tres vacunas de polisacáridos microbianos más
importantes son:

• vacuna frente a Haemophilus influenzae tipo b.


• vacuna frente a meningococos del serogrupo Y, A y C.
• vacuna multivalente frente a Streptococcus pneumoniae

La actividad protectora, no específica, frente a un gran número de virus ha sido demostrada en


varios polisacáridos, principalmente polímeros de eucariotas, entre los que destacan la heparina y el
carragenato (Sutherland, 1990).

La heparina muestra un potente efecto inhibitorio de la replicación de los herpesvirus, aunque


únicamente es activa en las primeras etapas de replicación viral. Puesto que es una molécula
polianiónica, se ha sugerido como mecanismo que ésta interacciona con las cargas positivas presentes en
el virus o en la superficie celular, inhibiendo de este modo la adsorción viral (González y col., 1987). De
modo similar se ha encontrado que el carragenato tiene un potente efecto inhibitorio del virus del herpes
simple (VHS-1) (González y col., 1987). Ambos polisacáridos carecen de efectos citotóxicos y su modo de
actuación es mediante el bloqueo de la adsorción y la multiplicación viral.

Una característica de algunos 1,3-β-D glucanos de origen fúngico es su actividad antitumoral.


Todos ellos son glucanos relacionados por su estructura con el escleroglucano, aunque varían en cuanto
a su solubilidad en agua y la naturaleza de sus cadenas. Un ejemplo de estos polímeros son los

67
Introducción

producidos por basidiomicetos lignocelulolíticos, como Phanerochaete chrysosporium y Coriolus


versicolor. Con algunos de estos glucanos fúngicos se ha demostrado experimentalmente una reducción
en los tumores de ratones (Burns y col., 1994).

El polisacárido microbiano curdlano también presenta actividad antitumoral in vivo a dosis


similares a las empleadas de β-D glucanos fúngicos. Se ha sugerido que los polisacáridos sulfatados de
origen no microbiano inhiben metástasis tumorales por el bloqueo de heparinasas desarrolladas en el
tumor, acción que no se ha confirmado para el caso de los β-D glucanos (Sutherland, 1990). Asimismo se
ha estudiado la actividad antitumoral del exopolisacárido producido por Lactobacillus kefiranofaciens
(Santos y col., 2003), del EPS de Agaricus blazer (Shu y Wen, 2003) y de un derivado del dextrano nativo
(Bastias y col., 2002).

La principal fuente de polisacáridos bacterianos sulfatados la proporcionan las cianobacterias,


aunque actualmente cada vez es mayor el número de polímeros aislados con estas características de
origen bacteriano. Existen numerosas publicaciones sobre el efecto de los polisacáridos sulfatados sobre
distintos virus in vivo, incluidos virus de inmunodeficiencia humana (Baba y col., 1988; Bagasra y
Lischner, 1988; Lynch y col., 1994; Javan y col., 1997; Neurath y col., 2002). Otros estudios han puesto
de manifiesto la actividad contra el herpesvirus del polisacárido sulfatado producido por microalgas rojas
(Huleihel y col., 2003), mientras que Yim y colaboradores (2003; 2004) estudiaron el exopolisacárido
sulfatado sintetizado por la cepa KG03 de la microalga marina Gyrodinium impudicum, y Carlucci y
colaboradores (2002) los carragenatos producidos por el alga marina Gigartina skottsbergii. Finalmente,
Ono y colaboradores (2003) estudiaron la actividad antiviral in vivo e in vitro de galactomananos
sulfatados contra el virus de la fiebre amarilla y el virus Dengue 1.

El tratamiento clínico con polisacáridos sulfatados aún no ha tenido éxito en la terapia de


infecciones víricas humanas por su actividad anticoagulante, debida a su alto contenido de sulfatos o su
gran tamaño molecular que le impide atravesar fácilmente las membranas. A esto hay que añadir su
pobre absorción oral (Okutani, 1992; Okutani y Shigesta, 1993; Yim y col., 2004).

3.12.3. Aplicaciones en la industria cosmética

Los materiales empleados en este campo son principalmente de origen vegetal, o procedentes
de algas, incluidos los alginatos, aunque también han encontrado aplicación polisacáridos microbianos
entre los que destacamos el xantano.

En cuanto a las propiedades utilizadas de los polímeros, son muy similares a las empleadas en
alimentación, y es importante la ausencia de sabor de los polisacáridos que serán incorporados a
determinadas preparaciones.

68
Introducción

El xantano, por su carácter pseudoplástico, y gracias a la sensación que origina en el paladar se


incorpora a pastas de dientes y otros productos. En base a sus propiedades gelificantes, el gelano
también se emplea en productos dentales y de cuidado personal, como los desodorantes y geles
cosméticos, en los que se requiere una menor concentración de este polímero que de la mezcla
carragenano-goma garrofín, de uso tradicional (Giavasis y col., 2000). Por su elevada capacidad de
retención del agua, el ácido hialurónico también se utiliza en numerosos productos cosméticos
(Sutherland, 1998).

3.12.4. Exopolisacáridos microbianos como fuente de L-fucosa

Algunos exopolisacáridos microbianos, normalmente conocidos por


sus propiedades reológicas, su capacidad para formar geles, o su
actividad emulgente, podrían constituir una fuente para la obtención
de azúcares poco frecuentes como L-fucosa (Figura 14), que tiene
potenciales aplicaciones en Medicina (antitumoral, antiinflamatorio,
contra la artritis reumatoide, producción de anticuerpos) (Bauer y
Figura 14. L-fucosa. Reutter, 1978; Kieda y Monsigny, 1986; Roszkowski y col., 1989;
Kamel y Serafi, 1995) y en Cosmética (como hidratante y
reafirmante de la piel) (Molina, 1998; Robert y col., 2004a y b). La síntesis química de L-fucosa es un
proceso muy laborioso y de bajo rendimiento (Tanimura, 1961; Chiba y Tejima, 1979; Defaye y col., 1984;
Gesson y col., 1992; Dejter-Juszynski y Flowers, 1973; Kristen y col., 1988; Sarbajna y col., 1995), y la
obtención a partir de algas marrones es costosa y está sujeta a variaciones estacionales en cuanto a
cantidad y calidad (Black y col., 1952; Schwerger, 1966; Takemura y col., 1986; 1988). La síntesis
enzimática está siendo actualmente sometida a investigación (Wong y col., 1995). La hidrólisis química o
enzimática de exopolisacáridos ricos en L-fucosa abre nuevas líneas de trabajo para una obtención
eficiente de este azúcar inusual (Vanhooren y Vandamme, 1999).

El crecimiento y la producción de EPS por


parte de Klebsiella pneumoniae cepa
ATCC 12657 y Clavibacter michiganensis
subsp. michiganensis cepa LMG 5604 han
sido ampliamente estudiados (Vanhooren,
1997) ya que los exopolisacáridos que
sintetizan contienen L-fucosa en su
composición. Klebsiella pneumoniae cepa
Figura 15. Unidad repetitiva del clavano.
ATCC 12657, en condiciones óptimas,
produce 2,5 g/l de EPS, que se corresponden con 0,5 g/l de L-fucosa, mientras que Clavibacter
michiganensis subsp. michiganensis cepa LMG 5604, unas vez establecidas las mejores condiciones

69
Introducción

para el crecimiento y la producción del polímero (denominado clavano, Figura 15), produce 19,7 g/l de
EPS, que suponen 7,4 g/l de L-fucosa.

3.12.4. Otras aplicaciones

El empleo de los EPS, fuera de las aplicaciones clínicas y en alimentación, refleja varios de sus
atributos físicos. Es en el sector de la industria del petróleo donde los exopolisacáridos han sido
realmente aceptados en competencia con gomas de plantas, sus derivados y compuestos químicos
sintéticos. En este campo, se emplea la solución de polímero para movilizar al petróleo que, en otras
circunstancias, permanecería in situ. Asimismo, pueden emplearse para aumentar la viscosidad y, por
tanto, disminuir la movilidad del agua que se inyecta en los pozos de crudo. Así, los polímeros empleados
en este campo deben poseer un tamaño molecular que les permita atravesar los poros de la roca, deben
dar lugar a soluciones de alta viscosidad que no se vean afectadas por altas concentraciones de sal, altas
temperaturas y presiones o por las deformaciones inherentes a las operaciones de bombeo (Sutherland,
1982).

Además de en la industria del petróleo, existen otra serie de aplicaciones industriales para
aquellos EPS con otras propiedades físicas.

Así, los geles de polisacáridos producidos por bacterias, hongos y algas son ampliamente
utilizados en la inmovilización de enzimas y células (el-Naggar y col., 2003; Jahnz y col., 2003; Zohar-
Pérez y col., 2003; Le-Tien y col., 2004).

Los polisacáridos se emplean como espesantes en la industria de pinturas y adherentes para la


aplicación de tintes. Los geles son destinados también a la preparación de medios de cultivo en
microbiología, como por ejemplo los de gelano, como principal alternativa por presentar propiedades
específicas (Giavasis y col., 2000).

Los alginatos son de utilidad en agricultura, donde se aplican como agentes de revestimiento
cuando se plantan árboles jóvenes o arbustos; las raíces se sumergen en una solución de polisacárido
con el fín de recubrirlas con una película protectora que evite su desecación mientras tiene lugar el
transplante (Vanhooren y Vandamme, 1998; Chand y Singh, 2004). Curiosamente, tales soluciones
polisacarídicas también se han empleado para sumergir en ellas a los árboles de Navidad con objeto de
prolongar el periodo en que éstos permanecen sin marchitarse en un ambiente seco y cálido.

Otro de los usos potenciales de los polisacáridos reside en su contenido en ácidos urónicos, que
permite la unión de la célula a superficies y la adsorción de compuestos. Los EPS con alto porcentaje de
ácidos urónicos tienen mucho interés desde el punto de vista biotecnológico y se utilizan para la
adsorción de metales pesados (Kaplan y col., 1987; Geddie y Sutherland, 1993).

70
OBJETIVOS
Objetivos

El Grupo de Investigación “Exopolisacáridos Microbianos” (CVI 188) de la Universidad de


Granada, desarrolla actualmente su trabajo en las siguientes líneas de investigación:

• Biodiversidad de ambientes hipersalinos.


• Taxonomía y filogenia de bacterias halófilas.
• Caracterización molecular de genes de especies del género Halomonas.
• Estudio de exopolisacáridos de interés biotecnológico producidos por bacterias halófilas.

En los últimos años hemos estudiado distintos ambientes hipersalinos; con el fin de dotar a
nuestras investigaciones de un carácter aplicado, se realizaron aislamientos dirigidos a encontrar
específicamente bacterias halófilas productoras de exopolisacáridos. Como resultado de estos esfuerzos
hemos descrito seis nuevas especies de microorganismos halófilos productores de EPS: Halomonas
ventosae, Halomonas anticariensis, Halomonas almeriensis, Idiomarina ramblicola, Idiomarina
fontislapidosi y Alteromonas hispanica, y dos nuevos géneros, Salipiger mucosus y Palleronia
marisminoris. Aún así, nuestra colección de microorganismos halófilos productores de exopolisacáridos
es muy amplia, y no todas las cepas que la constituyen están caracterizadas. A fin de iniciar el estudio
taxonómico de los microorganismos que aún no están identificados, de producir de manera eficaz los EPS
sintetizados por nuestras bacterias, y de conocer en profundidad su composición química y propiedades
funcionales, se plantearon los siguientes objetivos para la presente Tesis Doctoral:

1. Comenzar la caracterización taxonómica de las cepas productoras de EPS de


nuestra colección que todavía no han sido validamente descritas por nuestro
Grupo de Investigación, mediante el análisis filogenético de las mismas.
2. Optimizar el proceso de producción de los EPS.
3. Analizar la composición química, la masa molecular y las propiedades físicas de
los EPS.
4. Evaluar las potenciales aplicaciones biotecnológicas de los EPS.
5. Conocer el papel fisiológico de los EPS.

73
MATERIAL Y MÉTODOS
Material y métodos

1. CEPAS BACTERIANAS

Los microorganismos empleados para la realización del presente estudio se detallan a


continuación en la Tabla 8.

Tabla 8. Cepas productoras de exopolisacáridos objeto de estudio, hábitat de aislamiento e identificación.

CEPA HÁBITAT MUESTRA IDENTIFICACIÓN*


X2 Salinas de Souk El Arbaa (Marruecos) Suelo Halomonas maura
B40 Salinas de La Malá, Granada (España) Suelo “
B100 Salinas de Sabinar, Murcia (España) “ “
N12 Salinas de San Pedro de Pinatar, Murcia (España) “ “
A16 Salinas de Marchamalo, Murcia (España) “ “
M4 Salinas de Cabo de Gata, Almería (España) “ Halomonas eurihalina
X8 Salinas de Asilah (Maruecos) Suelo “
T
Al12 Barranco de la Salina, Jaén (España) “ Halomonas ventosae
Al15 “ “ “
Al16 “ “ “
FP34 Laguna Redonda, Málaga (España) “ Halomonas anticariensis
T
FP35 “ “ “
FP36 “ “ “
T
A3 Salinas de Calblanque, Murcia (España) “ Salipiger mucosus
T
M8 Salinas de Cabo de Gata, Almería (España) Agua Halomonas almeriensis
T
B33 Salinas de Marchamalo, Murcia (España) Suelo Palleronia marisminoris
T
F23 Laguna de Fuente de Piedra, Málaga (España) “ Idiomarina fontislapidosi
T
R22 Rambla Salada, Murcia (España) Agua Idiomarina ramblicola
T
F32 Laguna de Fuente de Piedra, Málaga (España) “ Alteromonas hispanica
B35 Salinas de Marchamalo, Murcia (España) “ Alteromonas spp.
*Ver Capítulo I de Resultados y Discusión, Caracterización taxonómica de las cepas.

Figura 16. Salinas de Asilah, al Norte de Marruecos, y humedal de Rambla Salada, en Murcia

2. MANTENIMIENTO DE LAS CEPAS

Para el mantenimiento de los microorganismos se hizo una resiembra periódica, cada 3 meses,
en tubos de medio MY (Moraine y Rogovin, 1966), adicionado de agar al 2% (p/v), y suplementado con

77
Material y métodos

una solución de sales cualitativamente similar al agua del mar (Rodríguez-Valera y col., 1981) hasta una
concentración final de sales del 7,5% (p/v). El pH del medio se ajustó a pH 7,2 con NaOH 1M. Dichos
tubos se incubaron durante 24 horas a 32 ºC. Igualmente, las cepas se mantuvieron liofilizadas para su
conservación a largo plazo.

Figura 17. Aspecto de las colonias de Halomonas maura B100 tras 48 horas de la siembra en medio MY sólido al 7,5%
(p/v) de sales.

Medio MY (Moraine y Rogovin, 1966)

Glucosa anhidra (Panreac) 10g


Proteosa Peptona nº3 (Cultimed) 5g
Extracto de Malta (Cultimed) 3g
Extracto de Levadura (Cultimed) 3g
Solución de Sales al 30% 250 ml
Agua destilada c.s.p 1000 ml

Solución de sales al 30% (p/v) (Rodríguez-Valera, 1981)

NaCl (Panreac) 205,2g


MgCl2·6 H2O (Merk) 36,0g
MgSO4·7 H2O (Merk) 52,0g
CaCl2·2 H2O (Merk) 0,8g
KCl (Merk) 5,2g
NaHCO3 (Merk) 0,2g
NaBr (Merk) 0,6g
Solución al 0,5% (p/v) de FeCl3 · 6 H2O 0,65 ml
Agua destilada c.s.p. 1000 ml

78
Material y métodos

3. ESTUDIO FILOGENÉTICO DE LAS CEPAS

Amplificación del gen ADNr 16S: Se amplificaron las secuencias del gen ADNr 16S de las
cepas que formaron parte de este trabajo y que hasta el momento no han sido definitivamente
caracterizadas desde el punto de vista taxonómico. Para ello, se utilizó ADN de las cepas disuelto en
agua bidestilada, y se amplificó el gen por PCR, utilizando el protocolo de Saiki y colaboradores (1988).
Se utilizó el cebador directo 16F27 (5´-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3´), que se une a las posiciones 8-
27, y el cebador reverso 16R1488 (5´-CGGTTACCTTAGGACTTCACC-3´) (Pharmacia), unido a las
posiciones complementarias 1511-1488 [E. coli numbering (Brosius y col., 1978)]. Para completar toda la
secuencia del gen, se diseñaron nuevos cebadores, complementarios a las posiciones intermedias.

Secuenciación del fragmento de ADN amplificado: Los productos de PCR se purificaron


®
utilizando el kit Microcon PCR, para purificación de fragmentos de PCR, de acuerdo con las
recomendaciones del fabricante. La secuenciación se llevó a cabo en el Servicio de Secuenciación
Automática del Instituto de Parasitología y Biomedicina López Neyra de Granada, utilizando el aparato
Applied Biosystems (modelo 373 STRECHT). El método de secuenciación fue el comercializado por
Perkin Elmer, ABI PRISM™ Dye Terminador, que utiliza en la reacción de extensión el enzima AmpliTaq
ADN polymerase y emplea didesoxinucleótidos marcados con cromóforos fluorescentes.

Análisis filogenético: Las secuencias obtenidas se compararon con las secuencias de los
genes ADNr 16S disponibles en las bases de datos GenBank y EMBL obtenidas de la base de datos del
Centro Nacional para Información Biotecnológica, usando BLAST search. Se realizó un árbol filogenético
con las secuencias ADNr 16S de las cepas incluidas en este trabajo más otras cepas de referencia,
utilizando el software MEGA 3.0 (Kumar y col., 2004) y el alineamiento de secuencias mediante el método
Clustal_X (Thompson y col., 1997). Las distancias filogenéticas y los agrupamientos se determinaron
utilizando el método “neighbour-joining”. La fiabilidad de los agrupamientos se aseguró por un análisis
“bootstrap” (1000 réplicas).

4. PROCESO DE EXTRACCIÓN DE LOS EXOPOLISACÁRIDOS

Los exopolisacáridos, que recibieron como denominación las mismas siglas que los
microorganismos que los producen, se obtuvieron según la metodología descrita por Quesada y
colaboradores en 1993 (Figura 18).

Se partió de un cultivo de 5 ml de cada una de las cepas en medio MY al 5% (p/v) de sales,


obtenido tras el crecimiento de las mismas durante 24 horas a 32ºC. Con dicho cultivo se inocularon con
un volumen de 1 ml, cuatro matraces erlenmeyer de 500ml que contenían 150ml de medio MY 5% (p/v)
de sales y se incubaron a 32ºC durante cinco días en agitación (100rpm).

79
Material y métodos

Transcurrido este tiempo, los cultivos bacterianos se centrifugaron a 10.000 rpm durante 60
minutos (Centrífuga Sorvall RC-5B, rotor GSA). Al sobrenadante se le añadieron tres volúmenes de etanol
96% (v/v) frío (-80º C) y tras 12 horas a 4º C se recogió el precipitado del material extracelular (EPS)
mediante centrifugación a 7.000 rpm durante 10 minutos, con el fin de eliminar el alcohol.

A continuación, se dejaron evaporar totalmente los posibles restos de alcohol en el precipitado y


éste se solubilizó en agua destilada. El material extracelular en solución se purificó mediante
ultracentrifugación a 50.000 rpm durante 60 minutos (Ultracentrífuga Beckman L8-M, rotor 50Ti).
Posteriormente, el sobrenadante se dializó empleando membranas de diálisis Midicell de tamaño de poro
12-14000 Daltons, durante 72 horas en agua destilada y por último, se liofilizó para que estuviera exento
de agua y así poder determinar la producción por gravimetría.

1 ml
Cultivo celular

Células

MY5% (p/v)
MY5%(p/v)
32ºC/24h 10.000rpm/60min
32ºC/5 días Sobrenadante

EPS sedimento
EPS sobrenadante

50.000rpm/60min 7.000rpm/10min
Precipitación
Diálisis Alcohólica
96 horas
Impurezas sedimento Alcohol sobrenadante

EPS

Liofilización

Figura 18. Proceso de extracción del EPS.

La productividad de cada cepa se expresó en gramos de EPS (producto final liofilizado) por litro
de medio de cultivo y con respecto al peso seco celular (gramos de EPS por gramo de peso seco celular).
Este producto purificado se utilizó para los posteriores estudios químicos, y determinación de la masa
molecular.

80
Material y métodos

5. OPTIMIZACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE LOS EXOPOLISACÁRIDOS

El estudio de la influencia sobre la producción del exopolisacárido, de distintas condiciones de


cultivo así como de la adición de diversos nutrientes en medio complejo, se llevó a cabo a partir del medio
de cultivo MY.

Para todos los ensayos, partimos de unas condiciones de cultivo estándar que son las siguientes:
cultivo en matraces erlenmeyer de 500 ml con 100 ml de medio MY al 7,5 % (p/v) de sales, incubación a
32ºC y 100 rpm durante 5 días. Cada uno de los matraces se sembró con un 1 % de inóculo (con una
densidad óptica entre 1 y 1,2 a una longitud de onda de 600 nm) preparado en el mismo medio. Estas
condiciones se mantuvieron, introduciéndose una serie de variaciones en cada caso en función del
parámetro estudiado, las cuales se indican a continuación.

En cada uno de los ensayos, realizados por triplicado, se determinó la producción de


exopolisacárido (g EPS/l y g EPS/g PSC) y la biomasa celular (g PSC/l). El método de extracción de
polímero empleado fue el descrito por Quesada y colaboradores en 1993.

5.1. Tiempo de incubación

Con objeto de determinar en que fase del crecimiento se produce la mayor cantidad de
exopolisacárido se realizaron por triplicado las siguientes determinaciones: D.O. de los cultivos a 600 nm,
g biomasa/l y g EPS/l a distintos tiempos de incubación: 24, 48, 72, 96, 120, 144, 168 y 192 horas (8
días).

Para ello se prepararon tres series de 8 matraces cada una, que se incubaron en las mismas
condiciones, siguiendo las pautas estandarizadas y a los distintos tiempos de incubación se procedió a
llevar a cabo las diferentes determinaciones.

5.2. Concentración de sales

La concentración óptima de sales se determinó adicionando al medio MY una mezcla de sales


(Rodríguez-Valera y col., 1981) hasta un porcentaje final del 2,5; 5; 7,5 y 10 % (p/v).

5.3. Fuente de carbono y nitrógeno

Se ensayaron las siguientes fuentes de carbono incorporadas a una concentración final del 1%
(p/v) en el medio MY al 7,5% (p/v) en sales: glucosa, sacarosa, manosa y galactosa. También se ensayó

81
Material y métodos

la sustitución en el medio MY, con glucosa como fuente de carbono, de la proteosa peptona y los
extractos de malta y levadura por bacto-peptona.

5.4. Concentración de la fuente de carbono

Se ensayó la adición de glucosa como fuente de carbono al medio MY a las concentraciones del
1, 2, 5, 7 y 10 % (p/v). De igual forma, se determinó la productividad del exopolisacárido y la biomasa en
el mismo medio en ausencia de fuente de carbono.

5.5. Temperatura de incubación

A partir del medio MY como medio de producción del exopolisacárido se ensayó la influencia de
la incubación durante cinco días a distintas temperaturas: 22, 32 y 42 ºC.

5.6. Agitación

Se ensayó el efecto de la agitación de los cultivos a 100 y 200 rpm, en comparación con aquellos
incubados en reposo.

6. COMPOSICIÓN QUÍMICA DE LOS EXOPOLISACÁRIDOS

6.1. ANÁLISIS COLORIMÉTRICOS

6.1.1. Determinación del contenido de carbohidratos (Dubois y col., 1956).

Este método se basa en la presencia ésteres metílicos en los mono, oligo y polisacáridos así
como en sus derivados, los cuales son grupos potencialmente reductores que dan una coloración
amarillo-anaranjada estable cuando se tratan con fenol y ácido sulfúrico. El ácido sulfúrico provoca la
hidrólisis del polisacárido de modo que al quedar los monómeros libres reaccionan con el fenol y se
obtiene la coloración que servirá para la cuantificación de los carbohidratos presentes en la muestra.

Reactivos:
Ácido sulfúrico de pureza 95-98% (v/v) (Panreac)
Solución de fenol al 5% (p/v) (Sigma). Dicha solución presenta un aspecto blanquecino y suele
amarillear aproximadamente tras un año de almacenamiento.

Técnica:
A partir de una suspensión de 1mg/ml de exopolisacárido en agua destilada, se tomaron 30 μl y
se completó hasta 200 μl con agua destilada. A esta mezcla se adicionó 200 μl de fenol al 5% (p/v); se

82
Material y métodos

agitó vigorosamente y se añadió bruscamente 1 ml de ácido sulfúrico, con objeto de que la solución
entrara en ebullición para que la reacción transcurriera correctamente. Tras 10 minutos de reposo, se
volvió a agitar con vigor y se incubaron las muestras 10-20 minutos a 25-30º C. Una vez transcurrido ese
tiempo, se procedió a medir la absorbancia de las muestras a una longitud de onda de 490 nm.

La curva patrón se preparó a partir de una solución de glucosa (Sigma) en agua destilada a
concentración de 1 mg/ml.

6.1.2. Determinación del contenido de proteínas (Bradford, 1976).

Esta técnica está basada en la formación de un compuesto azulado debido a la formación de un


complejo entre las proteínas y el reactivo colorante “Azul de Comassie”. Se trata de un método más
sensible que el tradicional de Lowry (Lowry y col., 1951) que permite detectar pequeñas cantidades de
proteínas.

Reactivos:
Reactivo de Bradford o Coomasie Brilliant Blue 250 (Sigma).

Técnica:
A partir de una suspensión de 1 mg/ml de exopolisacárido en agua destilada, se tomaron 200 μl y
se completaron hasta 800 μl con agua destilada. A esta solución se le añadieron 250 μl del reactivo de
Bradford, agitando la muestra vigorosamente para finalmente medir la absorbancia de las muestras a una
longitud de onda de 590 nm.

El reactivo empleado origina una coloración azul con las proteínas que permanece estable al
menos durante una hora, a partir de la cual el complejo tiende a agregarse pudiendo aparecer un
precipitado que provoca la alteración de las medidas, Así, para mayor precisión de la determinación, la
medida de absorbancia de las muestras debe realizarse entre los 5 y 20 minutos siguientes a la adición
del reactivo.

Se preparó una solucón de 1 mg/ml de albúmina sérica bovina (Sigma) a partir de la cual se hizo
una dilución 1/10 (100 μg/ml) que constituyó la solución madre para llevar a cabo la curva patrón.

6.1.3. Determinación del contenido de ácidos urónicos (Blumenkrantz y Asboe-Hansen,


1973).

Este método está basado en la hidrólisis del polisacárido por reacción con el sulfúrico-
tetraborato, liberándose los ácidos urónicos que reaccionan con el 3-fenil-fenol, apareciendo un
cromógeno de color rosado.

83
Material y métodos

Reactivos:
3-fenil-fenol: solución de 3-fenil-fenol al 0.15% (p/v) (Sigma) en NaOH al 0.5% (p/v) (Panreac).
Ácido sulfúrico tetraborato: solución de tetraborato sódico (Sigma) a concentración 0.0125 M
en ácido sulfúrico concentrado (Panreac).

Técnica:
A partir de una suspensión de exopolisacárido en agua destilada a una concentración de 10
mg/ml, se tomaron 200 μl y se le adicionaron 1.2 ml de ácido sulfúrico-tetraborato mientras se mantenía la
muestra refrigerada en hielo. Tras una agitación vigorosa se calentó durante 5 minutos a 100º C y
transcurrido este tiempo se enfrió la muestra en hielo. En ese momento se adicionaron 20 μl de 3-fenil-
fenol, se agitó vigorosamente y tras 5 minutos de reposo se midió la absorbancia de las muestras a una
longitud de onda de 590 nm.

La curva patrón se preparó a partir de una solución madre de 1 mg/ml de ácido glucurónico en
agua destilada.

6.1.4. Determinación del contenido de restos acetilo (McComb y McCready, 1957).

El fundamento de esta determinación radica en que los grupos éster con hidroxilamina en medio
básico dan lugar a los ácidos hidroxámicos, que se combinan con los restos acetilo para formar los ácidos
acetohidroxámicos y originar un complejo soluble rojo en presencia de iones hierro.

Reactivos:
Hidróxido sódico al 9.4% (p/v) (Panreac)
Hidroxilamina al 3.7% (p/v) (Sigma)
Perclorato férrico:
Solución A: Se disolvieron 1,93 g de FeCl3 · 6 H2O (Probus) en HCl concentrado (Panreac).
Posteriormente se añadieron 5 ml de ácido perclórico al 70% (v/v) (Merck) y se evaporó hasta sequedad.
Por último se completó esta dilución hasta un volumen de 100 ml con agua destilada.
Solución B: A 12 ml de la solución A se le añadieron 1,66 ml de ácido perclórico 70% (v/v). Esta
mezcla se enfrió en hielo y se completó hasta 100 ml con metanol (Panreac) frío absoluto. Esta solución
puede ser conservada hasta 1 semana a temperatura ambiente.
Solución ácida de metanol: 7 ml de ácido perclórico al 70% (v/v), completando hasta los 100 ml
con metanol frío absoluto en hielo.

Técnica:
A partir de una suspensión de exopolisacárido en agua destilada (10 mg/ml), se tomaron 0.8 ml y
se le añadieron 0.2 ml de la solución de hidroxilamina y 0.2 ml de la solución de NaOH, esta última gota a
gota. Esta mezcla se mantuvo en agitación durante 15 minutos y pasado este tiempo se tomó 0.8 ml de la

84
Material y métodos

misma a la que se adicionaron 2 ml de agua destilada y 2 ml de solución ácida de metanol completando


finalmente hasta 10 ml con la solución B añadida poco a poco y en agitación. Por último, con objeto de
eliminar el precipitado formado por los ácidos urónicos, se centrifugaron las muestras durante 10 minutos
a 500 rpm y se midió la absorbancia del sobrenadante a una longitud de onda de 520 nm.

La curva patrón se preparó a partir de una solución madre que contiene 108.9 mg de
pentaacetato de β-D-glucosa (Sigma) en 5 ml de alcohol etílico. Tras calentar ligeramente, se completó
hasta 100 ml con agua destilada. A partir de ella se tomaron 2, 4, 5 y 7 ml, que se completaron hasta 50
ml con agua destilada. Así, 5 ml de estas nuevas soluciones representan 120, 240, 300 y 400 μg de
acetilos.

6.1.5. Determinación del contenido de restos piruvato (Sloneker y Orentas, 1962).

Para llevar a cabo este ensayo se procedió en primer lugar a la hidrólisis del exopolisacárido,
para lo cual se disolvió el polímero en ácido clorhídrico 1 N a una concentración de 1mg/ml,
manteniéndose a 100º C durante 3 horas.

Transcurrido este tiempo, 2 ml de dicha solución se mezclaron con 1 ml de 2,4-


dinitrofenilhidrazina (Sigma) al 0.5% (p/v) en ácido clorhídrico 2 M durante 5 minutos. Esta mezcla de
reacción se extrajo con 5 ml de acetato de etilo (Sigma), descartándose la fase acuosa.

La fase correspondiente al acetato de etilo fue extraída mediante la adición de 5 ml de carbonato


sódico al 12% (p/v) en agua destilada, proceso que se repitió en tres ocasiones. El extracto obtenido se
diluyó hasta un volumen final de 25 ml con esa misma solución. La concentración de piruvato se
determinó mediante medida de la absorbancia a una longitud de onda de 375 nm.

La curva patrón se preparó a partir de una solución madre de piruvato sódico (0.1 mg/ml)
(Sigma).

6.1.6. Determinación del contenido en hexosaminas (Johnson, 1971)

Reactivos:
Na2CO3 1,5N
Reactivo A: Acetilacetona al 4% en Na2CO3 1,5N, preparado extemporáneamente.
Reactivo B: (Reactivo de Ehrlich): p-dimetilaminobenzaldehido al 2,67% (p/v) en una solución
1:1 de etanol al 95% Hcl concentrado.

85
Material y métodos

Técnica
Para llevar a cabo este ensayo se procedió a la previa hidrólisis del exopolisacárido, para lo cual
se disolvió el polímero en ácido sulfúrico 0,5 N a una concentración de 20 mg/ml, manteniéndose a 100º C
durante 3 horas.

Transcurrido ese tiempo, la muestra se disolvió en 1 ml de agua destilada en tubos Pirex de 17


mm x 150 mm, y se le añadió 1 ml del Reactivo A. A continuación se hirvió 30 minutos, y se enfrió en
agua a temperatura ambiente unos 5 minutos, para a después añadir 5 ml de etanol 95% y agitar.
Seguidamente se añadió 1 ml de Reactivo B, y tras una espera de 25 minutos, se midió la absorbancia a
una longitud de onda de 529 nm.

La curva patrón se preparó a partir de una solución madre de clorhidrato de glucosamina (2


mg/ml) (Sigma).

6.2. DETERMINACIÓN DEL CONTENIDO EN CENIZAS

El contenido en cenizas se determinó gravimétricamente mediante diferencia de pesada tras


calcinación de la muestra (EPS liofilizado) a 550º C durante 6 horas.

6.3. PURIFICACIÓN DE LOS EXOPOLISACÁRIDOS

La purificación de los EPS se llevó a cabo mediante cromatografía de intercambio iónico con un
cromatógrafo Pharmacia LKB. Se utilizó una columna de sefarosa Hi Prep 16/10 Q FF (Pharmacia, Inc.).

El polímero (15 mg) se disolvió en 15 ml de Tris-ClH 0,02M (Sigma) (pH 7,5). Tras inyección de
la muestra en la columna se eluyó inicialmente con 50 ml del mismo tampón para arrastrar el exceso de
EPS no adherido a la matriz de sefarosa. A continuación se programó un gradiente de elución lineal de 0-
1,5M de NaCl con una velocidad de flujo de 5 ml/min; para lo cual se empleó como tampón de elución
Tris-ClH 0,02M (pH 7,5) con NaCl 1,5M. Finalmente se realizó una elución con 50 ml del tampón 1,5M de
NaCl para eliminar los restos de polisacárido en la columna.

La muestra fue sonicada previamente a esta determinación. La detección de polímero en las


fracciones recogidas se realizó mediante la determinación de carbohidratos según el protocolo de Dubois
y colaboradores (1956).

6.3.1. Determinación del contenido en sulfatos y fosfatos.

El contenido en sulfatos y fosfatos de los exopolisacáridos purificados se determinó mediante


cromatografía iónica con un cromatógrafo Dionex DX 300. El eluyente empleado fue una mezcla

86
Material y métodos

Na2CO3/NaHCO3 preparado mediante dilución de 10 ml de eluyente concentrado (0,18 M de Na2CO3/


0,17 M NaHCO3) hasta un volumen final de 1 litro en agua desionizada. Como solución regenerante se
empleó una solución 17.5 M de H2SO4.

6.3.2. Análisis de los monosacáridos constituyentes de los EPS.

La composición en monosacáridos de los exopolisacáridos purificados se determinó en base a


una modificación del método propuesto por Chaplin (1982).

El polímero purificado (100 μg) se sometió a metanolisis, consistente en la adición de 200 μl de


ácido clorhídrico metanólico 0,9 M y calentamiento de las muestras a 80º C durante 16 horas. La mezcla
resultante de metilglicósidos se llevó a sequedad en atmósfera de nitrógeno a temperatura ambiente. A
continuación se sometieron a un proceso de re-N-acetilación, para lo cual se adicionaron 50 μl de metanol
seco, 5 μl de piridina y 5 μl de ácido acético anhidro. Tras el secado de las muestras bajo atmósfera de
nitrógeno, se trataron con 15 μl de trimetil-silil-imidazol durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Los glicósidos N-acetilados y transformados se analizaron a) con un cromatógrafo Peri 2000


GLC-FID (Perichom), empleando un gradiente de temperatura de 120-240º C, con un programa de 6,1º
C/min, seguido de elución isotérmica, equipado de una columna BP1 (BP1 fused-silica capillary column,
25m x 32 mm, SGE), y b) con un espectrómetro de masas 8060/MD (Fisions Instruments), equipado de
una columna PTE (PTE 5 fused-silica capillary, 30m x 32 mm, Supelco); en este caso el programa del
horno incluía una temperatura inicial de 80º C durante 2 minutos, seguido de un aumento de temperatura
hasta los 235º C, a razón de 20º C/min, seguido de elución isotérmica. Antes del análisis en el
cromatógrafo de gases acoplado a espectrometría de masas, las muestras se disuelven en 200 μl de
hexano y se centrifugan 5 minutos a 5000 rpm.

7. DETERMINACIÓN DE LA MASA MOLECULAR

Se realizó a partir de los exopolisacáridos purificados mediante cromatografía de exclusión de


tamaño de alta resolución, con un cromatógrafo Varian 9012 acoplado a un refractómetro Varian RI-4
como detector.
Esta determinación se llevó a cabo con una columna PL aquagel-OH 60 8 μm (Polymer
Laboratorios), utilizando como eluyente acetato sódico 0,2 M (pH 5.1) a un flujo de 0,8 ml/min. Las
muestras fueron sonicadas antes de ser inyectadas en la columna para evitar la formación de agregados
que pudieran interferir en la determinación de la masa molecular.

4
Como controles se emplearon dextranos comerciales de diferentes masas moleculares (7 x 10 ,
5 5 5 6 6
1,5 x 10 , 4,1 x 10 , 7,5 x 10 , 1,8 x 10 y 4,9 x 10 Da).

87
Material y métodos

8. ESTUDIOS DE MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

Estos ensayos se realizaron en el Centro de Instrumentación Científica de la Universidad de


Granada.

Se utilizaron de células en fase exponencial, que se fijaron con glutaraldehído (2,5% [p/v]) y rojo
de rutenio (0,05% [p/v]), en tampón cacodilato sódico, (CH3)2AsO2Na3 · H2O 0,05M, y MgCl2·6H2O 2mM
(pH 7,4).

Este tratamiento se realizó a 4º C durante 4 horas. Después de un lavado con cacodilato sódico
0,1M, las células se sometieron a una segunda fijación con OsO4, a temperatura ambiente durante una
hora. Posteriormente, las células se deshidrataron en varias series con etanol (30, 50, 70, 90 y 100% v/v)
a temperatura ambiente, durante 20 minutos cada deshidratación.

Las células deshidratadas se infiltraron en una mezcla de resina/etanol (1:1 v/v) durante una
noche, seguido de una infiltración en una resina pura, también durante una noche. Después, las células
se transfirieron a una cápsula de gelatina que se llenó con un monómero de resina. Esta resina se
polimerizó durante 8 horas a 60º C. Tras este proceso, se realizaron unas secciones ultra finas con un
ultramicrotomo Reichter Ultracut S, equipado con una cuchilla de diamante, recogiéndose en una rejilla de
cobre.
Las secciones se tiñeron con acetato de uranilo (1% [p/v]) y citrato de plomo. Finalmente, las
preparaciones se examinaron en un microscopio electrónico de transmisión (Zeiss TEM EM 10C, 30μm de
apertura de objetivo y 80 KV de voltaje de aceleración).

La observación de las preparaciones acuosas de los distintos polímeros se realizó mediante


tinción negativa con rojo de rutenio (0,05%[p/v]). Previamente se trataron las muestras con DNAsa, para
lo cual se preparó una solución al 1% (p/v) del polímero en el tampón cuya composición se detalla a
continuación.

Tampón DNAsa I

Tris-ClH 0,1M pH 7,6 10μl

KCl (Merck) 0,5M 10μl

MgCl2·6 H2O (Merk) 15mM 10μl

H2O c.s.p. 100 μl

88
Material y métodos

A 2 ml de esta solución con el polímero se le adicionaron 10μl de DNAsa y se mantuvo en


agitación durante 2 horas a 37ºC.

9. PROPIEDADES FÍSICAS DE LOS EXOPOLISACÁRIDOS

9.1. PROPIEDADES REOLÓGICAS

9.1.1. Viscosidad de las preparaciones acuosas

Las muestras liofilizadas de los distintos exopolisacáridos se disolvieron en agua destilada para
obtener soluciones al 0,5% (p/v). Las medidas de viscosidad de las preparaciones acuosas del polímero y
en general todos los ensayos reológicos se realizaron con un reómetro Bohlin CSR-10 de stress
controlado. Para todas las determinaciones se seleccionó el sistema de medida para pequeñas muestras
(small sample cell; SSC) y salvo en las excepciones que se indican se realizaron a una temperatura de
25º C. Se sometió a las preparaciones a un esfuerzo de cizalla que originó un gradiente de deformación
-1
comprendido entre 2 y 160 s . Como controles se utilizaron el maurano y el xantano.

Figura 19: Reómetro Bohlin CSR-10 y detalle del sistema de medida para pequeñas muestras.

9.1.2. Factores que influyen en la viscosidad de las preparaciones acuosas del


exopolisacárido producido por la cepa B100 de Halomonas maura

La muestra liofilizada se resuspendió en agua destilada y se evaluó el efecto de diversos


parámetros, que se detallan a continuación, sobre la viscosidad de tales preparaciones. Todos los
ensayos se llevaron a cabo con soluciones con una concentración de polímero del 0,5% (p/v), excepto en
el ensayo en el que se modificó la concentración de exopolisacárido.
Las medidas llevadas a cabo consistieron en la determinación de la viscosidad en función del
gradiente de deformación (shear rate) o esfuerzo de cizalla (shear stress) aplicado. La preparación de las
soluciones en cada uno de los ensayos, según el parámetro evaluado, se detalla a continuación.

89
Material y métodos

a) Concentración del polímero

Se determinó la viscosidad de preparaciones de exopolisacárido en agua destilada a una


concentración de polímero del 0,5, 0,6, 0,8 y 1% (p/v) aplicando a las muestras un esfuerzo de cizalla
-1
comprendido entre 2 y 7 Pa, correspondiente a un rango de gradientes de deformación de 0,1 a 150 s .

b) Temperatura

En primer lugar, se determinó la viscosidad a 25, 35, 45 y 55ºC, mediante el incremento gradual
de la temperatura de las preparaciones de EPS (0,5% p/v).

En segundo lugar, las preparaciones acuosas del polímero al 0,5% (p/v) fueron calentadas a 70 y
90ºC durante 10 minutos en un baño y posteriormente se dejaron enfriar hasta temperatura ambiente o
bien manteniendo las muestras a 4ºC durante toda una noche. Se determinó la viscosidad de las
soluciones tras el calentamiento y una vez que las muestras se enfriaron por ambos procedimientos.

En ambos ensayos la viscosidad se determinó en un rango de gradiente de deformación


-1
comprendido entre 3,2 y 162,4 s (2-15 Pa de esfuerzo de cizalla).

La viscosidad correspondiente a cada una de las temperaturas se comparó a un gradiente de


deformación de 59,5 1/s.

c) pH

Con objeto de establecer la influencia del pH sobre la viscosidad de las preparaciones acuosas
de EPS, se determinó este parámetro en un intervalo de pH de 3 a 9, aplicando a las muestras un
esfuerzo de cizalla comprendido entre 1 y 5 Pa. La viscosidad correspondiente a los distintos pH se
comparó a un esfuerzo de cizalla de 3 Pa.

