Está en la página 1de 65

Instituto Superior Politécnico “José Antonio Echeverría”

Facultad de Ingeniería Química

TRABAJO DE DIPLOMA PARA OPTAR


POR EL TÍTULO DE INGENIERO QUÍMICO

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa


fúngica aislada en el almacén central de alimentos del
IIIA”

Autora: Kathy De la Cruz Martorell


Tutores: MSc.Matilde Anaya Villalpanda
Dr.C. Julio César Dustet Mendoza

La Habana ,2014
Dedicatoria

Todo cuanto somos y todo lo que hacemos lo debemos únicamente al


Creador y Hacedor de nuestras vidas, al Rey del Universo ,quien
realmente nos muestra la verdadera ciencia y sabiduría y pone a
nuestra disposición sus leyes que rigen la vida y el desarrollo del
vasto universo y de la humanidad para proporcionarnos por su
inconmensurable amor la posibilidad de proporcionarnos como
profesionales a una vida de servicio consagrada a aplicar los
conocimientos adquiridos con fines pacíficos en aras de lograr
cumplir su voluntad sempiterna de un reino eterno de paz y justicia
perpetuas.
Agradecimientos
Resumen

Las enzimas celulasas tienen numerosas aplicaciones industriales. Estas pueden


obtenerse a partir de fermentación en estado sólido (FES) al emplear cepas
fúngicas, las cuales pueden aislarse de diferentes hábitats. Es de interés aumentar
la eficiencia del proceso fermentativo para la obtención de estas enzimas debido a
su elevado costo y en este sentido hay investigadores que demuestran la
influencia positiva de los campos magnéticos oscilantes de frecuencia
extremadamente baja (CMO-FEB) sobre la actividad celulolítica de hongos
filamentosos. Con tal propósito se aislaron 36 cepas fúngicas del almacén central
de alimentos del Instituto de Investigaciones de la Industria Alimentaria (IIIA), a las
cuales se les realizaron ensayos de actividad enzimática celulasa, obteniéndose
11 de ellas como las de mayor capacidad. Se le aplicó CMO-FEB a la cepa EC-
623 identificada como Aspergillus niger. Se estudiaron los efectos de las variables:
tiempo de exposición, incubación e intensidad del campo magnético oscilante
sobre la actividad celulolítica de dicha cepa. Se obtuvo como resultados que el
tiempo de exposición, incubación y la interacción de la intensidad del campo
magnético oscilante con el tiempo de incubación tienen efectos significativos, de
las cuales el tiempo de incubación fue el único factor con efecto negativo. Al
disminuir el tiempo de fermentación de 72 a 48 horas se observa una estimulación
en la actividad de celulasas cuando se aplicó el campo magnético. Además, se
caracterizaron las enzimas en cuanto a la estabilidad, conservadas en diferentes
tampones a temperatura ambiente por 24 horas, donde se obtuvo que las mismas
son estables en las condiciones ensayadas, resultado que difiere de estudios
similares realizados con las enzimas de otras cepas de la misma especie.
Abstract

Cellulases enzymes have numerous industrial applications. These can obtain


themselves from solid state fermentation in (SSF) using fungal stocks, which can
get away from different habitats. It is of concern to increase the efficiency of the
fermentative process for the obtaining of these enzymes due to their high cost, for
that reason there are many researchers that demonstrate the positive influences of
the oscillating magnetic fields of extremely low frequency (OMF-ELF) on cellulolytic
activity of filamentous fungus. With such endeavour 36 fungal stocks of the central
foods store of the Institute of Investigation of the Food Industry (IIFI) were isolated,
different assays of enzyme activity cellulase was realized, obtaining 11 like the
ones of bigger capacity. OMF-ELF was applied to stock EC - 623 identified like
Aspergillus niger, studying the effects of the variables: show time, incubation and
intensity of the oscillating magnetic field on cellulolytic activity. Show time,
incubation and the interaction of the intensity of the oscillating magnetic field with
time of incubation had significant effects, being time of incubation the only factor
with adverse effect. When decrease time of fermentation from 72 until 48 hours an
encouragement in the activity of cellulases was observed when the magnetic field
was applied. Furthermore, the enzymes were characterized as to stability kept in
different plugs at room temperature by 24 hours, was obtained that the same ones
are stable in the conditions tested, given results that he defers of education
matches fulfilled with the enzymes of other stocks of the same species.
Índice
Introducción ....................................................................................................................... 1
Problema científico ......................................................................................................... 3
Hipótesis ........................................................................................................................ 3
Capítulo 1. Revisión Bibliográfica....................................................................................... 4
1.1. Microbiología de la transformación de residuos celulósicos en azúcares
fermentables .................................................................................................................. 4
1.1.1Fisiología de microorganismos celulolíticos ......................................................... 4
1.2 Microorganismos que expresan el sistema enzimático celulasa .............................. 5
1.4Sistema enzimático celulasa de hongos filamentosos ............................................... 6
1.5 Estabilidad enzimática .............................................................................................. 8
1.6 Producción de enzimas por vía fermentativa ......................................................... 10
1.6.1-Celulasas que se obtienen en la actualidad por fermentación en estado sólido
(FES) ............................................................................................................................ 10
1.7 Los materiales lignocelulósicos como soportes para la fermentación en estado
sólido ............................................................................................................................ 12
1.7.1 El bagazo de caña de azúcar como material lignocelulósico ............................... 14
1.8 Pretratamiento a los materiales lignocelulósicos.................................................... 14
1.9 Experiencias en la obtención de enzimas celulasas mediante FES ........................ 16
1.10 Aplicación del campo magnético en fermentaciones ........................................... 16
1.10.1 Aspectos generales ........................................................................................... 16
1.10.2 Teorías sobre los efectos del tratamiento magnético ......................................... 18
1.10.3 Efecto de campo magnético en el crecimiento de microorganismos y en la
producción de metabolitos ............................................................................................ 19
1.10.4 Efecto genotóxico del campo magnético............................................................ 20
Capítulo 2. Materiales y métodos ..................................................................................... 22
2.1 Caracterización del local del muestreo ................................................................... 22
2.2 Técnicas de muestreo microbiológico ambiental.................................................... 22
2.2.1 Determinación de la cantidad de puntos de muestreo ...................................... 23
2.3 Técnicas microbiológicas .................................................................................... 23
2.3.1 Aislamiento e identificación de colonias fúngicas ............................................. 23
2.3.2 Determinación semicuantitativa de la actividad enzimática de los hongos
aislados..................................................................................................................... 24
2.3.2.1 Capacidad celulolítica y producción de pigmentos ....................................... 24
2.6 Ensayo de estabilidad de la actividad PFasa del crudo enzimático ........................ 29
2.7 Metodología experimental utilizada para la aplicación del tratamiento magnético... 29
Capítulo 3. Resultados y discusión .................................................................................. 31
3.1 Estudio de la actividad enzimática semicuantitativa de los hongos aislados del
almacén central de alimentos del IIIA ........................................................................... 31
3.2 Análisis de la actividad celulolítica cuantitativa de los hongos seleccionados ......... 37
3.3 Análisis del efecto del tratamiento magnético sobre actividad enzimática de la cepa
EC-623 (A. niger) ......................................................................................................... 39
3.4 Estudio de la estabilidad de la actividad PFasa del crudo enzimático de la cepa EC-
623 (A. niger)................................................................................................................ 44
3.5. Cálculo del costo de la investigación ..................................................................... 46
Conclusiones ................................................................................................................... 49
Recomendaciones ........................................................................................................... 50
Referencias Bibliográficas ............................................................................................... 51
Anexos ............................................................................................................................ 56
Introducción

A lo largo de la historia se han venido empleando las enzimas para usos


industriales, una de las enzimas más utilizadas son la celulasas obtenidas
mediante fermentación con diferentes microorganismos, los cuales han sido
estudiados en varios sustratos. Las celulasas juegan un papel muy importante
en diferentes industrias como la textil, la de detergentes y la alimentaria,
además de su utilización para la obtención de bioetanol.

Aunque un gran número de microorganismos son capaces de degradar la


celulosa, solo unos pocos pueden producir cantidades significativas de enzimas
libres que hidrolizan completamente la celulosa in vitro. Los hongos son los
principales microorganismos productores de celulasas, aunque se han
identificado también algunas bacterias y actinomicetos (Paredes, 2010). Los
hongos son responsables de la mayor proporción de celulasas en la naturaleza
y su primacía no es solamente consecuencia de la eficiencia y diversidad de
sus sistemas celulolíticos, sino que también tienen ventajas adaptativas que
son: la rápida colonización de los sustratos y una eficiente remoción de los
productos de hidrólisis. Estas características los distinguen de los demás
organismos como los principales descomponedores de materiales celulósicos.
El sistema enzimático de las especies de Trichoderma parece ser el más
efectivo, aunque hay una tendencia entre los investigadores hacia los cultivos
mixtos de Trichoderma sp.y Aspergillus sp.en dependencia del uso posterior de
la enzima (Turiño, 2011)

Un método empleado para la obtención de enzimas celulasas con una elevada


actividad ha sido la fermentación en estado sólido. Ello se debe a que la
presencia de poca agua en el sistema favorece el crecimiento de los hongos,
microorganismos que expresan un sistema enzimático más completo, por
expresar la gran mayoría dos de las tres enzimas que participan en el proceso
de hidrólisis (Méndez, 2010).

La producción de enzimas es costosa; por lo que una alternativa para


abatir costos es obtenerlas de subproductos agroindustriales como el
bagazo de caña de azúcar ,el cual presenta un alto contenido de carbohidratos,
relativamente bajo contenido de lignina y su disponibilidad industrial lo

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 1
convierte en un sustrato apropiado particularmente para la bioconversión en
etanol y la obtención del sistema enzimático celulasa (Xin, 2010).

Se están poniendo muchos esfuerzos en la obtención de enzimas con actividad


celulolítica, ya que los métodos tradicionales de producción pueden ser
demasiado prolongados hasta la obtención de la enzima purificada. Por esta
razón nace la necesidad de buscar nuevas alternativas que permitan obtener
enzimas en tiempos cortos y con propiedades bioquímicas adecuadas para el
proceso en el cual van a utilizarse. Una de estas alternativas es la utilización de
un tratamiento de campo electromagnético sobre ciertos microorganismos
(http://www.porquebiotecnologia.com.ar/index.php).

Por largos años, los científicos creyeron que los campos electromagnéticos de
baja frecuencia no causaban efectos biológicos significativos. En los decenios
recientes, muchos estudios científicos se han asegurado que los campos
magnéticos y/o eléctricos de frecuencia extremadamente baja (la frecuencia
extremadamente baja;< 300 hertz) pueden influenciar los sistemas biológicos
(Mengxiang, 2011).

Se han publicado pocos estudios sobre el crecimiento de microorganismos y la


producción de metabolitos bajo el efecto de campos electromagnéticos. Sin
embargo, hay investigadores que han realizado este tipo de análisis .Un
ejemplo de ello es Mengxiang (2011) que investigó la producción de celulasa y
ácido cítrico por A. niger en fermentación sumergida bajo una frecuencia
extremadamente baja de campo magnético (50 Hz), con una amplitud entre 0,2
y 1mT. Los resultados de esta investigación permitieron llegar a la conclusión
de que la actividad de celulasas y el rendimiento de ácido cítrico se
incrementaron con el tiempo de exposición.

Para Cuba resulta importante el desarrollo de la etapa de obtención de las


enzimas celulasas debido al elevado costo que presentan estas proteínas en el
mercado mundial. Es por ello que es necesario buscar nuevas cepas de
colonias fúngicas con actividad celulolítica y con propiedades atractivas de sus
enzimas. Además, de aplicar nuevos métodos como el tratamiento magnético
para determinar si se estimula la producción de las mismas.

Es práctica común aislar los microorganismos de su hábitat natural (sobre el


sustrato o del ambiente donde se encuentran) según la enzima de interés. En

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 2
este sentido, un local con materiales orgánicos como el almacén central de
alimentos del Instituto de Investigaciones de la Industria Alimenticia (IIIA),
brinda posibilidades para el aislamiento de colonias fúngicas capaces de
producir enzimas celulasas.

Problema científico

Búsqueda de nuevas cepas fúngicas con capacidad para expresar enzimas


celulasas.

Hipótesis

En el almacén central de alimentos del IIIA se encuentran cepas fúngicas que


producen el sistema de enzimas celulasas.

Objetivo general

Obtener a partir del aislamiento de hongos del almacén central de alimentos del
IIIA nuevas cepas que expresen el sistema enzimático celulasa.

Objetivos específicos

1. Analizar la actividad enzimática de las cepas fúngicas aisladas en


almacén central de alimentos del IIIA.
2. Seleccionar el régimen de tratamiento del campo magnético oscilante
apropiado para la estimulación de la actividad celulolítica de la cepa
aislada que expresa de mayor actividad celulasa.
3. Determinar la estabilidad a temperatura ambiente del concentrado del
crudo enzimático de la cepa seleccionada.

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 3
Capítulo 1. Revisión Bibliográfica
1.1. Microbiología de la transformación de residuos celulósicos en
azúcares fermentables

Los microorganismos celulolíticos (que degradan celulosa) desempeñan un


papel importante en la biosfera reciclando este polímero. Existe diversidad de
estos microorganismos que producen las enzimas celulasas, bacterias y
hongos aeróbicos o anaeróbicos, mesófilos o termófilos (Vargas, 2010).

Las enzimas celulasas pueden obtenerse a partir de hongos y bacterias, pero


estudios demuestran que los hongos son más empleados por ser capaces de
expresar hasta dos de las tres enzimas que conforman el sistema celulasas. El
principal problema consiste en que muchos hongos en su forma nativa no
expresan el sistema con elevada actividad; por lo que se emplean cepas
mutadas genéticamente (http://www.porquebiotecnologia.com.ar/index.php).

Estas enzimas se obtienen generalmente mediante fermentación en estado


sólido por simular el ambiente en el que crecen y se desarrollan los hongos,
aunque se ha informado sobre la obtención de enzimas celulasas por
fermentación en estado sumergido (Vilches, 2002).Todo esto conlleva a que
distintos países, entre ellos Cuba, se encaminen en el estudio de obtención de
enzimas celulasas con diversos tipos de sustratos, diferentes microorganismos,
y con el uso de diferentes técnicas de fermentación, para lograr disminuir los
costos de estas enzimas que son tan necesarias en procesos como el de
obtención de etanol (Méndez, 2010).

1.1.1 Fisiología de microorganismos celulolíticos

Preferencia por el sustrato: El amplio espectro de diversidad catabólica entre


microorganismos es una de las características distinguibles del mundo
microbiano. Dicho espectro varía entre especies individuales, desde algunas
altamente especializadas que utilizan uno o pocos sustratos como fuente de
energía hasta microorganismos versátiles que pueden utilizar alrededor de 100
compuestos como fuente de carbono (Vargas, 2010).

Según (Vargas, 2010), en general los microbios celulolíticos se encuentran


cerca del grupo de los organismos especialistas. Ellos principalmente degradan

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 4
carbohidratos y por lo general son incapaces de utilizar proteínas y lípidos (o
sus componentes) como fuente de energía para su crecimiento. Los
microorganismos celulolíticos nativos del suelo (por ejemplo, bacterias
Cellulomonas y Cytophaga y la mayoría de los hongos) pueden utilizar otros
carbohidratos además de la celulosa.

1.2 Microorganismos que expresan el sistema enzimático celulasa

En la actualidad se conocen muchas especies de microorganismos que pueden


usar celulosa como fuente de carbono y energía para realizar su metabolismo.
Entre ellas se encuentran bacterias, actinomicetos y hongos (ver Tabla 1.1),
siendo estos últimos los más estudiados respecto a la degradación de celulosa
y producción de celulasas. Sin embargo, pocos microorganismos pueden
producir el grupo de enzimas necesarias para degradar la celulosa cristalina
(Couri, 2000).

Tabla 1.1. Microorganismos representativos de cada especie productores de


celulasas.
Microorganismos
Hongos Actinomicetos Bacterias
Acremonium cellulolitycus Streptomyces sp. Clostridium thermocellum
Aspergillus acculeatus Thermoactinomyces sp. Ruminococus albus
Aspergillus fumigatus Termomonospora curvata
Aspergillus niger
Fusarium solani
Irpex lacteus
Penicillum funmiculosum
Schizophyllum commune
Sclerotium rolfsii
Sporotrichum cellulophilum
Talaromyces emersonii
Thielavia terrestris
Trichoderma koningii
Trichoderma viride
Adapatada de :(Duque, 2010)

Las celulasas de los hongos incluyendo además comestibles, se consideran las


más efectivas por ser enzimas extracelulares (Rodríguez, 2011). Para los
microorganismos que realizan la hidrólisis y el metabolismo de celulosa
insoluble, las celulasas extracelulares deben ser producidas libres o asociadas
a las células (Vargas, 2010).

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 5
En este sentido, estudios realizados sobre la naturaleza, modo de acción y
aspectos generales de la celulasa extracelular demuestran que el hongo
Trichoderma viride es el mejor productor de dichas enzimas (Vilches, 2002).
Sin embargo, la baja actividad de β-glucosidasa de esta especie fúngica limita
la velocidad y extensión de la hidrólisis (Martín, 2002; Vilches, 2002)

Por tal motivo continúa la búsqueda de cepas fúngicas mejores y más


eficientes productoras de celulasas. Tal es el caso dela especie Aspergillus
niger que produce la β-glucosidasa con una alta actividad. En ocasiones se
recomienda usar dicha enzima combinada con las celulasas de Trichoderma
viride para disminuir la inhibición por acumulación de celobiosa (Martín, 2002;
Vilches, 2002)

1.3 Enzimas celulolíticas. Características.

Las enzimas celulasas son catalizadores específicos encargados de degradar


la celulosa hasta unidades de D-glucosa, bajo condiciones moderadas de
presión y temperatura, que manifiestan inducción y represión catabólica. Su
forma es ligeramente elipsoidal con un tamaño entre 3 y 20 nm (Goyal, 1991).
En general, son proteínas bimodulares con un dominio catalítico grande y uno
pequeño de unión al sustrato ligado por una secuencia proteica altamente
glicosilada, rica en prolina y serina (Membrillo, 2008).

La estructura y la composición de los sustratos celulósicos naturales,


principalmente los materiales celulares de las plantas, están formados por
polisacáridos heterogéneos y entrelazados con hemicelulosa cristalina y
pectinas embebidas en la lignina. Para degradarlos, los microorganismos
producen enzimas múltiples que en su conjunto se les denomina sistema
enzimático. Su función se ha considerado en términos de su acción sobre las
fibras de celulosa (Vargas, 2010).

1.4Sistema enzimático celulasa de hongos filamentosos

Al estudiar las enzimas celulasas que utilizan naturalmente los hongos y


bacterias para degradar la celulosa, se ha encontrado que la hidrólisis
(degradación) de este polímero es muy compleja. Por eso, es necesario
investigar las estructuras y funciones de estas enzimas para conocer con
detalle los mecanismos enzimáticos involucrados en la degradación de la

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 6
celulosa.En realidad es un sistema enzimático donde participan varias enzimas,
las cuales realizan la hidrólisis total de la celulosa (Goyal, 1991; Walters, 1991)

Hasta el momento se han planteado varias teorías para describir el mecanismo


de acción de las enzimas celulasas; pero existe un consenso de que la
hidrólisis de la celulosa es el resultado de la acción sinergética de tres grupos
diferentes de enzimas (Duque, 2010):

 Endo-1,4 gluconasas (CM-celulasas o carboximetilcelulasas): Estas


enzimas atacan al azar las fibras de celulosa, disminuyendo rápidamente la
longitud de la cadena exponiendo nuevas cadenas terminales. La reacción
es en la fase sólida, adsorbiéndose fuertemente a la celulosa cristalina. Los
productos de la reacción son glucosa, celobiosa, celotriosa y otros
oligómeros (Ramos, 1996). El mejor sustrato para la medición de la
actividad de endoglucanasas es un derivado soluble de celulosa tal como la
carboximetilcelulosa (CMC).

 Exo-1,4 gluconasas (celobiohidrolasa): Es el constituyente de mayor


proporción en el sistema. Su acción se centra en la remoción de las
unidades de celobiosa (2 unidades de glucosa) de los terminales no
reductores de las cadenas de celulosa. También es una reacción en fase
sólida pudiendo adsorberse tanto en la celulosa cristalina como en la
amorfa.

 -1,4-glucosidasa (celobiasa): Hidroliza la celobiosa (en algunos casos


otros celooligosácaridos) a glucosa. Esta enzima puede inhibirse por la
acumulación de glucosa, lo que puede conducir al detenimiento completo de
la hidrólisis.

Una de las características más importantes del desempeño del sistema


enzimático es que el mismo se inhibe con la acumulación de los productos de
las reacciones que cataliza cada enzima (Walters, 1991).

La Figura 1.1 representa cómo ocurre la hidrólisis enzimática de la celulosa.

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 7
Figura 1. 1. Representación esquemática de los sistemas celulolíticos.
Fuente: (Garcìa, 2006)

El mecanismo de acción se explica a partir del ataque de las endoglucanasas


sobre las regiones no cristalinas de la fibra de celulosa amorfa, estas enzimas
conducen a la formación de cadenas libres, sobre cuyo extremo reductor
actúan las exoglucanasas que remueven hidrolíticamente pequeñas unidades
de celobiosa y glucosa (Molina, 2012).