El pH de las soluciones se ajustó una vez que el polímero fue disuelto en agua destilada con HCl
ó NaOH 1N.

d) Efecto del proceso de congelación-descongelación

Se determinó el efecto de la congelación de las preparaciones sobre su comportamiento


reológico determinando la viscosidad de soluciones al 0,5% (p/v) del EPS tras ser congeladas y

90
Material y métodos

posteriormente descongeladas. La viscosidad de las muestras se determinó aplicando un esfuerzo de


cizalla entre 1 y 5 Pa.

e) Efecto del proceso de esterilización en autoclave de vapor

Se determinó la viscosidad de las soluciones de EPS al 0,5% (p/v) tras ser esterilizadas en el
autoclave durante 30 minutos a 112ºC. La viscosidad de las muestras se determinó aplicando un esfuerzo
de cizalla comprendido entre 1 y 5 Pa.

f) Presencia de sales en solución

Se estudió el efecto de adicionar NaCl al 2,5, 5 y 7,5% (p/v) a las preparaciones de


exopolisacárido en agua destilada al 0,5% (p/v).

Las medidas de viscosidad se realizaron en un rango de gradientes de deformación comprendido


-1
entre 15 y 180 s .

g) Efecto de la presencia de azúcares en solución

Se estudió el efecto de la adición de sacarosa al 2% (p/v) a las preparaciones en agua destilada


de EPS al 0,5% (p/v), determinándose la viscosidad mediante la aplicación a las muestras de un esfuerzo
de cizalla entre 1 y 10 Pa.

9.1.3. Características reológicas de las preparaciones acuosas del exopolisacárido


producido por la cepa B100 de Halomonas maura

• Pseudoplasticidad

El carácter pseudoplástico de las preparaciones de exopolisacárido se evaluó mediante el ajuste


de los reogramas a un modelo empírico que establece la relación existente entre el esfuerzo de cizalla (σ)
y el gradiente de deformación (γº).

Dicho modelo es la ley de la potencia o de Ostwald-de Waele, según la cual: σ = K · γº , donde K


n

y n son los parámetros reológicos del modelo; siendo K el índice de consistencia y n el índice de
pseudoplasticidad. Dado que el comportamiento de un fluído newtoniano se caracteriza por ser n=1, la
diferencia entre n y la unidad es una medida del grado de desviación del comportamiento newtoniano de
modo que los fluídos pseudoplásticos se caracterizan por ser n < 1 y en el caso de un fluído dilatante n >
1.

91
Material y métodos

Se estudió el efecto de la concentración de polímero y temperatura de las preparaciones sobre


los parámetros K y n, para lo cual se realizó el ajuste a este modelo empírico para los reogramas
obtenidos a distintas concentraciones de polímero (0,5, 0,6, 0,8 y 1% p/v) y diferentes temperaturas (25,
35, 45, 55, 70 y 90 º C) utilizando el programa del reómetro Bohlin CSR-10.

• Tixotropía

El comportamiento tixotrópico del polímero en solución se determinó sometiendo la muestra a un


-1
gradiente de deformación elevado (90 s ) durante 5 minutos y disminuyendo posteriormente el mismo
hasta 3 s-1 durante 10 minutos. El proceso completo consistió en dos ciclos, sin interrupción, durante un
periodo de tiempo de 30 minutos, determinándose simultáneamente la viscosidad de las soluciones.

El material tixotrópico, al ser sometido a un esfuerzo de cizalla o gradiente de deformación


elevado presentará una disminución brusca de su viscosidad, la cual recuperará más tarde al disminuir la
fuerza aplicada.

• Estudio de las propiedades viscoelásticas. Ensayos de oscilación

El estudio del comportamiento viscoelástico del exopolisacárido B100 en solución se llevó a cabo
mediante ensayos de oscilación consistentes en aplicar a la muestra un esfuerzo de cizalla o gradiente de
deformación que varía de forma sinusoidal en función del tiempo. Se determinaron los siguientes
parámetros viscoelásticos:

• Módulo elástico, G’ (Pa) : relacionado con la respuesta elástica del material.


• Módulo viscoso, G’’ (Pa) : relacionado con la respuesta viscosa del material.

La determinación de dichos parámetros se ha de realizar dentro de la región viscoelástica lineal


del material; para lo cual se inició este estudio con un ensayo de “stress sweep”.

a) Ensayo de “stress sweep”.

Este ensayo, llevado a cabo para determinar la región viscoelástica lineal de la muestra objeto de
estudio, consistió en aplicar a la misma un esfuerzo de cizalla creciente a una frecuencia determinada.
Así, se determinará el esfuerzo de cizalla a partir del cual el módulo elástico experimenta una disminución
frente al aumento del módulo viscoso, denominado “punto crítico” y por debajo del cual se encuentra
delimitado el dominio viscoelástico lineal de la muestra.

92
Material y métodos

Dicha determinación se realizó a partir de una preparación en agua destilada al 1% (p/v) de EPS,
a la cual fue aplicada un rango de esfuerzos de cizalla desde 0,11-19,3 Pa a una frecuencia constante de
1 Hz; obteniéndose los valores para los parámetros viscoelásticos del módulo elástico (G’) y módulo
viscoso (G’’).

b) Propiedades viscoelásticas de las soluciones de EPS dentro de la región viscoelástica


lineal.

El estudio del comportamiento viscoelástico mediante ensayos de oscilación se llevó a cabo con
soluciones al 1% (p/v) de EPS siendo el esfuerzo de cizalla aplicado de 6 Pa (seleccionado dentro de la
región viscoelástica lineal de la muestra) y cuya variación sinusoidal se ha aplicado dentro del rango de
frecuencias comprendido entre 0,007 y 20 Hz. Se determinaron los siguientes parámetros viscoelásticos:
G’ (módulo elástico) y G’’ (módulo viscoso).

9.1.4. Efecto sinérgico del exopolisacárido producido por la cepa B100 de Halomonas
maura con otros agentes viscosizantes

Realizamos un estudio con objeto de comprobar si existía un efecto sinérgico entre el polímero
sintetizado por la cepa B100 de Halomonas maura y algunos agentes viscosizantes empleados con
frecuencia en la industria alimentaria. El ensayo que llevamos a cabo consistió en partir de soluciones al
0,5% de todos los biopolímeros, a partir de las cuales realizamos mezclas B100 / agente viscosizante en
proporción 1:4; 2:3; 3:2 y 4:1.

Se determinó la viscosidad de las mezclas y de las soluciones al 0,5% (p/v) de cada uno de los
-1
polímeros por separado, a un gradiente de deformación de 2 s para las mezclas del exopolisacárido
-1 -1
B100 con goma guar, 10 s con pectina, 85 s con carragenato e hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) y 30
-1
s con la goma de Plantago ovata.

9.2. PROPIEDADES EMULGENTES

9.2.1. Controles

En el estudio del poder emulgente de los polímeros producidos por las cepas objeto de estudio
se han empleado como controles los siguientes surfactantes químicos de uso habitual en la industria:

•Polisorbato 60 (suministrado por SKW/Biosystems S.A.)


•Tween 20 (Probus)
•Sugin 472 C/IKV (suministrado por SKW/Biosystems S.A.)

93
Material y métodos

•Tritón X-100 (Sigma)

También se ha incluido como control el xantano (SIGMA), un exopolisacárido microbiano con


capacidad emulgente además de viscosizante.

9.2.2. Actividad emulgente

Para la realización de este estudio se siguió la metodología descrita por Cooper y Goldenberg
(1987). En el ensayo se utilizaron tubos de base redonda, en los que se dispusieron 1,5 ml de fase
oleosa,y 1,5 ml de fase acuosa, consistente en una preparación del polímero al 0,5% (p/v). El ensayo se
llevó a cabo a temperatura ambiente, y las fases oleosas empleadas fueron: aceite de girasol, aceite
mineral ligero (Sigma), miristato de isopropilo (suministrado por Gley de Brech S.A.) y keroseno
(Panreac). Como controles se utilizaron: Tween 20 (probus), Polisorbato 60 (suministrado por
SKW/Biosystems S.A.), Xantano (suministrado por Sanaví S.A.) y lauril eter (suministrado por Gley de
Brech S.A.).

Para la determinación del porcentaje de emulsión, los tubos se agitaron en un homogeneizador


Polytron de alta velocidad (6000-21000 rpm) con varilla de dimensiones 105 x 7 mm, a 9750 rpm durante
1 minuto. Tras la agitación las muestras se dejaron reposar, tomándose las medidas del porcentaje de la
fase emulsionada a la hora y a las 24 horas, para determinar la actividad emulgente y la estabilidad de las
preparaciones. La actividad emulgente representa la fracción emulsionada (la altura de la misma)
respecto al volumen total de la muestra (altura en el tubo).

% actividad emulgente = altura emulsión / altura mezcla × 100

9.2.3. Determinación del poder tensioactivo

La determinación de la tensión superficial se llevó a cabo de acuerdo a la metodología descrita


por Weser (1980). Las medidas de tensión superficial se realizaron con un tensiómetro digital KRUSS
modelo K11 que básicamente consiste en un dinamómetro de precisión. El valor del parámetro σ (tensión
superficial) (mN/m) se obtuvo por lectura directa en el tensiómetro digital con una precisión de ± 0,1mN/m.
Todas las medidas se realizaron a temperatura ambiente. La determinación de la tensión superficial a las
distintas concentraciones de cada uno de los emulgentes nos permitió calcular la concentración micelar
crítica (CMC) (Phale y col., 1995) como aquella concentración de emulgente a partir de la cual la tensión
superficial no se ve modificada.

94
Material y métodos

9.2.4. Grado de dispersión

El grado de dispersión, que representa el tamaño comparativo de las gotas de la fase interna de
la emulsión (Voigt y Bornschein, 1979), se determinó por procedimiento microfotográfico para lo cual se
utilizó un microscopio con una cámara fotográfica acoplada. El examen se realizó con un objetivo de 10×.

9.2.5. Desproteinización de los exopolisacáridos

Para determinar si la fracción proteica de los exopolisacáridos Al12 y Al16 de H.ventosae


desempeña un papel importante en la actividad emulgente de los mismos, procedimos a la eliminación de
sus proteínas tanto por métodos químicos como enzimáticos. La desproteinización química de los
polímeros se realizó por el método del fenol caliente (Westphal and Jann, 1965): 500 mg de EPS en 100
ml de agua destilada se calentaron a 70º C y se agitaron con el mismo volumen de fenol al 90% (v/v)
durante 15 minutos. Tras ese tiempo, se enfriaron a 0º C, y se centrifugaron a 7000 rpm durante 15
minutos. La fase acuosa se dializó en agua destilada durante 72 horas y se liofilizó. A los EPS así
desproteinizados se les llamó Apo-EPS (Navon-Venezia y col., 1995). La desproteinización enzimática
de los polímeros se realizó con proteinasa K y tripsina; en el primer caso, las preparaciones acuosas de
los exopolisacáridos (0,5% p/v) se trataron con 20 mg/ml de enzima, a 37ºC durante 30 minutos, y en el
segundo caso, las soluciones acuosas de los polímeros (0,5% p/v) fueron tratadas con 2 mg/ml de enzima
durante 2 horas a 37ºC.

9.2.6. Electroforesis de proteínas

La electroforesis en geles de poliacrilamida (SDS-PAGE) se llevó a cabo según el protocolo de


Laemmli (1970) para determinar la presencia de proteínas en los polímeros. A los EPS (40 µl, 25 mg/ml)
se les añadió 10 µl del tampón para muestras, y a continuación se calentaron a 100ºC unos 5 minutos.
Tras el tratamiento, 25 µl de estas muestras se cargaron en el gel de poliacrilamida, y se dejaron correr 45
minutos a 200 V. Los geles se tiñeron con Azul de Comassie durante 15 minutos, y finalmente se
destiñeron. Patrones preteñidos de rango medio (Bio-Rad, California) se utilizaron como marcadores de
masa molecular.

Tampón de elución (x5) Tampón para disolver muestras (x5)


Trizma 0, 125 M 5,1 g Glicerol 5 ml
Glicina 0,96 M 2g SDS 1g
SDS 0,5% 5g β-mercaptoetanol 2,56 ml
Agua destilada c.s.p. 1000 ml Tris-HCl 0,5 M pH 6,8 + SDS 0,4 % 5g
Azul de bromofenol Trazas

95
Material y métodos

Geles de acrilamida (10 ml)


“Stacking” Gel (4% p/v) “Resolving” Gel (12% p/v)
Archilamida/Bis 30% 1,3 ml 4 ml
Tris-HCl 1,5 M pH 8 2,5 ml 2,5 ml
SDS 10% 0,1 ml 0,1 ml
Agua destilada 6,1 ml 3,4 ml
a
TEMED 10 μl 5 μl
a,b
APS 10% 50 μl 50 μl
a
Estos componentes se añaden a la fórmula al final
b
Preparado extemporáneamente

Solución para teñir los geles Solución para desteñir los geles
Metanol 500 ml Metanol 150 ml
Ácido acético 100 ml Ácido acético 100ml
Agua destilada 400 ml Agua destilada 750 ml
Azul de Comassie 2,5 g

9.3. CAPTACIÓN DE METALES PESADOS

La metodología seguida se basó en la descrita por Geddie y Sutherland en 1993. Antes de


realizar el experimento es muy importante lavar escrupulosamente todo el material con ácido nítrico al
25% (v/v), y enjuagar después muy bien con agua bidestilada.

Una vez disueltos los polímeros en agua bidestilada, dichas soluciones se pasaron a través de
+
una resina Amberlita IR 120H (Avocado) de intercambio iónico, con objeto de conseguir la forma ácida de
los polisacáridos.

Tras liofilización de las muestras, se prepararon soluciones al 0,5% (p/v) de los exopolisacáridos
y se dispusieron 5 ml de cada una de ellas en membranas de diálisis que se introdujeron en matraces con
200 ml de las soluciones de distintas sales metálicas, incubándose durante 24 horas a 30ºC en agitación
(100 rpm). Como control se utilizó un tubo de diálisis con agua bidestilada y sin exopolisacárido.

Las sales metálicas que se han utilizado en este estudio, junto con las concentraciones
ensayadas se recogen en la Tabla 9. Las soluciones de estas sales metálicas se prepararon en agua
bidestilada y las concentraciones de cada una de ellas se ajustaron al rango de linealidad y sensibilidad
del espectrómetro empleado en la posterior detección de los metales. El pH de las soluciones metálicas
se ajustó a 7 con NaOH ó HCl 1N.

96
Material y métodos

Tabla 9. Sales metálicas y concentraciones (ppm) utilizadas en el estudio de captación de metales


pesados por el exopolisacárido.

Sales metálicas Concentración (ppm)


Cloruro de cobalto 2
Sulfato de cobre 4
Acetato de plomo 10
Arsenato sódico 50
Cromato potásico 2,5

La captación de metales por los polímeros se determinó mediante espectrometría de absorción


atómica, restando a la cantidad de metal inicial, la cantidad de metal remanente en solución. Esta
determinación se llevó a cabo en un espectrómetro de absorción atómica Perkin-Elmer® a partir de
alícuotas de las soluciones recogidas a tiempo cero y tras 24 y 48 horas de incubación. Los miligramos
de metal captado se refirieron a un gramo de EPS. Este ensayo se realizó por triplicado.

10. ACTIVIDAD ANTIPROLIFERATIVA SOBRE CÉLULAS HEMATOPOYÉTICAS DE


EXOPOLISACÁRIDOS MICROBIANOS SULFATADOS

Basándonos en la naturaleza sulfatada de los exopolisacáridos sintetizados por nuestras


bacterias, y de acuerdo con los antecedentes existentes, hemos estudiado la acción moduladora sobre la
proliferación de células hematopoyéticas tumorales de los polímeros que forman parte de este estudio
que presentaron un mayor contenido en sulfatos, es decir, los producidos por las cepas B100 y N12 de H.
maura y FP34 de H. anticariensis, utilizando como controles estos mismos polisacáridos desulfatados e
hipersulfatados químicamente, para estudiar la importancia de los grupos sulfato en la actividad biológica
de estas macromoléculas.

10.1. Desulfatación de los EPS

Los EPS desulfatados se obtuvieron por solvolisis en dimetilsulfóxido según la metodología de


Nagasawa y col. (1977), con algunas modificaciones (Haroun-Bouhedja, 2000).

250 mg de EPS se disolvieron en 3,2 ml de agua bidestilada, y ésta solución se pasó por una
+
resina de Amberlita IR 120H (Avocado), para obtener la forma ácida del polímero, posteriormente
neutralizada con 2 ml de piridina. Las muestras se evaporaron a 40º C bajo vacío, y posteriormente se
adicionaron 20 ml de metanol (4 veces), el cual también se evaporó bajo vacío. El compuesto obtenido se
disolvió en una mezcla dimetilsulfóxido/metanol/piridina (90:9:1), y se calentó a 100º C 60 minutos. La

97
Material y métodos

reacción se detuvo por adición de agua (20 ml), el pH se ajustó a 9 con NaOH 3 M y la solución se dializó
con agua destilada y se liofilizó para recuperar el polímero.

10.2. Sulfatación de los EPS

Los EPS fueron químicamente sulfatados de acuerdo al protocolo de sulfatación de fucanos de


Nishino y Nagumo (1992).

Aproximadamente 0,5 g de EPS se disolvieron en 50 ml de dimetilformamida, y la solución se


mantuvo en agitación 2 horas a temperatura ambiente. A continuación la mezcla se incubó 2 horas a 45º
C, para favorecer la dispersión del EPS en el disolvente. A continuación se adicionó lentamente un
exceso del complejo piridina-SO3, y la reacción se mantuvo 2 horas a 45º C. La reacción se detuvo por
adición de agua (20 ml), y el pH se ajustó a 9 con NaOH 3 M y la solución se dializó con agua destilada y
se liofilizó para recuperar el polímero.

10.3. Cultivos celulares

Los ensayos de actividad biológica se han desarrollado con tres estirpes de células humanas
tumorales hematopoyéticas (células JURKAT, HEL y CEM), siendo el medio de cultivo empleado el medio
RPMI suplementado con glutamina (5 ml/500 ml), penicilina-estreptomicina (5 ml/500 ml), fungizona (5
ml/500 ml) y suero bovino fetal (10% v/v).

A partir de una concentración inicial de 12500 y 25000 células/pocillo, se ensayó la adición a


cada uno de los cultivos de dosis crecientes de EPS: 5, 50 y 500 ng/ml y μg/ml, respectivamente. Tras la
incubación a 37º C en atmósfera de CO2, durante tiempos comprendidos entre 24 y 72 horas, procedimos
a evaluar la proliferación celular en cada caso.

10.4. Test de proliferación celular

El test empleado para cuantificar la proliferación celular es el que utiliza el compuesto MTT
(Mosmann, 1983), el cual una vez incorporado y reducido por las células vivas, origina una coloración
medida como absorbancia a una longitud de onda de 570 nm. El porcentaje de inhibición de la
proliferación celular se determinó por triplicado mediante a la siguiente fórmula:

%I = [1-(Gf/Gm)] x 100,

donde Gf es la proliferación de las células tratadas con los exopolisacáridos, y Gm la proliferación de las
células sin tratar.

98
Material y métodos

11. ESTUDIO DE LA PARTICIPACIÓN DE LOS EPS EN LA FORMACIÓN DE BIOFILMS

Con el fin de atribuir una función fisiológica a los exopolisacáridos sintetizados por las bacterias
halófilas que forman parte de este trabajo, estudiamos la propensión de las mismas a formar biofilms o
biopelículas sobre superficies inertes, para a continuación determinar si los EPS se encuentran implicados
de forma activa en este proceso tan frecuente en la naturaleza.

11.1. Cuantificación de la formación de biofilms mediante tinción con cristal violeta


(O´Toole and Kolter, 1998a)

Se partió de un inóculo de 24 horas en medio SWYE 5% (p/v) de sales con el que se hizo una
dilución 1:100 en medio Koser al 5% (p/v) NaCl adicionado de glucosa (1% p/v), casaminoácidos (0,5%
p/v) y MgSO4·7H2O (25mM) y en medio MY al 2,5, 5, 7,5 y 10% (p/v) de sales. La dilución se transfirió a
placas microtitter que se incubaron a 32º C y en agitación, durante 16, 24, 40 y 48 horas. A continuación
se midió la densidad óptica de los cultivos a 600nm, se vació el contenido líquido y se lavaron las placas
microtitter con agua destilada estéril. Las células adheridas a las paredes de las placas fueron teñidas con
una solución al 0,5% de cristal violeta en etanol de 95º (v/v), durante 15 minutos, pasados los cuales, se
lavó con abundante agua para eliminar el colorante no adherido a las células. Posteriormente, los biofilms
fueron resuspendidos en etanol de 95º (v/v) mediante agitación vigorosa, y se midió la densidad óptica de
la suspensión resultante a 540nm. Para cada caso se empleó como blanco el medio de cultivo sin
inocular.

Medio SWYE (Nieto y col., 1989) Medio de Koser (Koser, 1923)


Extracto de Levadura (Cultimed) 5g NaCl (Panreac) 50 g
Solución de sales al 30% 166 ml KCl (Merck) 2g
Agua destilada c.s.p. 1000 ml KNO3 (Merck) 1g
(NH4)2PO4H (Merk) 0,5 g
Agua destilada c.s.p 1000ml

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Figura 20. Fotografía de una placa microtitter empleada en la cuantificación de la formación de biofilms. Pocillos 1-4.
Bacteria formadora de biofilms. Pocillos 5-12. Bacteria no formadora de biofilms.

99
Material y métodos

11.2. Microscopía electrónica de barrido

Estos ensayos se realizaron en el Centro de Instrumentación Científica de la Universidad de


Granada.

Se partió de un cultivo de 24 horas, de las cepas X2 de H. maura y M4 de H. eurihalina, en medio


SWYE 5% (p/v) de sales, y 2 ml de diluciones 1:100 de los mismos se vertieron sobre una placa petri de
10 ml. A cada placa se incorporó un par de cubreobjetos con el fin de que las células se adhirieran en él.
Se incubaron durante 48 horas a 32º C en agitación, pasadas las cuales, las células adheridas al cristal,
se fijaron con una capa de poli-L-lisina durante una noche a 4º C en atmósfera saturada de vapor de
gluteraldehido.

Posteriormente, las preparaciones se lavaron con una solución de cacodilato sódico 0,1M y se
les añadió rojo de rutenio 0,05% (p/v) durante 4 horas. Después, las células se deshidrataron en varias
series con etanol (30, 50, 70, 90 y 100% v/v) a temperatura ambiente, durante 20 minutos cada
deshidratación. A continuación, las muestras se secaron hasta un punto crítico y se cubrieron con oro. Por
último, las microfotografías electrónicas se obtuvieron con un microscopio electrónico de barrido Zeiss
DSM950.

11.3. Obtención de mutantes deficientes en la síntesis de EPS

Con el objetivo de obtener mutantes deficientes en la síntesis de polisacárido y a fin de investigar


la participación de los EPS en la estructura de los biofilms, se llevaron a cabo experiencias de
mutagénesis insercional al azar y dirigida.

a) Protocolo de mutagénesis insercional con el transposón mini-Tn5 Km2

a.1) Medios de cultivo

Medio Luria-Bertani (LB) (Sambrook y Russell, 2001): Se utilizó como medio de crecimiento
para Escherichia coli, donadora del transposón. A este medio de cultivo se le adicionaron los
antimicrobianos adecuados. Su composición es la siguiente:

Bactotriptona (Difco) 10g


Extracto de levadura 5g
Cloruro sódico (Panreac) 10g
Agua destilada c.s.p. 1000 ml

100
Material y métodos

Medio MM: Este medio se utilizó para disminuir la producción de exopolisacárido y así facilitar el
proceso de intercambio genético. Se diseñó a partir de los estudios de producción de EPS de la cepa S30
de Halomonas maura realizados en nuestro grupo de investigación. La concentración de sales del medio
fue de un 2% (p/v).

Proteosa Peptona nº3 (Cultimed) 2g


Extracto de Levadura (Cultimed) 0,4 g
Solución de Sales al 30% (p/v) sin MgSO4 250ml
Agua destilada c.s.p. 1000 ml

Medio SWYE: Es un medio complejo que se utilizó en los experimentos de conjugación; se


preparó a un 2% (p/v) de sales. Su composición se detalla en el apartado 11.1.

Medio TSA: Se utilizó para reconocer los posibles contaminantes que pudieran aparecer en los
medios de selección en los experimentos de mutagénesis. Tiene una concentración muy baja de NaCl y
ello impide que puedan crecer los microorganismos halófilos moderados. Se preparó a partir del medio
deshidratado comercializado por la casa Difco.

El pH de todos estos medios se ajustó a 7,2 con NaOH ó HCl 1M. Para la preparación de los
medios sólidos se añadió Agar Bacteriológico (Panreac) en una concentración del 2% (p/v).

a.2) Antimicrobianos

Las soluciones de antimicrobianos (Sigma) se prepararon en agua destilada, excepto la


rifampicina que se disolvió en metanol. Las soluciones acuosas se esterilizaron por filtración a través de
un filtro milipore de 0,22 μm y se conservaron a -20ºC en alícuotas. Cuando fue necesario se añadieron a
los medios de cultivo los correspondientes antimicrobianos a las siguientes concentraciones finales
(µg/ml): ampicilina (Ap), 100; kanamicina (km), 50; rifampicina (Rif), 50.

a.3) Conjugación

La transferencia del transposón mini-Tn5 Km2 se hizo vía conjugación biparental, siguiendo la
técnica de Herrero y colaboradores (1990), adaptada para trabajar con microorganismos halófilos
productores de gran cantidad de polisacárido (Llamas y col., 2000).

101
Material y métodos

Tabla 10. Cepas donadora y receptoras utilizadas en este trabajo.

Cepas bacterianas Características Referencia


Cepa donadora
r r - +
Escherichia coli S17-λpir Tp Sm recA, thi, pro, hsdR M RP4: Miller y Mekalanos, 1988
2-Tc:Mu:Km Tn7, λpir
Cepas receptoras
r
H. eurihalina M4 Rif Mutante espontáneo (Rif) . Fenotipo colonial liso Este trabajo
H. maura X2 Rif “

La bacteria donadora del transposón fue la cepa S-17-1 λpir de Escherichia coli portadora de un
minitransposón con marcador de resistencia a kanamicina (mini-Tn5 Km2), vehiculizado en el plásmido
suicida pUT (Figura 21). Como cepas receptoras se emplearon mutantes espontáneas resistentes a
rifampicina, crecidas en el medio mínimo MM, y en el caso de H. maura, adicionado de tioglicolato sódico
(5 mM) con el fin de disminuir aun más la producción de EPS y facilitar así el proceso de intercambio
genético. Tal y como se muestra en la Figura 22, se partió de cultivos en fase logarítmica del donador y
del receptor, crecidos a sus temperaturas óptimas. Se centrifugaron alícuotas de 1,5 ml de los cultivos a
13000 rpm y los sedimentos se lavaron dos veces con el medio de cultivo de conjugación para eliminar
restos de sales (procedentes del medio del receptor) y antimicrobianos de ambos medios.

Figura 21. Plásmido pUT portador del transposón mini-Tn5Km2.

A continuación, las células se resuspendieron en 100μl de medio SWYE al 2% (p/v) de sales, se


mezclaron en proporción donador/receptor 1:2 y se depositaron en un filtro de 0,22 μm estéril, dispuesto
sobre el medio sólido de conjugación SWYE al 2% (p/v) de sales. El resto de la solución se utilizó para

102
Material y métodos

sembrar controles positivos y negativos (en los medios propios del receptor y del donador, y en el medio
de selección de transconjugantes). Todas las placas se incubaron a 32º C durante 16-24 horas.
Seguidamente el filtro se resuspendió en 0,8ml de solución de sales al 2% (p/v). Se utilizaron 100μl para
hacer diluciones seriadas y se sembraron 100μl de cada dilución en las placas de medio de cultivo del
receptor y del donador para determinar el número de supervivientes tras la conjugación. El resto se
sembró en placas con el medio de selección [SWYE al 2% (p/v) de sales adicionado de rifampicina y
kanamicina].

RECEPTOR
DONADOR

Fase logarítmica

5ml MM 2% (p/v) de sales + Rif


32ºC, 20-24h 5ml LB1% (p/v) de NaCl + Ap + Km
32ºC, 8h
1,5ml
R
D
R
D Resuspender 100μl SWYE
Lavados células 2% (p/v) de sales
con SWYE 2%
(p/v) de sales
13.000rpm/5min

R
D
R D

SWYE 2% (p/v)
de sales+Rif+Km Control +/-
32ºC
Transconjugantes 16-24h
Diluciones SWYE 2% (p/v) de sales

SWYE 7,5% (p/v) de sales + Rif


SWYE 7,5% (p/v) de sales + Rif
LB1% (p/v) de NaCl + Ap + Km
LB1% (p/v) de NaCl+ Ap + Km
Supervivientes SWYE 2,5% (p/v) de sales + Rif + Km

Figura 22. Esquema del protocolo de mutagénesis insercional

Selección de transconjugantes

Se seleccionaron todas las colonias capaces de crecer en las placas de medio de selección.
Posteriormente se procedió a realizar pruebas fenotípicas para comprobar la identidad de los
transconjugantes obtenidos: incapacidad de crecer en TSA, que demuestra su carácter halófilo;

103
Material y métodos

observación de su morfología mediante la tinción de Gram; y por último, la prueba de la oxidasa, positiva
para H. maura y negativa para Halomnas eurihalina. Mediante sucesivas resiembras en medio sin
selección (líquido y sólido), se pudo comprobar la estabilidad del transposón mini-Tn5.

La pérdida del carácter fenotípico positivo para la biosíntesis de EPS, da lugar a


transconjugantes con morfología colonial lisa. Dicho carácter es observable tras el crecimiento de los
transconjugantes en el medio sólido de selección [SWYE 2% (p/v) de sales adicionado de rifampicina y
kanamicina].

a.4) Análisis de los transconjugantes mediante Southern Blot

TAMPONES Y SOLUCIONES

•Extracción de DNA

- Solución TE. Tris HCl 1M; EDTA 0,25M.


- Solución SDS. SDS AL 10% (p/v).
- Proteinasa K. (20 mg/ml)
- Solución NaCl 5M
- Solución CTAB/NaCl. Bromuro de hexadecil trimetil amonio (CTAB)
10% (p/v) en NaCl al 0,7 M.
- Cloroformo. Fue utilizado en mezcla de cloroformo:alcohol isoamílico (24:1)
- Fenol absoluto. Se empleó en una mezcla de fenol:cloroformo:alcohol
isoamílico (25:24:1).
- Isopropanol.
- Etanol al 70% (v/v).

•Electroforesis

-Tampón TAE 10×. Tris-acetato 0,4M; EDTA 10 mM (pH 8).


-Tampón TBE 10×. Tris 0,89M; ácido bórico 0,89M; EDTA 20 mM (pH 8).
-Tampón de carga 6×. Azul de bromofenol 0,25% (p/v); xileno cianol 0,25%
(v/v); glicerol 30% (v/v).
-Bromuro de etidio. Solución stock de 10 mg/ml.

•Transferencia de DNA e hibridación

-Solución de depurinización. HCl 250 mM.

104
Material y métodos

-Solución desnaturalizante. NaOH 0,5M; NaCl 1M.


-Solución neutralizante. Tris-HCl 1M (pH 8); NaCl 1,5M.
-SSC 20×. NaCl 3M; citrato sódico 0,3M (pH 7).

•Revelado de la membrana

-Tampón de ácido maleico. Ácido maleico 0,1M; NaCl 0,15M (pH 7)


-Tampón de lavado. Tampón de ácido maleico, Tween 20 30% (v/v)
-Solución de blocking. (10 % p/v).
-Solución anticuerpo. (1:10.000).
-Tampón de detección. Tris-HCl 0,1M, NaCl 0,1M, MgCl2 (pH 9,5).

Todos los reactivos utilizados son de la casa comercial Sigma.

EXTRACCIÓN DEL DNA TOTAL

La extracción de DNA genómico total se realizó siguiendo la metodología del CTAB (Martínez-
Checa, comunicación personal), incorporando algunas variantes con el fin de minimizar la producción de
exopolisacárido.

Se partió de 1,5 ml de cultivo en fase exponencial de crecimiento en medio MM al 7,5% (p/v) de


sales adicionado de rifampicina y de tioglicolato sódico (5 mM).

Se centrifugaron las células a 12.000 rpm durante 3 minutos, y el sedimento se lavó dos veces
con solución de sales al 2% (p/v). A continuación, el sedimento de células se resuspendió en 567 μl de
TE, al que se añadieron 30 μl de SDS al 10% (p/v) y 3 μl de solución de Proteinasa K. Esta mezcla se
incubó durante 1 hora a 37ºC. Transcurrido este tiempo, se le adicionó 100 μl de solución de NaCl 5M.
Una vez bien homogeinizado, se añadió 80 μl de solución de CTAB/NaCl y se volvió a agitar
vigorosamente. A continuación se añadió aproximadamente el mismo volumen de cloroformo/alcohol
isoamílico (24:1) y se mezcló para luego centrifugar durante 5 minutos a 12.000 rpm.

Seguidamente, al sobrenadante obtenido se le añadió un volumen igual de mezcla


fenol/cloroformo/ alcohol isoamílico (25:24:1); se agitó vigorosamente y se centrifugó durante 5 minutos a
14.000 rpm. Cuando se creyó necesario se procedió a realizar un segundo lavado empleando únicamente
cloroformo.

El sobrenadante totalmente limpio y transparente fue transferido a un nuevo tubo y se añadieron


0,6 volúmenes de isopropanol para la precipitación del DNA. Se conservó durante toda la noche a -20ºC

105
Material y métodos

para facilitar este proceso. El precipitado se recogió tras centrifugación a 12.000 rpm durante 10 minutos
a temperatura ambiente.

El último paso consistió en lavar el sedimento dos veces con 500 μl de etanol al 70% (v/v) y se
centrifugó a 14.000 rpm durante 5 minutos. El sobrenadante se eliminó y se dejó secar el precipitado a
temperatura ambiente para finalmente resuspenderlo en 30 μl de agua bidestilada estéril.

DIGESTIÓN DEL DNA CON ENDONUCLEASAS DE RESTRICCIÓN

Las digestiones de ADN se llevaron a cabo en las condiciones óptimas para cada enzima de
restricción fijadas por los fabricantes (Boerhinger-Manheim, Pharmacia-Amersham y New-England
Biolabs) e incubando durante toda la noche.

HIBRIDACIÓN DNA-DNA

Transferencia de DNA a membrana por el método de Southern Blot e hibridación

Una vez separados los fragmentos de ADN en geles de agarosa, se desnaturalizaron con una
solución de NaOH 0,5M y se neutralizaron con una solución de Tris-HCl 1M (pH 8) (Sambrook y col.,
1989).
Seguidamente, el ADN se transfirió durante 16 horas a una membrana de nylon cargada
positivamente (Hybond-N, Amersham, 0,45 μm de diámetro de poro), siguiendo la técnica de Southern
(1975) y utilizando 20 × SSC como solución de transferencia. La membrana posteriormente se lavó en 2 ×
SSC durante 5 minutos y el ADN se fijó colocando la membrana una hora en un horno a 80ºC o bien
mediante un horno de luz U.V 2 × 1.200J (U.V. Cross-linking, Stratagene).

Preparación de la sonda y marcaje

El DNA plasmídico que contiene el transposón mini-Tn5 se extrajo con el kit comercial (Gibco-
BRL). Tras digerir el DNA del plásmido pUT-miniTn5 con las enzimas de restricción EcoRI + XbaI, se
purificó el fragmento de 1,85 kb que incluía la resistencia a la kanamicina mediante un kit comercial
(Quiaquick gel extraction, Quiagen). Este fragmento constituye la sonda utilizada en los experimentos de
hibridación.

El marcaje de la sonda se realizó con digoxigenina utilizando el kit de Boehringer Mannheim y


sus recomendaciones. Los ácidos nucleicos se marcaron con digoxigenina-dUTP mediante “random
primer” donde el enzima Klenow de la ADN-polimerasa de E. coli sintetiza la cadena complementaria

106
Material y métodos

utilizando como cebadores una mezcla aleatoria de hexanucleótidos y va añadiendo los distintos
nucleótidos trifosfatos marcados previamente con digoxigenina.

Tabla 11. Sonda utilizada en la hibridación.

Nombre Característica Tamaño Referencia


PUTmini-Tn5/EcoRI+XbaI Resistencia a Km 1,85 kb De Lorenzo y col., 1990

Prehibridación e hibridación

Las membranas se colocaron en un tubo del horno de hibridación (Techne Hybridiser HB-1D,
Cambridge) y se dejaron prehibridar durante 4 horas con el líquido de hibridación a 42ºC. El líquido de
hibridación utilizado fue DIG EASY HIB (Boehringer-Mannheim) en una proporción de 20 ml/100cm2.

Tras este tiempo, se retiró la solución y se añadió 100-200ng de sonda marcada y previamente
2
desnaturalizada, a un volumen de 2,5ml/100 cm del mismo líquido. La hibridación se realizó durante 24
horas con las mismas condiciones que la prehibridación. Los lavados de las membranas se hicieron en
las siguientes condiciones de fuerza iónica y temperatura: dos lavados de 10 minutos a temperatura
ambiente con una solución que contenía SDS al 0,1% (p/v) y 2 × SSC, y un último lavado de 10 minutos a
68ºC en 0,1 × SSC.

Revelado de las membranas

Se siguió el protocolo descrito en el kit de la digoxigenina de Boehringer Mannheim. Se basa en


una reacción de inmunoensayo altamente específica mediante contacto de la membrana con una solución
de anticuerpo (anti-digoxigenina-fosfatasa alcalina conjugado). Tras varios lavados para eliminar el
anticuerpo que no se encuentra unido, se añadió una solución con sustratos cromogénicos, nitroblue
tetrazolium (NBT) y el 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (X-fosfato). Se deja en la oscuridad y se observa un
precipitado de color azul sobre el filtro en las bandas donde existe homología DNA-DNA.

b) Mutagénesis dirigida

Reacción en amplificación de ADN en cadena (PCR)

Este método se empleó para comprobar la presencia del gen epsA en el cromosoma de
Halomonas maura X2.

107
Material y métodos

La reacción de ADN contenía: ADN molde: 0,5-1 µg; cebadores: 30 pmoles tampón (con MgCl2);
Taq-ADN polimerasa (1x); dNTPs 0,2 mM de cada uno de ellos; enzima Taq ADN polimerasa: 1-5
unidades; H2O bidestilada hasta 50 µl.

Los parámetros de la reacción de PCR se eligieron en función del tamaño del fragmento de ADN
a amplificar, temperatura de hibridación de los cebadores y tiempo de elongación. Tras una
desnaturalización previa a 95ºC durante 5 minutos, se aplicaron 30 ciclos constituidos por tres etapas:
desnaturalización a 95ºC, 30 segundos; hibridación de los cebadores a 55-65ºC, 30 segundos; extensión
a 74ºC, 120 segundos, y un ciclo final de extensión a 74ºC durante 10 minutos. Una alícuota de la
reacción se sometió a una electroforesis en gel de agarosa a una concentración del 0,7% (p/v), que
posteriormente se visualizó a la luz UV tras teñirse con bromuro de etidio.

Construcción de la fusión epsA::lacZ

Para llevar a cabo esta experiencia, realizamos una fusión transcripcional del gen epsA y el gen
lacZ (Figura 23). El gen epsA es el primer gen que forma parte del clúster de genes eps responsables de
la síntesis de maurano en H. maura (Arco y col., 2005). Como paso previo a esta mutagénesis, se
confirmó mediante PCR que dicho gen epsA estaba presente en la cepa X2 de H. maura. La técnica
seguida para la mutagénesis del gen epsA, fue similar a la utilizada previamente en H. maura cepa S30
para el mismo fin (Arco y col., 2005): amplificamos por PCR un fragmento de 342pb correspondiente al
inicio del gen epsA, empleando los cebadores epsA-EcoRI y epsA342-XbaI. El producto de PCR obtenido
fue digerido con las enzimas EcoRI-XbaI y clonado en el vector pVIK112 previamente digerido con las
mismas enzimas de restricción. El plásmido recombinante pVIKepsA obtenido, fue transferido a H. maura
X2 Rif mediante conjugación, donde actúa como vector suicida, puesto que H. maura no posee el gen pir.
Ello facilita que pVIKepsA se incorpore al cromosoma de la cepa receptora mediante recombinación
homóloga simple. De esta forma, el plásmido pVIKepsA se insertó entre las bases 342 y 343 del gen
epsA, dando lugar a la fusión del promotor del cluster eps con el gen lacZ. La cepa obtenida la
denominamos X2 epsA::lacZ, la cual presentaba el gen epsA interrumpido en su lectura.

Km
pVIKepsA

lacZ
P
P P
Km
epsA epsA lacZ epsA

Figura 23. Construcción del mutante X2 epsA::lacZ

108
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
SECCIÓN I

ESTUDIO FILOGENÉTICO DE LAS CEPAS


Estudio filogenético de las cepas

CAPÍTULO 1

ESTUDIO FILOGENÉTICO DE LAS CEPAS

RESUMEN

El análisis de la secuencia que codifica para el ADNr 16S de los microorganismos halófilos
productores de exopolisacáridos incluidos en este trabajo y que todavía no han sido válidamente
descritos nos ha permitido realizar una aproximación preliminar a su situación taxonómica. Así,
las cepas M4 y X8 presentan una elevada semejanza con Halomonas eurihalina. En cuanto a las
cepas X2, B40, B100, N12 y A16, en principio podrían considerarse como miembros de la especie
Halomonas maura, aunque entre estos microorganismos es posible que exista variación
intraespecífica, por lo que se hacen necesarios ensayos de hibridación ADN-ADN para comprobar
dicha variación, y terminar de dilucidar el taxón al que pertenecen estas cepas. Por último, la cepa
B35 presenta una elevadísima relación filogenética con Alteromonas hispanica, por lo que
probablemente nos encontramos ante una nueva cepa de esta especie.

113
Resultados y Discusión

El objetivo fundamental de esta Tesis Doctoral es la caracterización de los exopolisacáridos


(EPS) sintetizados por diferentes microorganismos halófilos aislados de diferentes ambientes hipersalinos
(véase Tabla 8, apartado 1. Cepas bacterianas, Material y Métodos) gracias al Proyecto de Investigación
“Taxonomía polifásica de bacterias halófilas productoras de exopolisacáridos” (BOS2000-1519). Sin
embargo, hemos considerado importante comenzar encuadrando taxonómicamente los distintos
microorganismos estudiados en este trabajo, para lo cual hemos realizado un breve estudio filogenético.

La mayoría de los microorganismos con cuyos exopolisacáridos hemos trabajado, ya han sido
clasificados taxonómicamente y válidamente descritos por nuestro Grupo de Investigación, y constituyen
nuevas especies de los géneros Halomonas, Idiomarina y Alteromonas, así como dos nuevos géneros,
Salipiger y Palleronia.