1.5 Estabilidad enzimática

Desde el punto de vista práctico puede afirmarse que un producto biológico es


estable bajo condiciones dadas y en un tiempo determinado si se produce
como máximo, una pérdida del 20% de su actividad biológica y se mantienen
invariables sus propiedades físicas y químicas (Pandey, 2000). La naturaleza
proteica frágil de las enzimas, que conlleva a una estabilidad limitada de su
estructura y funcionalidad, constituye un aspecto tecnológico importante. Se
considera que una enzima es apropiada para una aplicación determinada, si su
estabilidad es suficiente.

La estabilidad de las enzimas depende de las condiciones ambientales


utilizadas, tales como pH, temperatura y presencia de sustancias
desestabilizantes de la estructura proteica. La estabilidad operacional puede
caracterizarse cuantitativamente en términos del beneficio obtenido y del
producto formado, durante el tiempo de vida del catalizador enzimático. La
predicción teórica de la estabilidad operacional de una enzima resulta imposible
hasta el momento, por lo que el único método útil de evaluación es la
acumulación de datos experimentales (García, 2006).

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 8
Los enfoques para lograr enzimas con mayor estabilidad operacional han sido
los siguientes: (García, 2006).

 Búsqueda de enzimas estables en la naturaleza, aisladas de


microorganismos adaptados a vivir en condiciones extremas como
fuentes termales (termófilos) y medios salinos (halófilos).
 La adición de estabilizantes, por ejemplo baja concentración de agentes
quelantes, inhibidores del crecimiento microbiano (ácidas) y protectores
de tioles (H2S) pueden ser beneficiosos, pero su utilización depende del
costo y de la compatibilidad con el proceso.
 La modificación química de la proteína, por acilación o alquilación de
algunos aminoácidos, puede mejorar la estabilidad, pero sus efectos son
difíciles de predecir.
 La inmovilización de enzimas en soportes insolubles puede mejorar la
estabilidad enzimática, aunque no es posible garantizar buenos
resultados.
 La ingeniería de proteínas es la aproximación más reciente al
mejoramiento de la estabilidad. Los métodos utilizados se derivan de los
avances en la Ingeniería Genética. Con esto es posible predecir cómo
mejorar el desempeño de una enzima o darle nuevas características
deseables. Las propiedades en las que hay mayor interés son:
especificidad y afinidad por el sustrato, estabilidad y dependencia del pH
y de la temperatura

Los parámetros más importantes que pueden afectar la estabilidad de las


proteínas son: temperatura, pH, actividad del agua y agentes desnaturalizantes
(García, 2006).

De forma general la temperatura produce un marcado efecto en la pérdida de


estabilidad cuando se expone la proteína durante un tiempo prolongado a altos
grados, o sea, ocurre desestabilización total alrededor de los 50ºC, aunque
existen proteínas capaces de conservar su actividad a temperaturas superiores
a 70ºC.

La influencia de la temperatura en la desestabilización de las proteínas está


dada por el debilitamiento de las interacciones no covalentes y a la exposición

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 9
de residuos hidrofóbicos. Además se favorecen reacciones irreversibles que
resultan de la inactivación (Lehninger, 2005).

El pH puede provocar cambios conformacionales menores e inactivación


irreversible de las proteínas, además de un alejamiento del punto isoeléctrico y
un aumento de la repulsión electrostática(Lehninger, 2005).

Muchos autores se han dedicado a estudiar la estabilidad de las enzimas


celulasas en diferentes sistemas. Por ejemplo, (Pérez, 2000) realizó un estudio
de estabilidad al crudo enzimático de tres cepas diferentes: Trichoderma viride,
Penicillium implicatum y Aspergillus niger siendo las enzimas celulasas de este
último las que tuvieron los mejores resultados. Las mejores condiciones de
trabajo fueron a pH 3 y 4, utilizando como solución tampón acetato de sodio.

(Ülger, 2001) también logró estabilizar las enzimas celulasas de Trichoderma


viride QM9414 en un sistema de dos fases acuosas compuesto por Dextrana
T500 5% (w/w)-PEG 20000 7% en 50 mmol/L de acetato de sodio (pH 4,8) por
16 días a 50ºC con una actividad residual de 100%. Además compararon este
resultado con la conservación en tampón de acetato de sodio a 50ºC y
obtuvieron que la mejor conservación se logró en el sistema de dos fases
acuosas.

1.6 Producción de enzimas por vía fermentativa

El proceso de producción de enzimas por vía fermentativa está asociado al


crecimiento microbiano.La mayor parte de estos procesos utilizan de obtención
de enzimas utilizan la fermentación sumergida (Viniegra, 2003).

Como proceso alternativo para obtener concentraciones elevadas de enzimas y


aprovechar las condiciones favorables del cultivo para los hongos se ha
utilizado la fermentación en estado sólido (FES) (Roussos, 1991).Este es el
medio más apropiado para la obtención de celulasas por ser la celulosa(el
sustrato inductor) completamente insoluble en agua (García, 2006).

1.6.1-Celulasas que se obtienen en la actualidad por fermentación en


estado sólido (FES)

La definición exacta de FES varía de un autor a otro, pero todas coinciden en


los objetivos y significados. Esta puede definirse como el proceso que involucra
una matriz sólida y que se lleva a cabo en ausencia total o parcial de agua

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 10
libre. Sin embargo, el sustrato debe poseer suficiente humedad para sustentar
el metabolismo y el crecimiento de los microorganismos. La matriz sólida puede
ser la fuente de nutrientes o un soporte impregnado con los nutrientes
apropiados que permitan el desarrollo de los mismos (Rani, 2009).

Por lo general los cultivos de microorganismos en medio sólido se realizan


utilizando sustratos agrícolas como el bagazo de caña al cual se le agrega una
solución de sales y una suspensión de esporas de hongo como inóculo
(Vargas, 2010).

Los principales parámetros físicos químicos que afectan la fisiología y


bioquímica de los microorganismos durante su crecimiento en fase sólida son:
humedad, actividad del agua, aireación y transferencia de oxígeno, regulación
de temperatura y pH (Rodríguez, 2011). De otra parte juega un papel muy
importante el género del microorganismo y la cantidad de inóculo (Vargas,
2010). Entre los microorganismos empleados en los procesos de FES, los
hongos filamentosos (mohos) constituyen la biota microbiana predominante.

La FES se aplica en un número importante de sectores. Su potencialidad


consiste en que los microorganismos cultivados se encuentran cerca del
sustrato, el cual está a la concentración más alta para la fermentación (García,
2006). Esto se debe a que la FES simula el hábitat natural de los
microorganismos y por lo tanto es más adecuada para crecer y producir
metabolitos de valor agregado (Rani, 2009).

La Tabla 1.2 muestra diferentes formas para obtener celulasas por FES, lo que
demuestra su importancia y potencialidad. No obstante la mayoría de estas se
encuentran solo aplicadas en la escala de laboratorio (Viniegra, 2003).

Tabla 1.2.Obtención de celulasas por FES

Enzima Microorganismo Sustrato

Celulasa Trichoderma reesei + Bagazo de caña


A.phoenics

Celulasa,β-glucosidasa Aspergillus niger Residuos de la


agroindustria

Celulasa Cepas de Basdiomicetos Bagazo de caña

Fuente: (García, 2006)

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 11
1.7 Los materiales lignocelulósicos como soportes para la fermentación
en estado sólido

Los materiales lignocelulósicos son un recurso natural, abundante y renovable


esencial para el funcionamiento de las sociedades industriales actuales y
resultan vitales para el desarrollo de una economía mundial sostenible. Como
la madera y el papel, estos materiales han jugado un rol importante en la
evolución de la civilización.

La lignocelulosa es el material estructural que compone la mayor masa de las


plantas. Los componentes de la materia lignocelulósica se clasifican en tres
grupos principales: sustancias extrañas, polisacáridos y lignina (Galbe, 2007).

Se denominan sustancias extrañas a los materiales que no constituyen las


paredes celulares. Estos componentes consisten en una amplia variedad de
productos químicos que atendiendo a su solubilidad en disolventes orgánicos
neutros, pueden clasificarse en productos extraíbles o no extraíbles. Aunque se
encuentran en pequeñas cantidades los materiales extraños son muy
importantes, puesto que hacen resistente la celulosa de las plantas al ataque
de los microorganismos y de los productos químicos (Turiño, 2011)

Los polisacáridos que componen la materia lignocelulósica son carbohidratos


de gran masa molar, principalmente celulosa y hemicelulosa, que suponen
cantidades del 60 al 80% de la madera total. La celulosa es el componente
estructural de la pared celular primaria y es un polisacárido que consiste en una
cadena lineal de unidades de D-glucosa unidas por enlaces β(1 →4) (Paredes,
2010).

La configuración β, le permite a la celulosa formar cadenas largas y lineales


(Figura 1.2), las cuales se presentan unidas entre sí por medio de enlaces de
puentes de hidrógeno dando lugar a la formación de microfibrillas. Estas
regiones, conocidas como regiones cristalinas, son altamente ordenadas y le
dan las características de insolubilidad, rigidez y resistencia al ataque
enzimático (Paredes, 2010).

La hemicelulosa es un polisacárido relacionado con la celulosa, que comprende


el 20% de la biomasa de la mayoría de las plantas. A diferencia de la celulosa,
la hemicelulosa es un polisacárido que consiste en una cadena ramificada de

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 12
varios azúcares además de la glucosa, fundamentalmente xilosa, manosa,
galactosa y arabinosa (Sassner, 2008).

Figura 1.2. Estructura lineal de la molécula de celulosa.


(Fuente:http://www.porquebiotecnologia.com.ar/index.php)

La lignina forma parte integral dela pared celular secundaria delas plantas y
está formada por un conjunto de compuestos aromáticos que se forman por la
extracción irreversible del agua de los azúcares. Está unida covalentemente a
la hemicelulosa de manera que entrecruza diferentes polisacáridos de la planta,
lo que confiere resistencia mecánica a la pared celular y por tanto a toda la
planta en su conjunto. La lignina tiene un papel fundamental en la conducción
del agua en los tallos de las plantas. Los polisacáridos de las paredes celulares
vegetales son hidrofílicos y por lo tanto permeables al agua, mientras que la
lignina es más hidrofóbica. El entrecruzamiento de los polisacáridos por la
lignina es un obstáculo para la absorción del agua en la pared celular (Duque,
2010).

Por su composición química, la biomasa lignocelulósica es muy diferente de


otros compuestos con alto contenido de azúcares como el almidón. La
estructura de estos materiales, formados en mayor parte por celulosa,
hemicelulosa y lignina, hace que los procesos para la obtención de etanol
deban ajustarse de acuerdo a las características de estos componentes
(Claassen, 1999).

La Tabla 1.3 muestra los contenidos de celulosa, hemicelulosa y lignina de


residuos de la agricultura usados como materiales lignocelulósicos y utilizados
en fermentaciones en estado sólido.

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 13
Tabla 1.3. Contenido de celulosa, hemicelulosa y lignina en diferentes materiales
lignocelulósicos

Material Celulosa (%) Hemicelulosa (%) Lignina (%)


Lignocelulósico
Mazorca de maíz 45 35 15
Bagazo de caña 41 24 18
Cáscara de nuez 25 a 30 25 a 30 30 a 40
Paja de trigo 30 50 15
(Fuente:(Duque, 2010)

1.7.1 El bagazo de caña de azúcar como material lignocelulósico

El bagazo es el residuo fibroso de la caña de azúcar obtenido después de la


molienda y de la extracción de azúcar. Está formado por agua, fibras, y
cantidades pequeñas de sólidos solubles. Por lo general, se quema en calderas
de baja eficiencia para producir poca energía.

No obstante, debido a su alto contenido de carbohidratos, relativamente bajo


contenido de lignina y disponibilidad como subproducto industrial es un sustrato
apropiado para la bioconversión en etanol y la obtención del sistema
enzimático celulasa (Martín, 2002; Xin, 2010).

En el caso de Cuba que tiene tradición y cultura azucarera de las primeras del
mundo, el bagazo y los residuos agrícolas de la caña de azúcar pueden ser
una opción para la producción de etanol lignocelulósico (Duque, 2010).

Para poder facilitar el ataque enzimático es necesario realizar un


pretratamiento al material lignocelulósico, que modifique su estructura a través
de la disminución del grado de cristalinidad y de polimerización de la celulosa,
que elimine la llamada capa de cemento de lignina-hemicelulosa que cubre la
celulosa y que incremente el área superficial (Aguilar, 2011).

1.8 Pretratamiento a los materiales lignocelulósicos

El efecto del pretatamiento de los materiales lignocelulósicos se conoce desde


hace tiempo (Li, 2009). El propósito es eliminarla lignina y la hemicelulosa,
reducir la cristalinidad de la celulosa y aumentar la porosidad de los materiales.
Tales cambios en la estructura son los que permiten el ataque de los
microorganismos a la celulosa.

El pretratamiento debe cumplir los siguientes requisitos (Galbe, 2007):

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 14
• Mejorar la formación de azúcares o la capacidad de formarlos por hidrólisis
enzimática.

• Evitar la degradación o pérdida de carbohidratos.

• Evitar la formación de subproductos inhibitorios en los posteriores procesos


de hidrólisis y fermentación.

•Ser rentable.

Las técnicas de pretratamiento pueden clasificarse en diferentes categorías


como muestra Figura 1.3 (Aguilar, 2011).

Figura 1.3.Clasificación de los pretratamientos. Fuente: (Aguilar, 2011)

El pretratamiento presenta el mayor desafío técnico del proceso fermentativo,


puesto que en esta etapa se producen los inhibidores para la fermentación
(Aguilar, 2011).

Durante el pretratamiento e hidrólisis de la biomasa lignocelulósica se forman,


junto con los azúcares fermentables, gran cantidad de compuestos que
pueden inhibir la fermentación subsiguiente. Estos inhibidores se forman a
partir de productos de degradación de los azúcares solubles y de la lignina
(Vargas, 2010). Sin embargo, a través de un control adecuado de la
temperatura y el pH la formación de productos inhibidores puede minimizarse
(Aguilar, 2011).

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 15
1.9 Experiencias en la obtención de enzimas celulasas mediante FES

El grupo cubano de Biotecnología Aplicada de la Facultad de Ingeniería


Química de la CUJAE, se dedica al estudio de la obtención de enzimas
celulasas a partir de la fermentación en estado sólido para la producción de
etanol. Duque (2010) en su trabajo evaluó la obtención de enzimas celulasas
de diferentes cepas de hongos (Trichoderma viride, Aspergillus niger y otras no
identificadas)aisladas en el ICIDCA y la velocidad de hidrólisis del sustrato
papel de filtro con esas enzimas, encontrando condiciones óptimas de pH y
temperatura de hidrólisis para algunas de esas enzimas. García (2006) también
estudió la estabilidad de la actividad celulolítica del crudo enzimático de la cepa
J-1 (Aspergillus niger) extraído con tres solventes diferentes y conservado a
temperatura ambiente en diferentes tampones.

Actualmente este grupo está desarrollando estudios para lograr un producto


cubano constituido por enzimas de las cepas de hongos autóctonas, aplicable
en la etapa de hidrólisis enzimática del proceso de transformación de desechos
lignocelulósicos en etanol (Martí, 2013; Turiño, 2011) y sustituto de las enzimas
comerciales de la firma danesa Novozymes y norteamericana Gencor. Es por
ello que la búsqueda de nuevas cepas fúngicas con actividad celulolítica y
propiedades estables de sus enzimas constituye un aspecto principal en el
desarrollo de estas investigaciones.

Por otra parte también es importante destacar que en los estudios


mencionados no se empleó ningún método para estimular la producción de
enzimas celulasas. Por tanto, basándose en experiencias como la de
Mengxiang (2011) resultaría interesante aplicar un tratamiento de campo
magnético oscilante, con el propósito de valorar su utilización como una
alternativa al desarrollo del proceso de obtención de enzimas celulasas por
FES.

1.10 Aplicación del campo magnético en fermentaciones

1.10.1 Aspectos generales

El magnetismo es un fenómeno físico íntimamente relacionado con la


electricidad. Para las investigaciones, el campo electromagnético se obtiene a
partir de corriente eléctrica que pasa a través de una bobina tipo solenoide, por
lo que será un campo magnético oscilante (CMO) dependiente de la frecuencia

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 16
de la corriente eléctrica que lo indujo. Si dicha corriente se rectifica a través de
un banco de capacitores, se obtiene un campo magnético estático (CME), que
puede obtenerse por imanes permanentes de intensidad de campo magnético.
Según la frecuencia de las oscilaciones de la corriente (Hz = s -1), el CMO se
clasifica de baja o alta frecuencia (FB y FA respectivamente), y en CME,
cuando la frecuencia es cero. Las unidades de densidad del campo magnético
son tesla (T) y Gauss (G), siendo 1T=104G (Anaya, 2011).

Las investigaciones actuales se realizan con CMO de baja frecuencia (1 a 300


Hz) aplicados en cortos tiempos de exposición. Así se facilita la
modelación y posterior escalado de los resultados obtenidos, ya que mientras
menor sea la frecuencia más semejan al CME (0 Hz), y mientras menor tiempo
de exposición mejor será para aplicar sobre flujos moderados (Zapata, 2005).
No obstante, el CMO siempre requerirá consumo de electricidad, lo que
debería de tenerse en cuenta para su aplicación (Anaya, 2012).

Se investiga la interacción de campos electromagnéticos en sistemas


biológicos, pero no existe consenso sobre los mecanismos biofísicos que
puedan explicar mucho de los efectos biológicos observados con CMO-FB. La
acción del campo magnético en el material biológico se ejerce en diferentes
niveles de organización, considerando el nivel celular y la complejidad
molecular del organismo expuesto (Mas Diego, 2010).

Aunque no hay una teoría aceptada concerniente a las reacciones de


microorganismos al campo magnético, estas se interpretan por los cambios
ocurridos en la permeabilidad de las membranas celulares. Por consiguiente,
se sugiere que los mecanismos de los efectos campo-inducción en células
pueden explicarse en términos de la cinética de las reacciones bioquímicas, de
los enlaces químicos, los estados físicos de las macromoléculas y la
modificación indirecta de las reacciones intermedias que no definen la
velocidad de las reacciones. Las características eléctricas de la membrana
(movilidad electroforética e impedancia) determinan el transporte y la
concentración iónica a ambos lados de la misma. Las alteraciones inducidas en
la doble capa iónica pueden jugar un papel significativo en las respuestas
celulares ante los campos magnéticos (Mas Diego, 1999).

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 17
Por tanto, es posible estimular el crecimiento microbiano con una combinación
experimental dada de inducción magnética y de tiempo de exposición. Aplicado
a los procesos cuyo objetivo es el incremento de la biomasa, esto significa que
se obtendrá un incremento de la eficiencia del proceso, disminuyendo los
tiempos de fermentación y aumentando el rendimiento del mismo. La
disminución del tiempo de fermentación implica directamente un menor costo
de operación (Mas Diego, 1999).

El incremento en el rendimiento de los sistemas fermentativos es uno de los


principales aspectos de la ingeniería de bioprocesos. Existe una amplia gama
de productos microbianos en la industria química, alimentaria y farmacéutica
por lo que el diseño de procesos basados en células vivas o componentes
celulares puede incorporar el uso de procedimientos que impliquen mayor
eficiencia. Con la aplicación del campo electromagnético se acelera el
crecimiento del sistema biológico, alcanzándose los parámetros requeridos en
menos tiempo (Mas Diego, 2013).

1.10.2 Teorías sobre los efectos del tratamiento magnético

Experimentalmente se ha probado que en los cambios que sufren


algunos sistemas biológicos por la acción de los tratamientos magnéticos
(TM) influyen la densidad, las características espaciales y temporales de
dichos TM y las propiedades del medio en el cual tiene lugar el fenómeno
(Sabanero, 2008).

Otra explicación a los fenómenos observados por la aplicación de TM


sobre los microorganismos, está dada por las teorías de la física cuántica,
planteándose que ciertos valores de densidad o frecuencia de los campos
electromagnético y magnético aportan energía que se amplifica lo suficiente
como para provocar el reordenamiento espacial entre las cargas (Cefalas,
2008).

Aunque los mecanismos por los cuales el TM afecta el desarrollo de los


microorganismos están sin esclarecer completamente, se mencionan dos que
son los más aceptados (Anaya, 2011): Mecanismo de resonancia del ión
ciclotrón y el mecanismo de resonancia del ión paramétrico.

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 18
Pero existen otros mecanismos relacionados a los sistemas biológicos que
consideran que el cambio ocurre sólo cuando las células no esféricas están
orientadas en dirección paralela o perpendicular al CEM aplicado. Los TM
pueden actuar mejor cuando dichas células están dispuestas en fila (como
bacterias), y ejercer una fuerza bastante grande en la membrana, como para
abrir sus canales. También se conoce que los iones Ca2+ vibran continuamente
sobre una posición de equilibrio. Dentro de este contexto es diferente el efecto
de un CME, que solamente produciría una rotación de los dipolos magnéticos
(hace girar el plano de vibración) tendiendo a orientarlos en la dirección del
campo en la frecuencia de giro exactamente igual al del ciclotrón del calcio
ligado y restringiendo su movilidad, ocasionando así un efecto significativo solo
si éstos participan en reacciones químicas. En contraste, un CMO en la
frecuencia del ciclotrón desordena su precesión al punto que debilita el enlace
entre el ión Ca2+ y los fosfolípidos de las membranas plasmáticas , que podría
afectar la velocidad de las reacciones químicas (Amado, 2005; Sabanero,
2008).