T
Las cepas Al12 , AL15 y Al16 constituyen la especie Halomonas ventosae (Martínez-Cánovas y
col., 2004c), caracterizada por su elevado contenido en G+C y por ser capaz de crecer en anaerobiosis
con nitrato o nitrito como último aceptor de electrones.

Los microorganismos FP34, FP35T y FP36, aislados de Fuente de Piedra, en la provincia de


T
Málaga, constituyen la especie Halomonas anticariensis (Martínez-Cánovas y col., 2004b), y la cepa M8
constituye la especie Halomonas almeriensis (Martínez-Checa y col., 2005a), caracterizada por su baja
versatilidad nutricional.

T T
Idiomarina fontislapidosi F23 e Idiomarina ramblicola R22 son microorganismos móviles por un
único flagelo polar descritos por Martínez-Cánovas y colaboradores (2004e). El análisis fenotípico,
genotípico y filogenético de la cepa F32T llevó a Martínez-Checa y colaboradores (2005c) a describir una
nueva especia bacteriana, Alteromonas hispanica, cuya principal característica es el inusual perfil de
ácidos grasos que presenta, ya que tiene una elevada cantidad de ácidos grasos poliinsaturados.

El estudio de estos ambientes hipersalinos también nos ha permitido aislar y caracterizar


microorganismos halófilos productores de exopolisacáridos pertenecientes a la clase α-Proteobacteria,
T
como son Salipiger mucosus cepa A3 (Martínez-Cánovas y col., 2004d), y Palleronia marisminoris cepa
T
B33 (Martínez-Cánovas y col., 2005b), que son bacilos quimioheterótrofos Gram negativos inmóviles,
con un metabolismo aerobio estricto y baja versatilidad nutricional.

Sin embargo, las cepas M4, X8, X2, B40, B100, N12, A16 y B35, aisladas de diversos hábitats
salinos (véase Tabla 8, apartado 1, Cepas bacterianas, Material y Métodos), y también incluidas en este
trabajo por ser productoras de exopolisacáridos, todavía no han sido definitivamente caracterizadas, por
lo que en este capítulo hemos querido realizar una aproximación a su situación taxonómica, estudiando la
secuencia que codifica para el ADNr 16S, y comparándola con la secuencia del resto de cepas

114
Estudio filogenético de las cepas

productoras de exopolisacáridos estudiadas en este trabajo, y con otras cepas de referencia cuya
secuencia del gen ADNr 16S se puede obtener de diversas bases de datos (Figuras 24 y 25). El análisis
de la secuencia de esta molécula se considera muy útil como parte de un planteamiento polifásico
(Stackebrandt y col., 2002) en la descripción de nuevas especies o taxones superiores (Ludwig y col.,
1998; Ludwig, 1999), aunque no se aconseja que estas se definan basándose exclusivamente en este
tipo de estudios (Goodfellow y col., 1997).

Como se puede observar en el árbol filogenético representado en la Figura 24, y en la Tabla 12,
la semejanza en la secuencia del ADNr 16S entre las cepas M4 y X8 es muy elevada, más de un 99%, y
la relación con Halomonas eurihalina (Quesada y col., 1990; Mellado y col., 1995), también productora de
exopolisacáridos, es de 99, 2 y 99% respectivamente, por lo que probablemente estos microorganismos
constituyan nuevas cepas de esta especie bacteriana, aunque probablemente será necesario completar
los estudios taxonómicos con técnicas de hibridación ADN-ADN para confirmar esta afirmación, ya que el
grado de semejanza desde el punto de vista filogenético con Halomonas elongata (Vreeland y col., 1980)
también es muy elevado.

Tabla 12. Porcentajes de semejanza y divergencia filogenética entre las cepas M4, X8, Halomonas
eurihalina y Halomonas elongata.

% Semejanza
M4 X8 H. eurihalina H. elongata
% Divergencia

M4 X 99,8 99,2 98
X8 0,2 X 99,0 98,2
H. eurihalina 0,8 1 X 97,2
H. elongata 2 1,8 2,8 X

También en el árbol filogenético representado en la Figura 24, y en la Tabla 13, podemos


observar la relación filogenética que existe entre las cepas X2, B40, B100, N12, A16, así como con
Halomonas maura (Bouchotroch y col., 2001). Excepto las cepas B40, B100 y N12, que guardan una
relación filogenética con H. maura de 96,4% para las dos primeras y 96,8% para la tercera, el resto de
relaciones filogenéticas entre todas estos microorganismos son superiores al 97%, valor establecido para
delimitar microorganismos de la misma especie (Stackebrandt y Goebel, 1994). Sin embargo, como ya
hemos comentado anteriormente, hoy día está aceptado que para realizar una adecuada clasificación de
procariotas, sobre todo si se trabaja con microorganismos estrechamente relacionados, por ejemplo a
nivel de especie, como es nuestro caso, es muy importante llevar a cabo el estudio taxonómico desde un
planteamiento polifásico (Stackebrandt y col., 2002); por tanto, van a ser necesarios ensayos de
hibridación ADN-ADN terminar de dilucidar de manera definitiva el taxón al que pertenecen estas cepas.

115
Resultados y Discusión

Tabla 13. Porcentajes de semejanza y divergencia filogenética entre las cepas X2, B40, B100, N12, A16 y
T
Halomonas maura S31 .

% Semejanza
B40 B100 N12 A16 X2 S31T
B40 X 99,0 99,5 98,7 97,6 96,4

% Divergencia
B100 1,0 X 99,4 98,5 97,2 96,4
N12 0,5 0,6 X 99,1 98 96,8
A16 1,3 1,5 0,9 X 98,9 97,5
X2 2,4 2,8 2 1,1 X 98,5
T
S31 3,6 3,6 3,2 2,5 1,5 X

Martínez-Cánovas y colaboradores (2004), rastrearon multitud de ambientes hipersalinos en


España y otros países, en busca de nuevos microorganismos halófilos productores de exopolisacáridos
con posibles aplicaciones biotecnológicas, y llegaron a la conclusión de que en este tipo de hábitats, las
especies productoras de exopolisacáridos más frecuentemente aisladas son Halomonas maura y
Halomonas eurihalina.

En el árbol filogenético que hemos representado en la Figura 25 se pueden observar las


relaciones filogenéticas que existen entre la cepa B35 y otros microorganismos pertenecientes a los
géneros Idiomarina, Alteromonas y otros géneros relacionados de la clase γ-Proteobacteria. Como se
puede comprobar, la cepa B35 presenta una elevadísima relación filogenética con Alteromonas hispanica
T
cepa F32 (Martínez-Checa y col., 2005c), también productora de exopolisacáridos, casi del 100%, por lo
que en principio podemos pensar que la cepa B35 pertenece a este taxón; sin embargo, una vez más, hay
que destacar que en base a esa filosofía de enfoque polifásico de la taxonomía de la que ya hemos
hablado, habría que realizar otras experiencias para confirmar este resultado.

116
Estudio filogenético de las cepas

95 H.elongata
59 X8
95
M4
98 H.eurihalina
H.halmophila
100 H. almeriensis M8T
H. organivorans

57 H.halophila
100 H.salina

51 H.maura
100 X2

A16
B100

95 B40
99 N12

H.pacifica
H.ventosae Al12T

99 Al15
77 Al16
70
H.cupida
H.alimentaria
94 H.halodenitrificans
H.campisalis
68 H.desiderata
H.halocynthiae

99 H.halodurans
H.subglaciescola
63
90 H.neptunia
99 H.boliviensis
94 98
H.variabilis
H.sulfidaeris

100 H.venusta
100
H.hydrothermalis

77 H.magadiensis
H.aquamarina
97
100 H.meridiana
56 H.axialensis Figura 24. Relaciones filogenéticas
Halomonas taeanensis entre las cepas M4, X8, X2, B40, B100,
70 H.muralis N12, A16 y otras cepas pertenecientes
H.pantelleriensis al género Halomonas. El árbol se ha
H. anticariensis FP35T construido utilizando el algoritmo
100 FP34
“neighbour-joining”. Sólo se muestran
99 FP36
los valores de “bootstrap” superiores al
H.marisflavi
50% (1000 réplicas). La barra indica un
1% de divergencia en las secuencias.
0.01

117
Resultados y Discusión

100 Idiomarina baltica


Idiomarina fontislapidosi F23T
Idiomarina seosinensis
100 Idiomarina zobellii
Idiomarina abyssalis

100 Idiomarina loihiensis


99 Idiomarina ramblicola R22T
Psychromonas antarctica
Pseudoalteromonas denitrificans
62
Pseudoalteromonas citrea
100
Pseudoalteromonas rubra
70 Pseudoalteromonas haloplanktis
82 Pseudoalteromonas prydzensis
Thalassomonas viridans
Colwellia demingiae
100
Colwellia psychrerythraea
96
Colwellia hornerae
Colwellia maris

94 Colwellia psychrotropica
Colwellia rossensis

84 Glaciecola pallidula
Glaciecola punicea

77 Aestuariibacter halophilus
100
Aestuariibacter salexigens

100 B35
54
Alteromonas hispanica F32T

100 Alteromonas stellipolaris


Alteromonas litorea
81
50 Alteromonas macleodii
55 Alteromonas marina

0.02
Figura 25. Relaciones filogenéticas entre la cepa B35 y otras cepas pertenecientes a los géneros Idiomarina,
Alteromonas y otros géneros relacionados de la clase γ-Proteobacteria. El árbol se ha construido utilizando el algoritmo
“neighbour-joining”. Sólo se muestran los valores de “bootstrap” superiores al 50% (1000 réplicas). La barra indica un
2% de divergencia en las secuencias.

118
SECCIÓN II

CARACTERIZACIÓN DE LOS EPS


Optimización de la producción

CAPÍTULO 1

OPTIMIZACIÓN DE LA PRODUCCIÓN DE LOS EXOPOLISACÁRIDOS

RESUMEN

El objetivo que nos propusimos para con este capítulo fue llegar a conocer las
condiciones que nos permitiesen obtener en cada caso una producción óptima y rentable de
exopolisacárido. Para ello, hemos evaluado los efectos que sobre el crecimiento bacteriano y
sobre la producción de polímero tienen la variación de diversos factores, como el tiempo de
incubación, la concentración de sales, la fuente de carbono y nitrógeno, y la concentración inicial
de fuente de carbono en el medio de cultivo. Nuestros microorganismos presentan una producción
de EPS parcialmente asociada al crecimiento, ya que, aunque comienza en la fase exponencial de
crecimiento, alcanza su máximo en la fase estacionaria (a los 3 ó 5 días, según el caso). En
general, tras el máximo de producción, se detecta un descenso en la producción de polímero,
posiblemente debido a la degradación del mismo. Todas las cepas estudiadas son capaces de
crecer y producir exopolisacáridos en todos los sustratos ensayados, siendo en general el
sustrato más idóneo la glucosa. La temperatura y la agitación de los cultivos, son otros factores
que también afectan al crecimiento y la producción de exopolisacáridos por parte de nuestros
microorganismos, de modo que 100 rpm y 32ºC son los parámetros ideales.

121
Resultados y Discusión

El estudio de optimización de la producción de exopolisacáridos microbianos para su posterior


utilización a nivel industrial es un proceso largo que normalmente comienza con la producción del
polímero en matraces de laboratorio. Según Sutherland (1990; 1998), el microorganismo debe ser
cultivado bajo diferentes condiciones, para seleccionar aquellas que determinan una producción óptima y
rentable desde el punto de vista de los sustratos empleados y el grado de conversión de los mismos hasta
el exopolisacárido, así como unas propiedades adecuadas del biopolímero que se correspondan con un
producto final de calidad.

Son muchos los estudios llevados a cabo para optimizar la producción y mejorar las propiedades
físicas de polisacáridos de interés comercial. Concretamente, la optimización de las condiciones de cultivo
y el diseño de un proceso de producción adecuado ha sido objeto de múltiples estudios en el caso del
biopolímero por excelencia y de mayor aceptación, el xantano (García-Ochoa y col., 1995, 1997;
Umanshankar y col., 1996 a y b; Lo y col., 1997; Amanullah y col., 1998 a y b; Azuaje y Sánchez, 1999;
Casas y col., 2000; Rao y Sureshkumar, 2001). Otro exopolisacárido con gran interés industrial es el
gelano, que se comercializa por sus propiedades espesantes y gelificantes y como agente solidificante en
medios de cultivo, sustituyendo al agar (Pszczola, 1993). En este caso, también se han publicado distintos
trabajos en los que se busca optimizar la producción y el coste de este biopolímero (Kang y col., 1983;
Giavasis y col., 2000; Pollock, 2001). Con respecto a los microorganismos halófilos productores de
exopolisacáridos, se han realizado estudios para optimizar la producción de los polímeros producidos por
distintas cepas de Halomonas eurihalina (Quesada y col., 1993; Béjar y col., 1996; 1998) y Halomonas
maura (Bouchotroch y col., 2000; Arias y col., 2003), todos ellos con potenciales aplicaciones en
biotecnología.

Dada la importancia de esta etapa previa a una futura producción de los exopolisacáridos a nivel
industrial, hemos estandarizado las condiciones óptimas de producción para cada uno de los 20
polímeros objeto de este estudio, teniendo en cuenta básicamente un criterio de selección, el rendimiento
en la producción.

• Tiempo de incubación

El proceso de optimización de la producción de los distintos polisacáridos sintetizados por las


cepas incluidas en este trabajo, se inició estableciendo la fase de crecimiento en la cual tiene lugar dicha
producción.

Para ello realizamos una curva de crecimiento de la bacteria durante 8 días en el medio MY con
un 7,5 % (p/v) de sales. Este medio complejo ha sido recomendado para la producción de xantano
(Moraine y Rogovin, 1966) y a su vez ha sido utilizado con anterioridad para la producción de otros
exopolisacáridos estudiados por nuestro grupo de investigación.

122
Optimización de la producción

El crecimiento celular se evaluó mediante la medida de la densidad óptica de los cultivos a 600
nm y producción de biomasa celular (g PSC/100 ml). Paralelamente se estudió la producción de polímero
en g EPS/100 ml y g EPS/g PSC.

En las Figuras 26-45 se muestra el efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento y sobre
la producción de exopolisacárido para cada una de las cepas estudiadas en este trabajo.

g EPS/ 100 ml
0,4 3

DO 600nm
0,3
2
0,2
0,1 1
0 0
0 24 48 72 96 120 144 168 192
Tiem po de incubación (horas)

g EPS/100 ml DO 600 nm

Figura 26. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de H. maura X2 y sobre la producción de EPS.
g EPS/100 ml

0,3 3

DO 600 nm
0,2 2
0,1 1
0 0
0 24 48 72 96 120 144 168 192
Tiem po de incubación (horas)

g EPS/100 ml DO 600 nm

Figura 27. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de H. maura B40 y sobre la producción de EPS.

0,3 3
g EPS/100 ml

DO 600 nm

0,2 2

0,1 1

0 0
0 24 48 72 96 120 144 168 192
Tiem po de incubación (horas)

g EPS/100 ml DO 600 nm

Figura 28. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de H. maura B100 y sobre la producción de EPS.

123
Resultados y Discusión

0,3 3

g EPS/100 ml

DO 600 nm
0,2 2

0,1 1

0 0
0 24 48 72 96 120 144 168 192
Tiem po de incubación (horas)

g EPS/100 ml DO 600 nm

Figura 29. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de H. maura N12 y sobre la producción de EPS.

0,2 3
g EPS/100 ml

DO 600 nm
2
0,1
1

0 0
0 24 48 72 96 120 144 168 192
Tiem po de incubación (horas)

g EPS/100 ml DO 600 nm

Figura 30. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de H. maura A16 y sobre la producción de EPS.

0,2 3
g EPS/100 ml

DO 600 nm

2
0,1
1

0 0
0 24 48 72 96 120 144 168 192
Tiem po de incubación (horas)

g EPS/100 ml DO 600 nm

Figura 31. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de H. eurihalina M4 y sobre la producción de EPS.

124
Optimización de la producción

0,15 3

g EPS/100 ml

DO 600 nm
0,1 2

0,05 1

0 0
0 24 48 72 96 120 144 168 192
Tiem po de incubación (horas)

g EPS/100 ml DO 600 nm

Figura 32. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de H. eurihalina X8 y sobre la producción de EPS.

0,15 3
g EPS/100 ml

DO 600 nm
0,1 2

0,05 1

0 0
0 24 48 72 96 120 144 168 192
Tiem po de incubación (horas)

g EPS/100 ml DO 600 nm

T
Figura 33. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de H. ventosae Al12 y sobre la producción de EPS.

0,2 3
g EPS/100 ml

0,15
DO 600 nm

2
0,1
1
0,05

0 0
0 24 48 72 96 120 144 168 192
Tiem po de incubación (horas)

g EPS/100 ml DO 600 nm

Figura 34. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de H. ventosae Al15 y sobre la producción de EPS.

125
Resultados y Discusión

0,2 3

g EPS/100 ml
0,15

OD 600 nm
2
0,1
1
0,05

0 0
0 24 48 72 96 120 144 168 192
Tiem po de incubación (horas)

g EPS/100 ml DO 600 nm

Figura 35. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de H. ventosae Al16 y sobre la producción de EPS.

0,15 3
g EPS/100 ml

DO 600 nm
0,1 2

0,05 1

0 0
0 24 48 72 96 120 144 168 192
Tiem po de incubación (horas)

g EPS/100 ml DO 600 nm

T
Figura 36. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de H. anticariensis FP35 y sobre la producción de
EPS.

0,15 3
g EPS/100 ml

DO 600 nm

0,1 2

0,05 1

0 0
0 24 48 72 96 120 144 168 192
Tiem po de incubación (horas)

g EPS/100 ml DO 600 nm

Figura 37. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de H. anticariensis FP34 y sobre la producción de
EPS.

126
Optimización de la producción

0,15 3

g EPS/100 ml

DO 600 nm
0,1 2

0,05 1

0 0
0 24 48 72 96 120 144 168 192
Tiem po de incubación (horas)

g EPS/100 ml DO 600 nm

Figura 38. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de H. anticariensis FP36 y sobre la producción de
EPS.

0,2 3
g EPS/100 ml

0,15

DO 600 nm
2
0,1
1
0,05

0 0
0 24 48 72 96 120 144 168 192
Tiem po de incubación (horas)

g EPS/100 ml DO 600 nm

T
Figura 39. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de H. almeriensis M8 y sobre la producción de EPS.

0,15 3
g EPS/100 ml

DO 600 nm

0,1 2

0,05 1

0 0
0 24 48 72 96 120 144 168 192
Tiem po de incubación (horas)

g EPS/100 ml DO 600 nm

T
Figura 40. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de S. mucosus A3 y sobre la producción de EPS.

127
Resultados y Discusión

0,3 3

g EPS/100 ml

DO 600 nm
0,2 2

0,1 1

0 0
0 24 48 72 96 120 144 168 192
Tiem po de incubación (horas)

g EPS/100 ml DO 600 nm

T
Figura 41. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de P. marisminoris B33 y sobre la producción de EPS.

0,2 3
g EPS/100 ml

0,15

OD 600 nm
2
0,1
1
0,05

0 0
0 24 48 72 96 120 144 168 192
Tiem po de incubación (horas)

g EPS/100 ml DO 600 nm

T
Figura 42. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de I. fontislapidosi F23 y sobre la producción de EPS.

0,2 3
g EPS/100 ml

0,15
DO 600 nm

2
0,1
1
0,05

0 0
0 24 48 72 96 120 144 168 192
Tiem po de incubación (horas)

g EPS/100 ml DO 600 nm

T
Figura 43. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de I. ramblicola R22 y sobre la producción de EPS.

128
Optimización de la producción

0,15 3

g EPS/100 ml

DO 600 nm
0,1 2

0,05 1

0 0
0 24 48 72 96 120 144 168 192
Tiem po de incubación (horas)

g EPS/100 ml DO 600 nm

T
Figura 44. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de A. hispanica F32 y sobre la producción de EPS.

0,15 3
g EPS/100 ml

DO 600 nm
0,1 2

0,05 1

0 0
0 24 48 72 96 120 144 168 192
Tiem po de incubación (horas)

g EPS/100 ml DO 600 nm

Figura 45. Efecto del tiempo de incubación sobre el crecimiento de A. hispanica B35 y sobre la producción de EPS.

Como se muestra en las Figuras 26-45, nuestras bacterias tienen una larga fase de crecimiento
estacionario que se prolonga al menos durante los ocho días que ha durado el ensayo, sin que se aprecie
lisis de la bacteria.

La producción de los biopolímeros aumenta progresivamente durante la fase logarítmica y


alcanza un máximo en la fase estacionaria, alrededor de las 96-120 horas de incubación de los cultivos
para las cepas de Halomonas maura, Halomonas eurihalina, Halomonas ventosae, Halomonas
anticariensis, Halomonas almeriensis y Alteromonas hispanica, y de 72 horas de incubación para las
cepas de Salipiger mucosus, Palleronia marisminoris, Idiomarina fontislapidosi e Idiomarina ramblicola.
Este hecho es indicativo de que la producción de EPS por parte de las bacterias halófilas que hemos
estudiado es un proceso parcialmente asociado con el crecimiento de la bacteria, ya que si bien tiene
lugar mientras que la bacteria crece, es máximo una vez que el crecimiento se ha estacionado
(Sutherland, 1990). Estos resultados podrían indicar que una multiplicación celular eficiente resulta
esencial para que después se produzca de forma correcta la síntesis del exopolisacárido (Walling y col.,

129
Resultados y Discusión

2005). Es como si durante la fase de crecimiento celular óptima, los precursores activados disponibles se
emplean fundamentalmente para la síntesis de biomasa; después, cuando el crecimiento se ha
estabilizado, estos se encuentran disponibles para la síntesis del exopolisacárido (Petry y col., 2000;
Ramos y col., 2001). Por tanto, la producción de exopolisacáridos por parte de nuestras bacterias
halófilas, podría considerarse una “fuga” o “escape” metabólico, tal y como lo definió Pham y
colaboradores (2000) para la síntesis de exopolisacáridos por parte de Lactobacillus rhamnosus R.

La fase de crecimiento durante la cual tiene lugar la producción de exopolisacárido difiere de


unos microorganismos a otros. La síntesis de EPS puede estar asociada al crecimiento, como en el caso
del pululano producido por Aureobasidium pullulans, el alginato bacteriano sintetizado por Azotobacter
vinelandii o los heteropolisacáridos producidos por muchas bacterias del ácido láctico (De Vuyst y

Degeest, 1999; Weldman y Maddox, 2003). Más raramente, la producción de exopolisacárido tiene lugar
únicamente cuando el crecimiento ha cesado totalmente, tal y como ocurre con el curdlano de Alcaligenes
faecalis (Sutherland, 1990) o para el exopolisacárido producido por Aeromonas salmonicida (Bonet y col.,
1993). En el caso del xantano, la síntesis ocurre, en todas las fases de crecimiento, obteniéndose el
máximo una vez que el crecimiento bacteriano se ha estacionado (Sutherland, 1990, 1993). Se ha
comprobado que en las diferentes fases de crecimiento, el xantano producido es distinto en cuanto a su
masa molecular y grado de ramificación de la cadena; por tanto el producto extraído al final del proceso
representa una mezcla del EPS producido en las diferentes etapas (Becker y col., 1998). La producción
de exopolisacárido por Halomonas maura S30 también se ha demostrado que está parcialmente asociada
al crecimiento bacteriano, ya que comienza al final de la fase exponencial de crecimiento, aunque alcanza
su máximo en la fase estacionaria, tras 120 horas de incubación (Arias y col., 2003).

Para todos los microorganismos estudiados en este trabajo, el máximo de producción de


exopolímero (que suele coincidir con la máxima cantidad de EPS por gramo de peso seco celular) está
seguido por una disminución de los niveles de exopolisacárido en tiempos prolongados de incubación, lo
que puede ser debido a una degradación enzimática del mismo (Dierksen y col., 1995; De Vuyst y col.,
1998; Degeest y De Vuyst., 1999) o a cambios en los parámetros físicos del cultivo (Gancel y Novel.,
1994 a y b). El fenómeno de degradación, tras un prolongado tiempo de incubación, es bastante frecuente
en muchos exopolisacáridos microbianos, entre ellos el gelano (Kennedy y Sutherland, 1994; Hashimoto y
col., 1996) o esfingano (Hashimoto y Murata, 1998). Este efecto es importante ya que pueden verse
alteradas algunas propiedades de los biopolímeros; de hecho, parece existir relación entre la actividad de
detrminadas enzimas y la disminución de la viscosidad de las soluciones de EPS; estas enzimas
producen una escisión a nivel de los enlaces glicosídicos de la cadena polisacarídica y originan polímeros
de menor masa molecular, que dan soluciones de menor viscosidad, tal y como se ha demostrado en un
estudio llevado a cabo con Lactobacillus rhamnosus (Pham y col., 2000).

130
Optimización de la producción

La degradación de los exopolisacáridos microbianos es un proceso complejo y del que se


desconocen muchos aspectos. Generalmente envuelve la acción de diferentes enzimas cuyo estudio se
está abordando cada vez con más frecuencia dada la necesidad de tratar de controlar y reducir al máximo
su efecto negativo sobre los EPS microbianos (Sutherland, 1999).

Actualmente se ha demostrado la presencia de glicohidrolasas en los extractos celulares y


fracciones extracelulares de algunos microorganismos. En un estudio realizado con Lactobacillus
rhamnosus se ha puesto de manifiesto la existencia de α-glucosidasa (fundamentalmente a nivel
intracelular) y β-glucuronidasa (mayoritariamente en la fracción externa) y asociadas a ellas otras enzimas
como β-D-glucosidasa, α-D-galactosidasa y β-D-galactosidasa (Pham y col., 2000). La actividad de dichas
enzimas se acentúa en cultivos de mayor edad debido a que en ellos se produce lisis celular y se provoca
la liberación de gran número de enzimas.

Además, se ha descrito que factores como la temperatura, el pH o la composición del medio


pueden influir en el proceso de degradación del EPS (De Vuyst y col., 1998).

• Concentración de sales

La presencia de sales en el medio de cultivo, indispensable para el crecimiento y desarrollo de


bacterias halófilas, constituye otro factor relevante en la producción de exopolisacárido. De ahí que la
optimización de la naturaleza de las mismas así como la concentración en la que han de ser incorporadas
al medio sea también decisiva en este estudio.

Hemos estudiado la influencia sobre el crecimiento de nuestras bacterias, así como sobre la
producción de exopolisacárido, de distintas concentraciones de una solución de sales (Rodríguez-Valera y
col., 1981), cuya composición se detalla en el apartado 2. Mantenimiento de las cepas, Material y
Métodos, tras cinco días de incubación. En la Figuras 46-65 se encuentran recogidos los resultados
obtenidos.

El crecimiento de los microorganismos estudiados se evaluó mediante la medida de la


producción de biomasa celular (g PSC/100 ml). Paralelamente se estudió la producción de
exopolisacárido en g EPS/100 ml y g EPS/g PSC.

131
Resultados y Discusión

0,5 2,5

g EPS/ 100 ml

g PSC/100 ml
0,4 2
0,3 1,5
0,2 1
0,1 0,5
0 0
2,5 5 7,5 10
% (p/v) sales

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 46. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular en H. maura X2.

0,4 1,5
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,3
1
0,2
0,5
0,1

0 0
2,5 5 7,5 10
% (p/v) sales

gEPS/100ml gPSC/100ml

Figura 47. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular en H. maura B40.

0,3 1,5
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml

0,2 1

0,1 0,5

0 0
2,5 5 7,5 10
% (p/v) sales

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 48. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular en H. maura B100.

132
Optimización de la producción

0,3 1

g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,2
0,5
0,1

0 0
2,5 5 7,5 10
% (p/v) sales

gEPS/100ml gPSC/100ml

Figura 49. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular en H. maura N12.

0,3 1
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,2
0,5
0,1

0 0
2,5 5 7,5 10
% (p/v) sales

gEPS/100ml gPSC/100ml

Figura 50. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular en H. maura A16.

0,2 0,5
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml

0,15 0,4
0,3
0,1
0,2
0,05 0,1
0 0
2,5 5 7,5 10
% (p/v) sales

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 51. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular en H. eurihalina M4.

133
Resultados y Discusión

0,2 0,5

g PSC/ 100 ml
0,4

g EPS/100 ml
0,15
0,3
0,1
0,2
0,05 0,1
0 0
2,5 5 7,5 10
% (p/v) sales

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 52. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular en H. eurihalina X8.

0,15 1
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,1
0,5
0,05

0 0
2,5 5 7,5 10
% (p/v) sales

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

T
Figura 53. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular en H. ventosae Al12 .

0,2 1
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml

0,15

0,1 0,5

0,05

0 0
2,5 5 7,5 10
% (p/v) sales

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 54. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular en H. ventosae Al15.

134
Optimización de la producción

0,2 1

g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,15
0,1 0,5
0,05
0 0
2,5 5 7,5 10
% (p/v) sales

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 55. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular en H. ventosae Al16.

0,15 0,8
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,6
0,1
0,4
0,05
0,2

0 0
2,5 5 7,5 10
% (p/v) sales

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 56. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular en H. anticariensis
T
FP35 .

0,2 0,8
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml

0,15 0,6

0,1 0,4

0,05 0,2

0 0
2,5 5 7,5 10
% (p/v) sales

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 57. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular en H. anticariensis
FP34.

135
Resultados y Discusión

0,2 0,8

g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,15 0,6

0,1 0,4

0,05 0,2

0 0
2,5 5 7,5 10
% (p/v) sales

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 58. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular en H. anticariensis
FP36.

0,2 0,8
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,15 0,6

0,1 0,4

0,05 0,2

0 0
2,5 5 7,5 10
% (p/v) sales

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

T
Figura 59. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular en H. almeriensis M8 .

0,3 2
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml

1,5
0,2
1
0,1
0,5
0 0
2,5 5 7,5 10
% (p/v) sales

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

T
Figura 60. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular en S. mucosus A3 .

136
Optimización de la producción

0,3 1,5

g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,2 1

0,1 0,5

0 0
2,5 5 7,5 10
% (p/v) sales

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 61. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular en P. marisminoris
T
B33 .

0,15 0,5
0,4
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,1
0,3
0,2
0,05
0,1
0 0
2,5 5 7,5 10
% (p/v) sales

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 62. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular en I. fontislapidosi
T
F23 .

0,2 0,5
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml

0,15 0,4
0,3
0,1
0,2
0,05 0,1
0 0
2,5 5 7,5 10
% (p/v) sales

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

T
Figura 63. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular en I. ramblicola R22 .

137
Resultados y Discusión

0,15 0,5

g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,4
0,1
0,3
0,2
0,05
0,1
0 0
2,5 5 7,5 10
% (p/v) sales

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

T
Figura 64. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular en A. hispanica F32 .

0,25 0,8
0,2
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,6
0,15
0,4
0,1
0,05 0,2

0 0
2,5 5 7,5 10
% (p/v) sales

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 65. Efecto de la concentración de sales sobre la producción de EPS y la biomasa celular en A. hispanica B35.

La mayor producción de EPS se obtuvo en el medio de cultivo con una concentración salina final
T
del 7,5% (p/v) para las cepas X2, B40, B100, N12 y A16 de H. maura, M4 y X8 de H. eurihalina, Al12 y
T T T
Al16 de H. ventosae, FP35 y FP36 de H. anticariensis, M8 de H. almeriensis y F32 y B35 de
Alteromonas hispanica, como podemos apreciar en las Figuras 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 55, 56, 58,
59, 64 y 65. En estos casos, al aumentar la concentración de sales hasta el 10% (p/v), se produce una
disminución en la producción de exopolisacárido. El comportamiento observado en cuanto a la producción
de exopolisacárido por parte de estas cepas en función de la concentración de sales ha sido descrito en
otros casos. A pesar de que en principio se ha considerado que la producción de exopolisacárido tiene
lugar en respuesta a condiciones de estrés osmótico en los ambientes hipersalinos (supuesto que quizás
podría aplicarse a las cepas Al15 de H. ventosae y FP34 de H. anticariensis, ya que a mayor
concentración salina, mayor producción de EPS, como se puede observar en la Figuras 54 y 57), este
proceso puede verse afectado en presencia de elevadas concentraciones salinas. En Shinorizobium
meliloti, la producción de succinoglicano se encuentra estimulada a una molaridad moderada de NaCl, y
a mayor salinidad la cantidad de exopolisacárido sintetizada es menor (Breedveld y col., 1990). Así,
parece ser que una elevada presión osmótica puede afectar a la producción de exopolímero, tal y como

138
Optimización de la producción

se ha constatado en varios estudios (Lloret y col., 1995; Lloret y col., 1998). Este fenómeno también ha
sido descrito para la producción de maurano por Halomonas maura S30 (Arias y col., 2003), aunque en
este caso, la máxima producción de polímero se produce a una concentración del 5% (p/v) en sales.

T T
El comportamiento frente al estrés salino de las cepas A3 de Salipiger mucosus, B33 de
Palleronia marisminoris, F23T de Idiomarina fontislapidosi, y R22T de I. ramblicola, es diferente, y es que
como podemos observar en las correspondientes gráficas de las Figuras 60, 61, 62 y 63, el crecimiento
bacteriano y la producción de exopolisacárido están totalmente desacoplados, son fenómenos no
asociados; a mayor concentración de la solución salina, más y mejor crecimiento, ya que podemos
observar que los valores de biomasa celular obtenidos son cada vez más elevados, y peor producción de
EPS; quizá, y como ya hemos comentado anteriormente en este mismo capítulo, las condiciones que
favorecen el crecimiento celular hacen que los precursores activados no se encuentren disponibles para
la síntesis de exopolisacárido, ya que se utilizan en gran medida para la síntesis de componentes de la
pared celular, para una multiplicación eficiente de las células, para la producción de biomasa celular.
Estos resultados coinciden con los de otros autores, que mantienen que el crecimiento y la producción de
EPS tienen requerimientos nutricionales diferentes (Cheirslip y col., 2001; Gorret y col., 2001; Petronella y
Hugenholtz, 1999).

• Fuente de carbono y nitrógeno

La producción de exopolisacáridos microbianos puede verse enormemente influenciada por la


fuente de carbono y nitrógeno que incorporemos al medio de cultivo, así como la relación que exista entre
dichos componentes.

A partir de la composición del medio complejo MY, se ha sustituido la glucosa (Glu) como fuente
de carbono por sacarosa (Sac), sustrato empleado comúnmente por los microorganismos para la síntesis
de exopolisacáridos, manosa (Man) y galactosa (Gal), azúcares que se encuentran habitualmente
formando parte de la composición química de los EPS. Además, hemos estudiado el efecto de sustituir
en el medio complejo MY, la proteosa peptona, y los extractos de levadura y malta, fuentes de nitrógeno,
por bacto peptona (BP), a fin de intentar disminuir el coste del medio de cultivo.

El crecimiento celular se evaluó mediante la medida de la producción de biomasa celular (g


PSC/100 ml). Paralelamente se estudió la producción de polímero en g EPS/100 ml y g EPS/g PSC.

Los resultados obtenidos se muestran a continuación en las Figuras 66-85.

139
Resultados y Discusión

0,5 4

g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,4 3
0,3
2
0,2
0,1 1
0 0
Gluc Sac Man Gal BP
Fuente de C y N

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 66. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa celular en Halomonas
maura X2. Gluc: glucosa; Sac: sacarosa; Man: manosa; Gal: galactosa; BP: bacto peptona.

0,4 2

g PSC/100 ml
g EPS/100 ml

0,3 1,5

0,2 1

0,1 0,5

0 0
Glu Sac Man Gal BP
Fuente de C y N

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 67. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa celular en Halomonas
maura B40. Gluc: glucosa; Sac: sacarosa; Man: manosa; Gal: galactosa; BP: bacto peptona.

0,4 2,5
g PSC/100 ml
g EPS/100 ml

0,3 2
1,5
0,2
1
0,1 0,5
0 0
Glu Sac Man Gal BP
Fuente de C y N

gEPS/100ml gPSC/100ml

Figura 68. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa celular en Halomonas
maura B100. Gluc: glucosa; Sac: sacarosa; Man: manosa; Gal: galactosa; BP: bacto peptona.

140
Optimización de la producción

0,25 5

g PSC/100 ml
g EPS/100 ml
0,2 4
0,15 3
0,1 2
0,05 1
0 0
Glu Sac Man Gal BP
Fuente de C y N

gEPS/100ml gPSC/100ml

Figura 69. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa celular en Halomonas
maura N12. Gluc: glucosa; Sac: sacarosa; Man: manosa; Gal: galactosa; BP: bacto peptona.

0,3 0,8

g PSC/100 ml
g EPS/100 ml

0,6
0,2
0,4
0,1
0,2
0 0
Glu Sac Man Gal BP
Fuente de C y N

gEPS/100ml gPSC/100ml

Figura 70. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa celular en Halomonas
maura A16. Gluc: glucosa; Sac: sacarosa; Man: manosa; Gal: galactosa; BP: bacto peptona.

0,2 0,8
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml

0,15 0,6

0,1 0,4

0,05 0,2

0 0
Glu Sac Man Gal BP
Fuente de C y N

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 71. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa celular en Halomonas
eurihalina M4. Gluc: glucosa; Sac: sacarosa; Man: manosa; Gal: galactosa; BP: bacto peptona.

141
Resultados y Discusión

0,2 0,8

g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,15 0,6

0,1 0,4

0,05 0,2

0 0
Glu Sac Man Gal BP
Fuente de C y N

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 72. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa celular en Halomonas
eurihalina X8. Gluc: glucosa; Sac: sacarosa; Man: manosa; Gal: galactosa; BP: bacto peptona.

0,2 0,8
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,15 0,6

0,1 0,4

0,05 0,2

0 0
Glu Sac Man Gal BP
Fuente de C y N

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 73. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa celular en Halomonas
T
ventosae Al12 . Gluc: glucosa; Sac: sacarosa; Man: manosa; Gal: galactosa; BP: bacto peptona.

0,2 0,8
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml

0,15 0,6

0,1 0,4

0,05 0,2

0 0
Glu Sac Man Gal BP
Fuente de C y N

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 74. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa celular en Halomonas
ventosae Al15. Gluc: glucosa; Sac: sacarosa; Man: manosa; Gal: galactosa; BP: bacto peptona.

142
Optimización de la producción

0,2 1
0,8

g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,15
0,6
0,1
0,4
0,05 0,2
0 0
Glu Sac Man Gal BP
Fuente C y N

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 75. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa celular en Halomonas
ventosae Al16. Gluc: glucosa; Sac: sacarosa; Man: manosa; Gal: galactosa; BP: bacto peptona.

0,2 0,8
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,15 0,6

0,1 0,4

0,05 0,2

0 0
Glu Sac Man Gal BP
Fuente de C y N

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 76. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa celular en Halomonas
T
anticariensis FP35 . Gluc: glucosa; Sac: sacarosa; Man: manosa; Gal: galactosa; BP: bacto peptona.

0,2 0,8
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml

0,15 0,6

0,1 0,4

0,05 0,2

0 0
Glu Sac Man Gal BP
Fuente de C y N

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 77. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa celular en Halomonas
anticariensis FP34. Gluc: glucosa; Sac: sacarosa; Man: manosa; Gal: galactosa; BP: bacto peptona.

143
Resultados y Discusión

0,2 0,8

g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,15 0,6
0,1 0,4
0,05 0,2
0 0
Glu Sac Man Gal BP
Fuente de C y N

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 78. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa celular en Halomonas
anticariensis FP36. Gluc: glucosa; Sac: sacarosa; Man: manosa; Gal: galactosa; BP: bacto peptona.

0,2 0,8
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,15 0,6

0,1 0,4

0,05 0,2

0 0
Glu Sac Man Gal BP
Fuente de C y N

mgEPS/100ml mgPSC/100ml

Figura 79. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa celular en Halomonas
T
almeriensis M8 . Gluc: glucosa; Sac: sacarosa; Man: manosa; Gal: galactosa; BP: bacto peptona.

0,3 2
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml

1,5
0,2
1
0,1
0,5
0 0
Glu Sac Man Gal BP
Fuente de C y N

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 80. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa celular en Salipiger
T
mucosus A3 . Gluc: glucosa; Sac: sacarosa; Man: manosa; Gal: galactosa; BP: bacto peptona.

144
Optimización de la producción

0,3 1,5

g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,2 1

0,1 0,5

0 0
Glu Sac Man Gal BP
Fuente de C y N

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 81. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa celular en Palleronia
T
marisminoris B33 . Gluc: glucosa; Sac: sacarosa; Man: manosa; Gal: galactosa; BP: bacto peptona.

0,2 0,4
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,15 0,3

0,1 0,2

0,05 0,1

0 0
Glu Sac Man Gal BP
Fuente de C y N

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 82. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa celular en Idiomarina
T
fontislapidosi F23 . Gluc: glucosa; Sac: sacarosa; Man: manosa; Gal: galactosa; BP: bacto peptona.

0,2 0,4
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml

0,15 0,3

0,1 0,2

0,05 0,1

0 0
Glu Sac Man Gal BP
Fuente de C y N

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 83. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa celular en Idiomarina
T
ramblicola R22 . Gluc: glucosa; Sac: sacarosa; Man: manosa; Gal: galactosa; BP: bacto peptona.

145
Resultados y Discusión

0,15 0,5

g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,4
0,1
0,3
0,2
0,05
0,1
0 0
Glu Sac Man Gal BP
Fuente de C y N

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 84. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa celular en Alteromonas
T
hispanica F32 . Gluc: glucosa; Sac: sacarosa; Man: manosa; Gal: galactosa; BP: bacto peptona.

0,25 1,2
1
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,2
0,8
0,15
0,6
0,1
0,4
0,05 0,2
0 0
Glu Sac Man Gal BP
Fuente de C y N

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 85. Efecto de la fuente de carbono y nitrógeno sobre la producción de EPS y la biomasa celular en Alteromonas
hispanica B35. Gluc: glucosa; Sac: sacarosa; Man: manosa; Gal: galactosa; BP: bacto peptona.

En líneas generales, la mayor producción de exopolisacárido, tal y como se muestra en las


Figuras 66-85, se produjo cuando empleamos el medio de cultivo indefinido MY tal y como fue descrito
por Moraine y Rogovin en 1966, es decir, adicionando glucosa como fuente de carbono. La productividad
en los medios de cultivo en los que la fuente de carbono había sido sustituida por sacarosa, manosa o
galactosa en general fue menor. En algunas ocasiones, si bien se aprecia un ligero aumento en la
producción de polímero a partir de otro sustrato (por ejemplo, con sacarosa para la cepa B100 de
Halomonas maura, con manosa para Halomonas ventosae Al16 o con galactosa para Idiomarina
T
ramblicola R22 ), creemos que este aumento no fue lo suficientemente significativo como para sustituir la
glucosa por alguno de los demás azúcares, que tienen un coste económico superior. Sin embargo, en
algunos casos, la glucosa si que se vio claramente superada como sustrato carbonado a partir del cual
sintetizar exopolisacáridos; así, las cepas FP34 y FP36 de Halomonas anticariensis, aunque crecen casi
por igual en todos los azúcares ensayados, producen una mayor cantidad de polímero cuando

146
Optimización de la producción

empleamos manosa como fuente de carbono, Palleronia marisminoris sintetiza una mayor cantidad de
EPS en presencia de sacarosa, e Idiomarina fontislapidosi F23T y Alteromonas hispanica F32T producen
más biopolímero cuando en el medio indefinido MY la glucosa es sustituida por galactosa.