1.10.3 Efecto de campo magnético en el crecimiento de microorganismos


y en la producción de metabolitos

Se han publicado algunos estudios sobre los efectos del campo magnético en
la estimulación del crecimiento de microorganismos. Respecto a las bacterias,
en el 2009 se informó el efecto de la exposición a un campo magnético estático
sobre el crecimiento y viabilidad celular, y expresión genética de Salmonella
entérica. Álvarez (2006) informó el efecto del CMO-FEB en la producción de la
nisina del Lactococcus lactis usando suero de queso, obteniendo como
resultado que el rendimiento de la nisina con relación al consumo del sustrato y
biomasa formada fue tres y cinco veces más alto, respectivamente, que los
valores del experimento de control.

En procesos de FES ,González (2002) informó resultados de la exposición de


Verticillium lecanii a 80 mT durante 30 minutos demostrando que el tiempo de
fermentación se redujo en 12 horas. Mas Diego (2010) informó incremento de
50%del crecimiento de Trichoderma harzianum, bajo la influencia de CMO de
60 mT durante 15 minutos y 20 % en la conidiación de Beauveria bassiana
después de la exposición a un CMO inferior a 0,1 T durante 20 minutos. Este

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 19
resultado sobre la formación de conidios coincide con los informados por
(Nagy, 2005), quien observó estimulación entre 10 y 70% en la germinación de
los conidios de Curvularia inaequalis y Alternaria alternata con campo
magnético estático de 0,1 a 3,5 mT.

Mengxiang (2011) investigó la producción de celulasa y ácido cítrico por A.


niger en fermentación sumergida con CMO-FEB (50 Hz), con una amplitud
entre 0,2 y 1 mT. Concluyó que la actividad de celulasa y el rendimiento de
ácido cítrico se incrementaron con el tiempo de exposición, siendo el
metabolismo del ácido cítrico más sensible al campo magnético que la
producción de celulasa. La actividad de celulasa se incrementó gradualmente
entre 0,2 y 1 mT en un tiempo de exposición de 4h.

En todos estos casos el campo se aplicó directamente al microorganismo, lo


que conlleva al planteamiento si el campo magnético produce efectos
genotóxicos.

1.10.4 Efecto genotóxico del campo magnético

Los científicos e ingenieros sostienen que el CMO-FEB (causados por líneas


de alta tensión, transformadores, centrales eléctricas, etc.) no puede producir
cambios biológicos significativos, porque las radiaciones no son capaces de
romper los enlaces moleculares y por ello solo generan un pequeño aumento
de calor (Castro, 2009). Las investigaciones realizadas en EE.UU., Canadá e
Inglaterra, demuestran que la exposición a dichos campos no es peligrosa,
pues debe tenerse en cuenta el valor de tensión o voltaje de la corriente y la
distancia de exposición. En tal sentido, se plantea que a corta distancia de una
bobina, la densidad del CMO-FEB decae drásticamente. Por ejemplo, una
bobina en cuyo interior el CMO es de 7 T, si se mide dicho parámetro a una
distancia de 2 m de la misma este tendrá un valor menor del orden de 10-5 T,
o sea, el CMO medido en ese lugar asociado a la bobina será de 70 micro tesla
(µT), nivel comparable al campo magnético de la tierra (50 a 70µT) (Anaya,
2011).

Por otra parte, se plantea que el TM puede provocar efectos genotóxicos


(cambios del ADN) que conllevan a mutaciones celulares. Investigaciones
recientes destacan que solo densidades superiores a los 5 T provocan cambios

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 20
sustanciales en el ADN. No obstante, deberán realizarse más investigaciones
que permitan aclarar la genotoxicidad del TM, ya que este aspecto puede ser
beneficioso o perjudicial según el interés en cuestión (Anaya, 2011).

Con vistas a esto se han realizado estudios como el de (Campos, 1999), donde
se analiza el crecimiento celular y los efectos genotóxicos de este agente físico
sobre Aspergillus nidulans, informando la ausencia de genotoxicidad y aumento
del crecimiento en dependencia de la inducción magnética, el tiempo de
exposición y el tipo de onda electromagnética utilizado en cada caso.

Por tanto, el TM puede ser aplicado como tecnología de forma segura, puesto
que a una corta distancia de la bobina la intensidad decae drásticamente. Los
equipos colocados a una distancia razonable de la bobina, también están fuera
de peligro y el proceso puede ser operado sin ningún riesgo (Anaya, 2011).

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 21
Capítulo 2. Materiales y métodos
2.1 Caracterización del local del muestreo

Se realizaron dos muestreos en período de lluvia en el almacén central del IIIA


(27 de mayo y 10 de junio de 2013). El mismo tiene las siguientes dimensiones
(Figura 2.1): 70 m de largo (con dos puertas de 3 m cada una ubicada en la
parte central) por 24 m de ancho y 7 m de alto (con un ventanal de 50 cm de
alto colocado a 5 m a lo largo del mismo).

Figura 2.1. Vista en planta del almacén central de víveres del IIIA. Nota: los
códigos de dos dígitos empleados representan los puntos de muestreo (del 1 al
6) indicando el número 1 el lado derecho y el número 2 el lado izquierdo del
almacén.

Se monitorearon la temperatura y la humedad relativa del almacén con un


termohigrómetro digital (Hygro-Thermometer DHT-1, China) con escala de
temperatura de 5 a 50ºC de precisión 0,1ºC y de humedad relativa de 10 a 100
% de precisión 1%.

2.2 Técnicas de muestreo microbiológico ambiental

Se aplicó el método gravimétrico de sedimentación propuesto por Omeliansky


(Bogomolova, 2009), con placas Petri de 90 mm de diámetro y Agar Extracto
de Malta. Luego se incubaron las placas Petri por 5 días a 30ºC. El tiempo de
exposición de las placas abiertas fue de 1 hora (Pasquarella, 2000).

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 22
2.2.1 Determinación de la cantidad de puntos de muestreo

La cantidad de puntos a muestrear se calculó a partir de la ecuación propuesta


por la norma FEDECAI de 2007:

P = 0,1 S 0,56 (1)


Donde P es el número de puntos a muestrear y S es la superficie del local.
Debido a la presencia de las dos puertas en dicho local, los 6 puntos de
muestreo obtenidos se distribuyeron a la derecha y a la izquierda de las
mismas (12 puntos en total) colocando las placas sobre los envases que
contenían diferentes sustratos (Tabla 2.1). De esta forma se procuró tener un
resultado más representativo, ya que muchos envases presentaban restos de
su contenido alrededor.

Tabla 2.1. Distribución de los puntos de muestreo en el interior del almacén del IIIA.

Ubicación en el Punto del Código Coordenadas Sustrato


almacén muestreo para la (m)
placa X Y
Derecha (1) 1 11 61 20 Proteína de soya en saco de papel
2 21 42 19 Azúcar blanco en saco de nylon
3 31 53 11 Nylon p/cubrir sacos de azúcar
4 41 59 4 Envases plásticos vacíos
5 51 43 4 Almidón de maíz en saco de papel
6 61 39 9 Pallets de madera
Izquierda (2) 1 12 7 20 Malta tostada en saco de nylon
2 22 23 19 Envases de cartón
3 32 16 13 Grasa vegetal en envase plástico
4 42 11 7 Glutamato monosódico en papel
5 52 6 4 Envases de vidrio
6 62 24 8 Envases de cartón
Nota: las placas se colocaron en el mismo lugar en los dos muestreos.
2.3 Técnicas microbiológicas

2.3.1 Aislamiento e identificación de colonias fúngicas

Posteriormente las colonias fúngicas que crecieron en las placas Petri de 90


mm, se aislaron, resembrándose en placas Petri de 30 mm con Agar Extracto
de Malta. Para ello se seleccionaron las colonias tipos que presentaban
características morfológicas similares en el anverso y el reverso enfatizando en
su color, pigmentación y textura.

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 23
Para diferenciar los hongos aislados se utilizó un código de 3 dígitos, siendo el
significado de los dígitos el punto de muestreo, ubicación en el almacén y
número del hongo encontrado en ese punto, respectivamente. No obstante,
algunos hongos se pudieron identificar por sus características morfológicas.

2.3.2 Determinación semicuantitativa de la actividad enzimática de los


hongos aislados

2.3.2.1 Capacidad celulolítica y producción de pigmentos

Con el objetivo de determinar el poder degradativo de la celulosa y la


producción de pigmentos por parte de las cepas fúngicas aisladas, se
cultivaron en tubos con cuña que contenían el medio de cultivo de composición
salina siguiente (para un litro): 2 g de nitrato de sodio; 1 g de fosfato de potasio;
0,5 g de sulfato de magnesio; 0,5 g de cloruro de potasio; 0,01 g de sulfato
ferroso; 20 g de agar; pH= 5,5. Como fuente de carbono se empleó en un caso
una tira de papel de filtro equivalente a 50 mg, en otro celulosa cristalina (1%) y
en otro carboxi-metil-celulosa (1%). Como control se empleó glucosa 1%. Las
cepas se incubaron a 300C durante 21 días. El crecimiento del hongo sobre el
papel de filtro y su tinción demuestran la capacidad celulolítica y la producción
de pigmentos respectivamente (Borrego, 2012).

2.3.2.2 Capacidad proteolítica

La actividad proteolítica se determinó a través de la hidrólisis de la gelatina en


tubos de cultivo implementando una modificación al método de (Abrusci, 2005)
informado por (Borrego, 2010). Cada hongo aislado se inoculó por punción en
el medio de composición salina similar al empleado anteriormente pero sin
agar.Se adicionó gelatina a razón de 120g/L y se ajustó el pH a 7,2. Los tubos
inoculados se incubaron por 7 días a 300C y luego a 4ºC por 1 hora. Después
de agitar los tubos se evidencia la reacción de hidrólisis positiva por la
licuefacción del medio.

2.3.2.3 Capacidad amilolítica

La actividad amilolítica se determinó a través de la hidrólisis del almidón en


placas Petri (Borrego, 2010). Cada aislado se inoculó por punción invertida en
placas con un medio de composición salina (para un litro) similar al empleado
anteriormente; 20g de agar y almidón soluble (5 g/L) como fuente de carbono.

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 24
Después de incubar por 7 días a 30ºC se añadió 5 mL de solución del reactivo
Lugol sobre cada placa de cultivo. La presencia de una zona incolora alrededor
de las colonias se tomó como indicador de hidrólisis positiva.

2.3.2.4 Producción de ácidos

Se sembraron las cepas de hongos en caldo de cultivo cuya composición salina


para un litro fue: 2 g de nitrato de sodio; 1 g de fosfato de potasio; 0,5 g sulfato
de magnesio; 0,01g de sulfato ferroso. Como fuente de carbono se utilizó
glucosa al 1% y se ajustó pH a 7. Se adicionó 0,001 % de rojo fenol como
indicador para el cambio de coloración. Los cultivos se incubaron a 30ºC por 3
días y posteriormente se midió el pH por potenciometría (Borrego, 2010).

2.4Selección de cepas fúngicas de interés

La selección de las cepas de interés se realizó a partir del análisis de los


resultados de la actividad enzimática semicuantitativa, teniendo en cuenta las
de mayor capacidad celulolítica. Para ello se hizo énfasis en su crecimiento
sobre papel de filtro y en la identificación taxonómica de las cepas, descartando
géneros fúngicos patógenos.

2.5 Determinación cuantitativa de la actividad celulolítica (PFasa)

2.5.1 Soluciones

2.5.1.1 Solución de sales trazas de Mandels

Se preparó la solución según (Mandels, 1976) y se esterilizó en autoclave


(modelo VEB MLW Medizinische) durante 20 minutos a 121ºC y 2 atmósferas
de presión.
2.5.1.2 Tampón citrato de sodio

Se preparó la solución tampón de 0,05mol/L y pH =4,8, según (Ghose, 1987).


2.5.1.3 Ácido 3,5- Dinitrosalicílico (DNS)

Se preparó el reactivo según (Miller, 1959).


2.5.1.4 Tampón acetato de sodio, pH =5

Se prepararon dos soluciones: una de citrato de sodio (C2H3O2Na) (8,204 g/L) y


otra de ácido acético de 0,1 mol/L. Se mezclaron ambas soluciones añadiendo
67,8 mL de la primera y 32,2 mL de la segunda.

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 25
2.5.1.5 Tampón fosfato, pH=7

Se prepararon dos soluciones una de fosfato de potasio (KH2PO4) (9,073 g/L) y


otra de fosfato de sodio dibásico anhidro (Na2HPO4) (9,686 g/L). Se mezclaron
ambas soluciones añadiendo 41,3 mL de la primera y 58,7 mL de la segunda.

2.5.2 Propagación de cepas

Los microorganismos se propagaron en medio Agar Malta (50 g de agar por


litro de agua destilada) vertido en erlenmeyers de 250 mL bajo condiciones de
esterilidad. Se incubaron a 30ºC durante 7 días para obtener abundante
esporulación. La manipulación durante el mantenimiento de cepas, la
preparación de inóculos y la inoculación se efectuó bajo condiciones de
asepsia en el cuarto de siembra para evitar contaminaciones.

2.5.3 Preparación de inóculos


Las suspensiones de esporas inoculantes de las fermentaciones se prepararon
añadiendo entre 10 y 20 mL de solución estéril de sales trazas a cada
erlenmeyer con los microorganismos previamente crecidos. Luego para
arrastrar las esporas se empleó la zaranda (HDL-APPARATUS) durante 30
minutos a velocidad entre 100 y 120 min-1. Se filtró la solución a través de lana
de vidrio estéril para eliminar restos de micelios y se realizó el conteo de
esporas en la cámara de Neubauer. Las suspensiones se conservaron a 10oC.

2.5.4 Sustrato para la fermentación en estado sólido (FES)


Como sustrato para la FES se empleó el bagazo de caña de azúcar donado por
el Instituto Cubano de Investigaciones de los Derivados de la Caña de Azúcar
(ICIDCA). Su tamaño de partículas varío entre 1 y 5 mm. El método de
pretratamiento usado fue hidrólisis básica con hidróxido de sodio (NaOH),
añadiendo 1 L de NaOH al 3% (p/v) por cada 100 g de bagazo de caña de
azúcar, seguidamente se agitó la mezcla hasta alcanzar homogeneidad y se
esterilizó a 121ºC y 2 atm durante 1 h en la autoclave. Luego se lavó con agua
a la cual se le añadieron gotas de H2SO4 para bajar pH entre 5 y 6 y se secó en
el horno (Modelo: DHG-1946 A) durante 24 h, según (Dustet, 1999).

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 26
2.5.5 FES con bagazo de caña de azúcar pretratado para las cepas

Se prepararon erlenmeyers de 500mL con 5g de bagazo de caña seco


pretratado como sustrato de la fermentación. Se esterilizaron durante 20
minutos a 121ºC y 2 atm. El sustrato (5 g de bagazo pretratado) se enriqueció
con las sales minerales siguientes: urea (0,117 g), fosfato de potasio (KH2PO4)
(0,234 g) y sulfato de amonio ((NH4)2SO4) (0,49 g) según Roussos S. et al.,
1991
Para obtener 70% de humedad en el medio de cultivo, se añadió la solución de
sales minerales mencionadas, fijando el pH en 4,5, y la solución de esporas
inoculante bajo condiciones de esterilidad. Se incubó a 30ºC durante 72 horas.
Los volúmenes de las soluciones de esporas y de sales minerales se
calcularon según las ecuaciones siguientes:

( )
( ) ( )
( )

( ) ( ) ( ) ( )

( ) ( ) ( ) ( )

( )
( ) ( )

2.5.6 Extracción y centrifugación del crudo enzimático

Al terminar la FES se realizó la extracción del crudo enzimático añadiendo 40


mL del tampón citrato de sodio pH= 4,8 y unas gotas de Tween 80 a cada
erlenmeyer. Se colocaron en la zaranda (HDL-APPARATUS) a una velocidad
de 120 min-1 por 20 minutos y posteriormente se filtró empleando la bomba de
vació (ILMVAC-GmbH) para recolectar el líquido. Los extractos fueron
centrifugados (centrífuga modelo: Hitachi SCT 15 B) a 10000min-1durante 5
minutos y se tomó el sobrenadante libre de células para los ensayos
posteriores.

2.5.7 Ensayo con papel filtro para la determinación de la actividad


celulasa

Se utilizó el método descrito por (Adney, 2009). En tubos de ensayo con 1mL
de tampón citrato de sodio 0,1 mol/L (pH=4,8) y una tira de papel filtro

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 27
Whatman 1; 1,0 x 6,0 cm (equivalente a 50 mg) como sustrato, se adicionaron
0,5 mL del sobrenadante de la centrifugación. La mezcla se incubó en baño
termostático (HITACHI SCT 15B) de agua a 50ºC por 60 minutos. Se añadieron
3 mL del reactivo DNS a cada tubo y se calentó a 100ºC durante 5 minutos
para detener la reacción. Se adicionó a cada tubo una cantidad de agua
equivalente a 2,5 mL en 0,2 mL de mezcla de reacción y se determinó la
absorbancia a 540 nm en un espectrofotómetro (modelo: modelo: RAYLEIGH
VIS-723G).

2.5.7.1 Curva patrón de glucosa


Para todas las determinaciones colorimétricas se utilizó una curva de
calibración en las mismas condiciones del ensayo descrito en 2.5.7. Se utilizó
como patrón una solución de D-glucosa con 10 mg/mL a la que se varió la
concentración final en tampón citrato 0,05 mol/L. A partir de las diferentes
concentraciones de glucosa estándar y los valores de absorbancia
correspondientes se obtuvo el modelo lineal que muestra la figura 2.2, el cual
permite determinarla concentración de glucosa.

4,0
Concentración (mg de glucosa/0,5 mL)

3,5
y = 3,5599x + 0,038
3,0
R² = 0,998
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0 0,2 0,4 0,6 0,8 1
Absorbancia a 540 nm

Figura.2.2. Curva patrón de glucosa en tampón citrato de sodio de 0,05 mol/L y


pH =4,8.

Para determinar la concentración de enzima la IUPAC define que la formación


de 2 mg de glucosa/0,5mL de tampón equivale a 0,37 UI/mL. Por tanto la

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 28
actividad enzimática de cada muestra puede determinarse mediante la relación
de proporcionalidad siguiente:

( )
( ) ( )

2.6 Ensayo de estabilidad de la actividad PFasa del crudo enzimático


Después de concluida la etapa de fermentación se procedió a extraer el crudo
enzimático con cuatro solventes diferentes en tampones de acetato de sodio
(NaAc) 0,1mol/L, pH=5; fosfato (PO4) pH=7; citrato de sodio 0,05mol/L para pH
=4,8 y agua destilada pH=6,91. Los extractos centrifugados se conservaron a
temperatura ambiente. La actividad enzimática celulasa se determinó por el
método descrito por (Adney, 2009): 0, 1, 2, 4 y 24 horas .El pH se midió a 0 y
24 horas con un medidor de pH (CRISON GLP 22).

2.7 Metodología experimental utilizada para la aplicación del tratamiento


magnético
Se seleccionó la cepa de mayor actividad celulolítica y se aplicó tratamiento
magnético siguiendo un diseño de experimento factorial 23 con los niveles de
los factores que muestra la Tabla 2.3. Se obtuvo la matriz experimental (Tabla
2.4) utilizando el programa estadístico Statgraphics Centurion XV.

Tabla 2.3. Niveles de los factores para experimento

Factor
Tiempo de
Niveles Densidad de Tiempo de
exposición a
CMO (mT) incubación (h)
CMO (h)
1 (bajo) 2 2 48
2 (alto) 4 4 72

Tabla 2.4. Matriz del diseño experimental


Tiempo Tiempo
Corrida CMO (mT) exposición incubación
(h) (h)
1 2 4 48
2 2 2 72
3 2 4 72
4 4 4 72
5 4 4 48
6 4 2 48
7 2 2 48

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 29
8 4 2 72
Los valores de CMO (Campo Magnético Oscilante) se seleccionaron a partir de
resultados de estudio anteriores (Anaya, 2011). El tiempo de aplicación del
tratamiento correspondiente a 2 h fue de acuerdo con dicho estudio en que se
observaron mayores efectos en el metabolismo de las cepas fúngicas
estudiadas, siendo este valor donde se manifestó la mayor variabilidad del
metabolismo fúngico. Y por otra parte (Mengxiang, 2011) observaron la máxima
expresión de celulasa a las 4 h. El tiempo de incubación se seleccionó a partir
de estudios de fermentaciones realizados por (Dustet, 1999).

Los tratamientos de CMO-FEB se efectuaron en la etapa descrita en el ensayo


2.5.5, es decir después de inoculados los erlenmeyers que contenían el
sustrato de la fermentación se colocaron en un equipo experimental diseñado y
confeccionado por Tecnologías Electrónicas (TECE) en Pinar del Río. El equipo
consta de un generador de señal y una bobina con núcleo de aire (Figura 2.3).

Figura 2.3.Equipo experimental de CMO-FEB(60 Hz)

Dicho equipo está calibrado (Tabla 1 en Anexo 1) y caracterizado por el Centro


Nacional de Electromagnetismo Aplicado (CNEA) de Santiago de Cuba. El
campo magnético aplicado en este estudio es homogéneo en el centro de la
bobina, el cual disminuye hasta 1 mT a los 30 cm de dicho centro.

Se realizaron réplicas a cada corrida experimental y se hizo una corrida control


(sin CMO-FEB) para 72 h de incubación.

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 30
Capítulo 3. Resultados y discusión

3.1 Estudio de la actividad enzimática semicuantitativa de los hongos


aislados del almacén central de alimentos del IIIA

Con los muestreos microbiológicos del aire del almacén de alimentos del IIIA se
aislaron 36 cepas fúngicas que evidenciaron la gran diversidad ecológica de
dicho ambiente en cuanto a hongos filamentosos. La Tabla 3.1 muestra los
datos de dichos microorganismos.