Por otra parte, el crecimiento celular detectado si que presenta en muchos casos una gran
variabilidad en función de las distintas fuentes de carbono empleadas, tal y como indican los resultados
de biomasa celular obtenidos en cada caso. Este comportamiento ha sido descrito para distintos
microorganismos, como por ejemplo Lactobacillus plantarum EP56 (Tallon y col., 2003), Lactobacillus
rhamnosus C83 (Gamar y col., 1997), Lactobacillus sakei 0-1 (Deggest y col., 2001) o Pediococcus
damnosus IOEB8801 (Walling y col., 2005). Sin embargo, el crecimiento de Halomonas maura S30
empleando diferentes fuentes de carbono fue muy similar (Arias y col., 2003).

A diferencia del laboratorio, donde únicamente se busca emplear sustratos que permitan una
producción adecuada de EPS, en la industria existen otros intereses prioritarios como es la elección de
sustratos de bajo coste. La aplicación final del producto sintetizado también condiciona la selección de los
sustratos, de ahí que se tienda a utilizar aquellos que sean de adecuada calidad y que contengan el
mínimo porcentaje de impurezas (Sutherland, 1990). De acuerdo con estos criterios y junto con los
resultados anteriormente comentados, la glucosa ha sido la fuente de carbono seleccionada por nosotros
para la producción de nuestros EPS y para realizar posteriores estudios.

En el caso del xantano, y a pesar de que Xanthomonas campestris puede utilizar un gran número
de fuentes de carbono (Becker y col., 1998), la de elección en el mayor número de estudios de producción
realizados, así como en los procesos de fermentación industrial es la glucosa, por su coste y fácil
biodisponibilidad. Los resultados de productividad son mejores que con otros sustratos ensayados, como
sacarosa, lactosa, maltosa, fructosa, xilosa o polioles como el inositol y sorbitol (Leela y Sharma, 2000).

Por otra parte, y a diferencia de lo observado con las distintas fuentes de carbono, la sustitución
del extracto de levadura, extracto de malta y proteosa peptona, presentes en el medio MY como fuentes
de nitrógeno, por una fuente de nitrógeno de menor coste económico, bacto-peptona, condujo a una
disminución importante en la producción de exopolisacárido así como en el crecimiento bacteriano.

• Concentración de la fuente de carbono

La optimización del porcentaje de la fuente de carbono en el medio de cultivo se llevó a cabo de


igual forma que en la experiencia anterior, en base a la producción de EPS (g EPS/100 ml y g EPS/g
PSC) y crecimiento bacteriano (g PSC/100 ml) en un amplio rango de concentraciones de glucosa (0, 1, 2,
5, 7 y 10% p/v). Los resultados se muestran a continuación en las Figuras 86-105.

147
Resultados y Discusión

0,6 4

g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
3
0,4
2
0,2
1
0 0
0 1 2 5 7 10
% (p/v) Glucosa

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 86. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa celular en Halomonas
maura X2.

0,4 1,5
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,3
1
0,2
0,5
0,1
0 0
0 1 2 5 7 10
% (p/v) Glucosa

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 87. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa celular en H. maura B40.

0,6 3
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml

0,4 2

0,2 1

0 0
0 1 2 5 7 10
% (p/v) Glucosa

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 88. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa celular en H. maura B100.

148
Optimización de la producción

0,6 3

g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,4 2

0,2 1

0 0
0 1 2 5 7 10
% (p/v) Glucosa

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 89. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa celular en H. maura N12.

0,4 0,8
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,3 0,6
0,2 0,4
0,1 0,2
0 0
0 1 2 5 7 10
% (p/v) Glucosa

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 90. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa celular en H. maura A16.

0,2 0,8
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml

0,15 0,6

0,1 0,4

0,05 0,2

0 0
0 1 2 5 7 10
% (p/v) Glucosa

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 91. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa celular en H. eurihalina M4.

149
Resultados y Discusión

0,2 0,6

g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,15
0,4
0,1
0,2
0,05

0 0
0 1 2 5 7 10
% (p/v) Glucosa

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 92. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa celular en H. eurihalina X8.

0,2 1
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,15 0,8
0,6
0,1
0,4
0,05 0,2
0 0
0 1 2 5 7 10
% (p/v) Glucosa

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 93. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa celular en H. ventosae
T
Al12 .

0,3 1,5
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml

0,2 1

0,1 0,5

0 0
0 1 2 5 7 10
% (p/v) Glucosa

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 94. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa celular en H. ventosae
Al15.

150
Optimización de la producción

0,2 1
0,8

g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,15
0,6
0,1
0,4
0,05 0,2
0 0
0 1 2 5 7 10
% (p/v) Glucosa

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 95. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa celular en H. ventosae
Al16.

0,2 0,6
0,5
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,15
0,4
0,1 0,3
0,2
0,05
0,1
0 0
0 1 2 5 7 10
% (p/v) Glucosa

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 96. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa celular en H. anticariensis
T
FP35 .

0,2 0,6
0,5
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml

0,15
0,4
0,1 0,3
0,2
0,05
0,1
0 0
0 1 2 5 7 10
% (p/v) Glucosa

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 97. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa celular en H. anticariensis
FP34.

151
Resultados y Discusión

0,2 0,8

g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,15 0,6
0,1 0,4
0,05 0,2
0 0
0 1 2 5 7 10
% (p/v) Glucosa

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 98. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa celular en H. anticariensis
FP36.

0,3 0,6
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,2 0,4

0,1 0,2

0 0
0 1 2 5 7 10
% (p/v) Glucosa

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 99. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa celular en H. almeriensis
T
M8 .

0,3 2,5
2
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml

0,2
1,5
1
0,1
0,5
0 0
0 1 2 5 7 10
% (p/v) Glucosa

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 100. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa celular en Salipiger
T
mucosus A3 .

152
Optimización de la producción

0,3 1,5

g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,2 1

0,1 0,5

0 0
0 1 2 5 7 10
% (p/v) Glucosa

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 101. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa celular en Palleronia
T
marisminoris B33 .

0,2 0,6
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,15
0,4
0,1
0,2
0,05

0 0
0 1 2 5 7 10
% (p/v) Glucosa

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 102. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa celular en Idiomarina
T
fontislapidosi F23 .

0,2 0,4
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml

0,15 0,3

0,1 0,2

0,05 0,1

0 0
0 1 2 5 7 10
% (p/v) Glucosa

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 103. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa celular en I. ramblicola
T
R22 .

153
Resultados y Discusión

0,15 0,4

g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,3
0,1
0,2
0,05
0,1

0 0
0 1 2 5 7 10
% (p/v) Glucosa

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 104. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa celular en Alteromonas
T
hispanica F32 .

0,4 1
g EPS/100 ml

g PSC/100 ml
0,3 0,8
0,6
0,2
0,4
0,1 0,2
0 0
0 1 2 5 7 10
% (p/v) Glucosa

g EPS/100 ml g PSC/100 ml

Figura 105. Efecto de la concentración de glucosa sobre la producción de EPS y la biomasa celular en A. hispanica
B35.

En la gran mayoría de los casos, como se puede apreciar en las Figuras 86-105, la mayor
producción de exopolisacárido tiene lugar a un porcentaje no muy elevado de glucosa, concretamente
entre el 1 y el 5% (p/v), a partir del cual y conforme se incrementa la concentración de este azúcar en el
medio (hasta un máximo del 10% p/v), dicha producción se va haciendo progresivamente menor. En
algunas ocasiones, en las fermentaciones realizadas con las mayores cantidades de glucosa formando
parte de la composición del medio de cultivo, el crecimiento bacteriano se veía total y absolutamente
inhibido, como se aprecia en las Figuras 86, 87, 99, 101, 104 y 105.

El comportamiento que presentan en general nuestros microorganismos frente a la concentración


de glucosa presente en el medio de cultivo es similar al de otros muchos microorganismos, que crecen
mejor cuando la concentración de azúcar no es demasiado alta. En un estudio llevado a cabo con el
xantano, se evaluó el efecto del porcentaje de glucosa sobre la producción de biopolímero, y se puso de

154
Optimización de la producción

manifiesto que el aporte óptimo de dicha fuente de carbono para la producción de xantano está entre el 1
y 5% (p/v), de modo que mayores porcentajes de este componente resultan inhibitorios y no se produce
un aumento en la producción de EPS posiblemente debido a una represión catabólica (Leela y Sharma,
2000). De hecho, Xanthomonas campestris metaboliza los azúcares mediante una ruta metabólica central
en la que, una vez que ingresa la glucosa, se produce primeramente una fosforilación para dar glucosa-6-
fosfato que puede incorporarse o bien al metabolismo central en el que es catabolizada hasta piruvato y
gliceraldehído 3-fosfato, o bien ser incorporada y utilizada para la producción de polímero. En condiciones
de exceso de glucosa en el medio, se induce la activación de una ruta metabólica alternativa consistente
en la oxidación directa de la glucosa a gluconato (Lessie y Phibbs, 1984). Bajo estas condiciones es de
esperar una disminución de los niveles y con ello menor disponibilidad de glucosa-6-fosfato, necesaria
para la producción de EPS, de ahí que el rendimiento en la producción de xantano sea menor. A causa de
este fenómeno, los procesos de optimización de producción de xantano han de incluir estrategias que
eviten una acumulación excesiva de glucosa en el medio (Lettisse y col., 2001).

Otra explicación para el comportamiento de la gran mayoría de nuestras bacterias frente a


elevados porcentajes de glucosa, podría ser el que a que a elevadas concentraciones de la fuente de
carbono, la bacteria sufra una plasmolisis que provoque que la captación de nutrientes no sea lo
suficientemente efectiva. Este fenómeno podría evitarse, y con ello hacer que la bacteria tolere mayores
cantidades de azúcar, incorporando de forma gradual concentraciones crecientes de la misma al medio
en el que crece el microorganismo cada cierto intervalo de tiempo (Sutherland, comunicación personal).

A ello hay que sumar el hecho de que un incremento de la concentración de azúcar puede
además traducirse en una utilización ineficaz de la misma al aumentar la síntesis de otros metabolitos en
detrimento de la producción de exopolisacárido (Farres y col., 1997).

Sin embargo, uno de nuestros microorganismos supone una excepción a este comportamiento
T
general descrito anteriormente frente a la concentración de glucosa; es Idiomarina fontislapidosi F23 . En
este caso, a medida que aumentamos la concentración de glucosa en el medio de cultivo, aumenta el
crecimiento celular y la producción de exopolisacárido, al igual que se ha descrito, por ejemplo, para
Pediococcus damnosus IOEB8801 (Walling y col., 2005). Parece que una concentración inicial de glucosa
en el medio elevada estimula la producción de polímero, no sólo por una mejora en el crecimiento celular,
sino también porque hay más glucosa disponible para la síntesis de EPS.

Un acontecimiento que es importante resaltar, es que al igual que como ocurre con Halomonas
maura S30 (Arias y col., 2003), todos nuestros microorganismos halófilos son capaces de producir
exopolisacáridos en medios de cultivo que no presentan un aporte directo de glucosa, como se observa
en las Figuras 87-106, algo que podría tener importantes implicaciones en lo que se refiere a disminuir
costes en la producción a nivel industrial de los exopolisacáridos. Aeromonas salmonicida es capaz de
crecer en ausencia de glucosa, pero en este caso no produce su exopolisacárido (Bonet y col., 1993).

155
Resultados y Discusión

• Temperatura de incubación y agitación de los cultivos

Para finalizar con la selección de las condiciones óptimas de producción de los EPS, fijamos la
temperatura de incubación y la agitación de los cultivos.

Tabla 14. Efecto de la temperatura de incubación sobre la producción de EPS y la biomasa celular.

Temperatura (ºC)

22 32 42
CEPA

EPS* Biomasa* Rendimiento* EPS Biomasa Rendimiento EPS Biomasa Rendimiento

X2 0,035 0,6 0,058 0,410 3,015 0,135 0,045 0,2 0,225


B40 0,025 0,3 0,083 0,335 1,38 0,242 0,035 0,1 0,35
B100 0,025 0,45 0,055 0,275 2,05 0,134 0,03 0,145 0,206
N12 0,015 0,6 0,025 0,205 2,75 0,074 0,02 0,2 0,1
A16 0,018 0,15 0,12 0,215 0,65 0,330 0,025 0,05 0,5
M4 0,012 0,1 0,125 0,15 0,45 0,333 0,015 0,035 0,428
X8 0,01 0,085 0,117 0,14 0,4 0,35 0,015 0,03 0,5
T
Al12 0,01 0,15 0,066 0,14 0,75 0,186 0,015 0,06 0,25
Al15 0,015 0,125 0,12 0,165 0,6 0,275 0,017 0,045 0,38
Al16 0,01 0,13 0,076 0,15 0,6 0,25 0,015 0,045 0,333
T
FP35 0,01 0,125 0,08 0,125 0,5 0,25 0,015 0,04 0,375
FP34 0,011 0,09 0,122 0,135 0,425 0,317 0,015 0,032 0,468
FP36 0,01 0,115 0,086 0,12 0,55 0,218 0,0125 0,04 0,3125
T
M8 0,015 0,075 0,2 0,17 0,3 0,566 0,02 0,025 0,8
T
A3 0,015 0,4 0,0375 0,165 1,75 0,094 0,02 0,115 0,173
T
B33 0,015 0,175 0,085 0,17 0,85 0,2 0,021 0,065 0,323
T
F23 0,008 0,095 0,089 0,1 0,4 0,25 0,01 0,035 0,285
T
R22 0,01 0,065 0,153 0,125 0.,3 0,416 0,013 0,025 0,52
T
F32 0,008 0,055 0,154 0,1 0,25 0,4 0,015 0,02 0,75
B35 0,015 0,15 0,1 0,2 0,75 0,266 0,025 0,06 0,416
* EPS: g EPS/100 ml; PSC: g PSC/100 ml; Rendimiento: g EPS/g PSC

A 32ºC tiene lugar la máxima producción de biopolímero para todas las cepas (Tabla 14),
temperatura a la cual se presenta también su óptimo de crecimiento, de ahí que se obtenga el máximo de
producción de biomasa celular. Estos resultados no concuerdan con los de muchos autores, que
mantienen que la máxima producción de exopolisacárido se produce a temperaturas por debajo del
óptimo para el crecimiento celular, como ocurre con muchas bacterias del ácido láctico o con diversos
microorganismos aislados del Antártico. A temperaturas subóptimas para el crecimiento, la división celular
está menos favorecida, y hay más precursores activados disponibles para la síntesis de exopolisacárido
(Kimmel y col., 1998; Mancuso-Nichols y col., 2005a).

156
Optimización de la producción

En cuanto a la agitación, se ha detectado una mayor producción de EPS en agitación que en


reposo (Tabla 15), ya que nuestras bacterias son aerobias; el óptimo lo encontramos a 100 rpm; a 200
rpm, aunque se produce más EPS que sin agitación, la producción disminuye, igual que se ha descrito
para, por ejemplo, el gelano (Dreveton y col., 1994).

Tabla 15. Efecto de la agitación de los cultivos sobre la producción de exopolisacárido y la biomasa
celular.

Agitación (rpm)

Reposo 100 200


CEPA

EPS* Biomasa* Rendimiento* EPS Biomasa Rendimiento EPS Biomasa Rendimiento

X2 0,085 2 0,0425 0,4095 3,015 0,135 0,2 3 0,066


B40 0,065 0,95 0,068 0,335 1,38 0,242 0,165 1,3 0,126
B100 0,055 1,45 0,0375 0,275 2,05 0,134 0,14 2 0,07
N12 0,045 2,05 0,021 0,205 3 0,068 0,1 2,75 0,036
A16 0,045 0,45 0,1 0,215 0,65 0,330 0,105 0,7 0,150
M4 0,03 0,3 0,1 0,15 0,45 0,333 0,075 0,425 0,176
X8 0,025 0,275 0,09 0,14 0,4 0,35 0,07 0,385 0,181
T
Al12 0,03 0,6 0,05 0,14 0,75 0,186 0,07 0,7 0,1
Al15 0,035 0,4 0,0875 0,165 0,6 0,275 0,085 0,625 0,136
Al16 0,035 0,425 0,082 0,15 0,6 0,25 0,075 0,555 0,135
T
FP35 0,025 0,345 0,072 0,125 0,5 0,25 0,065 0,49 0,132
FP34 0,03 0,285 0,105 0,135 0,425 0,317 0,07 0,4 0,175
FP36 0,025 0,385 0,065 0,12 0,57 0,210 0,055 0,555 0,099
T
M8 0,035 0,2 0,175 0,17 0,3 0,566 0,085 0,285 0,298
T
A3 0,035 1,15 0,030 0,175 1,75 0,1 0,09 1,6 0,056
T
B33 0,035 0,55 0,063 0,17 0,85 0,2 0,082 0,8 0,1025
T
F23 0,025 0,275 0,090 0,1 0,4 0,25 0,052 0,35 0,148
T
R22 0,025 0,2 0,125 0,125 0,3 0,416 0,07 0,275 0,254
T
F32 0,02 0,17 0,117 0,1 0,25 0,4 0,048 0,225 0,213
B35 0,045 0,425 0,105 0,2 0,7 0,285 0,105 0,6 0,175
* EPS: g EPS/100 ml; PSC: g PSC/100 ml; Rendimiento: g EPS/g PSC

Como conclusión de este apartado, podemos decir que a pesar de la diversidad de los
microorganismos estudiados en este trabajo, el comportamiento que presentan a la hora de sintetizar
exopolisacáridos bajo diversas condiciones es muy similar, lo que podría estar relacionado con un
metabolismo y fisiología comunes; así, por ejemplo, todas las cepas muestran una producción de
exopolisacárido parcialmente asociada al crecimiento celular, pues como ya hemos comentado, si bien la
síntesis comienza en la fase exponencial de crecimiento, alcanza su máximo durante la fase de
crecimiento estacionario. De la misma manera, todos los microorganismos estudiados son capaces de

157
Resultados y Discusión

crecer y producir su exopolisacárido sobre todas los sustratos ensayados, e incluso sin un aporte directo
de azúcar, lo que podría tener interesantes implicaciones a la hora de la obtención industrial de los EPS.
Además, en todos los casos los máximos de producción se alcanzaron a 32ºC y a 100 rpm. En general,
hay que destacar que las condiciones que condujeron a una mayor producción de biopolímero fueron las
mismas que permitieron el mejor crecimiento de los microorganismos, aunque hemos detectado algunas
excepciones; como ya hemos comentado, alguno autores mantienen que la síntesis de EPS es un
proceso que tiene requerimientos nutricionales distintos (Petronella y Hugenholtz, 1999; Davey y Amos,
2001; Cheirslip y col., 2001), aunque en otros muchos casos, la máxima producción de polímero coincide
con las condiciones óptimas de crecimiento, como ocurre por ejemplo con algunas bacterias del ácido
láctico (De Vuyst y col., 1998).

158
Composición química y Masa Molecular

CAPÍTULO 2

COMPOSICIÓN QUÍMICA Y MASA MOLECULAR DE LOS EXOPOLISACÁRIDOS

RESUMEN

Todos los polímeros estudiados son heteropolisacáridos, constituidos fundamentalmente


por carbohidratos, aunque con diversos sustituyentes orgánicos en su composición, como restos
acetilo, restos piruvato, hexosaminas y proteínas, además de una importante fracción inorgánica
dada fundamentalmente por los grupos sulfato, poco frecuentes entre los EPS microbianos, y que
podrían conferir a los polímeros que los poseen importantes propiedades biológicas. Todos los
EPS presentan un marcado carácter aniónico, y están constituidos por una sola fracción, a
excepción de los polisacáridos Al15 de Halomonas ventosae, M8 de Halomonas almeriensis, F23
de Idiomarina fontislapidosi y R22 de Idiomarina ramblicola, que presentan dos fracciones
polisacarídicas de distinta composición en monosacáridos y masa molecular. El análisis por GLC
y GC-MS de los exopolisacáridos purificados reveló la presencia de nueve azúcares: glucosa,
manosa, galactosa, ramnosa, fucosa, arabinosa, xilosa, ácido galacturónico y ácido glucurónico,
siendo la glucosa y la manosa los monosacáridos más frecuentes y que se detectaron en mayor
proporción. Los exopolisacáridos N12 y A16 de Halomonas maura y A3 de Salipiger mucosus,
presentan en su composición importantes cantidades de fucosa, un azúcar muy interesante desde
el punto de vista biotecnológico, y el polímero F32 de Alteromonas hispanica presenta una
importante proporción de xilosa, un monómero muy inusual entre los EPS microbianos. Los
resultados obtenidos en la determinación de la masa molecular se encuentran en concordancia
con la masa molecular de otros polímeros descritos.

159
Resultados y Discusión

2.1. Análisis colorimétricos. Determinación de cenizas

El contenido en carbohidratos, proteínas, ácidos urónicos, restos acetilo, pirúvico, hexosaminas y


cenizas de los exopolisacáridos se recoge en la Tabla 16. Los resultados son la media de tres
determinaciones, y están expresados en porcentaje en función del peso seco total de polímero.

Tabla 16. Composición química de los exopolisacáridos obtenidos en condiciones óptimas. Los
carbohidratos, proteínas, ácidos urónicos, restos acetilo, restos piruvato y hexosaminas fueron
determinados por análisis colorimétricos. Las cenizas fueron determinadas por gravimetría tras
calentamiento a 550ºC durante 6 horas. Los fosfatos y sulfatos se determinaron por cromatografía iónica
en los polímeros purificados.

Composición química (% p/p)


EPS
CH* Prot Uro Acet Pir Hex Cenizas Sulfatos Fosfatos
H. maura X2 30,4 3,3 7,85 3,6 2,1 2,4 20 1,45 0,25
H. maura B40 30,05 1,7 4,95 2,7 2,2 2,2 19 0,9 0,15
H. maura B100 33,2 1,65 4,1 0,25 2,7 2,4 16,5 7,9 0,25
H. maura N12 30,4 1,05 1,65 1,95 2,15 2,8 18,5 2,45 0,35
H. maura A16 38,95 0,75 4,95 1,65 2,4 2,8 20 1,35 0,3
H. eurihalina M4 38,05 0,75 3,9 1,95 2,5 2,4 17,5 0,95 0,25
H. eurihalina X8 44,85 0,95 6,4 2,6 2,3 2,6 18 0,9 0,2
H. ventosae Al12 30 3,05 2,85 1,4 1 2,8 16,25 1,1 ND
H. ventosae Al15 37,5 4,65 4,85 2,4 2,1 2,6 24,5 1,2 ND
H. ventosae Al16 30,8 3,95 4,4 1,5 2,3 2,8 14,5 0,7 ND
H. anticariensis FP35 35,5 0,3 2,85 1,55 2,7 2,9 16,4 0,75 0,2
H. anticariensis FP34 30 3,5 2,4 0,75 2,3 2,4 24,5 2,25 0,4
H. anticariensis FP36 33,7 0,4 2,7 2,05 2 2,4 14,5 1,5 0,15
H. almeriensis M8 30,55 1,1 2,85 0,8 2 2,4 19,5 1,45 0,15
S. mucosus A3 53,15 1,65 2,85 0,9 5,95 1,9 15,5 0,95 0,15
P. marisminoris B33 55 1,5 4,5 1,2 2,95 2,8 20 0,35 ND
I. fontislapidosi F23 50,85 0,8 4,3 1,85 1,5 2 18 0,65 ND
I. ramblicola R22 56,5 0,8 3,95 1,15 1,8 1,9 19,5 0,5 ND
A. hipanica F32 76,5 0,25 4,3 3,3 2,15 2,2 16,5 0,25 ND
Alteromonas spp. B35 53,1 2,75 3,95 2,2 2,2 1,8 14,5 1,1 ND
*, CH: Carbohidratos, Prot: Proteínas, Uro: Ácidos urónicos; Acet: Restos acetilo; Pir: Pirúvico; Hex: Hexosaminas;
ND: No detectado.

Todos los EPS estudiados son heteropolisacáridos (Tabla 17) compuestos mayoritariamente por
carbohidratos, aunque en su composición química también nos encontramos diferentes sustituyentes
orgánicos como restos acetilo, pirúvico, hexosaminas y proteínas, así como una fracción inorgánica
constituida por los restos sulfato y fosfato, sobre la que profundizaremos en el apartado 2.3 de este
mismo capítulo de Resultados y Discusión.

En cuanto al contenido en proteínas, se han detectado porcentajes que oscilan entre un 0,25 y
un 4,65% (p/p). El método de extracción de los exopolisacáridos empleado en este trabajo (Quesada y
col., 1993), incluye en sus últimas etapas la purificación de los EPS por ultracentrifugación y diálisis. Este

160
Composición química y Masa Molecular

último paso permite obtener un producto más purificado ya que las proteínas presentes en el polímero
generalmente son impurezas procedentes del medio de cultivo o de restos citoplasmáticos que fácilmente
son arrastradas durante la extracción del exopolisacárido y que pueden ser eliminados, en gran medida,
mediante el proceso de ultracentrifugación. Por tanto, en principio tenemos que pensar que el contenido
en proteínas detectado por el método de Bradford (1976) en los exopolisacáridos representa en su mayor
parte proteínas que forman parte del exopolisacárido, que están unidas al mismo, aunque para realizar
esta afirmación con rotundidad, habría que realizar estudios estructurales más profundos. El contenido
proteico de los exopolisacáridos puede desempeñar un papel fundamental en la actividad emulgente de
los polímeros, como ha sido descrito para otros exopolisacáridos (Navon-Venezia y col., 1995; 1998;
Shepherd y col., 1995; Toren y col., 2001; 2002a; 2002b). Este aspecto ha sido estudiado con mayor
profundidad en el Capítulo 2 de la Sección III (Estudio de las propiedades emulgentes de los
exopolisacáridos) de Resultados y Discusión, concretamente para los exopolisacáridos Al12 y Al16
producidos por Halomonas ventosae, polímeros que presentaron altos valores de proteínas en su
composición química comparados con el resto de EPS estudiados, y cuyas soluciones acuosas
presentaron una baja viscosidad (Sección III, Capítulo 1, apartado 1.1. Viscosidad de las preparaciones
acuosas de los exopolisacáridos), por lo que su papel como bioemulgentes podría atribuirse a su fracción
proteica, más a que a la estabilización de la mezclas agua-aceite por un aumento de la viscosidad.

Con respecto a los ácidos urónicos, hemos detectado en los EPS porcentajes que oscilan entre
1,65 y 7,85% (p/p); estos grupos confieren un carácter aniónico a los polímeros, lo cual es una propiedad
deseable, y es que los hace interesantes desde el punto de vista biotecnológico al ser potencialmente
aplicables en procesos de detoxificación de medios ambientes contaminados con metales pesados o en el
tratamiento de aguas residuales (Geddie y Sutherland, 1993; de Philippis and Vicenzini 1998; Sutherland,
1994). Este aspecto se tratará con mayor detalle en el capítulo 3 de la Sección III (Estudio de la captación
de metales pesados) de Resultados y Discusión. La presencia de ácidos urónicos puede ser responsable
de que no se hayan obtenido para la mayoría de los polímeros porcentajes de carbohidratos muy
elevados, tal y como se ha descrito para otros exopolisacáridos, pues los ácidos urónicos confieren al
EPS una mayor resistencia a la hidrólisis ácida con H2SO4 y se impide en ocasiones que la determinación
de carbohidratos se lleve a cabo de forma correcta (Pfiffner y col., 1983).

El contenido en restos acetilo fue en general bajo, detectamos porcentajes comprendidos entre
0,25 y 3,6% (p/p), como ya se había comprobado para otros polímeros producidos por Halomonas maura
(Bouchotroch y col., 2000; Arias y col., 2003) y otras especies de Halomonas (Béjar y col., 1996; 1998).
La presencia de grupos acetilo confiere carácter hidrófobo a los exopolisacáridos que los contienen, lo
que puede contribuir a su potencial actividad emulgente, como Ashtaputre y Shah (1995) han descrito
para un polímero sintetizado por Sphingomonas paucimobilis. Además, el efecto de los grupos acetilo
sobre las propiedades físicas de los exopolisacáridos está bien documentado. Así, además de afectar a
las propiedades gelificantes de determinados polímeros como alginatos o gelano (Skjak-Braek y col.,

161
Resultados y Discusión

1988; Chandrasekaran y Thailambal, 1990), también afectan a la unión de iones metálicos con polímeros
como los alginatos bacterianos (Geddie, 1992).

En general, los polisacáridos presentaron un bajo porcentaje en restos piruvato (entre 1 y


5,95% p/p), constituyentes que también contribuyen a la carga neta negativa de las moléculas de
polisacárido. La presencia de estos grupos es determinante de las propiedades reológicas del xantano.
Concretamente, parece ser que un elevado grado de piruvatación origina soluciones de mayor viscosidad
y de mayor termoestabilidad (Capron y col., 1998). Sin embargo, también se ha descrito que los grupos
piruvato inestabilizan el estado ordenado de las cadenas de xantano, debido a las repulsiones
electrostáticas existentes entre ellos (Gamini y col., 1991).

Un considerable porcentaje de los polímeros fue cuantificado como cenizas. Posiblemente esto
se debe a la presencia de compuestos inorgánicos unidos al EPS, tal y como ocurre con algunos
exopolisacáridos de Halomonas eurihalina y el maurano, producido por Halomonas maura cepa S30
(Béjar y col., 1998; Arias y col., 2003) u otras bacterias (Raguenes y col., 1996). En cualquier caso,
descartamos la contaminación por parte de las sales que presenta el medio de cultivo, pues el polímero
fue adecuadamente dializado en agua destilada durante tres días, cambiándose el agua cada 12 horas.

2.2. Purificación por cromatografía de intercambio aniónico

La purificación de los exopolisacáridos mediante cromatografía de intercambio iónico se llevó a


cabo para obtener la fracción de carbohidratos purificada, con un contenido mínimo de proteínas (sólo
aquellas realmente unidas al EPS) y de otras impurezas (restos celulares) que pudieran interferir en el
posterior análisis de los azúcares constituyentes del exopolisacárido y en la determinación del contenido
en sulfatos y fosfatos.

Además, mediante purificación de los exopolisacáridos por cromatografía, pudimos determinar si


nos encontrábamos en cada caso ante un único polímero o por el contrario se trataba de una mezcla de
varios EPS.

Dada la presencia de constituyentes del exopolisacárido con carga negativa, se seleccionó como
método de purificación la cromatografía de intercambio iónico. Para ello se utilizó como soporte sólido una
columna de sefarosa de intercambio aniónico con una matriz cargada positivamente, por la presencia de
moléculas de dietilaminoetil (DEAE+ ). La atracción electrostática permite la adhesión de las moléculas de
polímero a la matriz, siendo más tarde desplazadas mediante un incremento de la fuerza iónica en la fase
móvil empleada.

162
Composición química y Masa Molecular

La selección de los tampones que constituirían la fase móvil se realizó en función del tipo de
columna que utilizamos, la carga de la matriz sólida así como el pH idóneo para el proceso. El pH al que
trabajamos fue 7,5, puesto que en estudios llevados a cabo con anterioridad se había comprobado que
este pH origina una mayor ionización de los polímeros anteriormente descritos por nuestro Grupo de
Investigación, lo que permitía su mayor adhesión a la matriz sólida (Bouchotroch y col., 2000; Arias y col.,
2003).

EPS Al15 EPS M8T


1,6 0,8

1,4 0,7

1,2 0,6
DO a 490 nm

DO 490 nm
1 0,5

0,8 0,4

0,6 0,3

0,4 0,2

0,2 0,1

0 0
0 10 20 30 40 50 60 70 0 10 20 30 40 50 60 70

Fracciones Fracciones

EPS F23T EPS R22T


1,6 1,4

1,4 1,2

1,2 1
DO a 490 nm
DO a 490 nm

1
0,8
0,8
0,6
0,6
0,4
0,4
0,2
0,2
0
0
0 10 20 30 40 50 60 70
0 10 20 30 40 50 60 70
Fracciones
Fracciones

Figura 106. Cromatogramas obtenidos en la purificación de los exopolisacáridos Al15 de Halomonas ventosae, M8 de
Halomonas almeriensis, F23 de Idiomarina fontislapidosi y R22 de Idiomarina ramblicola, a un gradiente de elución de
0-1,5 M de NaCl.

Tras varias experiencias, podemos afirmar que todos los exopolisacáridos ensayados, a
excepción de los EPS Al15 de Halomonas ventosae, M8 de Halomonas almeriensis, F23 de Idiomarina

163
Resultados y Discusión

fontislapidosi y R22 de Idiomarina ramblicola, son un único polímero de naturaleza ácida que eluyen a
una concentración de NaCl en torno a 1 M. Tal y como puede comprobarse en los cromatogramas
representados en la Figura 106, para los exopolisacáridos mencionados como excepciones, obtuvimos
dos picos correspondientes a las fracciones con mayor contenido en carbohidratos y con ello mayor
concentración de exopolisacárido, resultado que se repitió en todos los ensayos que realizamos.
Lactobacillus plantarum EP56 produce dos tipos de EPS, uno que está unido a la célula y otro que es
liberado al medio de cultivo; este último también está constituido por dos fracciones (Tallon y col., 2003).

En la purificación por cromatografía de intercambio iónico de los polímeros producidos por


Halomonas eurihalina, la mayor parte de los EPS eluyen a una fuerza iónica mucho menor (0,1M de
NaCl); por tanto la elución a 1 M de NaCl es indicativa del marcado carácter ácido de nuestros
exopolisacáridos, al igual que ocurre con el maurano, exopolisacárido sintetizado por Halomonas maura
S30 (Arias y col., 2003).

La mayor parte de los exopolisacáridos de naturaleza ácida descritos y que han sido purificados
mediante esta técnica cromatográfica, eluyen a una fuerza iónica comprendida entre 0,2 y 0,6 M de NaCl.
Entre ellos podemos citar a los EPS producidos por distintas especies de Pseudomonas de origen marino
(Christensen y col., 1985), o los polímeros sintetizados por especies fitopatógenas como Pseudomonas
marginalis (Osman y Fett, 1989) o Burkholderia cepacia (Cérantola y col., 1996; Linker y col., 2001).

2.3. Sulfatos y fosfatos

Todos los exopolisacáridos analizados en este trabajo presentaron en su composición cantidades


mayores o menores de grupos sulfato, como puede apreciarse en la Tabla 16.

En general, los sulfatos son componentes inusuales de los EPS microbianos, y este hecho
convierte a estos exopolisacáridos en compuestos muy singulares desde el punto de vista químico.

La presencia de grupos sulfato en nuestros exopolisacáridos es una característica compartida


con la mayoría de polisacáridos producidos por distintas cepas de Halomonas eurihalina. Los polímeros
V2-7 y H96, de mayor interés biotecnológico por sus propiedades físicas, presentaron un porcentaje de
sulfatos del 11,5 y 12% (p/p), respectivamente, en medio complejo MY. Hay que destacar el EPS
producido por la cepa H28 de esta especie, en el que se detectó el mayor contenido de sulfatos (24,7%
p/p) (Béjar y col., 1998; Calvo y col., 1998). De igual manera, el maurano, sintetizado por Halomonas
maura cepa S30, presenta en su composición química un 6,5% (p/v) de grupos sulfato.

Los polímeros producidos por distintas especies del género Halomonas y por otros géneros
relacionados no representan la única excepción en cuanto a la detección de sulfatos. Se han descrito
otros polisacáridos producidos por algunas bacterias marinas, arqueas, o microorganismos aislados de

164
Composición química y Masa Molecular

ambientes hipersalinos que presentan esta propiedad (de Philippis y Vincenzini, 1998). Entre ellos
podemos citar el EPS producido por Haloferax mediterranei (Antón y col., 1988), los polímeros de distintas
especies de Arthrobacter (Inoue y col., 1988), los producidos por diversas bacterias marinas (Guezennec
y col., 1994; Rougeaux y col., 1998; 1999) o los sintetizados por bacterias pertenecientes a distintos
grupos taxonómicos aisladas del Antártico (Mancuso-Nichols y col., 2005b).

En algunos polisacáridos de cianobacterias también se han detectado cantidades significativas


de residuos sulfato (Bar-Or y Shilo, 1987; Tease y Walker, 1987). El porcentaje descrito, concretamente
para la cianobacteria halófila Aphanocapsa halophytia es del 12% (p/p) (Sudo y col., 1995), muy similar a
los porcentajes descritos para los EPS producidos por las cepas F2-7 y H96 de H. eurihalina.

Los exopolisacáridos sulfatados presentan propiedades biológicas muy interesantes. La similitud


de estos EPS con la heparina debido su carácter sulfatado puede convertirlos en potenciales agentes
anticoagulantes y antitrombóticos, teniendo en cuenta que los grupos sulfato desempeñan un papel crítico
en la actividad antitrombótica de la heparina (Lindahl, 1999). A este nivel, y debido a que la heparina
presenta algunas limitaciones farmacocinéticas y biofísicas, se han intentado desarrollar nuevos
anticoagulantes y antitrombóticos entre los que han encontrado aplicación los polímeros microbianos
sulfatados. Existen varios estudios al respecto que han demostrado la actividad de diversos exopolímeros
(Colliec-Jouault y col., 2001) e incluso otros en los que se realiza una sulfatación de los EPS para mejorar
sus propiedades (Guezennec y col., 1998).

Por otra parte, los polímeros sulfatados pueden interferir en la adsorción y penetración de
determinados retrovirus. Es por ello que pueden ser empleados como antivirales (Nakashima y col., 1987;
Bagasa y Lischner, 1988; Hasui y col., 1995; Hayashi y Hayashi, 1996; Hayashi y col., 1996; Witvrouw y
de Clercq, 1997; Cáceres y col., 2000; Yim y col., 2004). En estos polímeros se ha puesto de manifiesto,
de igual forma, una acción antitumoral (Itoh y col., 1993; Riou y col., 1996; Haroun-Bouhedja y col., 2000;
Sogawa y col., 2000; Patel y col., 2002; Koyanagi y col., 2003; Matou y col., 2005). Otras actividades
descritas para los exopolisacáridos sulfatados son: antiadhesiva (Ley y col., 1991), antiinflamatoria (Afors
y Ley., 1993), de inhibición del sistema del complemento (Boisson-Vidal y col., 1995) y contra la malaria
(Xiao y col., 1996; Andrews y col., 2005; Adams y col., 2005).

En el capítulo 4 de la Sección III (Actividad antiproliferativa sobre células tumorales de EPS


sulfatados) de Resultados y Discusión, en base a estos antecedentes, hemos estudiado la actividad
antitumoral de los exopolisacáridos con mayor contenido en grupos sulfato (véase Tabla 16): B100 y N12
de Halomonas maura y FP34 de Halomonas anticariensis, en los que se detectó por cromatografía iónica
un 7,9, 2,45 y 2,25% (p/p) de grupos sulfato.

En muchos de los exopolisacáridos estudiados observamos la presencia de fosfatos en


porcentajes diversos, como puede apreciarse en la Tabla 16. No es muy común la existencia de estos

165
Resultados y Discusión

sustituyentes inorgánicos en los exopolisacáridos producidos por bacterias Gram negativas (Sutherland,
1990), aunque se han encontrado en otros polímeros microbianos (Kitazawa y col., 1998; 2000; Robjin y
col., 1995; 1996), y por ello ésta puede ser otra característica peculiar desde el punto de vista químico
para estos exopolisacáridos. Estos sustituyentes inorgánicos contribuyen a la naturaleza ácida de los
polímeros junto con los ácidos urónicos, restos piruvato y los restos sulfato. Además, estos grupos
funcionales pueden conferir a los exopolisacáridos que los contienen importantes e interesantes
propiedades, y es que se ha demostrado que la activación de los linfocitos (Kitazawa y col., 2000;
Nishimura y col., 2003) y algunos procesos antitumorales requieren de la presencia de restos fosfato
(Ebina y col., 1995).

2.4. Monosacáridos constituyentes de los EPS

En la Tabla 17 se muestran los monosacáridos detectados en los distintos exopolisacáridos


obtenidos en condiciones de cultivo óptimas (véase Sección II, Capítulo 1. Optimización de la producción
de los exopolisacáridos), así como los porcentajes de cada uno de ellos.

Tabla 17. Masa molecular (Da) y monosacáridos constituyentes (% p/p) de los exopolisacáridos.

Masa Monosacáridos (% p/p)


EPS Molecular
(Da) Glua Man Gal Ram Fuc Ara Xil AGal AGlc
5
X2 1,75 x 10 45,1 17,65 NDb ND ND ND ND 19,6 17,65
5
B40 3 x 10 82,8 17,2 ND ND ND ND ND ND ND
5
B100 3,75 x 10 44,5 15 40,5 ND ND ND ND ND ND
5
N12 2,1 x 10 48,82 25,47 ND ND 25,69 ND ND ND ND
5
A16 3,1 x 10 38,87 19,8 25,3 ND 16 ND ND ND ND
6
M4 1,5 x 10 50 25 25 ND ND ND ND ND ND
5
X8 4,5 x 10 62,5 35,65 ND 1,85 ND ND ND ND ND
4
Al12 5,3 x 10 23,8 55,9 13,8 ND ND 2,4 4 ND ND
Ac 6,5 x 10
5
37 35,7 17,4 ND 9,8 ND ND ND ND
Al15 4
B 2 x 10 40 45 15 ND ND ND ND ND ND
4
Al16 5,25 x 10 23,65 56,65 12,6 ND ND 2,75 4,3 ND ND
4
FP35 2 x 10 15 45 ND 1,5 ND ND 1,5 37 ND
4
FP34 5,3 x 10 14,6 59,95 ND 1,15 ND ND 1,35 22,95 ND
4
FP36 4,6 x 10 17 42,9 ND 1,15 ND ND 1,5 37,5 ND
6
A 6,3 x 10 27,5 72 ND 0,5 ND ND ND ND ND
M8 4
B 1,5 x 10 30 70 ND ND ND ND ND ND ND
5
A3 2,5 x 10 19,7 34 32,85 ND 13,4 ND ND ND ND
6
B33 7,2 x 10 60 26,5 ND ND ND ND ND 13,5 ND
6
A 1,5 x 10 28,25 46,35 14,85 ND 2,5 3 5 ND ND
F23 4
B 1,5 x 10 40 60 20 ND ND ND ND ND ND
5
A 5,5 x 10 25 68,2 ND 6,8 ND ND ND ND ND
R22 4
B 2 x 10 18,9 53,6 ND 0,65 ND ND 0,85 25,95 ND
7
F32 1,9 x 10 18,15 62,75 ND 6,85 ND ND 12,25 ND ND
6
B35 1,9 x 10 60 26,5 ND 13,5 ND ND ND ND ND
a
, Glu: Glucosa, Man: Manosa, Gal: Galactosa, Ram: Ramnosa, Fuc: Fucosa, Ara: Arabinosa, Xil: Xilosa, AGal: Ácido
galacturónico, AGlc: Ácido glucurónico.
b
, ND: No detectado.
c
, A: Alto peso molecular, B: Bajo peso molecular.