Tabla 3.1. Colonias de cepas fúngicas puras aisladas del almacén de alimentos del IIIA

Imagen en placa Materiales


presentes en
Código Observación
No. Anverso Reverso las zonas de
muestreo

Almidón de Verde oscuro en anverso y


1 AM-511
maíz verde claro en reverso.

Hialino en anverso y reverso,


2 EV-521
sin pigmentación al medio

Gris en anverso y con


3 EV-522
reverso negro
Envases de
Dematáceo en anverso y
vidrio
reverso (verde oscuro en el
4 EV-523
centro y más negro
alrededor)

Hialino en anverso y oscuro


5 EV-524
en reverso

Grasa vegetal Verde claro en anverso y


6 GV-321 en envase hialino en reverso (posible
plástico Trichoderma sp)

Verde claro en anverso y en


7 AM-512
reverso
Almidón de
maíz
Amarillo crema en anverso y
8 AM-513
hialino en reverso

Nylon p/cubrir Marrón en anverso y en


9 NA-311
saco de azúcar reverso

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 31
Nylon p/cubrir Verde oscuro en anverso y
10 NA-312
saco de azúcar en reverso

Envases
11 EP-411 Hialino en anverso y reverso
plásticos

Pallets de
12 PM-611 Crecimiento levaduriforme
madera

Blanco en anverso y hialino


GM-
13 en reverso, con pigmentación
421
Glutamato amarilla oscura al medio
monosódico Blanco en anverso y hialino
GM-
14 en reverso, con pigmentación
422
amarilla clara al medio

Envases de
15 EC-621
cartón Verde oscuro en anverso y
verde claro en reverso
(posible Trichoderma sp)
16 PS-111
Proteína de
soya Hialino en anverso y reverso,
17 PS-112 muy filamentoso (posible N.
crassa)

Verde oscuro en anverso y


18 AB-211 Azúcar blanco
verde claro en reverso

Carmelita claro en anverso y


Envases
19 EP-412 reverso, arenoso (inhibe a N.
plásticos
crassa)

Blanco en anverso y crema


20 EP-413
en reverso, algodonoso
Envases
plásticos
Hialino en anverso y reverso,
21 EP-414
muy algodonoso

Verde oscuro en anverso y


Proteína de
22 PS-113 crema en reverso (colonia
soya
pequeña)
Verde oscuro en anverso y
23 AB-212 Azúcar blanco hialino en reverso (posible
Aspergillus sp)
Verde oscuro en anverso y
24 EP-415 verde claro en reverso
Envases (posible Trichoderma sp)
plásticos Verde olivo oscuro en
25 EP-416 anverso y reverso (posible
Aspergillus sp)

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 32
Verde olivo oscuro en
26 EP-417 anverso y negro en reverso
(posible Aspergillus sp)
Carmelita oscuro en anverso
Pallets de
27 PM-612 y claro en reverso (única
madera
colonia en esa placa)
Negro en anverso y amarillo
28 MT-121 verdoso en reverso (posible
Aspergillus sp)
Malta tostada
Verde olivo anverso y
29 MT-122 reverso, formando anillos
concéntricos
Negro en anverso y hialino en
30 EC-622 reverso, con pigmento fucsia
al medio

31 PM-613 Crecimiento levaduriforme


Envases de
cartón
32 EC-623

Negro en anverso y hialino en


33 EC-624 reverso (posible Aspergillus
sp)

Nylon p/cubrir
34 NA-313
saco de azúcar

Envases
35 EP-418 Crecimiento levaduriforme
plásticos

Blanco en anverso y hialino


GM- Glutamato
36 en reverso, con pigmentación
423 monosódico
amarilla oscura al medio

Puede observarse que los hongos se encontraron mayormente en las zonas


donde existían condiciones más favorables como la presencia de nutrientes
(almidón de maíz, malta tostada, azúcar, cartón, madera, proteína y grasa).
Esto permite inferir que la aeromicota de este almacén deberá poseer una alta
actividad enzimática y, por tanto, alta capacidad biodeteriorante. La Tabla 3.2
muestra los resultados de las actividades enzimáticas semicuantitativas
determinadas a dichas cepas.

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 33
Tabla 3.2. Actividades enzimáticas semicuantitativas de los géneros fúngicos aislados del almacén de alimentos del IIIA

Género Celulolítica Amilolítica Proteolítica Pigmentos ácidos


código fúngico Glucosa Papel de filtro Carboxi-metil- Celulosa Degradación Degradación Coloración pH
celulosa (CMC) cristalina de almidón de gelatina del papel
AM-511 1 +++ +++ ++ ++ + + - 5,2
EV-521 2 +++ ++ +++ +++ - + - 5,1
EV-522 3 +++ +++ ++ + + - pardo 5,5
EV-523 4 ++++ ++++ +++ ++ + - grisáceo 5,5
EV-524 5 ++++ ++++ +++ + + - negro 5,6
GV-321 6 ++ + + ++ + + - 5,9
AM-512 7 +++ +++ + ++ + + - 5,3
AM-513 8 ++ + + + - + - 5,7
NA-311 9 +++ +++ +++ +++ + + - 5,3
NA-312 10 +++ +++ +++ +++ + + - 5,4
EP-411 11 - - - - + + - 5,7
PM-611 12 - - - - + + - 5,7
GM-421 13 +++ + + +/- + + - 5,2
GM-422 14 ++ + + +/- + + - 6,0
EC-621 15 ++ + + + + + - 5,1
PS-111 16 +++ ++ +++ ++ + + - 5,6
PS-112 17 + + ++ + + + - 5,7
AB-211 18 +++ +++ +++ ++ + + - 5,8
EP-412 19 +++ ++ +++ +++ + + - 5,4
EP-413 20 + ± ++ ++ + + - 5,0
EP-414 21 +++ ++ ++ ++ + + - 5,0
PS-113 22 +++ +++ +++ ++ + + - 5,1
AB-212 23 +++ ++ ++ ++ + + - 5,8
EP-415 24 ++++ +++ ++ ++ + + - 6,4
EP-416 25 +++ ++ ++ ++ + + - 5,2
EP-417 26 ++++ ++ ++ ++ + + - 5,9

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 34
PM-612 27 +++ ++ ++ ++ + + - 5,0
MT-121 28 +++ ++ ++ ++ + + - 5,1
MT-122 29 +++ ++ ++ + + + - 5,3
EC-622 30 +++ + ++ ++ + + - 5,9
PM-613 31 ++ - - - + - - 5,8
EC-623 32 +++ +++ ++ ++ + + - 5,3
EC-624 33 +++ ++ ++ ++ + + - 5,2
NA-313 34 +++ + ++ ++ + + - 5,3
EP-418 35 +++ + + + + - - 5,8
GM-423 36 +++ +/- - - + + - 5,2

++++: Indica crecimiento muy abundante, +++: indica crecimiento abundante, ++: indica crecimiento moderado, +: indica
crecimiento pobre, también es indicativo de la degradación de almidón y degradación de gelatina. +/- : indica crecimiento muy
pobre, -: indica NO crecimiento, NO producción de pigmento, NO degradación de almidón y NO degradación de gelatina.

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 35
Al analizar la tabla anterior, en sentido general, se observó que todas las cepas
aisladas mostraron resultados positivos a las pruebas realizadas (excepto EP-411
y PM-611, de tipo levaduriforme, que no presentaron actividad celulolítica ni
pigmentación).

Todas las cepas fúngicas filamentosas asimilaron la glucosa, que se utilizó como
control de crecimiento, siendo PS-112 y EP-413 las de menor desarrollo, lo que
evidencia su baja actividad celulolítica. Se observó que el 92% de las cepas
fúngicas aisladas fueron capaces de crecer (crecimiento desde muy abundante
hasta muy pobre) sobre el papel de filtro como única fuente de carbono (celulosa
amorfa de más fácil asimilación que CMC y celulosa cristalina) . Debe destacarse
que el 31% de ellas tuvieron crecimiento muy abundante sobre papel de filtro lo
cual evidencia que son posibles productoras de celulasas. De igual forma, la
mayoría de los hongos aislados (89%) crecieron (crecimiento desde muy
abundante hasta muy pobre) en celulosa cristalina (de más difícil asimilación) lo
que respalda la idea anterior.

Por otra parte, el 94% de las cepas aisladas fueron capaces de degradar el
almidón mientras el 86 % resultaron positivas a la licuefacción de la gelatina. Este
comportamiento demuestra que dichas cepas pueden emplearse en estudios
posteriores para la obtención de enzimas de interés industrial como proteasas y
amilasas.

Así mismo, se evidenció que todas las cepas produjeron ácidos pues propiciaron
la disminución del pH del medio de cultivo desde 7 hasta valores entre 5 y 6,4.
Estos valores de pH son mayores que los encontrados en otros ambientes
interiores como el Archivo Nacional de Cuba (ARNAC), donde se han aislado
colonias fúngicas productoras de ácidos que reducen el pH hasta valores entre 3 y
4 (Borrego, 2012).

Se destacan los hongos identificados con los códigos EV-522, EV-523, EV-524 ya
que a pesar de degradar fácilmente la celulosa y el almidón y crecer sobre papel
de filtro y con producción de pigmentos y pH similares (5,5 y 5,6), no manifestaron
capacidad de degradación de proteínas. Dos casos contrarios a lo anterior son los
hongos EV-521 y AM-513 (presentan alta actividad celulolítica y proteolítica, pero

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 36
no amilolítica). Este comportamiento evidencia que los hongos expresan actividad
enzimática en función de su adaptación evolutiva.

Dado el interés de esta investigación se seleccionaron las colonias fúngicas que


se destacaron por su crecimiento sobre papel de filtro: AM-511, EV-522, EV-523,
EV-524, AM-512, NA-311, NA-312, AB-211, PS-113, EP-415 y EC-623. Además,
se tuvieron en cuenta los siguientes aspectos: crecimiento rápido, tamaño de la
colonia y esporulación abundante. Por tal motivo se eliminó la cepa PS-113 por su
lento crecimiento y tamaño pequeño, siendo estos aspectos importantes para los
ensayos posteriores.

Después que los micólogos realizaran la identificación taxonómica de dichas


cepas, se concluyó que AM-511, EV-522,EV-523,EV-524,AM-512,NA-311,NA-312
y AB-211 pertenecían a las especies Aspergillus flavus o Aspergillus fumigatus.
Estudios realizados demuestran que estos hongos son patógenos tanto para el ser
humano como para animales, causando enfermedades como aspergilosis
pulmonar. Se plantea que causan con frecuencia infecciones de córnea y
nasoorbitales, además de ser alergénicos y producir aflatoxinas (micotoxinas
tóxicas y carcinogénicas) (Hung, 2011). Generalmente solo se trabaja con estos
hongos a nivel de laboratorio (pertenecen al nivel I y II, según manual del Centro
de Control y prevención de enfermedades (CDC, 2010), existiendo códigos de
bioseguridad (Decreto-Ley 190/2008) que impiden la utilización de los mismos en
procesos a escala industrial (Decreto de ley No. 190, 2008). Por tales motivos, no
se escogieron para continuar en esta investigación, quedando solo las cepas EP-
415 (Trichoderma sp) y EC-623 (Aspergillus niger). Estas especies se han
empleado en estudios similares (Duque, 2010; Dustet, 1999; García, 2006;
Mengxiang, 2011) lo que demuestra que son seguros y manifiestan alta
productividad de celulasa.