166
Composición química y Masa Molecular

El análisis por GLC y GC-MS de los exopolisacáridos purificados reveló la presencia de nueve
azúcares: glucosa, manosa, galactosa, ramnosa, fucosa, arabinosa, xilosa, ácido galacturónico y ácido
glucurónico. Estos mismos monosacáridos fueron detectados en los polisacáridos producidos en
condiciones no óptimas de cultivo, aunque en proporciones diferentes. En los polímeros producidos por
Halomonas eurihalina y Halomonas maura tampoco se encontraron diferencias en cuanto a la
composición de monosacáridos en función del medio de cultivo empleado, aunque sí se produjo una
modificación en cuanto a la cantidad relativa de los monosacáridos (Béjar y col., 1996; 1998; Bouchotroch
y col., 2000; Arias y col., 2003).

Además de en los polímeros producidos por Halomonas, se ha comprobado que las


proporciones de los distintos monómeros azucarados varían con las condiciones de cultivo en otros EPS
producidos por distintas cepas de Lactobacillus (Van Geel-Schutten y col., 1998, 1999). Tallon y
colaboradores (2003) comprobaron también que los monosacáridos constituyentes de los
exopolisacáridos producidos por Lactobacillus plantarum EP56 no variaban al modificar las condiciones
de producción.

Así, generalmente, las condiciones de fermentación no afectan al tipo de azúcares de los


exopolisacáridos microbianos, aunque influyen de forma importante en su conformación final, masa
molecular, grado de sustitución y proporción de los distintos monosacáridos constituyentes (Orgambide y
col., 1991; Sutherland, 1994).

La glucosa fue el monómero más abundante en los exopolisacáridos X2, B40, B100, N12, A16,
M4, X8, B33 y B35, como puede apreciarse en la Tabla 17, mientras que para el resto de polímeros el
monosacárido que detectamos en mayor cantidad fue la manosa. La xilosa (las pentosas en general) y la
arabinosa son azúcares poco frecuentes en los exopolisacáridos microbianos (Kenne y Lindberg, 1983;
Sutherland, 1994), aunque nosotros los hemos encontrado en muchos de nuestros EPS, normalmente
como trazas, excepto en el exopolisacárido F32 sintetizado por Alteromonas hispanica, que presenta un
12,25% (p/p) de xilosa en su composición, y por ello ésta puede ser una característica peculiar desde el
punto de vista químico para este biopolímero. Sin embargo, el polímero sintetizado por la cepa B35 de
T
Alteromonas spp., muy íntimamente relacionada taxonómicamente con Alteromonas hispanica cepa F32 ,
no presenta este monosacárido formando parte del polímero. Este hecho también fue descrito por
Mancuso-Nichols y colaboradores (2005) para un grupo de cepas marinas aisladas del Antártico. El ácido
glucurónico es relativamente frecuente en los exopolisacáridos microbianos, mientras que el ácido
galacturónico se detecta en muchas menos ocasiones (Sutherland, 1994). Sin embargo, en nuestros
exopolisacáridos el análisis de los monosacáridos por cromatografía gaseosa ha relevado una mayor
presencia de ácido galacturónico, mientras que el ácido glucurónico sólo lo hemos encontrado formando
parte del EPS X2 sintetizado por Halomonas maura.

167
Resultados y Discusión

En el apartado 3.12 de la Introducción de este trabajo (Aplicaciones de los exopolisacáridos


microbianos), ya hemos hablado de las potenciales aplicaciones de los polímeros extraídos de algunos
microorganismos como fuente de fucosa, un azúcar poco habitual, de difícil y cara obtención, y con
múltiples aplicaciones. El análisis por GLC y GC-MS de los EPS reveló la presencia de este monosacárido
en proporciones importantes en la composición de los polímeros N12 y A16 de Halomonas maura (25,69
y 16% p/p, respectivamente) y A3 de Salipiger mucosus (13,4% p/p), y en menores cantidades en las
fracciones de elevado peso molecular de los polisacáridos Al15 de Halomonas ventosae y F23 de
Idiomarina fontislapidosi. Más adelante, en el Capítulo 5 de la Sección III, profundizaremos en las
posibilidades de nuestros EPS microbianos como fuente de fucosa.

Como ya hemos mencionado en el apartado 2.2. (Purificación por cromatografía de intercambio


aniónico) de este capítulo de Resultados y Discusión, los exopolisacáridos Al15 de Halomonas ventosae,
M8 de Halomonas almeriensis, F23 de Idiomarina fontislapidosi y R22 de Idiomarina ramblicola, están
constituidos por dos fracciones polisacarídicas, cada una de las cuales presenta distinta composición en
monosacáridos (Tabla 17), fenómeno que también ha sido descrito para otros microorganismos (Tallon y
col., 2003; Degeest y De Vuyst, 1999; Grobben y col., 1997; Kitazawa y col., 1998; Marshall y col., 1995)
que también presentaban una gran heterogeneidad en la síntesis de EPS en cuanto a composición
química y masa molecular.

2.5. Masa molecular

La masa molecular para un determinado exopolisacárido puede variar en función de las


condiciones de cultivo así como del método de aislamiento y purificación del polímero (De Vuyst y
Degeest, 1999). La masa molecular de los exopolisacáridos obtenidos en condiciones óptimas (véase
Capítulo II. Optimización de la producción de los exopolisacáridos) y extraídos por el método de Quesada
y colaboradores (1993) se detalla en la Tabla 17.

Los resultados obtenidos se encuentran en concordancia con la masa molecular de otros


polímeros descritos, y es que los valores de la masa molecular de los biopolímeros de origen microbiano
3 7
están comprendidos entre 1x10 y 5x10 Da (Sutherland, 1994; Lapasin y Pricl, 1995).

Por otra parte, en una misma especie bacteriana, los polímeros producidos por las distintas
cepas pueden presentar masas moleculares diferentes. Este hecho se ha puesto de manifiesto entre la
mayoría de exopolisacáridos ya conocidos como el escleroglucano, pululano, xantano (Sutherland, 1994)
o el polímero producido por Enterobacter cloacae (Isobe y col., 2001). Este fenómeno también se pone de
manifiesto entre nuestros exopolisacáridos, como podemos observar en la Tabla 17. Mancuso-Nichols y
colaboradores (2005) también han descrito polímeros con diferente masa molecular producidos en las
mismas condiciones por microorganismos marinos muy relacionados taxonómicamente aislados del
Antártico.

168
Composición química y Masa Molecular

La masa molecular es determinante de las propiedades físicas de los exopolisacáridos, y sobre


todo, de la viscosidad de sus soluciones acuosas. La masa molecular de algunos de nuestros
exopolisacáridos podría ser comparable con la de polímeros como el maurano, xantano, gelano, dextrano
o curdlano entre otros (Arias y col., 2003; Looijestein, 2000; Tombs y Harding, 1997), lo que podría
acarrear propiedades funcionales parecidas; por consiguiente, en el apartado correspondiente al estudio
reológico de los exopolisacáridos (Sección III, Capítulo 1), hemos profundizado en las propiedades
reológicas de las soluciones acuosas de estos polímeros; fundamentalmente hemos estudiado la reología
del exopolisacárido B100, cuyas preparaciones dieron valores de viscosidad comparables a los del
maurano o el xantano, posiblemente debido en gran parte a su elevada masa molecular.

El hecho de que un exopolisacárido presente una baja masa molecular (como muchos de los
incluidos en este estudio), y que por tanto de soluciones de baja viscosidad, no tiene por qué considerarse
una desventaja o un problema a la hora de buscar y encontrar potenciales aplicaciones biotecnológicas
para el mismo; de hecho, esta característica es deseada en algunas ocasiones. Así por ejemplo, el
exopolisacárido sintetizado por Alteromonas infernus presenta una gran analogía estructural con la
heparina, por lo que podría utilizarse como sustituto de la misma, debido a las limitaciones que presenta
como agente anticoagulante; sin embargo, presenta el problema de ser un exopolisacárido de alta masa
molecular, que origina soluciones viscosas, por lo que se ha desarrollado un protocolo de hidrólisis del
polímero para obtener fracciones de una menor masa molecular, solventar este inconveniente, y competir
con la heparina (Colliec-Jouault y col., 2001).

169
Estudios de microscopía electrónica

CAPÍTULO 3

ESTUDIOS DE MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA

RESUMEN

La microscopía electrónica de transmisión nos ha permitido observar a los


microorganismos con los que hemos trabajado en esta Tesis Doctoral, así como los
exopolisacáridos producidos por los mismos. Cuando los cultivos son jóvenes, los
exopolisacáridos forman una estructura bastante organizada y adherida a las células; sin
embargo, tras una incubación más prolongada, no se observa EPS adherido a la superficie celular
sino disperso en el medio. Para el exopolisacárido B100 hemos observado una morfología en
doble hélice, estructura similar a la propuesta para otros exopolisacáridos ya descritos.

171
Resultados y Discusión

La observación de las células, así como de los exopolisacáridos producidos por las especies
microbianas estudiadas en este trabajo, se llevó a cabo mediante microscopía electrónica de transmisión
(TEM) en el Centro de Instrumentación Científica de la Universidad de Granada.

En las Figuras 107-116 se muestran las fotografías correspondientes a la observación


microscópica de las células bacterianas cultivadas en medio líquido MY al 7,5% (p/v) en sales de las
T T T T T T T T
cepas B100, M4, Al12 , FP35 , M8 , A3 , B33 , F23 , R22 y F32 .

A B

Figura 107. Fotografías de microscopía electrónica de transmisión de la cepa B100 de Halomonas maura en medio MY
líquido al 7,5% (p/v) de sales tras incubación durante 18-24 (A) y 120 horas (B). Las flechas se encuentran señalando
la disposición del exopolisacárido. Barra: 1 μm.

Figura 108. Fotografía de microscopía electrónica de transmisión de la cepa M4 de Halomonas eurihalina en medio MY
líquido al 7,5% (p/v) de sales tras una incubación de 18-24 horas. La flecha se encuentra señalando la disposición del
exopolisacárido. Barra: 1 μm.

172
Estudios de microscopía electrónica

A B

T
Figura 109. Fotografías de microscopía electrónica de transmisión de la cepa Al12 de Halomonas ventosae en medio
MY líquido al 7,5% (p/v) de sales tras incubación durante 18-24 (A) y 120 horas (B). Las flechas se encuentran
señalando la disposición del exopolisacárido. Barra: 1 μm.

A B

T
Figura 110. Fotografías de microscopía electrónica de transmisión de la cepa FP35 de Halomonas anticariensis en
medio MY líquido al 7,5% (p/v) de sales tras incubación durante 18-24 (A) y 120 horas (B). Las flechas se encuentran
señalando la disposición del exopolisacárido. Barra: 1 μm.

A B

T
Figura 111. Fotografías de microscopía electrónica de transmisión de la cepa M8 de Halomonas almeriensis en medio
MY líquido al 7,5% (p/v) de sales tras incubación durante 18-24 (A) y 120 horas (B). Las flechas se encuentran
señalando la disposición del exopolisacárido. Barra: 1 μm.

173
Resultados y Discusión

T
Figura 112. Fotografía de microscopía electrónica de transmisión de la cepa A3 de Salipiger mucosus en medio MY
líquido al 7,5% (p/v) de sales tras una incubación de 18-24 horas. Las flechas se encuentran señalando la disposición
del exopolisacárido. Barra: 1 μm.

A B

T
Figura 113. Fotografías de microscopía electrónica de transmisión de la cepa B33 de Palleronia marisminoris en
medio MY líquido al 7,5% (p/v) de sales tras incubación durante 18-24 (A) y 120 horas (B). Las flechas se encuentran
señalando la disposición del exopolisacárido. Barra: 1 μm.

174
Estudios de microscopía electrónica

A B

T
Figura 114. Fotografías de microscopía electrónica de transmisión de la cepa F23 de Idiomarina fontislapidosi en
medio MY líquido al 7,5% (p/v) de sales tras incubación durante 18-24 (A) y 120 horas (B). Las flechas se encuentran
señalando la disposición del exopolisacárido. Barra: 1 μm.

A B

T
Figura 115. Fotografías de microscopía electrónica de transmisión de la cepa R22 de Idiomarina ramblicola en medio
MY líquido al 7,5% (p/v) de sales tras incubación durante 18-24 (A) y 120 horas (B). Las flechas se encuentran
señalando la disposición del exopolisacárido. Barra: 1 μm.

175
Resultados y Discusión

T
Figura 116. Fotografía de microscopía electrónica de transmisión de la cepa F32 de Alteromonas hispanica en medio
MY líquido al 7,5% (p/v) de sales tras una incubación de 18-24 horas. Las flechas se encuentran señalando la
disposición del exopolisacárido. Barra: 1 μm.

La diferencia en cuanto a la disposición de los EPS en las células bacterianas es patente entre
las fotografías correspondientes a cultivos de 18-24 horas (A) y aquellas que se corresponden con
cultivos de 120 horas (B).

En medio líquido y tras incubación más prolongada, no se observa polímero alguno adherido a la
superficie celular, sino disperso en el medio. Es por ello que los mayores rendimientos de producción de
estos exopolisacáridos se obtengan tras incubación prolongada de los cultivos, ya que el EPS se
encuentra liberado y por ello su extracción se ve facilitada.

En la Figura 117 se muestra la morfología del exopolisacárido sintetizado por Halomonas maura
cepa B100 suspendido al 1% (p/v) en tampón DNAsa I, para evitar cualquier tipo de contaminación por
ADN que nos pudiera confundir en este ensayo.

La morfología que pudimos observar en el polímero B100 de Halomonas maura fue la de una
doble hélice, estructura similar a lo que muchos autores han propuesto para polímeros como el xantano
(Gamini y col., 1991; Gamini y Mandel, 1994), gelano (Giavasis y col., 2000), escleroglucano (Stokke y
col., 1993) o maurano (Arias y col., 2003).

La base de la conformación molecular y estructura terciaria de los exopolisacáridos microbianos


no se ha explicado totalmente, pero sí se ha comenzado a investigar mediante el estudio de las

176
Estudios de microscopía electrónica

propiedades viscoelásticas de los EPS (Macosko, 1994; Pelletier y col., 2001) así como mediante la
aplicación de diversas técnicas como la difracción de rayos X o dispersión de luz (Sutherland, 1990).

Los resultados que obtuvimos en el estudio de las propiedades viscoelásticas del polímero
sintetizado por H. maura B100, similares a algunas características descritas para el xantano y el maurano,
podían llevarnos a deducir la posible existencia de una estructura o conformación ordenada (véase más
adelante Sección III, Capítulo 1, apartado 1.4. Estudio de las propiedades viscoelásticas. Ensayos de
oscilación). Este estudio microscópico apoyaría dicha suposición y pone de manifiesto la disposición del
exopolisacárido en solución en forma de doble cadena helicoidal.

Por otra parte, la estructura en forma de hélice del polímero B100 de Halomonas maura puede
explicar muchas de sus propiedades reológicas. A partir de 55ºC, la disminución de la viscosidad de sus
preparaciones acuosas (Sección III, Capítulo 1, apartado 1.4, Factores que influyen en la viscosidad del
polímero B100), podría deberse a una desnaturalización térmica que implica la desorganización de la
doble hélice en dos cadenas simples, fenómeno que ya ha sido descrito para otros polímeros como el
xantano (Villain-Simmonet y col., 2000) o el maurano, exopolisacárido producido por Halomonas maura
cepa S30 (Arias y col., 2003).

Para el resto de exopolisacáridos cuya estructura también quisimos estudiar por microscopía
electrónica de transición, uno por especie bacteriana (M4 de Halomonas eurihalina, Al12 de Halomonas
ventosae, FP35 de Halomonas anticariensis, M8 de Halomonas almeriensis, A3 de Salipiger mucosus,
B33 de Palleronia marisminoris, F23 de Idiomarina fontislapidosi, R22 de Idiomarina ramblicola y F32 de
Alteromonas hispanica) no fuimos capaces de detectar con claridad este tipo de estructuras en doble
hélice, y quizás por ello sus propiedades reológicas no son comparables a las del exopolisacárido B100
(apartado V.1. Viscosidad de las preparaciones acuosas).

Figura 117. Fotografía de microscopía electrónica de una solución


acuosa al 1% (p/v) de polímero B100 de Halomonas maura. Barra: 1
μm.

177
SECCIÓN III

POTENCIALES APLICACIONES BIOTECNOLÓGICAS DE LOS EPS


Propiedades reológicas

CAPÍTULO 1

PROPIEDADES REOLÓGICAS DE LOS EXOPOLISACÁRIDOS

RESUMEN

Los EPS estudiados presentan una gran heterogeneidad desde el punto de vista
reológico; los polímeros sintetizados por las cepas de Halomonas maura originan soluciones de
una mayor viscosidad, mientras que el resto de EPS dan soluciones de una viscosidad
sensiblemente inferior, excepto el polímero AL15 de Halomonas ventosae. El polisacárido
producido por la cepa B100 de Halomonas maura presenta un comportamiento comparable al del
xantano y el maurano, y por ello hemos profundizado en sus propiedades reológicas. La
viscosidad que origina este polímero en solución aumenta con la concentración de polímero y
disminuye con la temperatura, aunque esta disminución es termorreversible. La viscosidad de las
soluciones se mantiene estable a pH entre 4 y 8, produciéndose tanto a pH básico como ácido una
ligera caída de la misma. La adición de NaCl a las soluciones de polímero provocó un incremento
de la viscosidad. Del mismo modo, la viscosidad de las soluciones acuosas permanece
prácticamente inalterada frente a factores como la presencia de azúcares, y procesos de
congelación-descongelación y esterilización en autoclave de vapor. El exopolisacárido B100 y la
goma guar, presentan un efecto sinérgico, y es que al combinar ambos polímeros se obtienen
soluciones de mayor viscosidad que cuando estos polímeros se utilizan por separado.

181
Resultados y Discusión

El interés a nivel comercial de los exopolisacáridos reside en una gran cantidad de casos en su
capacidad para modificar las propiedades reológicas de los sistemas acuosos al ser adicionados a ellos.

De hecho, existe un gran número de polisacáridos microbianos interesantes debido a que


presentan propiedades físicas únicas, por lo que son considerados superiores a otras gomas de origen
natural o sintético. Tal es el caso del xantano o el gelano, polímeros que han encontrado diversas
aplicaciones en alimentación y otros sectores industriales (Sutherland, 1999; 2001a). Actualmente el
xantano se sigue considerando como la referencia entre los biopolímeros de origen microbiano, ya que
además de presentar unas excelentes propiedades reológicas, es relativamente económico y rentable en
cuanto a su producción debido al alto grado de conversión (en torno al 60-70%) del sustrato en polímero
(Sutherland, 1999).

Debido a que el éxito comercial del xantano y otros polímeros microbianos viene determinado por
sus propiedades reológicas, el análisis de las mismas en nuevos polímeros es un estudio de gran
importancia que puede conducir al descubrimiento de características realmente novedosas con utilidad en
algunos de los múltiples sectores industriales.

Además, la reología proporciona información de gran valor previa a la comercialización de un


determinado producto, en cuanto al conocimiento de la relación existente entre su estructura y sus
propiedades físicas, su comportamiento en un determinado proceso industrial o su textura una vez
integrado en el producto final (Moreno y col., 2000).

El estudio reológico llevado a cabo en la presente Tesis doctoral se ha desarrollado en dos


partes; en primer lugar hemos determinado la viscosidad de las preparaciones acuosas de todos los
exopolisacáridos incluidos en este trabajo, para después profundizar en las propiedades reológicas del
exopolisacárido B100, por presentar las mejores características, algo que hemos desarrollado en diversos
apartados.

Así, se ha estudiado el efecto de diversos factores sobre la viscosidad del exopolisacárido B100
en solución con objeto de conocer los parámetros que determinan el poder viscosizante de este
biopolímero. También ha sido objeto de estudio el comportamiento reológico de las soluciones del
polímero B100, en cuanto a las variaciones que se producen en la viscosidad en función del gradiente de
deformación (pseudoplasticidad) y el tiempo (tixotropía); se ha realizado un estudio completo de las
propiedades viscoelásticas de dicho exopolisacárido, mediante ensayos de oscilación, lo cual nos ha
permitido obtener información sobre su estructura y conformación molecular. Por último, hemos estudiado
el posible efecto sinérgico de nuestro exopolisacárido con otros viscosizantes habitualmente empleados
en la industria alimentaria.

182
Propiedades reológicas

1.1. Viscosidad de las preparaciones acuosas

En la Figura 118 se representa la viscosidad de las preparaciones acuosas al 0,5% (p/v) de los
EPS producidos por los microorganismos halófilos incluidos en este trabajo a un gradiente de deformación
-1
de 59,5 s .

1,00E-01

9,00E-02

8,00E-02
Viscosidad (mPa a 59,5 1/s)

7,00E-02

6,00E-02

5,00E-02

4,00E-02

3,00E-02

2,00E-02

1,00E-02

0,00E+00
FP34

FP35

FP36
N12

M4

M8

F23

R22

F32

Maurano
X2

B40

B100

X8

B33

B35

Xantano
A16

Al12

Al15

Al16

A3

Exopolisacáridos

Figura 118. Viscosidad de las preparaciones acuosas al 0,5% (p/v) de los polímeros objeto de estudio a un gradiente
-1
de deformación de 59,5 s .

Como se aprecia en el gráfico, el comportamiento más viscoso de todos los exopolisacáridos


ensayados, se corresponde con el producido por la cepa B100 de Halomonas maura, polímero con
viscosidad comparable a la del maurano o el xantano. Es destacable que exopolisacáridos con una
elevada masa molecular, como es el caso de los polímeros M4 y X8 de Halomonas eurihalina, F32 de
Alteromonas hispanica y B35 de Alteromonas spp. (véase Sección II, Capítulo 2. Composición química y
masa molecular de los exopolisacáridos), a cuyas soluciones acuosas en principio se les podría atribuir
unas buenas propiedades reológicas, dan soluciones de una baja viscosidad, como se aprecia en la
Figura 119. Este hecho podría deberse a la mayor proporción de restos acetilo que presentan estos EPS
(Tabla 16, Sección II, Capítulo 2. Composición química y masa molecular de los exopolisacáridos), tal y
como han descrito con anterioridad otros autores para exopolisacáridos de diversa procedencia
(Sutherland, 1994; Sutherland, 1997; Rinaudo, 2004), en los que la presencia o ausencia de estos grupos,
modifica la conformación molecular, y por tanto, sus propiedades físicas.

183
Resultados y Discusión

1.2. Factores que influyen en la viscosidad del polímero B100

• Concentración de polímero

La concentración de polímero es el primer factor que hemos estudiado determinando la


viscosidad de las preparaciones acuosas del polímero B100 a una concentración de 0,5; 0,6; 0,8 y 1%
(p/v).

Viscosidad (mPa·s) 2000

1500

1000

500

0
5,05

4,56

4,12

3,7

3,35

3,02

2,72

2,45

2,2

2
Esfuerzo de cizalla (Pa)

0,5% (p/v) 0,6% (p/v)


0,8% (p/v) 1% (p/v)

Figura 119. Efecto de la concentración del EPS B100 de H. maura sobre la viscosidad de sus preparaciones acuosas.

En la Figura 119 se han representado los reogramas correspondientes a las distintas


concentraciones de EPS. Como era de esperar, la viscosidad aumenta con la concentración de
biopolímero en solución, encontrándose prácticamente solapados los gráficos para las preparaciones al
0,5 y 0,6% (p/v) de EPS. El aumento de viscosidad es más notable para las soluciones al 0,8 y 1% (p/v)
de polímero.

Concretamente, las soluciones al 1% (p/v) de EPS presentan una viscosidad unas 5 veces
superior a la de las preparaciones al 0,5% (p/v) de exopolisacárido; por tanto, no existe una relación
directamente proporcional entre la concentración de exopolisacárido y la viscosidad de sus soluciones,
puesto que el incremento de la viscosidad es mucho mayor que el correspondiente aumento del
porcentaje de polisacárido en la muestra.

La dependencia entre la viscosidad y el gradiente de deformación o esfuerzo de cizalla es


indicativa del comportamiento pseudoplástico del EPS B100 de Halomonas maura en solución (la
viscosidad disminuye al aumentar el gradiente de deformación o el esfuerzo de cizalla) (Figura 119).
Dicho comportamiento constituye una propiedad compartida por la mayor parte de los biopolímeros de

184
Propiedades reológicas

reconocido uso industrial, tales como xantano (Becker y col., 1998) o gelano (Miyoshi y Nishinari, 1999) y
ha sido evaluada en otro ensayo del que nos vamos a ocupar más adelante.

• Temperatura

La temperatura es uno de los factores más interesantes de estudiar en cuanto a su influencia


sobre la viscosidad del polímero producido por H. maura cepa B100 en solución, puesto que el
comportamiento de dicho biopolímero en función de este parámetro es determinante para su posterior
aplicación en procesos industriales que requieren operar bajo diferentes temperaturas.

En líneas generales, la viscosidad de las preparaciones acuosas de EPS disminuye al aumentar


la temperatura. No obstante, podemos considerar que en un rango de temperaturas entre 25 y 55ºC existe
una considerable estabilidad, con leve pérdida de viscosidad en comparación con calentamientos más
acusados. De hecho, los reogramas de soluciones al 0,5% (p/v) de polímero para este rango de
temperaturas se encuentran muy cercanos, siendo la diferencia de viscosidad únicamente apreciable a
bajos valores de gradientes de deformación.

300

250
Viscosidad (mPa·s)

200

150

100

50
0
136

82,2

49,3

29,8

18,3

11,6

7,5

4,95

3,3

2,25

Gradiente de deform ación (1/s)

25ºC 35ºC 45ºC 55ºC

Figura 120. Efecto de la temperatura (25, 35, 45 y 55ºC) sobre la viscosidad de soluciones al 0,5% (p/v) del
exopolisacárido B100 de H. maura.

La evolución de la viscosidad de las preparaciones acuosas del exopolisacárido B100 de H.


maura sometidas a un rango más amplio de temperaturas (25-90ºC) se ha representado en la Figura 121,
y se ha comprobado que a temperaturas superiores (70 y 90ºC), la pérdida de viscosidad de dichas
muestras es mayor y especialmente se produce un descenso brusco a 90ºC. Hasta 55ºC, el poder
viscosizante del polímero sintetizado por H. maura cepa B100 permanece prácticamente inalterable.

185
Resultados y Discusión

200
180
160

Viscosidad (mPa·s)
140
120
100
80
60
40
20
0
25 35 45 55 70 90
Tem peratura (ºC)

Figura 121. Efecto de la temperatura sobre la viscosidad de las soluciones al 0,5% (p/v) del EPS B100.

El succinoglicano se comporta de modo similar al nuestro polímero. Entre 60-70ºC se produce


una caída notable de su viscosidad, fenómeno que se ha relacionado con una transición conformacional
de dicho polímero (Stredansky y col., 1999).

El efecto de estos calentamientos se ha estudiado más detenidamente con objeto de comprobar


si a pesar de disminuir la capacidad viscosizante de este biopolímero, tras el enfriamiento de las muestras
se produce una recuperación de la viscosidad de las mismas. Para ello, tras someter a soluciones al 0,5%
(p/v) de polímero a temperaturas de 70 y 90 ºC, se dejaron enfriar dichas preparaciones a temperatura
ambiente (25ºC) o bien en una cámara fría a 4ºC determinándose en cada caso la viscosidad de las
mismas (Figura 122).

A B

180 180
160 160
Viscosidad (mPa·s)

Viscosidad (mPa·s)

140 140
120 120
100 100
80 80
60 60
40 40
20 20
0 0
25 70 E25 E4 25 90 E25 E4
Tem peratura (ºC) Tem peratura (ºC)

Figura 122. Recuperación que experimenta la viscosidad de las soluciones al 0,5% (p/v) del EPS B100 de H. maura
-1
tras enfriamiento a 25ºC (E25) y 4ºC (E4), a un gradiente de deformación de 59,5 s .

186
Propiedades reológicas

El comportamiento del biopolímero en solución tras un calentamiento a 70 y 90ºC se ha


representado gráficamente en las Figuras 122 A y B, respectivamente. Las consecuencias en cuanto a la
pérdida de viscosidad son más drásticas en el segundo caso, llegándose a producir una pérdida casi total
de la misma tras someter las soluciones a una temperatura de 90ºC, mientras que a 70ºC la pérdida está
en torno al 50%. Sin embargo, hay que destacar que en ambos casos se produce una recuperación de la
viscosidad tras enfriamiento de las muestras a 25 ó 4ºC. En las muestras en las que se produce la mayor
pérdida de viscosidad (calentamiento a 90ºC), se llega a recuperar hasta un 50% de la viscosidad inicial
tras enfriar a 25ºC o un 75%, si el enfriamiento de la muestra se realiza en cámara fría (4ºC).

Por tanto, si bien tras procesos de calentamiento bruscos (>70ºC), las propiedades viscosizantes
del exopolisacárido B100 de H. maura se ven afectadas de forma considerable, la pérdida de viscosidad
no es irreversible ya que cuando el calentamiento cesa, las soluciones recuperan progresivamente su
carácter viscoso.

Al igual que obtuvimos para el polímero producido por H. maura cepa B100, la inestabilidad
térmica del EPS producido por Vibrio alginolyticus a temperaturas superiores a 40-50ºC se trata de una
pérdida de viscosidad que resultó ser reversible tras enfriamiento de las muestras hasta 30ºC. Tras el
tratamiento térmico únicamente se produce una pérdida de viscosidad del 10% si se considera un
posterior enfriamiento (Muralidharan y Jayachandran, 2003). A diferencia de estos exopolisacáridos, en
otras ocasiones la pérdida de viscosidad tras calentamiento es irreversible, tal y como describieron Isobe
y colaboradores (1992) para un polímero producido por una cepa de Bacillus.

Como adelantábamos anteriormente, se ha descrito para otros exopolisacáridos como el


succinoglicano, la pérdida de viscosidad a partir de 70ºC en el caso de nuestro exopolisacárido puede
deberse a una transición conformacional del polímero a un estado de menor orden, y concretamente
puede estar relacionada con una desnaturalización de la estructura en doble hélice que pudimos observar
mediante microscopía electrónica (Sección II, Capítulo 3).

En este sentido, el xantano se caracteriza por una gran termoestabilidad, pudiendo permanecer
inalterado hasta temperaturas alrededor de los 90ºC. No obstante, sus propiedades reológicas se ven
afectadas si se supera la temperatura de transición conformacional de la molécula, que es dependiente de
la concentración de polímero y de sales presentes en la solución (Oviatt y Brant, 1993; 1994).

• pH

El efecto del pH sobre las propiedades reológicas del exopolisacárido producido por la cepa
B100 de Halomonas maura en solución se ha estudiado en un amplio intervalo de valores (3-9). Las
determinaciones realizadas han puesto de manifiesto que la viscosidad de las soluciones se mantiene

187
Resultados y Discusión

estable a pH entre 4 y 8, produciéndose tanto a pH ácido como a pH básico una ligera caída de la misma
(Figura 123).

80

70

60

Viscosidad (mPa·s)
50

40

30
20

10

0
3 4 5 6 7 8 9
pH

Figura 123. Efecto del pH sobre la viscosidad de soluciones al 0,5% (p/v) del exopolisacárido B100 de H. maura a un
esfuerzo de cizalla de 3 Pa.

Esta tendencia se ha observado en algunos polímeros de reciente descripción, como el


producido por Paenibacillus sp., estable en un intervalo de pH entre 2 y 14, aunque con cierta disminución
de su viscosidad al pH de mayor acidez o basicidad (Weon-Taek y col., 1999). Junto a éste, la viscosidad
de preparaciones acuosas de una sustancia exopolisacarídica procedente del mucílago producido por una
especie de Klebsiella, se comporta de igual forma y únicamente es estable a pH entre 4 y 9 (Wang y col.,
1999), al igual que el EPS sintetizado por Vibrio alginolyticus; con disminución de su viscosidad a pH 2 y
11 (Muralidharan y Jayachandran, 2002). Por último, el succinoglicano mantiene su poder viscosizante en
el intervalo de pH 3-10 (Harada y col., 1993).

En cualquier caso, la viscosidad se ve afectada de distinta forma en función del pH, dependiendo
de la alteración de la carga iónica que se provoque en la molécula de polisacárido.

La viscosidad de las soluciones de xantano es estable a pH entre 2 y 12, y a pesar del carácter
inalterable de este polímero, en condiciones de extrema acidez (pH < 2) y basicidad (pH > 12), ésta tiende
a disminuir, tal y como lo indica la ficha técnica del xantano comercializado por Vanderbilt Company Inc.
(Vanzan y Veegum, Vanderbilt Company, Inc.)

188
Propiedades reológicas

• Presencia de sales en solución

La presencia de sales es otro de los factores que afecta a la viscosidad de los polímeros
microbianos en solución.

En el caso del exopolisacárido sintetizado por H. maura cepa B100, este es un parámetro
interesante dado el carácter halófilo de la bacteria productora de este biopolímero y el efecto que sobre el
proceso de producción del mismo tiene el porcentaje de sales incorporado al medio de producción, (véase
el apartado de optimización de la producción en medio complejo MY). Por ello en el estudio reológico de
este polímero se ha incluido el análisis de la influencia de la presencia de electrolitos sobre sus
propiedades reológicas.

Así, se ha estudiado el efecto de adicionar a las preparaciones acuosas del exopolisacárido B100
distintas cantidades de cloruro sódico hasta porcentajes del 2,5, 5 y 7,5 %. En la Figura 124 se representa
el reograma obtenido en cada caso.

350

300
Viscosidad (mPa·s)

250

200

150

100

50

0
170

143

125

107

86

70,8

60,7

48,1

33,2

21

Gradiente de deform ación (1/s)

NaCl 0% (p/v) NaCl 2,5% (p/v)


NaCl 5% (p/v) NaCl 7,5% (p/v)

Figura 124. Viscosidad de preparaciones al 0,5% (p/v) del polímero B100 en agua destilada adicionadas con distintas
cantidades de NaCl.

La adición de cloruro sódico a las soluciones de polímero provocó un incremento de la


viscosidad; se obtuvo, como se puede observar en la Figura 124, la mayor viscosidad en las
preparaciones al 2,5% (p/v) de NaCl.

189
Resultados y Discusión

Estas condiciones, en las que las propiedades de nuestro polímero como agente viscosizante se
ven potenciadas determinarán posibles aplicaciones del biopolímero en algunos sectores industriales.

En alimentación, esta propiedad lo puede hacer apto para ser incorporado a aderezos de
ensaladas, salsas o preparados instantáneos en los que la sal es un ingrediente común. En cosmética, la
presencia de electrolitos en determinadas formulaciones, como es el caso de algunos geles, determina la
necesidad de disponer de agentes viscosizantes estables en tales condiciones.

Otras aplicaciones en las que resulta interesante la compatibilidad de los biopolímeros o


hidrocoloides en general, en cuanto a su poder viscosizante, con elevadas concentraciones salinas están
relacionadas con la industria del petróleo. El interés de este sector por los exopolisacáridos microbianos
se centra en su poder para incrementar la viscosidad de los lodos inyectados en los tanques para la
extracción del petróleo, para lo cual se requiere que estos polímeros presenten elevada viscosidad y
pseudoplasticidad en solución así como resistencia frente a las sales (Margesin y Schinner, 2001). Es por
ello que éste sea un aspecto bastante importante a estudiar en la caracterización reológica de nuevos
EPS. Así, además del xantano, estable incluso a salinidades superiores al 20% (p/v) (Amro y col., 2002),
la estabilidad en presencia de sales se ha descrito para otros EPS microbianos, pudiendo citar al
heteropolisacárido producido por Paenibacillus sp. (Weon-Taek y col., 1999).

• Efecto del proceso de congelación-descongelación

En lo que se refiere a los procesos de congelación-descongelación, podemos afirmar que la


viscosidad del exopolisacárido B100 de H. maura en solución permanece prácticamente inalterada tras
dicho tratamiento. Esta propiedad es muy importante para las potenciales aplicaciones de nuestro
polímero en la elaboración de productos congelados, ya que los mantiene estables durante ciclos
sucesivos de congelación y descongelación. Además, reduce la formación de cristales de hielo en estos
productos, proporciona una textura suave y una vida de almacenamiento prolongada, al igual que el
xantano (Vafiadis, 1999).

• Efecto del proceso de esterilización en autoclave de vapor

Para comprobar la resistencia a la esterilización de nuestro EPS sometimos una solución del
mismo al 0,5% (p/v) a un proceso de esterilización en autoclave de vapor a 112ºC durante 30 minutos.
Según pudimos comprobar, la viscosidad de las soluciones es bastante resistente a la esterilización, al
igual que se ha descrito para el xantano (Born y col., 2002), y es que como hemos comentado
anteriormente, la pérdida de viscosidad del este EPS por efecto del calor parece ser termorreversible.
Esta propiedad es muy interesante, de modo que el polímero B100 de H. maura podría encontrar

190
Propiedades reológicas

potenciales aplicaciones en la industria alimentaria, pues se podría utilizar como aditivo en aquellos
alimentos que sufren una esterilización durante su procesamiento, como por ejemplo las conservas.

• Presencia de azúcares

Por último, también hemos puesto de manifiesto la estabilidad del exopolisacárido B100 en
presencia de azúcares en solución, como es el caso de la sacarosa, que no afecta a la viscosidad del
mismo. Ello nos indica a su vez la compatibilidad de nuestro biopolímero con los azúcares, lo cual puede
tener interés cuando se precise incorporar este viscosizante a determinados alimentos.

1.3. Características reológicas de las preparaciones acuosas del polímero B100

• Pseudoplasticidad

En todas las determinaciones realizadas, los reogramas pusieron de manifiesto el carácter


pseudoplástico de las soluciones del exopolisacárido sintetizado por Halomonas maura B100 (disminución
de la viscosidad con el progresivo aumento del gradiente de deformación o esfuerzo de cizalla).

Este comportamiento es característico de la mayoría de los exopolisacáridos microbianos, entre


ellos el xantano, y a su vez, responsable de muchas de sus propiedades funcionales. Al tratarse de un
polímero de naturaleza semirígida se caracteriza por una marcada pseudoplasticidad que se pone de
manifiesto por su elevado índice de pseudoplasticidad (n) (Andrews y col., 1998).

En el sector industrial este comportamiento puede determinar la utilidad de muchos de estos


polímeros. Así, la pseudoplasticidad de algunos ingredientes es una propiedad esencial y de gran utilidad
en la industria alimentaria. Al añadirse a un determinado alimento, contribuyen a mejorar algunas
propiedades del mismo, como la textura, palatabilidad o propiedades reológicas en general (Enriquez y
col., 1989).

La pseudoplasticidad permite que a elevados gradientes de deformación, la viscosidad de las


preparaciones de EPS sea baja y con ello se vean facilitados procesos de mezcla o bombeo del producto;
mientras que cuando la deformación se hace menor y las muestras se llevan al reposo, la viscosidad se
incrementa y el biopolímero puede actuar como agente viscosizante o espesante en tales condiciones
(Moreno y col., 2000).

Si bien habíamos puesto de manifiesto el comportamiento pseudoplástico del polímero B100 en


solución, resulta de gran interés conocer el mayor o menor grado de pseudoplasticidad de sus soluciones
en función de diversos parámetros.

191
Resultados y Discusión

El grado de pseudoplasticidad de las soluciones de polímero B100 de H. maura se ha evaluado


mediante el ajuste de los reogramas obtenidos a un modelo empírico, concretamente a la ecuación de
Ostwald-de Waele o ley de la potencia, que establece la siguiente relación entre el esfuerzo de cizalla ( σ)
y el gradiente de deformación (γº): σ = K · γº n; siendo K el índice de consistencia y n el índice de
pseudoplasticidad (que tiende a 0 para los fluídos pseudoplásticos y se iguala a la unidad para aquellos
newtonianos). Los reogramas obtenidos a diferentes concentraciones de EPS B100 (0,5, 0,6, 0,8 y 1%
p/v) y a diferentes temperaturas (25, 35, 45, 55, 70 y 90ºC) se han ajustado a dicho modelo. En las Tablas
18 y 19 se recogen los valores de los parámetros del modelo de Power-Law (K y n).

Tabla 18. Parámetros reológicos (K, índice de consistencia; n, índice de pseudoplasticidad) del ajuste al
modelo de Ostwald-de-Waele de los reogramas a las diferentes concentraciones de polímero B100.

2a
% (p/v) K n r
0,5 0,3877 0,5204 0,99875
0,6 0,5130 0,5198 0,99819
0,8 1,165 0,4371 0,99691
1 1,965 0,3974 0,99756
a
, índice de correlación al ajuste del modelo empírico.

Tabla 19. Parámetros reológicos (K, índice de consistencia; n, índice de pseudoplasticidad) del ajuste al
modelo de Ostwald-de-Waele de los reogramas de soluciones de polímero B100 al 0,5% (p/v) a diferentes
temperaturas.

2a
Temperatura (ºC) K n r
25 0,3877 0,5204 0,99875
35 0,3186 0,5311 0,99884
45 0,2726 0,5406 0,99884
55 0,2419 0,5476 0,99836
70 0,2238 0,5845 0,99867
90 0,09123 0,6874 0,99978
a
, índice de correlación al ajuste del modelo empírico.

En todos los casos, las soluciones de exopolisacárido B100 exhiben un marcado comportamiento
pseudoplástico al presentar valores para el índice de pseudoplasticidad menores de 0,7. La evolución de
este parámetro en función de la concentración de polímero es clara; se produce una disminución del
índice de pseudoplasticidad a medida que la concentración de exopolisacárido es mayor, de ahí que las
soluciones más concentradas con un porcentaje del 1% (p/v) de EPS sean las que presenten el mayor
grado de pseudoplasticidad (n= 0,3974). Consecuentemente y tal y como se ha descrito en otros muchos

192
Propiedades reológicas

casos, cuanto menos concentradas son las soluciones, más próximo es su comportamiento al típico fluído
newtoniano. En cuanto al índice de consistencia (K), representativo de la viscosidad de las soluciones,
este parámetro se hace mayor a medida que aumenta la concentración de EPS, como consecuencia de la
existencia de una estructura molecular más fuerte y consolidada (Moreno y col., 2000).

Al incrementarse la temperatura se produce una disminución del carácter pseudoplástico, lo cual


se traduce en un aumento del índice de pseudoplasticidad desde 0,5204 a 0,6874 y disminución del
índice de consistencia.

Resultados similares se han descrito en el caso del xantano, en el que de igual forma se ha
comprobado una aproximación al comportamiento newtoniano para las soluciones más diluidas o a mayor
temperatura (Dolz y col., 2002). En el xantano comercial (Kelco), el índice de consistencia (K) estimado es
de 35 y el índice de flujo (n) presenta valores de 0,23-0,25.

• Tixotropía

Las soluciones del exopolisacárido B100 mostraron ser tixotrópicas ya que se produce un
descenso de su viscosidad tras aplicar un gradiente de deformación elevado y la subsiguiente
recuperación cuando cesa el flujo (deformación), lo cual se ha determinado aplicando ciclos sucesivos de
mayor y menor deformación en un periodo total de 40 minutos (Figura 125).

700 100
Gradiente de deformación (1/s)

90
600
80
Viscosidad (mPa·s)

500 70

400 60
50
300 40
200 30
20
100
10
0 0
1 4 7 10 13 16 19 22 25 28
Tiem po (m inutos)
viscosidad (mPa·s)
gradiente de deformación (1/s)

Figura 125. Evolución de la viscosidad de soluciones al 0,5% (p/v) del exopolisacárido B100 de H. maura en un ciclo
-1 -1
de gradiente de deformación creciente (90 s ) y decreciente (3 s ).

193
Resultados y Discusión

1.4. Estudio de las propiedades viscoelásticas del polímero B100. Ensayos de oscilación

El estudio del comportamiento viscoelástico de un polímero en solución constituye un apartado


importante en su caracterización desde el punto de vista reológico.

Para llevar a cabo tales estudios se recurre a los ensayos de oscilación dinámicos, los cuales
constituyen una de las herramientas fundamentales para la caracterización de las propiedades
viscoelásticas de un amplio abanico de productos de interés tanto para la industria alimentaria como
químico-farmacéutica.

La información que aportan estos ensayos es de gran aplicación en cuanto al control de calidad,
investigación y desarrollo de nuevos productos y optimización de formulaciones y procesos a nivel
industrial, de ahí que este estudio sea importante para la caracterización de nuevos polímeros como es el
caso del exopolisacárido B100, cuya proyección industrial se pretende evaluar en este trabajo.

Los ensayos de oscilación consisten en aplicar un esfuerzo de cizalla o deformación que se hace
variar sinusoidalmente a lo largo del tiempo en que se realiza el ensayo, para así determinar las funciones
viscoelásticas G’ (módulo elástico) y G’’ (módulo viscoso), ambas función de la frecuencia del movimiento
oscilatorio, estando la primera de ellas relacionada con la respuesta elástica del material (comportamiento
próximo al de un sólido) y la segunda con la respuesta viscosa (característica de un fluído) (Macosko,
1994).

Los resultados obtenidos se pueden relacionar con la estructura de la muestra siempre que tales
ensayos se lleven a cabo dentro de la región viscoelástica lineal. Ello implica que las deformaciones por
cizalla a que se somete el material objeto de estudio no produzcan una destrucción irreversible de su
estructura. Así por tanto, la naturaleza no destructiva del ensayo permite obtener información acerca de
los aspectos estructurales de la muestra examinada, de modo que cualquier cambio en su estructura en
función de las condiciones que ensayemos, quedará reflejado en los valores de las funciones
viscoelásticas y su dependencia respecto de la frecuencia.

Por lo tanto, un paso previo para la determinación de las propiedades viscoelásticas del EPS
B100 de H. maura ha sido seleccionar un esfuerzo de cizalla que garantice la no destrucción irreversible
de la estructura de la muestra en el intervalo de frecuencias en que realizaremos los posteriores ensayos,
y con ello trabajar dentro del dominio viscoelástico lineal. Para ello realizamos un ensayo de “stress
sweep” en el que se sometió a la solución de exopolisacárido (al 1% p/v) a un barrido creciente de
esfuerzos de cizalla entre 0,1 y 20 Pa a una frecuencia constante de 1 Hz. Tal y como puede
comprobarse en la Figura 126, a medida que se incrementa el esfuerzo de cizalla, la respuesta obtenida
del material se caracteriza por la constancia de las funciones viscoelásticas hasta que se alcanza un
punto crítico (esfuerzo de cizalla de 8,95 Pa) a partir del cual se produce una caída importante del módulo

194
Propiedades reológicas

elástico (G’) lo que determina una alteración de la estructura del polímero y la salida del dominio
viscoelástico lineal. Así por tanto trabajaremos en condiciones lineales siempre que el esfuerzo de cizalla
aplicado sea inferior a 8,95 Pa.

5
G'' (Pa)

3
G'

0 Figura 126. Ensayo de “stress sweep”. Evolución


0,17

0,23

0,33

0,57

1,11

2,07

3,5

5,71

9,04

13,6

17,3
0,11

del módulo elástico (G´) y modulo viscoso (G´´) de


Esfuerzo de cizalla (Pa) una solución al 1% (p/v) de polisacárido B100 de H.
G' G'' maura en un intervalo de esfuerzo de cizalla de 0,1-
20 Pa a una frecuencia de 1 Hz.

Seleccionada la región viscoelástica lineal, la determinación de los parámetros viscoelásticos se


llevó a cabo a partir de soluciones de polímero B100 de H. maura con diferente concentración del
exopolisacárido en ausencia o presencia de sales, aplicando a dichas muestras un esfuerzo de cizalla de
6 Pa en un rango de frecuencias comprendido entre 0,007 y 20 Hz (Figuras 127 y 128). La representación
del módulo elástico y viscoso en función de la frecuencia, conocido como espectro mecánico, nos ha
permitido conocer la respuesta elástica y viscosa del polímero B100 de Halomonas maura en solución.

1000

100

10
G'' (Pa)

0,1

0,01
G'

0,001

0,0001

0,00001
0,01

0,03

0,06

0,09

0,2

0,5

0,8

1,5

10

Frecuencia (Hz)

G' 1% (p/v) G'' 1% (p/v)


G' 1,5% (p/v) G'' 1,5% (p/v)

Figura 127. Espectro mecánico de soluciones al 1 y 1,5 % (p/v) del polímero B100 de H. maura en un intervalo de
frecuencia 0,01 -20 Hz y a un esfuerzo de cizalla de 6 Pa.

195
Resultados y Discusión

1000
100
10

G'' (Pa)
1
0,1
0,01

G'
0,001
0,0001
0,00001

0,4
0,7
1
3
6
9
0,01
0,01
0,02
0,05
0,08
0,15

20
Frecuencia (Hz)

G' 1%+ 0,1M NaCl G'' 1%+ 0,1M NaCl


G' 1,5%+ 0,1M NaCl G'' 1,5%+0,1M NaCl

Figura 128. Espectro mecánico de soluciones al 1 y 1,5% (p/v) del polímero B100 adicionadas con 0,1M NaCl en un
intervalo de frecuencia 0,007-20 Hz a una esfuerzo de cizalla de 6 Pa.

Para las soluciones al 1 y 1,5% (p/v) de EPS en ausencia de sales (Figura 127), a elevadas
frecuencias existe un dominio elástico donde G’ domina sobre G’’, lo cual está en concordancia con el
comportamiento típico de polímeros rígidos (Morse, 1998) y es reflejo de una conformación ordenada. A
frecuencias de oscilación bajas, los ciclos de deformación son largos y se producen múltiples
reorganizaciones moleculares que alteran la estructura rígida del polímero (G’’> G’). A medida que la
frecuencia se incrementa, los ciclos de deformación son cada vez más cortos y no hay tiempo para que se
den cambios internos considerables, manteniéndose la estructura sólida y estable de la molécula (G’>G’’)
(Lapasin y Pricl, 1995).

El punto correspondiente a la frecuencia en que se cruzan los gráficos del módulo elástico y
viscoso determina la transición de un estado o conformación molecular a otro, y puede ser indicativo de la
estructura y del carácter más o menos sólido de un polímero (Oba y col., 1999).

Tabla 20. Frecuencia de transición (Hz) de las preparaciones acuosas del exopolisacárido B100 en
función de la concentración de polímero, la presencia de sales y la temperatura.

% (p/v) EPS Frecuencia de transición (Hz) Temperatura (ºC) Frecuencia de transición (Hz)
1 1,5 25 1,5
1,5 0,8 45 1,5
1+NaCl 0,1M 1 70 3
1,5 +NaCl 0,1M 0,7

196
Propiedades reológicas

La concentración de EPS afecta al punto en el que se produce la transición de un estado menos


ordenado al de mayor estabilidad. En el caso del exopolisacárido B100 de H. maura, al 1% (p/v) de
polímero el punto de cruce tiene lugar a una frecuencia de 1,5 Hz, disminuyendo hasta 0,8 Hz para las
soluciones al 1,5 %(p/v) de EPS (Tabla 20). Por tanto, al aumentar la concentración de polímero, se
obtiene un dominio elástico más amplio, reflejo de una estructura molecular más ordenada y de mayor
rigidez. A su vez, G’ y G’’ aumentan con la concentración de polisacárido, siendo más marcado el
aumento del módulo elástico. Este comportamiento es característico de polímeros con grupos cargados,
tal es el caso de nuestro polisacárido, con restos de ácidos urónicos, grupos sulfato y fosfato. Se debe a
que a bajas concentraciones existen repulsiones intramoleculares que obligan a las cadenas
polisacarídicas a expandirse y con ello generar una estructura más débil mientras que al aumentar la
concentración de EPS este efecto se contrarresta por las repulsiones intermoleculares y las cadenas se
compactan, lo cual se traduce en un aumento del módulo elástico (G’) (Oba y col., 1999).

El xantano no forma geles o únicamente geles débiles a concentración elevada (superior al 2%


p/v en solución acuosa) (Oviatt y Brant., 1993; Rodd y col., 2000). Sin embargo, experimenta en muchas
ocasiones una transición desde una conformación ordenada a una desordenada. La mayor parte de los
autores coinciden en afirmar que la forma ordenada es una doble hélice (Gamini y Mandel, 1994, Capron
y col., 1998). La forma ordenada existe a elevadas concentraciones del xantano (1% p/v), lo cual se ha
puesto de manifiesto entre otras técnicas mediante el estudio viscoelástico de este polímero en solución
al obtenerse espectros mecánicos caracterizados por la existencia de un módulo elástico (Pelletier y col.,
2001). A este porcentaje, existe un dominio del módulo elástico tal y como obtuvimos para el polímero
B100, lo cual puede llevarnos a hablar de una forma o estado de mayor orden en el caso de nuestro
polímero al presentar un comportamiento similar al xantano.

A su vez, las propiedades reológicas del xantano son extremadamente dependientes de la


concentración de polímero y presencia de sales (Pelletier y col., 2001). Puesto que la influencia del primer
factor ha resultado evidente también para el polímero B100 de H. maura, estudiamos como se veían
afectados los parámetros viscoelásticos de este biopolímero en solución con la adición de sales. En
presencia de NaCl 0,1M, y al igual que ocurre al incrementar la concentración de polisacárido, la
frecuencia en la que los módulos elástico y viscoso se igualan (G’= G’’), se hace menor (Figura 128). Ello
se debe a que los cambios estructurales que determinan la transición de un estado ordenado a
desordenado son dependientes del contenido en sal de la solución, de forma que la adición de electrolitos
induce a asociaciones intermoleculares que reducen las repulsiones electrostáticas típicas de polímeros
con carga neta y con ello se consigue que las moléculas estén más ordenadas y que el estado sea más
estable. Este mismo efecto se ha descrito para el xantano (Pelletier y col., 2001), polímero de naturaleza
ácida al igual que el EPS producido por Halomonas maura cepa B100.

Por último, se ha estudiado el efecto de la temperatura sobre los parámetros viscoelásticos de


las preparaciones acuosas del polímero B100 de H. maura. En la Figura 129 se han representado los

197
Resultados y Discusión

módulos elástico y viscoso de soluciones al 1% (p/v) de exopolisacárido en función de la frecuencia a una


temperatura de 25, 45 y 70ºC.

1000
100
10

G'' (Pa)
1
0,1
0,01

G'
0,001
0,0001
0,00001

0,01
0,03
0,06
0,09
0,2
0,5
0,8
1,5
4
7
10
0,01
Frecuencia (Hz)

G' 25ºC G' 45ºC G' 70ºC


G'' 25ºC G'' 45ºC G'' 70ºC

Figura 129. Espectro mecánico de soluciones al 1% (p/v) de maurano a temperaturas de 25, 45 y 70ºC en un intervalo
de frecuencia 0,007-20 Hz a un esfuerzo de cizalla de 6 Pa.

Puede comprobarse que a bajas frecuencias, los parámetros viscoelásticos sufren una
disminución con el aumento progresivo de la temperatura, apreciándose especialmente en el caso de G’.
La frecuencia de transición (G’=G’’) tiende a aumentar con la temperatura (Tabla 20), reduciéndose la
región de dominio del módulo elástico (especialmente a temperaturas superiores a 70ºC, lo cual podría
ser reflejo de una estabilidad conformacional entre 25 y 70ºC). De igual forma, resulta obvia la
superposición de los gráficos de G’ y G’’ a las distintas temperaturas (Figura 129), indicativo de que la
estructura global de la red formada por las moléculas de polímero no se ve modificada por el
calentamiento. Puede sospecharse un cierto cambio estructural dado que sobre todo a frecuencias bajas
el solapamiento de las gráficas es menor. Un ensayo de este tipo permitió llegar a una conclusión similar
para el EPS producido por Lactococcus lactis subsp. cremoris (Oba y col., 1999), desde el punto de vista
estructural considerado como un polímero con estructura helicoidal.

La superposición de los parámetros viscoelásticos frente a la frecuencia, a distintas


temperaturas, ha sido un estudio de utilidad para conocer la transición de la conformación ordenada-
desordenada del xantano (Born y col., 2002; Pelletier y col., 2001). En este caso se observa una
superposición de dichos parámetros en un rango de temperatura entre 30 y 80ºC, (para las soluciones del
polímero en presencia de sales), lo cual indica que la forma ordenada presenta una gran estabilidad y
apoya la suposición de que se trate de un estructura de doble hélice. De hecho, en ambas
conformaciones el xantano parece estar constituido por una doble hebra (Viebke y Williams, 2000) lo que
determina su gran estabilidad frente a multitud de factores.

198
Propiedades reológicas

Por otra parte, la presencia de determinados grupos tiende a estabilizar la forma ordenada del
xantano, como los grupos acetilo (Gamini y col., 1991), también presentes en el exopolisacárido B100 de
Halomonas maura.

En el caso del gelano, preparaciones acuosas al 5% (p/v) presentan valores prácticamente


constantes para G’ y G’’ a temperaturas inferiores a 40ºC, por encima de la cual se produce una caída de
los valores de dichos parámetros viscoelásticos como consecuencia de que esta temperatura induce una
transición conformacional de las moléculas de gelano desde su forma ordenada a un estado de desorden
(Takigawa y col., 1999). No obstante, la temperatura a la que se produce este cambio es dependiente de
la concentración de gelano y presencia de sales (Ogawa, 1999).

Estos resultados nos pueden llevar a concluir que el polímero B100 a porcentajes elevados (1-
1,5% p/v) podría presentar una estructura de mayor orden al igual que el xantano y el maurano al
presentar espectros mecánicos similares. Esta forma ordenada responsable de una estructura de mayor
solidez se mantiene estable a temperaturas entre 25-70ºC, a partir de la cual parece ser que comienza a
producirse una desorganización molecular. Este último hecho determinaría que la viscosidad de las
soluciones no se modifique a temperaturas entre 25-55ºC como vimos en apartados anteriores,
produciéndose una disminución a temperaturas de 70ºC y superiores. Sin duda alguna, la capacidad
viscosizante de este exopolisacárido está relacionada con la estructura molecular de sus cadenas
polisacarídicas.

1.5. Efecto sinérgico con otros agentes viscosizantes

En este apartado hemos estudiado efecto sinérgico de nuestro EPS con alguno de los
espesantes empleados en la industria alimentaria. La viscosidad de las soluciones del exopolisacárido
B100 y cada uno de los viscosizantes industriales así como las mezclas obtenidas con cada uno de ellos
a distintas proporciones se representa en las Figuras 130-134.

B100/GG 4:1
B100/GG 3:2
B100/GG 2:3
B100/GG 1:4
GG
B100

0 500 1000 1500


Viscosidad (mPa·s)

Figura 130. Viscosidad de soluciones al 0,5% (p/v) de polímero B100 (B100), goma guar (GG) y las mezclas B100/GG
-1
a un gradiente de deformación de 2 s .

199
Resultados y Discusión

B100/C 4:1
B100/C 3:2
B100/C 2:3

B100/C 1:4
C
B100

0 20 40 60 80
Viscosidad (m Pa·s)

Figura 131. Viscosidad de soluciones al 0,5% (p/v) de polímero B100 (B100), carragentato (C) y las mezclas B100/C a
-1
un gradiente de deformación de 85 s .

B100/HPMC 4:1
B100/HPMC 3:2

B100/HPMC 2:3
B100/HPMC 1:4

HPMC
B100

0 20 40 60 80
Viscosidad (m Pa·s)

Figura 132. Viscosidad de soluciones al 0,5% (p/v) de polímero B100 (B100), hidroxipropilmetilcelulosa (HPMC) y las
-1
mezclas B100/HPMC a un gradiente de deformación de 85 s .

B100/P 4:1
B100/P 3:2

B100/P 2:3
B100/P 1:4
P

B100

0 100 200 300


Viscosidad (m Pa·s)

Figura 133. Viscosidad de soluciones al 0,5% (p/v) de polímero B100 (B100), pectina (P) y las mezclas B100/P a un
-1
gradiente de deformación de 10 s .

200
Propiedades reológicas

B100/PO 4:1

B100/PO 3:2

B100/PO 2:3

B100/PO 1:4

PO

B100

0 50 100 150
Viscosidad (m Pa·s)

Figura 134. Viscosidad de soluciones al 0,5% (p/v) de polímero B100 (B100), goma de Plantago Ovata (PO) y las
-1
mezclas B100/PO a un gradiente de deformación de 30 s .

Nuestros resultados indican que únicamente existe efecto sinérgico entre nuestro exopolisacárido
(B100) y la goma guar (GG), y es que al combinar ambos polímeros (en proporciones B100:GG 1:4, 2:3 y
3:2) se obtienen soluciones de mayor viscosidad que cuando estos polímeros se utilizan por separado. La
viscosidad en el primer caso (1:4) es un 25% superior respecto a la viscosidad respecto de la viscosidad
de polímero B100 o gomar guar por separado.

La sinergia existente en la asociación xantano-galactomananos y xantano-glucomananos ha sido


descrita por varios autores (Goycoolea y col., 2001; Annable y col., 1994; Paradossi y col., 2002),
concretamente en cuanto a la formación de geles. Casas y colaboradores (2000) han estudiado la
asociación xantano-goma guar, en la cual el efecto sinérgico depende de la proporción de cada una de las
gomas en la mezcla, de modo que se obtiene la mayor viscosidad para la proporción 3:3. En cuanto al
mecanismo de esta sinergia, juega un papel fundamental la fuerza de las interacciones entre las cadenas
polisacarídicas. Parece ser que entre el xantano y la goma guar (un galactomanano), dichas interacciones
se producen a nivel de los lugares no sustituidos de la cadena de manosa. Por lo tanto, aquellos
galactomananos con un menor contenido en galactosa, entre ellos la goma guar, permiten las
interacciones de mayor fuerza (Bresolin y col., 1997; 1999; Sutherland, 1990).

La compatibilidad y la sinergia del exopolisacárido sintetizado por la cepa B100 de Halomonas


maura y la goma guar representa una característica atractiva para este polímero, que en este aspecto se
asemeja una vez más al maurano y al xantano, el cual, gracias a su efecto sinérgico con diversas gomas,
ha permitido disponer de agentes viscosizantes y estabilizantes con propiedades modificadas (Kelco,
1994; Craig y col., 1997).

201
Propiedades emulgentes

CAPÍTULO 2

ESTUDIO DE LAS PROPIEDADES EMULGENTES DE LOS EXOPOLISACÁRIDOS

RESUMEN

En este capítulo hemos estudiado las propiedades emulgentes de los exopolisacáridos.


Todos los polímeros ensayados fueron capaces de estabilizar, en mayor o menor medida, mezclas
oleoacuosas en las que la fase oleosa era un hidrocarburo o un aceite vegetal o mineral. Destacan
los exopolisacáridos B100 de Halomonas maura y B33 de Palleronia marisminoris, mucho más
eficientes que los surfactantes químicos utilizados como control. Por tanto, nuestros EPS podrían
encontrar aplicaciones en la industria alimentaria, cosmética o en biorremediación, entre otros
campos. Además, en la mayoría de los casos, las emulsiones presentan un tamaño de gotícula
pequeño y uniforme lo que determina que sean estables y homogéneas. Con respecto al
mecanismo por el que nuestros EPS actúan como emulgentes, podemos decir que se comportan
estabilizando emulsiones, no son biosurfactantes, ya que no disminuyen la tensión superficial.
Los exopolisacáridos Al12 y Al16 producidos por Halomonas ventosae, con una considerable
actividad emulgente, y que originan soluciones de baja viscosidad, deben su actividad al
contenido en proteínas que presentan en su composición química, como hemos demostrado por
eliminación química y enzimática del contenido proteico de los mismos.

203
Resultados y Discusión

En la industria alimentaria, farmacéutica, cosmética y del petróleo se utilizan con frecuencia


diversos agentes emulgentes, de origen químico o vegetal; entre las propiedades funcionales de los
exopolisacáridos microbianos, se encuentra su capacidad para actuar como agentes emulgentes, por lo
que este tipo de macromoléculas podrían constituir una alternativa a los productos empleados
tradicionalmente, ya que tienen numerosas ventajas frente a los surfactantes de origen químico; así, por
ejemplo, son compuestos biodegradables y de menor toxicidad, presentan una gran diversidad, son
eficaces en condiciones extremas (pH, temperatura, salinidad), y se obtienen a partir de fuentes
renovables (Desai y Banat, 1997; Banat y col., 2000). Además, el crecimiento de los microorganismos no
está sujeto a variaciones estacionales, como ocurre con las plantas, lo que supone un problema a la hora
de asegurar el suministro de las gomas de origen vegetal. De hecho, los emulgentes microbianos ya han
comenzado a hacerse un hueco en el mercado (O´Connor, 2002), y se espera que para el año 2010 los
bioemulgentes acaparen hasta el 10% del mercado de los surfactantes, con unas ventas que rondarán los
200 millones de dólares (Hester, 2001).

Con objeto de evaluar la utilidad de nuestros EPS como agentes emulgentes, en este capítulo se
ha determinado su capacidad para emulsionar fases oleosas de diversa naturaleza. Igualmente, se ha
estudiado la estabilidad en el tiempo y las características de estas emulsiones. Por último, también
hemos tratado de analizar el mecanismo de acción por el que dos de nuestros exopolisacáridos, Al12 y
Al16, sintetizados por Halomonas ventosae, que mostraron una considerable actividad emulgente
(cuantitativa y cualitativamente), pero que dan soluciones acuosas de baja viscosidad (Sección III,
Capítulo 1, apartado 1.1. Viscosidad de las preparaciones acuosas de los exopolisacáridos), son capaces
de actuar como agentes emulgentes.

Este estudio se ha llevado a cabo con los exopolisacáridos producidos en el medio de cultivo
complejo MY (Moraine y Rogovin, 1966), en condiciones óptimas de cultivo.

2.1. Actividad emulgente

En las Tablas 21-26 se recoge la actividad emulgente de nuestros exopolisacáridos, en


comparación con la del xantano y los surfactantes químicos utilizados como control (Tritón X-100, Tween
20, Sugin 472, Polisorbato 60), a una concentración del 0,5% (p/v), sobre las distintas fases oleosas
ensayadas (aceite de oliva, aceite de girasol, aceite mineral, keroseno, miristato de isopropilo,
tetradecano y octano).

Los resultados son la media de tres determinaciones e indican el porcentaje emulsionado de la


mezcla agua-fase oleosa. Las medidas fueron realizadas tras dejar la emulsión en reposo durante 1 hora
y 24 horas a temperatura ambiente, con el objetivo de evaluar la estabilidad de las mismas con el paso
del tiempo.

204
Propiedades emulgentes

Tabla 21. Actividad emulgente de los controles sobre el aceite de oliva, aceite de girasol, aceite mineral y
keroseno.

EMULGENTE FASE OLEOSA


Aceite oliva Aceite girasol Aceite mineral Keroseno
Tritón X-100 1 hora 70,1* 69,25 61,8 92,6
24 horas 61,85 67,1 64,75 60,35

Tween 20 1 hora 61,75 62,8 61,25 62


24 horas 60,7 62,5 58,15 62

Sugin 472 1 hora 56,8 54,05 54,45 55,45


24 horas 53,75 52,9 52,55 49,6

Polisorbato 60 1 hora 62,55 64,7 61,95 62,8


24 horas 61,5 62,8 60,2 62,3

Xantano 1 hora 100 92,45 100 90,5


24 horas 100 88,95 90,35 89
* Los resultados son la media de tres determinaciones e indican el porcentaje emulsionado de la mezcla
agua-fase oleosa.

Tabla 22. Actividad emulgente de los controles sobre el miristato de isopropilo, tetradecano y octano.

EMULGENTE FASE OLEOSA


Miristato de Isopropilo Tetradecano Octano
Tritón X-100 1 hora 68,75* 70,25 67,55
24 horas 65,5 65,85 62,4

Tween 20 1 hora 67,4 59,75 60,15


24 horas 61,7 63,85 61,85

Sugin 472 1 hora 53,5 54,45 57,45


24 horas 49,95 53,35 50

Polisorbato 60 1 hora 63,5 61,95 60,7


24 horas 62,5 61,3 61,05

Xantano 1 hora 100 93,05 95,1


24 horas 100 90,25 93,25
* Los resultados son la media de tres determinaciones e indican el porcentaje emulsionado de la mezcla
agua-fase oleosa.

205
Resultados y Discusión

Tabla 23. Actividad emulgente de los exopolisacáridos producidos por las bacterias halófilas X2, B40,
B100, N12, A16, M4, X8, Al12, Al15 y Al16 sobre el aceite de oliva, aceite de girasol, aceite mineral y
keroseno.

EMULGENTE FASE OLEOSA


Aceite oliva Aceite girasol Aceite mineral Keroseno
H. maura X2 1 hora 66,6* 65 67,5 75
24 horas 60 60 62,5 72,5

H. maura B40 1 hora 90 95 92,5 72,5


24 horas 67,5 75 70 60

H.maura B100 1 hora 85 100 100 100


24 horas 82,5 100 92,5 75

H. maura N12 1 horas 60 67,5 62,5 62,5


24 horas 52,5 62,5 57,5 60

H. maura A16 1 hora 55 90 85 65


24 horas 50 50 60 42,5

H. eurihalina M4 1 hora 77,5 80 82,5 82,5


24 horas 67,5 75 70 70

H. eurihalina X8 1 hora 55 67,5 85 85


24 horas 50 50 60 60

H. ventosae Al12 1 hora 55 57,15 57,8 62,5


24 horas 42,8 51 35,5 55

H. ventosae Al15 1 hora 55 62,5 62,5 62,5


24 horas 45 50 50 50

H. ventosae Al16 1 hora 66,6 65 67,5 67,5


24 horas 55 60 62,5 62,5
* Los resultados son la media de tres determinaciones e indican el porcentaje emulsionado de la mezcla
agua-fase oleosa.

206
Propiedades emulgentes

Tabla 24. Actividad emulgente de los exopolisacáridos producidos por las bacterias halófilas X2, B40,
B100, N12, A16, M4, X8, Al12, Al15 y Al16 sobre el miristato de isopropilo, tetradecano y octano.

EMULGENTE FASE OLEOSA


Miristato de Isopropilo Tetradecano Octano
H. maura X2 1 hora 62,5* 75 75
24 horas 60 70 70

H. maura B40 1 hora 80 90 77,5


24 horas 67,5 72,5 65

H.maura B100 1 hora 100 100 100


24 horas 75 62,5 70

H. maura N12 1 horas 50 60 60


24 horas 45 55 55

H. maura A16 1 hora 75 57,15 37,5


24 horas 50 34,5 30

H. eurihalina M4 1 hora 100 75 80


24 horas 70 67,5 72,5

H. eurihalina X8 1 hora 92,5 67,5 88,9


24 horas 62,5 57,5 55,5

H. ventosae Al12 1 hora 50 62,5 67,5


24 horas 25 57,5 57,5

H. ventosae Al15 1 hora 50 57,5 62,5


24 horas 30 47,5 50

H. ventosae Al16 1 hora 60 62,5 62,5


24 horas 55 60 60
* Los resultados son la media de tres determinaciones e indican el porcentaje emulsionado de la mezcla
agua-fase oleosa.

207
Resultados y Discusión

Tabla 25. Actividad emulgente de los exopolisacáridos producidos por las bacterias halófilas FP35, FP34,
FP36, M8, A3, B33, F23, R22, F32 y B35 sobre el aceite de oliva, aceite de girasol, aceite mineral y
keroseno.

EMULGENTE FASE OLEOSA


Aceite oliva Aceite girasol Aceite mineral Keroseno
H. anticariensis FP35 1 hora 50* 54,5 54,75 54,75
24 horas 40 47,5 47,5 40,5

H. anticariensis FP34 1 hora 62,5 65 65 67,5


24 horas 55 62,5 62,5 65,1

H. anticariensis FP36 1 hora 55 55 55 53,5


24 horas 42,5 46,5 50 42,8

H. almeriensis M8 1 hora 92,5 90 92,5 90


24 horas 67,5 65 67,5 65

S. mucosus A3 1 horas 65 71,5 87,5 90


24 horas 60 68,5 70 70

P. marisminoris B33 1 hora 100 100 100 100


24 horas 70 67,5 67,5 70

I. fontislapidosi F23 1 hora 65 67,5 65 65


24 horas 60 65 62,5 55

I. ramblicola R22 1 hora 82,5 77,15 80 85


24 horas 65 60 62,5 62,5

A. hispanica F32 1 hora 52,6 67,5 50 73,35


24 horas 40 55 50 66,65

A. hispanica B35 1 hora 52,5 62,5 65 66,65


24 horas 37,5 57,5 55 60
* Los resultados son la media de tres determinaciones e indican el porcentaje emulsionado de la mezcla
agua-fase oleosa.

208
Propiedades emulgentes

Tabla 26. Actividad emulgente de los exopolisacáridos producidos por las bacterias halófilas FP35, FP34,
FP36, M8, A3, B33, F23, R22, F32 y B35 sobre el miristato de isopropilo, tetradecano y octano.

EMULGENTE FASE OLEOSA


Miristato de Isopropilo Tetradecano Octano
H. anticariensis FP35 1 hora 42,5* 55 55
24 horas 32,5 45 50

H. anticariensis FP34 1 hora 62,5 62,5 62,5


24 horas 50 60 51,5

H. anticariensis FP36 1 hora 50 55 54,5


24 horas 32,5 42,5 42,5

H. almeriensis M8 1 hora 92,5 87,5 90


24 horas 70 62,5 65

S. mucosus A3 1 horas 84,25 90 80


24 horas 67,5 75 70

P. marisminoris B33 1 hora 100 100 100


24 horas 72,5 65 70

I. fontislapidosi F23 1 hora 67,5 62,5 75


24 horas 50 45 60

I. ramblicola R22 1 hora 85 77,5 76,6


24 horas 62,5 55 60

A. hispanica F32 1 hora 75 75 70


24 horas 72,5 50 55

A. hispanica B35 1 hora 67,5 65 75


24 horas 57,5 60 67,5
* Los resultados son la media de tres determinaciones e indican el porcentaje emulsionado de la mezcla
agua-fase oleosa.

209
Resultados y Discusión

El porcentaje de fase emulsionada que originan nuestros exopolisacáridos es prácticamente en


todos los casos es superior al 50% (Tablas 23-26). Destaca el poder emulgente de los exopolisacáridos
sintetizados por Halomonas maura cepa B100 y Palleronia marisminoris cepa B33, sobre todos los
sustratos oleosos ensayados; estos EPS consiguen porcentajes de emulsión del 100% en todos los
casos, excepto cuando la fase oleosa es el aceite de oliva y el emulgente el polímero B100, donde la
emulsión es del 85%.

La posibilidad de emulsionar el aceite de oliva y el aceite de girasol por parte de nuestros


biopolímeros es un hecho de interés a nivel alimentario. La emulsión aceite/agua es muy común en la
industria alimentaria, en concreto en la elaboración de salsas y aliños, así como en otros muchos
productos. El porcentaje de mezcla emulsionada por nuestros exopolisacáridos con ambos aceites es
como mínimo comparable, y en muchos casos superior, al obtenido con cualquiera de los emulgentes
químicos empleados como control en este estudio. Hemos de tener en cuenta que de los surfactantes
utilizados únicamente se encuentran aceptados como aditivos alimentarios además del xantano, el Tween
20 y Polisorbato 60, presentando estos dos últimos un menor poder emulgente que muchos de nuestros
EPS.

Tradicionalmente, en la industria alimentaria se utilizan como emulgentes de origen vegetal la


lecitina y sus derivados, así como la goma arábiga (Bloomberg, 1991), los cuales presentan ciertos
inconvenientes, como el ser inestable en determinados procesos industriales, en el primer caso, o el que
su producción se ve afectada por las condiciones climáticas, en el segundo (Whistler, 1993). A este nivel,
y con objeto de suplir estos problemas, algunos autores ya han descrito la utilidad de sustancias
poliméricas de elevada masa molecular con actividad emulgente (Klekner y Kosaric, 1993; Shepherd y
col., 1995), como sería el caso de nuestros polímeros. Estos emulgentes recubren las gotículas de aceite
dando lugar a emulsiones muy estables. Concretamente, ya se ha utilizado a nivel experimental para la
elaboración de aliños de ensaladas un bioemulgente producido por Candida utilis (Shepherd y col., 1995).

Los bioemulgentes también se han hecho un hueco en la industria cosmética (Brown, 1991). Por
ejemplo, Kao Chemical Corporation comercializa una formulación que contiene soforolípidos obtenidos de
Candida spp., para su uso como hidratante de la piel (Yamame, 1987).

Al margen de su posible aplicación en alimentación y cosmética, resulta interesante la capacidad


emulsionante de nuestros biopolímeros sobre hidrocarburos, en concreto hidrocarburos alifáticos lineales
como el keroseno, el tetradecano y el octano, lo que les proporciona potenciales aplicaciones en el sector
de la biorremediación del medio ambiente y procesos de recuperación y limpieza del petróleo y/o sus
derivados, ya que anualmente se producen en todo el mundo más de dos millones de toneladas métricas
de petróleo, y se considera que entre el 0,08 y el 0,4% de esta producción anual acaba contaminando
diversos hábitats oceánicos y terrestres (Bartha, 1986).

210
Propiedades emulgentes

Los bioemulgentes han encontrado la mayor parte de sus aplicaciones precisamente en estos
sectores. La biorremediación de hábitats contaminados con petróleo y sus derivados se encuentra
limitada en muchas ocasiones por la escasa disponibilidad de estos agentes hidrofóbicos para los
microorganismos. Así, la capacidad de estos agentes para emulsionar hidrocarburos favorece en muchas
ocasiones la degradación de estos compuestos altamente tóxicos presentes en medios acuáticos y
terrestres (Banat y col., 2000) al aumentar la solubilidad y con ello la biodisponibilidad de estos
compuestos para su utilización por otros microorganismos (Déziel y col., 1996; Lin, 1996). Este hecho se
ha puesto de manifiesto tanto para hidrocarburos alifáticos como policíclicos aromáticos (Begley y col.,
1996), y concretamente se han obtenido excelentes resultados con el alasano, un bioemulgente producido
por Acinetobacter radioresistens (Navon-Venezia y col., 1995; Barkay y col., 1999). Sin embargo, el
emulsano, un potente bioemulgente muy eficaz a bajas concentraciones, no es capaz de emulsionar
hidrocarburos alifáticos, aromáticos o cíclicos puros, sino únicamente mezclas de hidrocarburos en las
proporciones adecuadas (Rosemberg y Ron, 1999); por tanto, nuestros EPS, al igual que el alasano,
presentan la ventaja de emulsionar los hidrocarburos en solitario. La concentración de biosurfactante se
ha comprobado que no deber superar su concentración micelar crítica (CMC), ya que en algunos casos
puede llegar a inhibir el proceso al interferir en la adhesión bacteriana a las gotículas de hidrocarburo
(Stelmack y col., 1999).

En la industria del petróleo, de igual forma, la presencia de surfactantes acelera la degradación


del petróleo y sus derivados lo cual facilita el proceso de limpieza de los conductos y tanques petrolíferos
(Volkering y col., 1997; Banat y col., 2000).

Además de sus aplicaciones como bioemulgentes en alimentación, cosmética y especialmente


en procesos de biorremediación, podemos citar entre otros campos donde los bioemulgentes han
encontrado utilidad, su incorporación a detergentes o la elaboración de herbicidas y pesticidas
(Rosenberg y Ron, 1999). De igual modo, en los últimos años también se han descrito las potenciales
aplicaciones de biosurfactantes en diversos campos de la Medicina (Singh y Cameotra, 2004; Cameotra y
Makkar, 2004), como antimicrobianos, como antiadhesivos evitando la formación de biofilms en catéteres
y prótesis, o formando parte de formulaciones prebióticas para evitar infecciones del tracto urinario.

Al tratarse de bioemulgentes producidos por bacterias halófilas, nuestros EPS presentan


posibilidades únicas para su aplicación en condiciones extremas de salinidad, lo cual puede ampliar el
abanico de aplicaciones (Trebbau-de y McInerney, 1996, Desai y Banat, 1997; Cameotra y Makkar, 1998).

Por último, hemos de comentar que la producción de biopolímeros con poder emulgente también
se ha descrito en otras cepas del género Halomonas, concretamente Halomonas maura y Halomonas
eurihalina. En el primer caso se ha descrito la capacidad del EPS producido por al menos 6 cepas
bacterianas de esta especie para emulsionar varios hidrocarburos (Bouchotroch y col., 2000). Además, el
maurano (Arias y col., 2003), exopolisacárido producido por Halomonas maura cepa S30, es un

211
Resultados y Discusión

bioemulgente de naturaleza polisacarídica con elevada masa molecular que presenta una importante
actividad emulgente a destacar además de sobre el aceite de oliva o girasol sobre diversos hidrocarburos
y en especial el crudo de petróleo, y que además potencia el poder emulgente de surfactantes químicos
como el Tween 20 o Polisorbato 60. En cuanto a Halomonas eurihalina, se ha estudiado la actividad
emulgente de los polímeros producidos por las cepas F2-7, H28, H96, H212 y H214 (Calvo y col., 1998,
Martínez-Checa y col., 1996; 2002), siendo el sustrato más eficamente emulsionado el crudo de petróleo.
Por otra parte, se ha comprobado que estas bacterias son capaces de crecer y producir estos
bioemulgentes en medios con hidrocarburos y petróleo como fuente de carbono (Calvo y col., 2002;
Martínez-Checa y col., 2002).

La estabilidad de las emulsiones originadas por nuestros exopolisacáridos se ha comprobado


determinando el porcentaje de mezcla emulsionado tras 24 horas (Tablas 23-26). Tal y como puede
comprobarse, se produce una disminución en dicho porcentaje en casi todos los casos, probablemente
debido a una degradación del exopolisacárido, presentando mayor estabilidad las emulsiones preparadas
con los surfactantes químicos o el xantano. No obstante, el porcentaje de fase oleosa emulsionada por
nuestros polímeros tras 24 horas, en general, fue comparable al obtenido con el resto de los agentes
emulgentes empleados como control. A pesar de esta disminución se ha comprobado que estas
emulsiones permanecen estables para períodos de tiempo mayores sin mostrar signos de floculación,
coalescencia o sedimentación.

El tamaño y diámetro de las gotículas de la emulsión, determinado por procedimiento


microfotográfico, acoplando una cámara fotográfica a un microscopio, también resulta indicativo de su
estabilidad (Figuras 135 y 136). Las emulsiones de los EPS B100 de Halomonas maura y M4 de
Halomonas eurihalina con aceite de oliva o keroseno nos pueden servir como ejemplo; presentan un
tamaño de gotícula pequeño y uniforme lo que determina que dichas emulsiones sean estables y
homogéneas. El diámetro de las gotículas de estas emulsiones estuvo en todos los casos dentro de los
límites establecidos para las emulsiones en general (0,1-100 μm) (Swarbrick, 1998).

Figura 135. Emulsión aceite de oliva-agua (A) y keroseno-agua (B) estabilizada por el EPS B100 de Halomonas
maura. La barra mide 6 μm.

212
Propiedades emulgentes

Figura 136. Emulsión estabilizada por el EPS M4 utilizando keroseno. La barra mide 10 μm.

2.2. Poder tensioactivo

Hemos finalizado este estudio tratando de clasificar los exopolisacáridos en base al mecanismo
por el que son capaces de actuar como agentes emulgentes. Existen diversos mecanismos de acción
mediante los cuales un emulgente permite la interposición de dos fases inmiscibles entre sí. Uno de ellos
consiste en la disminución de la tensión superficial o interfacial de las distintas fases, en cuyo caso
hablamos de agentes surfactantes o tensioactivos. En otros casos el emulgente actúa estabilizando las
emulsiones, por un aumento de la viscosidad. Generalmente las moléculas de menor peso molecular
actúan como surfactantes y aquellas de peso molecular más elevado actúan estabilizando la emulsión
mediante un mecanismo diferente, sea el aumento de viscosidad u otro (Rosenberg y Ron, 1999).

Mediante la determinación de la tensión superficial de preparaciones acuosas a distintas


concentraciones de exopolisacárido determinamos si algunos de los EPS que presentaron buenas
propiedades emulgentes (X2, B40, B100, M4, Al12, B33 y F23) eran agentes tensioactivos o por el
contrario deben su poder emulgente a su elevada viscosidad en solución o a otro mecanismo de acción.
Como control se ha empleado el Polisorbato 60, un surfactante con poder tensioactivo, ampliamente
utilizado en la industria alimentaria y farmacéutica. Los resultados se han recogido en la Tabla 27.

Tabla 27. Tensión superficial (mN/m) de las preparaciones acuosas de los EPS X2, B40, B100, M4 Al12 y
F23, y del surfactante químico utilizado como control Polisorbato 60.

Concentración (% p/v)
Emulgente
0,25 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1
a
X2 54,5 52,5 50,7 46,6 ND ND 45,3 ND 44,8
B40 53,2 53 52,7 48,6 47,3 ND 48,4 ND 46,4
B100 53,3 53,8 53,3 49,4 ND 48,3 ND ND 47,5
M4 ND ND ND 54 54,1 53,6 53,4 49,3 49
Al12 50,4 49,3 45,8 46 ND ND 46 ND 46,1
B33 55,4 52,2 52,4 53 52,8 52,6 ND ND ND
F23 ND 53,2 ND 52 ND 52,6 49,2 47,8 47,4
Polisorbato 60 32,4 26,9 28,4 28,7 28,65 29,1 ND ND ND
a
, No determinado. En negrita y subrayado, la concentración de emulgente que se corresponde a la CMC. La medida
de la tensión superficial del agua fue 70,4 mN/m.

213
Resultados y Discusión

Nuestros exopolisacáridos no presentaron una actividad surfactante significativa, siendo la


disminución de la tensión superficial mucho que la obtenida utilizando Polisorbato 60, surfactante químico
empleado como control. A la concentración micelar crítica (CMC, mínima concentración de polímero a
partir de la cual no se origina una disminución considerable de la tensión superficial) únicamente se
consigue reducir la tensión superficial del agua hasta valores de aproximadamente 50 mN/m. Se
considera que un compuesto presenta actividad surfactante cuando, siendo la tensión superficial del agua
de 72 mN/m, la reduce aproximadamente hasta al menos 30 mN/m (Desai y Banat, 1997). Por tanto, los
polímeros ensayados se comportan como agentes emulgentes estabilizadores de las emulsiones, no
como surfactantes, aunque la disminución de la tensión superficial que hemos detectado podría contribuir
a la formación de las emulsiones.

2.3. Desproteinización de los exopolisacáridos Al12 y Al16. Electroforesis de proteínas

Como acabamos de comentar, nuestros EPS no deben su poder emulgente a una disminución
de la tensión superficial, es decir, no son surfactantes, más bien tienen esta propiedad por su capacidad
para estabilizar las emulsiones, como otros bioemulgentes de elevada masa molecular (Rosenberg y Ron,
1999). El EPS sintetizado por H. maura cepa B100, por ejemplo, al igual que el maurano producido por H.
maura S30 o el xantano, se comporta como un agente emulgente estabilizador de las emulsiones gracias
a su poder viscosizante. Sin embargo, la mayoría de los EPS aquí estudiados, originan soluciones de baja
viscosidad (Figura 118, Sección III, Capítulo 1, apartado 1.1. Viscosidad de las preparaciones acuosas de
los exopolisacáridos), por lo que su capacidad para estabilizar diversas mezclas oleoacuosas no se debe
a sus propiedades reológicas. Un hecho que hay que tener en cuenta es que nuestros exopolisacáridos
presentan en su composición química restos acetilo (Tabla 16, Sección II, Capítulo 2, apartado 2.1.
Análisis colorimétricos. Determinación de cenizas), los cuales imparten hidrofobicidad a la molécula
polisacarídica, algo que podría influir en la actividad emulgente de los polímeros, como ya ha sido descrito
para los EPS sintetizados por Arthrobacter viscosus (Novak y col., 1992) y Sphingomonas paucimobilis
(Ashtaputre y Shah, 1995). De igual modo, no podemos olvidar la presencia de una fracción proteica en la
composición química de los EPS (Tabla 16, Sección II, Capítulo 2, apartado 2.1. Análisis colorimétricos.
Determinación de cenizas), fracción que podría jugar un papel importante en el poder emulgente de los
biopolímeros. En otros EPS, parece ser que las proteínas (de carecer hidrófobo) se unen a la fase lipídica
de forma reversible y la cadena polisacarídica estabiliza la emulsión (Rosenberg y Ron, 1999).

Los exopolisacáridos Al12 y Al16, producidos por Halomonas ventosae, presentan una
considerable actividad emulgente (Tablas 23 y 24), tanto cuantitativa como cualitativamente, comparable
con los resultados obtenidos para algunos de los surfactantes químicos utilizados como control. Sin
embargo, sus soluciones acuosas son de muy baja viscosidad (Figura 118, Sección III, Capítulo 1,
apartado 1.1. Viscosidad de las preparaciones acuosas de los exopolisacáridos), por lo que no podemos
relacionar en absoluto este parámetro, la viscosidad de las soluciones acuosas, con su capacidad para
estabilizar emulsiones. Este hecho puede ser muy beneficioso para algunas de las potenciales

214
Propiedades emulgentes

aplicaciones biotecnológicas de los bioemulgentes, en las que un aumento considerable de la viscosidad


no es ni mucho menos deseable (Desai y Banat, 1997). Por tanto, nos propusimos determinar si las
proteínas detectadas en estos polisacáridos durante el estudio de su composición química, un 3,05 y un
3,95% p/p respectivamente, desempeñan un papel importante en las propiedades emulgentes de los
mismos.

Para ello eliminamos las proteínas de los polímeros por el método del fenol caliente (Westphal y
Jann, 1965); como pudimos comprobar por SDS-PAGE (Figura 137) y también gracias a la determinación
colorimétrica del contenido en proteínas de los EPS por el método de Bradford (1976), los EPS Al12 y
Al16 producidos por H. ventosae, perdieron por completo su porción proteica tras este tratamiento; una
vez conseguidos los correspondientes Apo-EPS (exopolisacáridos desproteinizados), procedimos a
determinar nuevamente su capacidad para estabilizar emulsiones; como puede apreciarse en la Tabla 28,
la actividad emulgente de los polímeros Apo-Al12 y Apo-Al16, fue menor a la mostrada por los
exopolisacáridos en estado nativo, lo que sugiere que las proteínas desempeñan un papel muy importante
en la actividad emulgente de estos biopolímeros, tal y como se ha descrito para otros polisacáridos
(Shepherd y col., 1995). Como la desproteinización por el método del fenol caliente es un proceso muy
agresivo, que podría haber causado modificaciones químicas adicionales a los EPS, además de la
pérdida de las proteínas, examinamos también el efecto de enzimas proteasas sobre los mismos, y
constatamos que tanto el tratamiento con tripsina como proteinasa K, provocaban también una pérdida
significativa de la actividad emulgente de los exopolisacáridos Al12 y Al16, como se observa en la Tabla
28.

Tabla 28. Actividad emulgente de los exopolisacáridos Al12 y Al16 de Halomonas ventosae en estado
nativo y tras ser sometidos a desproteinización química y enzimática sobre diversos sustratos.

FASE OLEOSA
EMULGENTE Aceite de Aceite de Aceite Keroseno Miristato de Tetradecano Octano
oliva girasol mineral isopropilo
Al12 42,8 51 35,5 55 25 57,5 57,5
Apo-Al12 33,5 37,5 25 37,5 17,5 33,5 50
Al12 + Tr* 37,5 37,5 27,5 35 10 42,8 50
Al12 + Pk* 35 33,5 22,5 33,5 12,5 37,5 35

Al16 55 60 62,5 62,5 55 60 60


Apo-Al16 33,5 37,5 37,5 33,5 33,5 25 42,8
Al16 + Tr 33,5 10 33,5 27,5 33,5 25 37,5
Al16 + Pk 25 35 37,5 37,5 27,5 33,5 37,5
* Tr: Tripsina; Pk: Proteinasa K. Los resultados son la media de tres determinaciones e indican el porcentaje
emulsionado de la mezcla agua-fase oleosa después de 24 horas.

215
Resultados y Discusión

1 2 3 4 5

97

66

45

30

2 0 .1

1 4 .4

Figura 137. SDS-PAGE de los exopolisacáridos en estado nativo y tras ser sometidos a desproteinización por el
T
método del fenol caliente (Apo-EPS) producidos por las cepas Al12 y Al16 de Halomonas ventosae. Los números de la
izquierda indican la masa molecular de los patrones en kilodaltons. Carril 2: Apo-Al12; Carril 3: Apo-Al16; Carril 4: EPS
Al12; Carril 5: EPS Al16.

El alasano, un bioemulgente producido por Acinetobacter radioresistens KA53 (Navon-Venezia y


col., 1995), es un complejo entre un polisacárido aniónico y una proteína de una masa molecular
aproximada de 1 MDa. La fracción polisacarídica del alasano es peculiar, ya que tiene alanina unida de
forma covalente. Como para los exopolisacáridos Al12 y Al16 sintetizados por Halomonas ventosae, la
fracción proteica del alasano parece desempeñar un papel crítico en su actividad emulgente (Navon-
Venezia y col., 1998). Esta fracción proteica a la que nos referimos, está constituida por tres elementos;
una de esas tres proteínas, denominada AlnA (identificada como una proteína OmpA, Toren y col.,
2002a), y que presenta un tamaño de unos 45 kDa, comparable a la principal fracción proteica del
exopolisacárido Al12 de Halomonas ventosae (Figura 137), tiene mayor actividad emulgente que el
alasano al completo (Toren y col., 2001), y es capaz de aumentar la solubilidad de diversos hidrocarburos
poliaromáticos (PAHs) (Toren y col., 2002b). Hay muy pocos trabajos en los que se haya descrito la
solubilización de PAHs por bioemulgentes de elevada masa molecular; además del alasano, Burd y Ward
(1996) demostraron que el bioemulgente producido por Pseudomonas marginalis PD-14D, un complejo
formado por el LPS y una proteína, es capaz de solubilizar PAHs. Por tanto, sería interesante estudiar la
acción de los EPS Al12 y Al16 de H. ventosae o de sus proteínas sobre este tipo de compuestos.

216
Captación de metales pesados

CAPÍTULO 3

ESTUDIO DE LA CAPTACIÓN DE METALES PESADOS

RESUMEN

La contaminación por metales pesados es un problema creciente en las últimas décadas.


Los metales pesados pueden llegar a ser muy tóxicos, lo que ha promovido la búsqueda de
soluciones al problema, y una de esas soluciones podría venir dada por la captación por
exopolisacáridos microbianos, debido en la mayoría de los casos a su carácter ácido. En base a
estos precedentes, hemos ensayado la capacidad para captar iones metálicos por parte de los EPS
que forman parte de este trabajo. Todos los EPS sintetizados por nuestras bacterias halófilas
fueron capaces de captar considerables cantidades de plomo, cobre y cobalto, destacando el EPS
2+
X2 de Halomonas maura, capaz de captar más de 53,5 mg Pb /g EPS. El cobalto fue el metal
captado con menor eficiencia por todos los exopolisacáridos. Por tanto, nuestros EPS podrían
utilizarse en el tratamiento de ecosistemas contaminados con metales pesados.

217
Resultados y Discusión

Tras determinar las propiedades viscosizantes y emulgentes de nuestros polímeros, procedimos


a evaluar sus propiedades como agentes secuestrante de metales pesados, partiendo de la base de que
se trata de polímeros de naturaleza ácida debido a la presencia de ácidos urónicos, así como otros
grupos inorgánicos tales como sulfatos y fosfatos.

El problema creciente de la contaminación por metales pesados de suelos, aguas y diversos


medioambientes, ha estimulado la búsqueda de nuevos mecanismos para retirar estos agentes
polucionantes. Entre ellos se ha propuesto el uso de biomasa bacteriana (López y col., 2000; 2002;
Ozdemir y col., 2003), así como la captación de metales por distintos componentes y productos
bacterianos, tales como los polisacáridos extracelulares y componentes de la pared celular (Tolley y
Macaskie, 1993; Volesky y Holan, 1995; Wilhelmi y Duncan, 1995; Dhami y col., 1998; Geddie y
Sutherland, 1993). También se ha propuesto la eliminación de metales pesados de efluentes con células
vivas, metabólicamente activas (Malik, 2004), lo que parece presentar numerosas ventajas frente al uso
de biomasa bacteriana, aunque hoy día el desarrollo de esta tecnología presenta límites que todavía no
han podido ser superados (Donmez y Asku, 2001).

Entre los mecanismos propuestos para la utilización de los microorganismos en la retirada de


metales pesados de áreas contaminadas, la interacción de los cationes metálicos con polisacáridos
extracelulares es uno de los procesos más rentables y eficaces. Otros mecanismos son: 1) acumulación
intracelular de los metales; 2) asociación de los metales a la pared celular; 3) interacción con los
sideróforos; 4) inmovilización de los metales en productos metabólicos bacterianos y 5) transformación y
volatilización de los metales (Ford y Mitchell, 1992). Para muchos de ellos se requiere la presencia de
células bacterianas “in situ”, mientras que en el caso de los EPS, su producción puede ser “ in situ” o bien
pueden ser adicionados sin necesidad de disponer de la cepa productora, lo cual facilita el modo de
operación y tratamiento de la zona (Kilbane, 1991).

Se ha apuntado que los exopolisacáridos microbianos reúnen los principales requisitos exigidos
para un transportador en la movilización de metales pesados. Los principales son su gran afinidad por el
contaminante (fundamentalmente gracias a su carácter ácido), y el hecho de que parecen ser
relativamente poco degradables por microorganismos del suelo, con lo que son aptos para ser
incorporados a ellos con la garantía de que pueden permanecer estables durante mayor tiempo. Ventajas
adicionales de estos productos son su aceptación pública y la posibilidad de poder ser producidos con alto
rendimiento bajo condiciones de producción óptimas y controladas (Chen y col., 1995a).

Siguiendo la metodología descrita por Geddie y Sutherland en 1993, hemos ensayado la


2+ 2+ 2+
capacidad de los EPS para retener diversos cationes metálicos: Pb , Cu y Co . El plomo ha sido
utilizado por el ser humano desde hace miles de años, y sus efectos tóxicos se conocen desde hace años
(Johnson, 1998). El cobre puede llegar a ser muy tóxico por su capacidad para formar radicales libres
(Rodríguez-Montelongo y col., 1993) y por sus interacciones con la membrana celular; todos estamos hoy

218
Captación de metales pesados

día expuestos al contacto con cobre, y es que todos los días tocamos monedas; sin embargo, deberíamos
ingerir 275 monedas para que la dosis de cobre fuera tóxica (Yelin y col., 1987). El cobalto es un metal de
toxicidad media (Nies, 1999), pero el polvo de cobalto podría causar enfermedades pulmonares (Nemery
y col., 1994). Los miligramos de metal captado por gramo de exopolisacárido tras contacto durante 24
horas se muestran en la Tabla 29. Los resultados mostrados se obtuvieron tras realizar tres experiencias
en las que se incrementó progresivamente la concentración de EPS, con objeto de asegurarnos de que la
cantidad de metal que quedaba remanente en solución, tras el ensayo, no podía ser retenida por el
exopolisacárido.

Tabla 29. Captación de metales pesados por los exopolisacáridos. Los resultados indican los miligramos
de metal captados por gramo de EPS.

Catión
EPS 2+
Cu Pb2+ Co2+
H. maura X2 14,25 >53,5* >10
H. maura B40 11,05 50,72 >10
H. maura B100 12,25 50,15 >10
H. maura N12 12,35 48,1 7,45
H. maura A16 12 51,25 8,65
H. eurihalina M4 18 24 >10
H. eurihalina X8 20,5 23,5 >10
H. ventosae Al12 12 24,8 2,5
H. ventosae Al15 18,15 24,8 2
H. ventosae Al16 27,6 25,7 10
H. anticariensis FP35 26,6 26,3 >10
H. anticariensis FP34 17,85 25 >10
H. anticariensis FP36 28,1 25,15 >10
H. almeriensis M8 19,2 24,5 >10
S. mucosus A3 15,75 43,5 8,75
P. marisminoris B33 24,8 44,5 >10
I. fontislapidosi F23 16,3 40 8
I. ramblicola R22 26,25 44,65 >10
A. hispanica F32 6,95 30 4
A. hispanica B35 16,75 43,5 8,65
* >, Supera la sensibilidad del aparato de espectrometría de adsorción atómica.

219
Resultados y Discusión

Pudimos comprobar que no se produce secuestro de ninguno de los metales pesados en


ausencia de exopolisacárido mediante el uso en estos ensayos de tripas de diálisis conteniendo
únicamente agua destilada. En estos casos la cantidad de metal retirada de la solución fue nula.

Por otra parte, parece obvio que las interacciones que se producen entre los polímeros y el metal
se basan en atracciones electrostáticas con los grupos químicos del EPS cargados negativamente, ya
que cuando se pusieron en contacto los exopolisacáridos con soluciones de arsenato sódico y cromato
potásico, no se detectó retención alguna de arsénico ni cromo, puesto que se encuentran en forma
aniónica en estas sales.

El plomo es el metal para el que todos los exopolisacáridos presentaron mayores niveles de
retención, destacando el polímero sintetizado por la cepa X2 de Halomonas maura, que es capaz de
2+
captar más de 53,5 mg Pb /g EPS, cantidad algo superior a la capturada por el maurano tras 24 horas de
incubación (Arias y col., 2003). Incluso el exopolisacárido F32 de Alteromonas hispanica, con poca
2+
capacidad para captar cobre y cobalto, es capaz de captar hasta 30 mg Pb /g EPS. La utilización de un
exopolisacárido microbiano de este tipo en procesos de biorremediación ofrece mejores resultados que
otros componentes de la pared celular, ya que por ejemplo el peptidoglicano de E. coli K-12 es capaz de
2+
unir una cantidad mucho menor de plomo (10,3 mg Pb /g peptidoglicano) (Hoyle y Beveridge, 1984). No
obstante, nuestros resultados están lejos de los 316 mg Pb2+/g EPS que capta el exopolisacárido
2+
sintetizado por Alteromonas macleodii subsp. fijiensis (Loaëc y col., 1998), o los 1103 mg Pb /g EPS
retenidos por el polisacárido de Bacillus firmus MS-102 (Salehizadeh y Shojaosadati, 2003). Un posible
camino a seguir para aumentar la capacidad de nuestros exopolisacáridos de captar metales pesados es
exponer progresivamente a los microorganismos que los sintetizan a concentraciones cada vez mayores
de iones metálicos (Guibaud y col., 2005). Esta exposición probablemente haría a los microorganismos
más resistentes a la polución por metales pesados; Kazy y colaboradores (2002) demostraron que la cepa
BU2 de Pseudomonas aeruginosa, mucho más resistente al cobre que la cepa BU1 de la misma especie,
producía una mayor cantidad de EPS, y además, este polímero poseía una mayor capacidad para quelar
cobre. Otra posibilidad es aplicar técnicas de biología molecular para modificar la estructura de los
exopolisacáridos, introduciendo en los microorganismos genes que puedan alterar el esqueleto
polisacarídico o las cadenas laterales, o modificar la composición en monosacáridos (Gutnick y Bach,
2000).

La capacidad para retener cobre por parte de los exopolisacáridos Al16 de Halomonas ventosae,
FP35 y FP36 de Halomonas anticariensis, B33 de Palleronia marisminoris y R22 de Idiomarina ramblicola
(Tabla 29) es comparable a la mostrada por la biomasa de la bacteria productora de exopolisacáridos
Ochrobactrum anthropi (Ozdemir y col., 2003), y muy superior a la captación de este metal demostradas
2+
por el EPS de Enterobacter cloaceae (Iyer y col., 2005), que solo puede captar entre 3,1 y 6,6 mg Cu /g
2+
EPS o Halomonas marina (Ford y col., 1987), que sólo capta 16,8 mg Cu /g EPS.

220
Captación de metales pesados

Para todos y cada uno de nuestros EPS, el cobalto es el metal secuestrado con menor eficacia
(Tabla 29); este hecho ha sido descrito para otros polisacáridos. Mientras que el exopolisacárido de
Enterobacter cloaceae presenta excelentes propiedades para la captación de cadmio, sólo puede captar
cantidades residuales de cobalto (Iyer y col., 2005). De igual manera, el EPS producido por
Chryseomonas luteola TEM05 se muestra también mucho más eficiente en la captación de cadmio que en
la de cobalto (Ozdemir y col., 2005).

Hay que tener en cuenta que la eliminación de las aguas del plomo y otros cationes metálicos es
de especial interés a causa de su gran toxicidad y a la frecuencia con la que se encuentran presentes en
los medios acuáticos tras ser liberados fruto de múltiples actividades antropogénicas en el medio
ambiente (Chen y col., 1995a). Se han detectado hasta 250 ppm de plomo en efluentes industriales, valor
que habría que reducir hasta 0,5 mg/l, cantidad permitida en las aguas de consumo (Crine, 1993).
Además, el plomo y otros cationes metálicos son especialmente contaminantes debido a su fuerte
adsorción fundamentalmente en suelos contaminados, lo que dificulta su eliminación (Jensen-Spaulding y
col., 2004).

Algunos factores que pueden afectar al proceso de captación son el tiempo, la temperatura y el
pH (Veglio y Beorchini, 1997). Es frecuente encontrar en la bibliografía que la captación de metales
pesados por parte de los exopolisacáridos microbianos es un proceso que comienza casi inmediatamente,
y que luego se incrementa con el tiempo, para finalmente estabilizarse, como se ha descrito por ejemplo
para la captación de metales por el maurano (Arias y col., 2003). Un incremento de la temperatura puede
ocasionar una disminución de los niveles de unión del exopolisacárido con los metales, como
consecuencia de un cambio en la estructura conformacional del polímero. En cuanto al pH, en
condiciones ácidas, puede dificultarse el proceso al existir mayor concentración de protones que compiten
por las cargas negativas del EPS (Geddie y Sutherland, 1993; 1994). Es por ello que estos ensayos de
captación los realizamos tras 24 horas de incubación, para estar seguros que se ha alcanzado el
equilibrio, a pH 7 y la temperatura seleccionada fue de 30ºC, siendo perfectamente estables nuestros
exopolisacáridos en estas condiciones.

En resumen, los exopolisacáridos sintetizados por nuestras bacterias seguramente desempeñan


un papel determinante en la ecología de los metales pesados de ambientes hipersalinos, al igual que se
ha descrito para EPS sintetizados por bacterias marinas (Bhaskar y Bhosle, 2006); además podrían ser
utilizados en procesos de biorremediación, por su capacidad para captar metales pesados,
probablemente debido a su carácter ácido (Wingender y col., 1999), fundamentalmente plomo, aunque se
hacen necesarios más estudios para terminar de conocer el mecanismo de acción por el que se produce
este fenómeno, ya que probablemente otros mecanismos además de las interacciones electrostáticas
juegan su papel en la captación de metales pesados por exopolisacáridos (Guibaud y col., 2005). Así
mismo tendríamos que determinar el efecto que sobre la captación tienen factores como el pH, la
concentración inicial de polisacárido, la concentración inicial de metal, la presencia de otros iones en el

221
Resultados y Discusión

medio, etc., ya que modificando estos factores seguramente variaran las cantidades de iones metálicos
retenidas.

Otro aspecto que podría estudiarse es la influencia de los grupos acetilo sobre la capacidad de
los exopolisacáridos de unirse a iones metálicos, como ha sido descrito para otros polímeros como los
alginatos bacterianos (Geddie, 1992). Fundamentalmente, la presencia o no de estos grupos, afecta a la
selectividad de interacción con cationes metálicos. La desacetilación de los exopolisacáridos determina
una mayor afinidad de unión con cationes monovalentes, tal y como describieron Geddie y Sutherland
(1993) para los polímeros producidos por Zoogloea ramigera o Rhizobium meliloti. Parece ser que en los
polímeros no desacetilados, los grupos acetilo originan una densidad de carga negativa mayor en la
proximidad de los sitios de unión favoreciendo la unión de cationes divalentes y a su vez de mayor
tamaño. Además, los sustituyentes acetilo originan una geometría irregular en la cadena polisacarídica, lo
cual condiciona el tipo de catión que puede incorporarse. De ahí que además de la valencia y carga de los
iones metálicos también sea determinante en el proceso de unión, su tamaño, radio iónico y geometría.
La desacetilación del maurano permite una mayor retención para la mayor parte de los cationes metálicos
ensayados (Arias y col., 2003), aunque para la captación de plomo esta modificación química del polímero
no resulta satisfactoria.

222
Actividad biológica

CAPÍTULO 4

ACTIVIDAD ANTIPROLIFERATIVA SOBRE CÉLULAS TUMORALES DE EPS SULFATADOS

RESUMEN

Los exopolisacáridos sulfatados son poco frecuentes entre los de origen microbiano. Sin
embargo, el grupo de microorganismos halófilos estudiados en este trabajo sintetizan en todos los
casos polímeros en cuya composición se han detectado grupos sulfato. Se ha descrito
previamente que determinados exopolisacáridos sulfatados tienen actividad moduladora de la
proliferación sobre distintos tipos celulares. En este trabajo hemos puesto de manifiesto la
actividad moduladora sobre la proliferación de células tumorales humanas de los
heteropolisacáridos FP34 de Halomonas anticariensis y B100 y N12 de Halomonas maura, y hemos
demostrado la importancia de los grupos sulfato en dicha actividad biológica, comparando la
acción de dichos polímeros con sus análogos sulfatados y desulfatados químicamente. Entre los
EPS ensayados destaca el producido por Halomonas maura B100; en estado nativo, es capaz de
inhibir en un 50,35% la proliferación de las células Jurkat, en un 47,75% la proliferación de las
células CEM, y en un 35,65% la proliferación de las células HEL. Este mismo polímero, tras ser
sometido a un proceso de sulfatación química disminuye dramáticamente la proliferación de estas
tres líneas celulares ensayadas, de manera que los porcentajes de inhibición de la proliferación
celular llegan a ser del 98,3%, 93,5% y 80%, respectivamente.

223
Resultados y Discusión

Aunque hasta hace unos años se pensaba que la presencia de grupos sulfato era exclusiva de
los polisacáridos de organismos eucariotas, se ha demostrado la existencia de estos grupos en algunos
exopolisacáridos microbianos. Así, además de estar presentes en polímeros de ciertas especies de
cianobacterias (Bar-Or y Shilo, 1987; Tease y Walker, 1987; Sudo y col., 1995), también se han
encontrado en el polisacárido producido por la arquea halófila Haloferax mediterranei, que se caracteriza
por una elevada masa molecular, además de por originar soluciones viscosas, presentando un 6% (p/p)
de sulfatos (Antón y col., 1988; Rodríguez-Valera y col., 1991), así como en un EPS de Staphylococcus
epidermis (Arvaniti y col., 1994). Algunas bacterias marinas (Matsuda y col, 1993; Guezennec y col.,
1994; Rougeaux y col., 1998; 1999) también se caracterizan por la detección de sulfatos en sus
exopolisacáridos; los polímeros de distintas especies de Arthrobacter (Inoue y col., 1988) o los
sintetizados por bacterias pertenecientes a distintos grupos taxonómicos aisladas del Antártico (Mancuso-
Nichols y col., 2005) presentan igualmente cantidades significativas de restos sulfato en su composición.

Todos los exopolisacáridos analizados en este trabajo presentaron en cantidades mayores o


menores grupos sulfato, como puede apreciarse en la Tabla X del Capítulo III. Composición química y
masa molecular de los exopolisacáridos. La presencia de grupos sulfato en nuestros exopolisacáridos es
una característica compartida con la mayoría de polisacáridos producidos por distintas cepas de
Halomonas eurihalina (Béjar y col., 1998; Calvo y col., 1998). De igual manera, el maurano, sintetizado
por Halomonas maura cepa S30, presenta en su composición química un 6,5% (p/p) de grupos sulfato
(Arias y col., 2003).

Los exopolisacáridos sulfatados presentan propiedades biológicas muy interesantes. La similitud


de estos EPS con la heparina debido su carácter sulfatado puede convertirlos en potenciales agentes
anticoagulantes y antitrombóticos, teniendo en cuenta que los grupos sulfato desempeñan un papel
crítico en la actividad antitrombótica de la heparina (Lindahl, 1999). Por otra parte, los polímeros
sulfatados pueden interferir en la adsorción y penetración de determinados retrovirus. Es por ello que
pueden ser empleados como antivirales (Nakashima y col., 1987; Bagasa y Lischner, 1988; Hasui y col.,
1995; Hayashi y Hayashi, 1996; Hayashi y col., 1996; Witvrouw y de Clercq, 1997; Cáceres y col., 2000;
Yim y col., 2004). En estos polímeros se ha puesto de manifiesto, de igual forma, una acción antitumoral
(Itoh y col., 1993; Riou y col., 1996; Haroun-Bouhedja y col., 2000; Sogawa y col., 2000; Patel y col.,
2002; Koyanagi y col., 2003; Matou y col., 2005). El cáncer es, a pesar de que a menudo se descubren
nuevas herramientas para el diagnostico y el tratamiento de la enfermedad, una de las principales causas
de muerte en todo el mundo. Por ello, la comunidad científica continúa a la búsqueda de nuevos
medicamentos con una mayor actividad y una menor toxicidad, entre los que parece que se pueden
encontrar los polisacáridos extraídos de plantas, algas, hongos, levaduras, setas, líquenes y bacterias (Lin
y col., 2003; Ooi y Liu, 2000; Franz y Alban, 1995).

Basándonos en la naturaleza sulfatada de los exopolisacáridos sintetizados por nuestras


bacterias, y de acuerdo a los antecedentes existentes, en este trabajo hemos estudiado la acción

224
Actividad biológica

moduladora sobre la proliferación de células cancerosas de los EPS producidos por Halomonas maura
B100 y N12 y por Halomonas anticariensis FP34, es decir, aquellos que presentaron una mayor cantidad
de restos sulfato en su composición, utilizando como controles estos mismos polímeros desulfatados e
hipersulfatados químicamente, para intentar poner de manifiesto la importancia de estos sustituyentes en
la actividad biológica de nuestros biopolímeros.

4.1. Desulfatación e hipersulfatación de los exopolisacáridos

La eliminación de los grupos sulfato de los exopolisacáridos sintetizados por Halomonas


anticariensis FP34 y Halomonas maura B100 y N12 se realizó por solvolisis a 100ºC. La sal pirimidínica
de cada uno de los exopolisacáridos se trató con metanol en dimetilsulfóxido durante 60 minutos, tiempo
tras el cual la reacción se detuvo por adición de agua. La desulfatación de los exopolisacáridos es un
proceso que comienza casi inmediatamente, y que aumenta progresivamente con el tiempo (Inoue y
Nagasawa, 1976; Haroun-Bouhedja y col., 2000). Tras este tratamiento la cromatografía de intercambio
iónico reveló que los tres exopolisacáridos objeto de estudio habían perdido por completo los grupos
sulfato presentes en la composición de los polímeros en estado nativo. La integridad de los
exopolisacáridos desulfatados se comprobó determinando por cromatografía de exclusión de alta
resolución la masa molecular de los mismos. Tal y como ha sido descrito para los fucanos sintetizados por
algas marrones (Haroun-Bouhedja y col., 2000), la desulfatación es un tratamiento que no llevó a la
degradación de los EPS, ya que su masa molecular se mantuvo del todo inalterada.

Calor

Figura 138. Sulfatación de polisacáridos con el complejo piridina-SO3 (Mähner y col., 2001)

La adición de restos sulfato a los exopolisacáridos FP34, B100 y N12 se realizó por el protocolo
de sulfatación directa de fucanos (Nishino y Nagumo, 1992) con el complejo piridina-SO3 (Figura 138).
Este tratamiento nos permitió obtener el polímero FP34 sulfatado, con un 7% (p/p) de sulfatos, el polímero
B100 sulfatado, con un 12,5% (p/p) de sulfatos, y el polímero N12 sulfatado, con un contenido del 17%

225
Resultados y Discusión

(p/p) en grupos sulfatos. Además del grado de sulfatación, otro parámetro a tener en cuenta a la hora de
evaluar un proceso de sulfatación es la masa molecular del polímero resultante, y es que la degradación
de los polisacáridos es un problema común durante la sulfatación (Engelskirchen, 1987; Whistler y
Spencer, 1961). Como para el proceso de desulfatación de los EPS, comprobamos por cromatografía
líquida de alta resolución que nuestros polímeros no habían sufrido ningún tipo de degradación tras el
tratamiento con el complejo piridina-SO3, ya que la masa molecular permaneció inalterada en todos los
casos. Posiblemente, hemos evitado la degradación de los exopolisacáridos gracias a la utilización de
bajas temperaturas en el protocolo de sulfatación (45ºC), y es que se ha comprobado que temperaturas
más elevadas y mayores cantidades del complejo piridina-SO3 pueden aumentar el grado de sulfatación
obtenido, aunque se produce una considerable disminución de la masa molecular de los productos así
conseguidos (Lu y col., 2000; Yang y col., 2002).

4.2. Actividad antiproliferativa sobre células hematopoyéticas de los exopolisacáridos con


distinto grado de sulfatación

Los ensayos de citotoxicidad se realizaron con tres estirpes de células humanas tumorales
hematopoyéticas, Jurkat, CEM y HEL. A partir de una concentración inicial de 12500 y 25000
células/pocillo, se ensayó la adición a cada uno de los cultivos de dosis crecientes de exopolisacárido.
Tras la incubación a 37º C en atmósfera de CO2, durante 24, 48 y 72 horas, procedimos a evaluar la
proliferación celular en cada caso, empleando para ello el compuesto MTT, el cual una vez incorporado
por las células vivas, y reducido a nivel mitocondrial, se transforma en el compuesto formazan, que da
una coloración violeta medida como absorbancia a una longitud de onda de 570 nm (Figura 139).

Figura 139. Test de proliferación celular empleando MTT (Mosman, 1983).

Las Figuras 140-148 muestran el efecto de los exopolisacáridos FP34 de Halomonas


anticariensis y B100 y N12 de Halomonas maura, en estado nativo y tras ser sometidos a los procesos de
sulfatación y desulfatación, sobre la proliferación de las células Jurkat, CEM y HEL (25000 células/pocillo).
Los resultados están expresados como el porcentaje de inhibición del crecimiento celular tras tres días de
incubación, y representan la media de al menos tres experimentos.

226
Actividad biológica

100
90
80
% Inhibición 70
60
50
40
30
20
10
0
500 50 5 0,5 0,05 0,005
Concentración EPS (μg/ml)

Nativo Sulfatado Desulfatado

Figura 140. Efecto sobre la proliferación de células Jurkat de los EPS de Halomonas anticariensis FP34.

100
90
80
70
% Inhibición

60
50
40
30
20
10
0
500 50 5 0,5 0,05 0,005
Concentración EPS (μg/ml)

Nativo Sulfatdo Desulfatdo

Figura 141. Efecto sobre la proliferación de células CEM de los EPS de Halomonas anticariensis FP34.

227
Resultados y Discusión

100
90
80
% Inhibición 70
60
50
40
30
20
10
0
500 50 5 0,5 0,05 0,005
Concentración EPS (μg/ml)

Nativo Sulfatado Desulfatado

Figura 142. Efecto sobre la proliferación de células HEL de los EPS de Halomonas anticariensis FP34.

100
90
80
70
%Inhibición

60
50
40
30
20
10
0
500 50 5 0,5 0,05 0,005
Concentración EPS (μg/ml)

Nativo Sulfatado Desulfatado

Figura 143. Efecto sobre la proliferación de células Jurkat de los EPS de Halomonas maura B100.

228
Actividad biológica

100
90
80
% Inhibición 70
60
50
40
30
20
10
0
500 50 5 0,5 0,05 0,005
Concentración EPS (μg/ml)

Nativo Sulfatado Desulfatado

Figura 144. Efecto sobre la proliferación de células CEM de los EPS de Halomonas maura B100.

100
90
80
70
%Inhibición

60
50
40
30
20
10
0
500 50 5 0,5 0,05 0,005
Concentración EPS (μg/ml)

Nativo Sulfatado Desulfatdo

Figura 145. Efecto sobre la proliferación de células HEL de los EPS de Halomonas maura B100.

229
Resultados y Discusión

100
90
80
70
% Inhibición

60
50
40
30
20
10
0
500 50 5 0,5 0,05 0,005
Concentración EPS (μg/ml)

Nativo Sulfatado Desulfatado

Figura 146. Efecto sobre la proliferación de células Jurkat de los EPS de Halomonas maura N12.

100
90
80
70
% Inhibición

60
50
40
30
20
10
0
500 50 5 0,5 0,05 0,005
Concentración EPS (μg/ml)

Nativo Sulfatado Desulfatado

Figura 147. Efecto sobre la proliferación de células CEM de los EPS de Halomonas maura N12.

230
Actividad biológica

100
90
80
70
% Inhibición

60
50
40
30
20
10
0
500 50 5 0,5 0,05 0,005
Concentración EPS (μg/ml)

Nativo Sulfatado Desulfatado

Figura 148. Efecto sobre la proliferación de células HEL de los EPS de Halomonas maura N12.

Los exopolisacáridos FP34, B100 y N12, así como sus análogos sulfatados y desulfatados
químicamente, redujeron la proliferación de las células Jurkat, CEM y HEL de una manera dosis-
dependiente. Este efecto es detectable incluso a bajas concentraciones de exopolisacárido (0,005 μg/ml)
y aumenta con el contenido en grupos sulfato (Figuras 149-151) y la dosis de EPS empleada, alcanzando
máximos de inhibición de la proliferación celular comprendidos entre 53,5 y 98,3% para los
exopolisacáridos sulfatados químicamente a una concentración de 500 μg/ml.

100

80
% Inhibición

60

40

20

0
0 2,25 7
Grupos sulfato (% p/p)

Jurkat CEM HEL

Figura 149. Influencia de los grupos sulfato en la actividad antiproliferativa del EPS FP34 de Halomonas anticariensis,
tras 72 horas de incubación, a una concentración de 500 μg/ml.

231
Resultados y Discusión

100

80

% Inhibición
60

40

20

0
0 7,9 12,5
Grupos sulfato (% p/p)

Jurkat CEM HEL

Figura 150. Influencia de los grupos sulfato en la actividad antiproliferativa del EPS B100 de Halomonas maura, tras 72
horas de incubación, a una concentración de 500 μg/ml.

100

80
% Inhibición

60

40

20

0
0 2,45 17
Grupos sulfato (% p/p)

Jurkat CEM HEL

Figura 151. Influencia de los grupos sulfato en la actividad antiproliferativa del EPS N12 de Halomonas maura, tras 72
horas de incubación, a una concentración de 500 μg/ml.

Hay que destacar que, como bien puede apreciarse en las Figuras 140-148, los exopolisacáridos
FP34, B100 y N12 desulfatados por solvolisis en dimetilsulfóxido, también presentan actividad inhibitoria
de la proliferación celular en mayor o menor medida, lo que nos lleva a pensar que el contenido en grupos
sulfato no es el único parámetro determinante de la actividad biológica de nuestros exopolisacáridos; sin
embargo, como muestran las experiencias que hemos realizado, la actividad antiproliferativa de los
polímeros hipersulfatados es considerablemente mayor a la de los EPS en estado nativo y desulfatados,
lo que nos lleva a pensar que esta acción biológica está específicamente relacionada con la presencia de

232
Actividad biológica

estos grupos sulfato. Haroun-Bouhedja y colaboradores (2000) pusieron de manifiesto que la actividad
antiproliferativa sobre células malignas de fucanos sulfatados obtenidos a partir de algas marrones,
depende no sólo del contenido en restos sulfato de los mismos, sino que hay otros factores implicados en
la acción biológica de estos EPS, como la masa molecular, otras cargas negativas distintas a las
aportadas por los sulfatos, y la distribución de las cargas negativas, distribución que puede constituir un
patrón determinante para el reconocimiento de señales biológicas envueltas en los procesos de
proliferación celular, y con ello interferir en tales procesos. Por tanto, y en definitiva, la acción
antiproliferativa de nuestros exopolisacáridos depende, aunque no exclusivamente, del contenido en
sulfatos de los mismos. Estos resultados están en concordancia con los obtenidos en muchos estudios
con otros exopolisacáridos sulfatados y otras líneas celulares (Koyanagi y col., 2003; Ellouali y col., 1994;
Tiozzo y col., 1991; 1993; Vischer y Buddecke, 1991).

Todos los exopolisacáridos ensayados presentan actividad antiproliferativa, y esta acción está
directamente relacionada, como hemos visto, con su contenido en grupos sulfatos, y también con la dosis
de exopolisacárido empleada, es decir, es un efecto dosis-dependiente. Esta relación entre la cantidad de
exopolisacárido presente en el medio de cultivo empleado para el desarrollo de las células y el porcentaje
de inhibición de la proliferación celular ha sido descrita para una gran cantidad de polisacáridos de distinto
origen (Cao y Lin, 2006; Bae y col., 2005; 2006). Sin embargo, un dato importante que debemos destacar
es que la actividad moduladora de la proliferación celular de nuestros exopolisacáridos es independiente
del tiempo de incubación; así, los porcentajes de inhibición del crecimiento de las distintas líneas celulares
empleadas en este trabajo son máximos tras 72 horas de incubación a 37ºC con un 5% de CO2 (Figuras
X), pero prácticamente iguales a los obtenidos tras 24 y 48 horas de incubación (datos no mostrados).
Estos resultados discrepan con los de otros autores, que han encontrado que para otros polisacáridos de
origen diverso y distintas líneas celulares, la acción antitumoral está estrechamente relacionada con el
tiempo de incubación, de manera que cuanto más tiempo dejamos transcurrir, mayor es el porcentaje de
inhibición de la proliferación celular (Zhang y Huang, 2005; 2006; Lin y col., 2003).

Como ya hemos comentado al comenzar este capítulo, hasta hace pocos años se pensaba que
la presencia de grupos sulfato era una característica química exclusiva de los polisacáridos de origen
eucariota; sin embargo, hoy día sabemos que esto no es cierto, y es que como hemos comentado, cada
vez se describen más exopolisacáridos microbianos sulfatados (Bar-Or y Shilo, 1987; Tease y Walker,
1987; Sudo y col., 1995; Antón y col., 1988; Rodríguez-Valera y col., 1991; Arvaniti y col., 1994; Matsuda
y col, 1993; Guezennec y col., 1994; Rougeaux y col., 1998; 1999; Inoue y col., 1988; Mancuso-Nichols y
col., 2005; Béjar y col., 1998; Calvo y col., 1998; Arias y col., 2003). A pesar de todo, son muy pocos los
trabajos publicados acerca de la actividad biológica de exopolisacáridos sulfatados extraídos de bacterias,
todo lo contrario a lo que ocurre con los polímeros obtenidos a partir de eucariotas, como plantas, hongos,
setas, algas, etc. Así, el exopolisacárido V2-7, sintetizado por Halomonas eurihalina, estimula el sistema
inmune (Pérez y col., 2000). Alteromonas infernus, produce un EPS ácido constituido por glucosa,
galactosa, ácido glucurónico y ácido galacturónico, con un 10% (p/v) de restos sulfato, y que ha

233
Resultados y Discusión

demostrado poseer una considerable actividad anticoagulante (Colliec-Jouault y col., 2001), sobre todo
tras ser sometido a un proceso de hipersulfatación con el complejo piridina-SO3. Así mismo, el
polisacárido sintetizado por Escherichia coli K5, tras ser sulfatado químicamente, ha demostrado que
podría utilizarse en una terapia anti-VIH, virus causante del SIDA, o al menos, servir como base para el
desarrollo de nuevos medicamentos contra esta enfermedad (Urbinati y col., 2004).

Por tanto, los estudios de actividad antitumoral realizados con nuestros exopolisacáridos,
sintetizados por bacterias halófilas, podrían ser pioneros en este campo, y podrían constituir la base para
la selección de nuevos agentes anticancerosos, y es que cada vez es mayor el interés en buscar
productos de origen natural con esta actividad biológica, y efectos secundarios menores a los que
presentan los quimioterápicos utilizados en la actualidad (Deshpande y col., 1997; Lee, 2004). De los tres
exopolisacáridos estudiados (FP34, B100 y N12), el que presenta las mejores perspectivas de ser
utilizado algún día en la terapia anticancerosa, es el polímero B100 sintetizado por Halomonas maura. En
estado nativo, tal y como es excretado por la bacteria al medio de cultivo, es capaz de inhibir en un
50,35% la proliferación de las células Jurkat, en un 47,75% la proliferación de las células CEM, y en un
35,65% la proliferación de las células HEL (Figuras X), cuando es administrado a una población de 25000
células a una dosis de 500 μg/ml, tras tres días de incubación a 37ºC en atmósfera de CO2. Estos
resultados son de por sí prometedores, pero es que este mismo polímero, tras ser sometido a un proceso
de sulfatación química con el complejo piridina-SO3, disminuye dramáticamente la proliferación de estas
tres líneas celulares ensayadas, en las mismas condiciones antes expuestas, de manera que los
porcentajes de inhibición de la proliferación celular llegan a ser del 98,3%, 93,5% y 80%, respectivamente.

Por ejemplo, el exopolisacárido extraído de Lycium barbarum, una planta utilizada desde hace
miles de años por la medicina tradicional china, es capaz de inhibir un 30% la proliferación de las células
malignas QGY7703, tras 4 días de incubación, y además a una concentración mucho más elevada, 100
mg/ml (Zhang y col., 2005). El alga marrón Ascophyllum nodosum es capaz de sintetizar un fucano de
baja masa molecular con un contenido del 27% (p/v) en grupos sulfato; este polímero inhibe la
proliferación de las células CCL39 hasta en un 100%, tras 4 días de incubación, aunque también a dosis
mayores a la máxima empleada en nuestro estudio, 1000 μg/ml (Haroun-Bouhedja y col., 2000). Cladonia
furcata es un liquen que crece con frecuencia en muchos bosques del mundo, también es España, y a
partir del cual se puede obtener un polisacárido denominado CFP-2, el cual, administrado a una
concentración de 800 mg/l, y tras 6 días de incubación, inhibe en un 70% la proliferación de las células
HL-60 y en un 60% la proliferación de las células K562 (Lin y col., 2003). Los polisacáridos extraídos a
partir de las setas, también poseen una considerable actividad antitumoral (Cheung y col., 2002; Wasser,
2002). Por ejemplo, el polímero obtenido a partir de Phellinus gilvus, es capaz, a una concentración de
300 μg/ml, y tras 48 horas de incubación, inhibir aproximadamente en un 90% la proliferación de las
células cancerosas TMK-1 y B16F10 (Bae y col., 2005; 2006). El problema de la utilización de estos
polisacáridos extraídos de hongos y setas en terapia anticancerosa, es que para obtener la seta en las
condiciones apropiadas para la extracción del polímero, hay que cultivarla durante unos 90 días (Jo y col.,

234
Actividad biológica

2002), mientras que nuestros polisacáridos, extraídos igualmente de una fuente inagotable y renovable,
como son los microorganismos, son obtenidos por un proceso mucho más rápido y mucho menos
laborioso (Quesada y col., 1993). Algunos polímeros procedentes de hongos y setas, y después de
numerosos estudios, como los extraídos de Lentinus edades, Schizophyllum commune y Coriolus
versicolor, (Chiara y col., 1970; Tsukagoshi y Ophashi, 1974), se utilizan hoy día como adyuvantes en la
terapia anticancerosa (Bae y col., 2005), lo que nos invita a pensar que los exopolisacáridos sulfatados
producidos por nuestras bacterias halófilas podrían seguir el mismo camino y convertirse en agentes
antitumorales empleados por los oncólogos en la lucha contra el cáncer.

Sin embargo, muchos son los pasos que aún debemos dar para que nuestra investigación llegue
a buen puerto; por ejemplo deberíamos ampliar el abanico de células malignas sobre las cuales nuestros
exopolisacáridos son efectivos, disminuyendo la proliferación celular; de igual manera, deberíamos
comprobar la toxicidad de los polímeros sobre células no cancerosas; Bae y colaboradores (2003; 2006)
han demostrado in vivo la nula toxicidad del exopolisacárido extraído a partir de una seta, Phellinus gilvus,
a las dosis administradas por vía oral a animales de experimentación; este hecho es fundamental, porque
como ya hemos comentado, es creciente en nuestros días el interés por los productos de origen natural,
con actividad antitumoral, y con una menor toxicidad que los compuestos normalmente empleados en
quimioterapia, muy agresivos (Deshpande y col., 1997; Lee, 2004).

Igualmente se hace imprescindible conocer el mecanismo por el cual los exopolisacáridos


sintetizados por nuestros microorganismos halófilos presentan esta acción antitumoral; el elevado peso
molecular de los mismos, nos hace pensar que estas macromoléculas no son capaces de interaccionar
directamente con enzimas y orgánulos intracelulares; más bien, nos inclinamos a pensar en la posibilidad
de que los exopolisacáridos FP34 de Halomonas anticariensis y B100 y N12 de Halomonas maura son
capaces de inhibir la proliferación de las células malignas ensayadas por una inducción de la apoptosis, y
en esa dirección se dirigirán nuestros esfuerzos más inminentes, y es que la muerte celular en los
procesos tumorales, ya sea inducida o natural, se da más por apoptosis que por necrosis (Wyllie y col.,
1980; Arend y col., 1990).

La apoptosis o “muerte celular programada” es una forma de suicidio celular genéticamente


definida, que ocurre de manera fisiológica durante la morfogénesis, la renovación tisular y en la regulación
del sistema inmunitario (Oppenheim, 1991; Barres y col., 1992). Determinados hechos celulares pueden
ser explicados por trastornos en la regulación de los genes responsables de la apoptosis, como es el caso
de la transformación y la progresión tumorales. Debido a que la apoptosis puede considerarse como un
proceso de eliminación de células defectuosas, la desregulación de los genes que codifican las proteínas
relacionadas con la apoptosis, puede ser la causa del desarrollo de diversos tumores (Korsmeyer, 1992).

Las características de la célula apoptótica difieren de las observadas en las células que sufren
necrosis. En este último fenómeno la muerte es un proceso “pasivo” que no requiere síntesis de

235
Resultados y Discusión

proteínas, y es causado por la pérdida de la homeostasis. Se caracteriza por daño mitocondrial, rotura de
la membrana, lisis celular y liberación de su contenido al medio extracelular (Wyllie y col., 1980; Raff,
1992). Por el contrario, la apoptosis, es un proceso activo que implica síntesis proteica, en el cual la célula
sufre una condensación nuclear y citoplasmática. Durante el proceso final se produce la fragmentación del
ADN debido a una ruptura internucleosomal del ADN, y se forman fragmentos nucleares recubiertos de
membrana (cuerpos apoptóticos), que son fagocitados sin evidencia de inflamación (Cohen, 1993; Wyllie
y col., 1984). Muchas de las proteínas sintetizadas durante el proceso de apoptosis (por ejeplo, NUC-18,
DNAsa I, DNAsa II; Peitsch, 1994) son enzimas calcio dependientes, por lo que la concentración de iones
2+
Ca en la célula es un parámetro muy importante en la apoptosis. Los genes de la familia Bcl-2 juegan un
papel fundamental en el fenómeno apoptótico. El destino de una célula de morir o sobrevivir está
determinado por las diferencias en la expresión de las proteínas sintetizadas por los genes de esta
familia, actuando unas como promotoras, y otras como inhibidoras de las señales de apoptosis (Boise y
col., 1993; 1995).

Gymnodinium A3 cepa OKU-1 (Hasui y col., 1995) es un microalga capaz de sintetizar un


exopolisacárido sulfatado que ha mostrado una gran capacidad citotóxica hacia diversas líneas de células
tumorales humanas, como son las células MT-4, CEM y K562; parece ser que el mecanismo por el cual
actúa este polisacárido es una inducción de la apoptosis, y concreto en el caso de las células K562, esa
apoptosis parece estar inducida por la inhibición del enzima ADN Topoisomerasa I (Sogawa y col., 1998;
2000). Ya hemos hablado del polisacárido sintetizado por la seta Phellinus gilvus, que es capaz de inhibir
aproximadamente en un 90% la proliferación de las células cancerosas TMK-1 y B16F10 (Bae y col.,
2005; 2006); en este caso también se ha demostrado que el efecto citotóxico se debe a la inducción de la
apoptosis en estas células malignas. El exopolisacárido obtenido a partir de una seta de la misma familia,
Phellinus linteus ha mostrado a su vez una acción antiproliferativa en células SW480, y esta propiedad se
ha atribuido a su capacidad de promover el fenómeno de apoptosis, y es que la expresión del gen anti-
apoptosis Bcl-2 s encuentra muy disminuida tras el tratamiento de las células cancerosas con el polímero
(Li y col., 2004). Un mecanismo similar ha sido descrito para el polisacárido producido por Misgurnus
anguilliacaudatus, otra seta, que induce apoptosis en las células tumorales SMMC-7721, por represión del
gen Bcl-2, y una expresión aumentada del gen Bax, pro-apoptosis (Zhang y Huang, 2006). De igual modo,
el extracto acuoso del exopolisacárido producido por Pleurotus ostreatus induce apoptosis en las células
HT-29, en las que se ha encontrado, tras el tratamiento con el polímero, una expresión aumentada del
gen Bax.

Por tanto, nuestros esfuerzos en un futuro cercano se van a centrar en intentar dilucidar el
mecanismo por el cual nuestros EPS, fundamentalmente el polímero B100 de Halomonas maura y su
análogo hipersulfatado, presentan esta marcada acción sobre células cancerosas. De igual modo vamos
a evaluar su seguridad ante la posibilidad de ser utilizados en el futuro como agentes antitumorales,
ensayando su toxicidad sobre células no malignas, y vamos a comprobar su actividad in vivo, en animales
de experimentación.

236
Obtención de L-fucosa

CAPÍTULO 5

EXOPOLISACÁRIDOS MICROBIANOS COMO FUENTE DE L-FUCOSA

RESUMEN

La síntesis química de fucosa es un proceso largo, laborioso, de bajo rendimiento y caro.


Por tanto, la hidrólisis química o enzimática de EPS microbianos ricos en este azúcar abre nuevas
líneas de investigación para una obtención eficaz y rentable de este monosacárido. El análisis por
GLC y GC-MS de los EPS reveló la presencia de fucosa en proporciones importantes en la
composición de los polímeros N12 y A16 de Halomonas maura (25,69 y 16% p/p, respectivamente)
y A3 de Salipiger mucosus (13,4% p/p). Independientemente del interés que puede tener la
obtención de fucosa en sí, por su alto coste económico, este azúcar y los oligo/polisacáridos ricos
en fucosa presentan un interés especial por sus aplicaciones en medicina y cosmética.

237
Resultados Y Discusión

En los últimos años, algunos homo y (especialmente) heteropolisacáridos microbianos, se están


teniendo en cuenta como potenciales fuentes de inusuales pero muy valiosos azúcares, como por ejemplo
es el caso de la fucosa. La síntesis química de la fucosa es un proceso largo, muy laborioso, de bajo
rendimiento y caro (Tanimura, 1961; Chiba y Tejima, 1979; Defaye y col., 1984; Gesson y col., 1992;
Dejter-Juszynski y Flowers, 1973; Kristen y col., 1988; Sarbajna y col., 1995). Por tanto, la hidrólisis
química o enzimática de exopolisacáridos microbianos ricos en este azúcar abre nuevas líneas de
investigación para una obtención eficaz y rentable de este monosacárido. Se han descrito distintas
bacterias, hongos y algas productores de exopolisacáridos en cuya composición podemos encontrar
fucosa en mayor o menor medida (Vanhooren y Vandamme, 1999), destacando Klebsiella pneumoniae
cepa ATCC 12657 y Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis cepa LMG 5604 (Vanhooren, 1997).

Klebsiella pneumoniae cepa ATCC 12657 produce, utilizando glucosa como fuente de carbono y
controlando el pH a 6,5, un exopolisacárido que contiene un 18,9% p/p de fucosa; teniendo en cuenta que
este microorganismo es capaz de sintetizar 2,5 g/l de EPS, la hidrólisis eficaz de este polímero permitiría
obtener unos 0,5 g/l de fucosa libre. Vanhooren y colaboradores (1997) han aislado diversas enzimas
(denominadas genéricamente EPSasas) de microorganismos que son capaces de crecer utilizando como
única fuente de carbono y energía el exopolisacárido producido por Klebsiella pneumoniae cepa ATCC
12657, y en la actualidad están estudiando el uso de las mismas para conseguir liberar fucosa de este
biopolímero.

Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis cepa LMG 5604 produce en condiciones


óptimas de cultivo 20 g/l de un exopolisacárido, denominado clavano, el cual contiene un 37,5% p/p de
fucosa; por tanto, una hidrólisis eficiente de este polímero podría suponer la obtención de 7,5 g/l de
fucosa. Vanhooren y colaboradores (1997) ensayaron la adición de un 2% de pectinasa TLQ a los cultivos
de este microorganismo, con la intención de, por un lado, disminuir la viscosidad de los mismos, y por
otro, obtener fucosa libre. En estos ensayos, se consiguió disminuir un 85% la viscosidad de los cultivos,
pero en ningún caso se consiguió obtener fucosa libre. Por tanto, este Grupo de Investigación ha seguido
la misma táctica que para el caso de Klebsiella pneumoniae cepa ATCC 12657, aislando del suelo
microorganismos capaces de crecer con clavano como única fuente de carbono y energía; Streptomyces
sp. YSDL-20 ha sido la cepa seleccionada para la despolimerización de este exopolisacárido (Yemmas y
Vandamme, 2001; 2002; Yemmas y col., 2003).

Independientemente del interés que puede tener la obtención de fucosa en sí, por su alto coste
económico, este azúcar y los oligo/polisacáridos ricos en fucosa presentan un interés especial por sus
aplicaciones en medicina y cosmética. En 2003, Peterszegi y colaboradores consiguieron preparar por
hidrólisis enzimática de un exopolisacárido bacteriano de alto peso molecular rico en fucosa,
oligosacáridos (FROPs) que presentaron diversas propiedades biológicas, como la estimulación de la
proliferación de fibroblastos y protección contra la citotoxicidad mediada por ascorbato debido a la
liberación de agentes oxidantes (ROS). Los FROPs, administrados junto a las vitaminas A, C y E, han

238
Obtención de L-fucosa

mostrado también un efecto favorable en la actividad biosintética de los fibroblastos (Robert y col.,
2004a), y se han mostrado altamente eficaces en el control de las modificaciones que se producen en la
piel a causa del envejecimiento (Robert y col., 2004b). En 2005, Robert y colaboradores prepararon una
formulación cosmética a base de FROPs, y la probaron en un grupo de 20 mujeres voluntarias, en un
tratamiento de 4 semanas contra las arrugas que se forman con la edad cerca de los ojos, las llamadas
“patas de gallo”, y obtuvieron resultados realmente prometedores, aunque detectaron que cada “pata de
gallo” es prácticamente única e inconfundible, ya que el tratamiento, aunque eficaz en la mayoría de los
casos (todos excepto en dos mujeres), variaba entre mujeres, e incluso en la misma voluntaria de un ojo a
otro.

En otro orden de cosas, y ya en el campo de la medicina, Isnard y colaboradores (2005) han


demostrado que una dosis de 0,5 mg/ml de fucosa es capaz de regenerar en apenas 24 horas las heridas
causadas en corneas de conejo, por lo que otra posible aplicación de la fucosa y los FROPs podría ser el
tratamiento local de las heridas que se pudieran producir en la cornea.

Otra aplicación de los FROPs es su utilización en la prevención de la diarrea infantil, una de las
causas más frecuentes de mortalidad infantil. Se ha demostrado (Ruiz-Palacios y col., 2003) que el primer
paso en la patogenia de Campylobacter jejuni, el principal causante de este mal, es la unión del mismo a
la mucosa intestinal, y que esta unión está fuertemente inhibida por los fucosiloligosacáridos que se
encuentran formando parte de la composición de la leche materna. La utilización de estos oligosacáridos
como ingredientes activos en alimentos infantiles está limitada en la actualidad por la capacidad de la
comunidad científica de producirlos en cantidad suficiente para evaluar su eficacia y su seguridad. La
síntesis química o enzimática de los mismos es muy cara, por lo que la producción de oligo/polisacáridos
ricos en fucosa a partir de microorganismos es una nueva línea de investigación que puede cumplir las
expectativas creadas a este respecto (Newburg y col., 2005).

Como vimos en el Capítulo 2 de la Sección II de este trabajo, el análisis por GLC y GC-MS de los
EPS reveló la presencia de fucosa en proporciones importantes en la composición de los polímeros N12 y
A16 de Halomonas maura (25,69 y 16% p/p, respectivamente) y A3 de Salipiger mucosus (13,4% p/p), y
en menores cantidades en las fracciones de elevado peso molecular de los polisacáridos Al15 de
Halomonas ventosae y F23 de Idiomarina fontislapidosi. Por tanto, en la actualidad, nuestro Grupo de
Investigación se encuentra poniendo a punto la tecnología necesaria para la obtención de fucosa libre y
oligosacáridos ricos en fucosa a partir de los exopolisacáridos N12 y A16 de Halomonas maura y A3 de
Salipiger mucosus. Concretamente, en estos momentos estamos ensayando la hidrólisis enzimática de
los exopolisacáridos.

Una vez conseguido este objetivo, buscaremos aplicaciones de nuestros productos en el campo
cosmetológico junto a la empresa granadina GLEY de BRECH S.A., con la cual ya hemos colaborado en
otras ocasiones. Al mismo tiempo, iniciaremos una colaboración con el Departamento de Bioquímica y

239
Resultados Y Discusión

Biología Molecular de la Facultad de Farmacia de la Universidad de Granada, para determinar si nuestros


exopolisacáridos o sus derivados tienen carácter prebiótico y podrían utilizarse como ingredientes en
formulaciones especialmente ideadas para la alimentación infantil.

240
SECCIÓN IV

FUNCIONES FISIOLÓGICAS DE LOS EPS


Formación de biofilms

CAPÍTULO 1

ESTUDIO DE LA PARTICIPACIÓN DE LOS EPS EN LA FORMACIÓN DE BIOFILMS

RESUMEN

Los biofilms se definen como comunidades de microorganismos que crecen embebidos


en una matriz de exopolisacáridos y adheridos a una superficie inerte o un tejido vivo. El
crecimiento en biofilms representa la forma habitual de crecimiento de las bacterias en la
naturaleza. Para determinar si las cepas objeto de estudio en este trabajo daban lugar a la
formación de biofilms, empleamos la técnica de adhesión sobre superficies de PVC y posterior
tinción con cristal violeta. A continuación, estudiamos la participación de los exopolisacáridos en
la estructura de los biofilms. Para ello elegimos las cepas X2 de Halomonas maura y M4 de
Halomonas eurihalina, es decir, aquellas que daban lugar a una mayor formación de biofilms en
todas las condiciones ensayadas, comparando su capacidad para formar estas biopelículas con la
de mutantes de ambas cepas deficientes en la síntesis de exopolisacárido, demostrando que la
presencia de exopolisacáridos en el medio es fundamental para la formación de biofilms por parte
de nuestros microorganismos.

243
Resultados y Discusión

Los biofilms se definen como comunidades de microorganismos que crecen embebidos en una
matriz de exopolisacáridos y adheridos a una superficie inerte o un tejido vivo (Costerton y col., 1995). El
crecimiento en biofilms representa la forma habitual de crecimiento de las bacterias en la naturaleza. La
capacidad de formación de biofilms no parece estar restringida a ningún grupo específico de
microorganismos y hoy se considera que bajo condiciones ambientales adecuadas todos los
microorganismos son capaces de formar biofilms.

Aunque la composición del biofilm es variable en función del sistema en estudio, en general, el
componente fundamental del biofilm es el agua, que puede representar hasta el 97% del contenido total.
Además de agua y de las células bacterianas, la matriz del biofilm es un complejo formado principalmente
por exopolisacáridos (Sutherland, 2001a). En menor cantidad se encuentran otras moléculas como
proteínas, ADN y productos diversos procedentes de la lisis de las bacterias (Branda y col., 2005).

Estudios realizados utilizando microscopía confocal han mostrado que la arquitectura de la matriz
del biofilm no es sólida y presenta canales que permiten el flujo de agua, nutrientes y oxígeno incluso
hasta las zona más profundas del biofilm. La existencia de estos canales no evita, sin embargo, que
dentro del biofilm podamos encontrar distintos ambientes en los que la concentración de nutrientes, pH u
oxígeno es diferente. Esta circunstancia aumenta la heterogeneidad sobre el estado fisiológico en el que
se encuentra la bacteria dentro del biofilm y dificulta su estudio (Costerton y col., 1995; Davey y O´Toole,
2000; Stoodley y col., 2002).

Figura 152. Esquema mostrando las etapas en el proceso de formación del biofilm (Lasa y col., 2005)

El proceso de formación del biofilm se desarrolla en diversas etapas (Figura 152); la etapa inicial
es la adherencia sobre la superficie. En bacterias Gram negativas se ha visto que los flagelos, las fimbrias
y los curli son importantes para la etapa de adherencia primaria (O´Toole y col., 2000), así como, en

244
Formación de biofilms

algunos casos, la síntesis de EPS (Hammer y Bassler, 2003). En el caso de las bacterias Gram positivas
se ha descrito la participación de proteínas de superficie en esta primera etapa (Cucarella y col., 2001;
Toledo-Arana y col., 2001). Una vez que la bacteria se ha adherido a la superficie, comienza a dividirse y
las células hijas se extienden alrededor del sitio de unión, formando una microcolonia. En una etapa
posterior la bacteria comienza a secretar un exopolisacárido, la matriz del biofilm, y forma unas
estructuras similares a setas en las cuales se aprecia la presencia de canales. Finalmente, algunas
bacterias de la matriz del biofilm se liberan del mismo para poder colonizar otras superficies cerrando el
proceso de desarrollo de formación del biofilm.

Numerosas evidencias experimentales sugieren que el proceso de formación del biofilm está
regulado por una compleja cascada de reguladores. Un trabajo pionero con Pseudomonas aeruginosa
demostró que el proceso de formación del biofilm está regulado por un proceso de quorum sensing o
autoinducción (Davies y col., 1998). El sistema de quorum sensing es un mecanismo de regulación
dependiente de la acumulación en el medio ambiente de una molécula señal, autoinductor, que permite a
la bacteria sentir la densidad de población existente. Cuando en el medio extracelular se acumula una
cantidad suficiente de autoinductor éste activa un receptor específico (receptor transcripcional) que altera
la expresión de genes afectando a distintos fenotipos (González y Marketon, 2003). Además de la
regulación a nivel transcripcional, existen numerosos indicios de una regulación postranscripcional del
proceso de formación del biofilm (Bomchil y col., 2003; Kirillina y col., 2004). Finalmente, parece lógico
pensar que la formación de biofilms se produzca en respuesta a las condiciones ambientales y por tanto
que existan sistemas de fosfotransferencia que transmitan la señal al interior de la bacteria para adecuar
la expresión de genes a la nueva situación ambiental (Toledo-Arana y col., 2005).

Independientemente de su abundancia y de la importancia que tienen en la naturaleza, los


biofilms también han despertado interés en el mundo civilizado; así, pueden aparecer biofilms en prótesis
y catéteres, provocando infecciones crónicas de difícil tratamiento por la resistencia de los
microorganismos que forman parte del biofilm a los antibióticos, que no pueden acceder a las células
(Costerton y col., 1999; Goto y col., 1999; Mah y O´Toole, 2001; Donlan y Costerton, 2002); de igual
modo, los biofilms pueden obturar tuberías (Carr y col., 1996) y contaminar productos alimentarios
durante su preparación industrial (Wong, 1998). Sin embargo, los biofilms también pueden presentar
algunos efectos beneficiosos, como por ejemplo al actuar como biocontroladores en la prevención de
infecciones fúngicas en ciertas plantas (Geels y Schippers, 1983). Dada la importancia de los biofilms en
la naturaleza, así como sus implicaciones médicas y en la industria alimentaria, es importante llegar a
conocer el mecanismo que gobierna la formación y la disolución de estas comunidades microbianas
(Danese y col., 2000), así como las estrategias a seguir para la eliminación de las mismas (Meyer, 2003).

Diversos trabajos con Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli han mostrado que la síntesis
de exopolisacáridos se induce una vez que el microorganismo se ha adherido a la superficie en la cual se
va a formar el biofilm (Davies y col., 1993; 1995; Prigent-Combaret y col., 1999). Estos resultados no

245
Resultados y Discusión

desvelaron por completo el rol que desempeñan los EPS desempeñan en la formación de biofilms. Sin
embargo, otros estudios con distintos microorganismos Gram negativos y Gram positivos (McKenney y
col., 1998; Watnick y Colter, 1999) han revelado que los exopolisacáridos son esenciales en la etapa de
adhesión, inicio de la formación del biofilm, para los microorganismos que los producen.

Considerando todos estos precedentes, en este capítulo hemos estudiado la capacidad de


nuestros microorganismos halófilos productores de polisacáridos de formar biofilms bajo diversas
condiciones ambientales, así como la implicación de dichos exopolisacáridos en la estructura de los
biofilms.

1.1. Tinción con cristal violeta

Empíricamente habíamos observado que nuestros microorganismos halófilos daban lugar a la


formación de un velo de crecimiento adherido al cristal del tubo de ensayo cuando se cultivaban en medio
líquido y se dejaban reposar durante un tiempo prolongado. Para determinar si las cepas estudiadas en
este trabajo daban lugar a la formación de biofilms, empleamos la técnica de adhesión sobre superficies
de PVC (placas microtitter) y posterior tinción con cristal violeta, según se ha descrito en Material y
Métodos (apartado 11.1). Así mismo, variamos diversos parámetros (tiempo de incubación, concentración
de sales en el medio de cultivo, riqueza del medio de cultivo) para determinar si la formación de biofilms
estaba influenciada por las condiciones ambientales, y en ese caso, ver qué parámetros determinaban
una mayor formación de estas biopelículas. En las Figuras 153-155 se muestran los resultados obtenidos
tras incubar nuestros microorganismos en agitación bajo las distintas condiciones antes mencionadas.

5
4,5
Tinción con cristal violeta

4
3,5
OD 540 nm

3
2,5
2
1,5
1
0,5
0
X2

X8
B40

B100

N12

A16

M4

Al12

Al15

Al16

FP34

FP35

FP36

A3

M8

B33

F23

R22

F32

B35

Cepas
16 hrs 24 hrs 40 hrs 48 hrs

Figura 153. Formación de biofilms a las 16, 24, 40 y 48 horas de incubación en medio MY al 5% (p/v) de sales.

246
Formación de biofilms

5
Tinción con cristal violeta

4
OD 540 nm

0
X2

X8
B40

B100

N12

A16
M4

Al12

Al15

Al16
FP34

FP35

FP36
A3

M8
B33

F23

R22
F32

B35
Cepas

3% 5% 7,50% 10%

Figura 154. Formación de biofilms en medio MY al 3, 5, 7,5 y 10% (p/v) de sales tras 40 horas de incubación.

5
Tinción con cristal violeta

4
OD 540 nm

0
X2

X8
B40

B100

N12

A16

M4

Al12

Al15

Al16

FP34

FP35

FP36

A3

M8

B33

F23

R22

F32

B35

Cepas

MY Koser

Figura 155. Formación de biofilms en medio MY al 5% (p/v) de sales y medio Koser al 5% (p/v) de NaCl tras 40 horas
de incubación.

En las Figuras 153-155 puede observarse como todas las cepas ensayadas fueron capaces de
formar biofilms. Como ya hemos comentado, las condiciones ambientales pueden afectar la formación de
biofilms; en efecto, para nuestras cepas, el tiempo de incubación, la concentración de sales en el medio

247
Resultados y Discusión

de cultivo, y la riqueza del medio en el que se desarrollan los microorganismos, son factores que influyen
en la capacidad de nuestros microorganismos para formar biofilms. Con respecto al tiempo de incubación,
podemos comentar que, en general, nuestras cepas presentan una mayor capacidad para la formación de
biofilms a las 40-48 horas de incubación, como se ha descrito para la mayoría de los microorganismos
(O`Toole y Kolter, 1998 a y b; Jackson y col., 2002); en lo que se refiere a la concentración de sales en el
medio de cultivo, en general, los mejores resultados se obtuvieron a un 5-7,5% (p/v) de sales, aunque en
T
algunos casos, como por ejemplo la cepa R22 de Idiomarina ramblicola esta característica fenotípica se
ve aumentada a un 10% (p/v) de sales; es de resaltar la marcada diferencia en la formación de biofilms
para todas las cepas en función del medio de cultivo empleado; así, todos nuestros microorganismos
producen biofilms tanto en medio complejo como en medio definido, aunque esa capacidad es mucho
mayor en el medio MY, más rico que el medio Koser. Estos resultados coinciden con los obtenidos por
Stoodley y colaboradores en 1999, quienes demostraron que las condiciones nutricionales influían de
manera definitiva en la estructura de los biofilms, de manera que al aumentar la concentración de glucosa
presente en el medio de 40 a 400 mg/l, la formación de biopelículas se veía enormemente incrementada.

Como se aprecia en las Figuras 154-156, los microorganismos que presentaron en todos los
casos una mayor propensión para la formación de biofilms fueron las cepas X2 de Halomonas maura y
M4 de Halomonas eurihalina. Por tanto, para realizar un estudio preliminar de la participación de los
exopolisacáridos en la estructura de los biofilms, seleccionamos estos dos microorganismos; así, como
veremos a continuación, obtuvimos mutantes de ambas cepas deficientes en la síntesis de
exopolisacárido, y comparamos su comportamiento con el de las cepas salvajes en cuanto a la formación
de biopelículas.

1.2. Obtención de mutantes deficientes en la síntesis de EPS: participación de los


exopolisacáridos en la estructura de los biofilms

Para la obtención de mutantes de la cepa M4 de Halomonas eurihalina deficientes en la


síntesis de exopolisacárido, se llevaron a cabo experiencias de mutagénesis insercional vía conjugación
biparenteral, según el protocolo de Herrero y colaboradores (1990), adaptado por nuestro grupo de
investigación para trabajar con bacterias halófilas productoras de cantidades considerables de
exopolisacárido. Para ello la cepa receptora se cultivó en medio mínimo para evitar en lo posible la
producción de EPS, y posteriormente las células fueron lavadas con solución de sales al 2% (p/v) con el
fin de minimizar la presencia de sales y antibióticos en el proceso de conjugación. En estas experiencias
se utilizó el transposón mini-Tn5 Km2 por dar lugar a inserciones estables, únicas y al azar (Llamas y col.,
2000). Todos los clones que aparecieron en las placas de selección de transconjugantes se sometieron a
distintas pruebas fenotípicas que permitieran descartar la presencia de contaminantes. Además, de los
transconjugantes seleccionados, se descartaron aquellos que eran resistentes a ampicilina (100μg/ml), ya
que eran consecuencia de la cointegración del plásmido completo en el cromosoma de la célula huésped,

248
Formación de biofilms

por lo que no eran el resultado de un verdadero proceso de transposición. Tras el chequeo de varios miles
de colonias, seleccionamos el mutante TK95 (Transconjugante resistente a Kanamicina) por presentar
fenotipo colonial liso (Figura 156), es decir, por ser deficiente en la síntesis de maurano. La frecuencia de
transposición fue de 2 x 10-5; esta se determinó teniendo en cuenta el número de transconjugantes
(colonias que aparecieron en el medio de selección) y el número de supervivientes (colonias del medio
propio del receptor) (de Lorenzo y col., 1990). El análisis del transconjugante TK95 mediante Southern
Blot nos permitió comprobar que la inserción del transposón era única ya que las preparaciones del DNA
procedente del mutante TK95 digeridas con diferentes enzimas de restricción (BamHI, BgIII, NcoI, SaII y
SmaI, que no tenían sitio de corte en el transposón), originaban bandas únicas.

A B

Figura 156. Fotografía del crecimiento de Halomonas eurihalina TK95 (A), mostrando su fenotipo colonial liso, y
Halomonas eurihalina M4 (B) en medio sólido MY 7,5% (p/v) de sales tras 3 días de incubación a 32ºC.

Mediante la utilización de transposones, se puede insertar en los genes objeto de estudio una
secuencia de DNA que contiene un marcador de resistencia a algún antibiótico y debido a que dicho
marcador está físicamente unido al gen mutado, se logra seleccionar fácilmente los clones
recombinantes, así como realizar el mapa de la región génica donde se ha producido la mutación. Por
ello, la mutagénesis con transposones es una estrategia habitual en Biología Molecular, y ha sido
empleada con gran éxito para conocer los distintos genes que intervienen en la síntesis de
exopolisacáridos tales como el xantano (Barreré y col., 1986; Harding y col., 1987; Wei y col., 1996) y
succinoglicano (Leigh y col., 1987). Por otra parte, en microorganismos halófilos moderados, este tipo de
mutaciones ha permitido esclarecer algunos de los mecanismos fisiológicos relacionados con la
adaptación a la salinidad. Concretamente, mediante la utilización de transposones se ha establecido una
relación entre la síntesis del soluto compatible ectoína y la tolerancia a la sal que presentan dichas

249
Resultados y Discusión

bacterias (Cánovas y col., 1997; Göller y col., 1998; Min-Yu y col., 1993). Esta estrategia también ha
permitido obtener información relacionada con el gen responsable de la síntesis de la α-amilasa en
Halomonas meridiana (Coronado y col., 2000), la caracterización del operón que codifica para la enzima
carbamilfosfato sintetasa relacionada con la producción de EPS en Halomonas eurihalina (Llamas y col.,
2003), los genes responsables de la síntesis de una nitrato reductasa anaerobia ligada a membrana y una
T
citocromo c oxidasa tipo cbb3 en la cepa S31 de Halomonas maura (Argandoña y col., 2006; Argandoña,
2003), así como los genes de transporte y ensamblaje del EPS sintetizado por Halomonas maura (Arco y
col., 2005).

La frecuencia de transferencia del transposón mini-Tn5 Km2 ha sido inferior a la encontrada para
otros microorganismos halófilos; así, en Chromohalobacter salixigens ATCC 37173, se estableció que la
-2
relación entre el número de transconjugantes y el número de supervivientes del receptor es de 10
cuando la proporción donador:receptor es de 1:2; y 5 × 10-3 cuando la relación es 1:8,5 (Kunte y Galinski,
1995). Esta elevada frecuencia puede ser explicable por el hecho de que esta especie microbiana no es
productora de exopolisacárido. Sin embargo, en experiencias previas de mutagénesis con agentes
biológicos en Halomonas eurihalina se estableció que la frecuencia de mutación era también de 2 × 10
-5

-7
(Llamas y col., 2000). En Halomonas maura S30 la frecuencia de transición es de 8 x 10 (Arco y col,
2005b), algo menor que para Halomonas eurihalina, debido probablemente a la presencia de una mayor
cantidad de EPS (maurano).

Para la obtención de mutantes de la cepa X2 de Halomonas maura deficientes en la síntesis de


exopolisacárido, llevamos a cabo experiencias de mutagénesis dirigida; para ello se construyó una fusión
transcripcional del gen lacZ al gen epsA en una cepa mutante espontánea resistente a la rifampicina de
Halomonas maura X2. El gen epsA es el primer gen que forma parte del clúster de genes eps
responsables de la síntesis de maurano en H. maura (Arco y col., 2005a). Como paso previo a esta
mutagénesis, se confirmó mediante PCR que dicho gen epsA estaba presente en la cepa X2 de
Halomonas maura, como se observa en la Figura 157.

M 1 2 3
(Kb)

21
5.1
3.5
2.0
1.6
1.38
0.94
0.83
0.56 Figura 157. Comprobación de la recombinación del gen epsA::lacZ-pVIK112 en
Halomonas maura X2 por PCR. M: marcador de peso molecular λ HindIII + EcoRI;
Carril 1: DNA del clon Halomonas maura X2 epsA::lacZ; Carril 2: control negativo,
DNA de Halomonas maura X2 ; Carril 3: control positivo, pVIK112:: epsA::lacZ.

250
Formación de biofilms

El mutante X2 epsA::lacZ mostró también morfología colonial lisa (Figura 158), debido a la
interrupción del gen epsA por la fusión transcripcional del gen lacZ, como resultado de la recombinación
homologa simple (tipo Campbell) del plásmido pVIKepsA.

A B

Figura 158. Fotografía del crecimiento de Halomonas maura X2 (A) y Halomonas maura X2 epsA::lacZ, mostrando su
fenotipo colonial liso, en medio sólido MY 7,5% (p/v) de sales tras 3 días de incubación a 32ºC.

La morfología colonial lisa del mutante X2 epsA::lacZ indicaba una disminución muy acusada en
la biosíntesis de exopolisacárido, tanto era así, que pudimos comprobar que había perdido casi por
completo la capacidad de producir EPS tras realizar el protocolo de extracción del polisacárido después
de incubar el mutante en medio MY 7,5% (p/v) de sales durante 5 días.

Una vez obtenidos los mutantes deficientes en la síntesis de exopolisacárido de las cepas M4 de
Halomonas eurihalina y X2 de Halomonas maura, comparamos su comportamiento con el de las cepas
salvajes en cuanto a la formación de biofilms, empleando de nuevo la técnica de adhesión a superficies
de PVC y posterior tinción con cristal violeta, con el fin de establecer diferencias y atribuir a los
exopolisacáridos de estas cepas una función biológica, la participación de sus EPS en la estructura de los
biofilms que son capaces de formar.

En la Figura 159 se puede observar una marcada disminución en la capacidad para formar
biofilms por parte de las dos cepas deficientes en la síntesis de exopolisacárido, TK95 y X2 epsA::lacZ,
con respecto a las cepas salvajes, M4 de Halomonas eurihalina y X2 de Halomonas maura. Esta
disminución es más acentuada en la comparación de la formación de biopelículas por parte de la cepa X2
de Halomonas maura y el correspondiente mutante deficiente en la síntesis de EPS X2 epsA::lacZ.

251
Resultados y Discusión

5,000

Tinción con crital violeta


4,000

OD 540 nm
3,000

2,000

1,000

0,000
X2 M4
Cepas

Salvaje EPS (-)

Figura 159. Formación de biofilms por las cepas X2 y X2 epsA::lacZ de Halomonas maura y M4 y TK95 de Halomonas
eurihalina en medio MY 5% (p/v) de sales, tras 40 horas de incubación.

La capacidad de formación de biofilms por parte de las cepas salvajes X2 de Halomonas maura y
M4 de Halomonas eurihalina se comprobó mediante microscopía electrónica de barrido; para ello, las
cepas se crecieron durante 40 horas en medio líquido MY al 5% (p/v) en sales, en el cual se introdujo un
cubreobjetos para el comprobar la adhesión de estos microorganismos a superficies lisas. En la Figura
160 observamos las microfotografías electrónicas de las cepas X2 y M4, y podemos ver como ambas se
encuentran rodeadas por cúmulos de EPS y fibrillas que les permiten la adherencia a superficies lisas.

Figura 160. Microfotografías electrónicas de barrido de Halomonas maura X2 (A) y Halomonas eurihalina M4 (B).

Por otro lado, también pudimos apreciar gracias a la microscopía electrónica de barrido como la
cepa X2 presenta una mayor capacidad para la formación de microcolonias que el correspondiente
mutante liso (Figura 161), paso previo a la formación de estructuras maduras del biofilm. La formación de
microcolonias por parte del mutante con fenotipo colonial liso X2 epsA::lacZ está muy reducida.

252
Formación de biofilms

Figura 161. Microfotografías electrónicas de barrido en las que se muestra la formación de microcolonias por
Halomonas maura cepa X2 (A) y el mutante deficiente en la síntesis de EPS X2 epsA::lacZ (B).

Por tanto, nuestros resultados experimentales preliminares nos indican que la presencia de
exopolisacáridos en el medio es fundamental para la formación de biofilms por parte de nuestros
microorganismos; mediante la técnica de adhesión y posterior tinción con cristal violeta, observamos
como las cepas X2 y M4 eran capaces de adherirse a la superficie de los recipientes donde eran
cultivadas; de igual modo, los mutantes lisos X2 epsA::lacZ y TK95, perdían gran parte de esa capacidad.
Además, la microscopía electrónica de barrido nos ha permitido observar la capacidad de adherencia de
las cepas X2 y M4 a una superficie inerte así como a otras células, y como emplean para ello su EPS a
modo de red. También hemos observado como el mutante X2 epsA::lacZ, al perder casi por completo la
capacidad para sintetizar EPS, también pierde la facultad de formar biofilms maduros (Figura 161). Este
comportamiento ha sido descrito para diferentes bacterias formadoras de biofilms (Allison y Sutherland,
1987; Watnick y Kolter, 1999; Davey y O`Toole., 2000; Danese y col., 2000; Sutherland y col., 2001a;
Wang y col., 2004). Sin embargo, algunos autores han descrito para otros microorganismos que aunque
el exopolisacárido ayuda y está implicado en la formación de biofilms, éste no es estrictamente necesario;
este es el caso, por ejemplo, del alginato producido por Pseudomonas aeruginosa (Stapper y col., 2004),
o de la celulosa sintetizada por Salmonella enteritidis (Solano y col., 2002).

Numerosos trabajos experimentales han puesto de manifiesto, como ya hemos comentado, que
el proceso de formación de biofilms está regulado por un sistema de “quorum sensing” o de autoinducción
(Davey y O`Toole, 2000; Hammer y Bassler, 2003). Recientemente, nuestro grupo de investigación ha
descrito un sistema de “quorum sensing” entre las especies de Halomonas, aunque todavía no se ha
podido determinar qué función concreta regula. También hemos identificado algunas de las moléculas
señal producidas por las especies productoras de EPS de Halomonas (Llamas y col., 2005).

253
CONCLUSIONES
Conclusiones

1. Las bacterias halófilas objeto de este estudio producen EPS en una amplia gama de condiciones
ambientales y nutricionales. Dicha producción está parcialmente asociada al crecimiento, ya que
comienza en la fase exponencial, pero alcanza su máximo en la fase estacionaria. Las cepas clasificadas
preliminarmente como Halomonas maura presentan los mayores rendimientos en la producción, aunque
la productividad final del cultivo es aceptable en todos los casos, con vías a su potencial uso.

2. Todas las especies halófilas productoras de exopolisacáridos estudiadas hasta el momento sintetizan
heteropolisacáridos con un marcado carácter aniónico, no existiendo una composición química específica
que caracterice a los EPS de los distintos taxa. Por el contrario todos los polímeros comparten la
presencia de grupos sulfato, sustituyente inorgánico poco frecuente entre los polisacáridos bacterianos,
destacando el EPS sintetizado por Halomonas maura B100, con un 7,9 % p/p de sulfatos. Por otra parte,
el carbohidrato más inusual que hemos encontrado formando parte de los EPS ha sido la fucosa,
presente fundamentalmente en los EPS N12 y A16 de Halomonas maura y A3 de Salipiger mucosus.

3. Entre los 20 polímeros investigados hemos seleccionado los siguientes para su futuro desarrollo
biotecnológico:
• EPS X2 de Halomonas maura, por la capacidad que presenta para la captación de
metales pesados.
• EPS B100 de Halomonas maura, por sus excelentes propiedades reológicas, su
actividad viscosizante y emulgente, y especialmente por su efecto modulador sobre
células tumorales humanas.
• EPS N12 de Halomonas maura, por su elevado contenido en fucosa, lo que puede
convertirlo en una fuente de oligosacáridos ricos en este azúcar, los cuales presentan
potenciales aplicaciones en cosmética y medicina.
• EPS B33 de Palleronia marisminoris, por sus propiedades emulgentes.

4. Todas las cepas estudiadas presentan la capacidad de formar biofilms, en cuya maduración intervienen
los exopolisacáridos que las mismas sintetizan.

257
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