3.2 Análisis de la actividad celulolítica cuantitativa de los hongos


seleccionados

Al comparar los resultados obtenidos del ensayo de actividad celulolítica


cuantitativa de los hongos seleccionados, mostrados en la Tabla 3.3, se evidencia
que la cepa A. niger es la que mayor actividad celulolítica produce, y por ende

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 37
mejor productora de celulasas que Trichoderma sp. Este resultado concuerda con
un estudio similar realizado por Duque (2010), donde obtuvo que la cepa J-1
(Aspergillus niger) presentó mayor actividad enzimática PFasa que la cepa27
(Trichoderma viride (137 MCX-1)). Sin embargo, investigaciones realizadas por
otros autores (Vilches, 2002) indican que el género Trichoderma sp es el mejor
productor de celulasas.

Tabla 3.3.Actividad celulolítica cuantitativa de las cepas seleccionadas


Cepa fúngica Promedio de Concentración
Absorbancia de Glucosa
(540nm) (mg/0,5 mL) UPF/mL

EC-623 0,135 0,517 0,382


EP-415 0,105 0,412 0,305

Teniendo en cuenta esto, se seleccionó la cepa EC-623 (A. niger) para


caracterizar sus enzimas desde el punto de vista de la estabilidad a temperatura
ambiente y para realizar el ensayo de tratamiento magnético.

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 38
3.3 Análisis del efecto del tratamiento magnético sobre actividad enzimática
de la cepa EC-623 (A. niger)

La Tabla 3.4 muestra los resultados obtenidos a partir del diseño de experimentos
planteado en el acápite 2.7. Los valores mostraron distribución normal lo que
permite tomar la media de la muestra como la media de la población.

Tabla 3.4. Actividad enzimática PFasa de la cepa EC-623 (A. niger) por efecto del
tratamiento magnético.

Corrida Densidad Tiempo Tiempo


Actividad PFasa
CMO (mT) magnetismo(h) incubación(h)
(UPF/mL)
1 2 2 48 0,313
0,357
2 4 2 48 0,297
0,341
3 2 4 48 0,350
0,277
4 4 4 48 0,347
0,352
5 2 2 72 0,180
0,053
6 4 2 72 0,215
0,182
7 2 4 72 0,219
0,186
8 4 4 72 0,331
0,244
control 0 0 72 0,380
Nota:Condiciones iniciales: pH=4,6 y T=30ºC. En la corrida control no se aplicó campo
magnético

La tabla indica la influencia del tiempo de exposición, incubación y la densidad


delCMO sobre la actividad celulolítica de la cepa EC-623 (A.niger) al aplicarle el
tratamiento magnético.La Figura 3.1 ilustra la significación estadística de los
factores investigados y sus interacciones. Como se muestra en la misma, solo el
tiempo de exposición (B) y de incubación (C) tienen efecto significativo sobre la
actividad de la celulasa. Sin embargo, al analizar las interacciones de los factores
CMO (A) que no fue significativo por sí solo, mostró efecto positivo con el tiempo
de incubación (AC). El resto de los factores e interacciones resultaron no
significativos.

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 39
Diagrama de Pareto Estandarizada para PFasa

C:Tiempo de incubación (h) +


-
B:Tiempo de exposición (h)

AC

A:CMO de 60 Hz\220 V (mT)

BC

AB

0 2 4 6 8
Efecto estandarizado

Figura 3.1. Diagrama de Pareto de los efectos estimados en orden decreciente de


magnitud de los factores estudiados.

En la Tabla 3.5 se resume el análisis estadístico, mostrando que 3 efectos tienen


un valor-P menor que 0,05, indicando que son significativamente diferentes de
cero con un nivel de confianza del 95,0%.Esto respalda lo observado en la Figura
3.1.
Tabla 3.5 Resumen delanálisis de varianza (ANOVA)

Fuente Valor-P
A:Intensidad del CMO (mT) 0,2571
B:tiempo de exposición (h) 0,0056
C:tiempo de incubación (h) 0,0001
AB 0,5975
AC 0,0116
BC 0,3754

Por otra parte, la Figura 3.2 muestra los resultados del análisis estadístico de
comparación entre los valores obtenidos para la actividad PFasa de la cepa
tratada a 48 y 72 h, con el valor obtenido para tiempo de 72 h incubación sin
aplicar el tratamiento (control: 0,380UPF/mL).

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 40
Medias y 95.0% de Fisher LSD

0.4

0.38

Actividad celulasa (UPF/ mL)


0.36

0.34

0.32

0.3

0.28
2 4

CMO de 60 Hz / 220 V (mT)

a)
Medias y 95.0% de Fisher LSD

0.5

0.4
Actividad celulasa (UPF/mL)

0.3

0.2

0.1

0
0 2 4

C M O de 60 Hz / 220 V (mT)

b)

Figura 3.2. Análisis de varianza (ANOVA) con el método de Rangos Múltiple por
diferencias mínimas cuadradas (LSD) de Fisher(p ≤ 0,05)para diferentes tiempos
de incubación: a) 48 h y b) 72 h.

Nótese en la Figura. 3.2a que no hubo diferencia estadísticamente significativa


entre los valores obtenidos al aplicar las diferentes densidades de CMO (para 48
h), mientras que para 72 h (Figura 3.2b) sí hubo diferencia estadísticamente
significativa entre la cepa tratada respecto a la control, observándose que el
tratamiento de CMO inhibió la actividad celulolítica.

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 41
Sin embargo, al comparar los valores obtenidos para 48 h de la cepa tratada con
la cepa control a 72 h (líneas punteadas) se observó que el tratamiento magnético
aplicado resultó efectivo al reducir el tiempo de fermentación, alcanzándose
valores similares de actividad enzimática (ver escala de ambas figuras).

El planteamiento anterior debe valorarse desde el punto de vista de la


productividad de las enzimas (UPF/mL/tfermentación) obtenida para las 2 condiciones.
La Tabla 3.6 muestra las productividades promedios de la cepa tratada
magnéticamente a 48 h de fermentación y la control a 72 h de fermentación.

Tabla 3.6. Productividad de celulasa de la cepa EC-623 (A. niger)

Productividad
Tiempo de Actividad PFasa
Cepas promedio
incubación (h) (UPF/mL)
(UPF/mL/h)
control 72 0,380 5,27*10-3
Tratada 48 0,3305 6,89*10-3
magnéticamente

Como se aprecia, la productividad promedio obtenida a 48 h con el tratamiento


magnético, es mayor que la obtenida con la fermentación hasta 72 h sin la
aplicación del mismo. No obstante, debe valorarse la relación costo-beneficio,
puesto que, a pesar de que al aplicar el tratamiento de CMO disminuye el tiempo
de fermentación de 72 a 48 h con incremento de la productividad, esto pudiera
involucrar mayores costos económicos si se llevaran estos resultados a escala
industrial. Por tanto, esta alternativa solo se justificaría si al aplicar el tratamiento
magnético, el costo fuese menor que cuando la fermentación es por 72 h sin el
empleo del mismo.

La Figura 3.3 muestra los valores más adecuados de los factores analizados,
siendo el régimen de tratamiento: 48 h de incubación y 4 h de exposición para
CMO de 4 mT, donde se logra la mayor producción de celulasas. El tiempo de
exposición coincide con el informado en el estudio realizado por (Mengxiang,
2011) con otra cepa de A. niger en fermentación sumergida.

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 42
Gráfica de Efectos Principales para PFasa

0,35

Actividad celulasa (UPF/ml)


0,32

0,29

0,26

0,23

0,2
2,0 4,0 2,0 4,0 48,0 72,0
CMO de 60 Hz \220 V (mT) Tiempo exposición (h) Tiempo incubación (h)

Figura 3.3. Efectos principales estimados de la actividad PFasa como una función
de cada factor experimental.

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 43
3.4 Estudio de la estabilidad de la actividad PFasa del crudo enzimático de la
cepa EC-623 (A. niger)

Teniendo en cuenta que las enzimas pueden perder de manera irreversible su


actividad después que se separan del sustrato y que los volúmenes a manejar
entre una etapa y otra del proceso industrial son grandes; es necesario mantener
la actividad enzimática que se logró en la etapa de fermentación.

Por las razones anteriores y debido a que se desconoce la estabilidad del crudo
enzimático concentrado de la cepa EC-623, se determinó la estabilidad de la
actividad PFasa post fermentación utilizando cuatro solventes diferentes para la
extracción y conservando el crudo a temperatura ambiente durante 24 horas.
Se consideró como criterio de estabilidad una pérdida de actividad enzimática no
mayor del 20% de la que se logró en la etapa de fermentación. La Figura 3.4
muestra los porcentajes de actividad celulolítica residual obtenidos durante el
ensayo.

100

95
% de Actividad residual

90

Citrato pH=4,8
85
Agua pH=6,9
80
Acetato de sodio
pH=5
75
Fosfato pH=7

70
0 0,5 1 2 4 24

Tiempo (h)

Figura 3.4.Actividad PFasa residual durante 24 horas en diferentes soluciones tampón a


temperatura ambiente.

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 44
Se aprecia que, la celulasa conservada en los cuatro tampones mantiene su
estabilidad en 24 h a temperatura ambiente sin una diferencia tan maracada (ver
Tablas en Anexo 1), teniendo todas las muestras más del 80% de actividad PFasa
residual. En estudios similares realizados con enzimas pertenecientes a otras
cepas de la misma especie (A. niger) no se considera lo mismo.

Haramboure (1998) y Pérez (2000) demostraron que las enzimas celulasas de la


cepa J-1 (A. niger) extraídas con solución tampón de acetato de sodio de pH 4 y
almacenadas a temperatura ambiente perdieron 20% de actividad PFasa en 24 h.
Posteriormente, García (2006) estudió la estabilidad de la actividad PFasa del
crudo enzimático de dicha cepa (J-1) extraído con tres solventes diferentes y
conservado a temperatura ambiente en tampones de acetato de sodio (NaAc),
fosfato (PO4) 50 mmol/L y agua destilada. Los resultados obtenidos en 24 h
demostraron 100% de estabilidad en el tampón NaAc a pH 4,23, mientras que en
agua destilada a pH 5,3 y en la solución tampón de fosfato a pH 7,0 se observaron
pérdidas de actividad de la enzima de 20 y 24%, respectivamente. En el 2010
Duque caracterizó el crudo enzimático concentrado de la misma cepa sin
presencia de tampón, obteniendo que pierde 35,4% de actividad enzimática PFasa
en 24 h a temperatura ambiente.

Por tanto, los resultados obtenidos en este estudio son interesantes, puesto que al
compararlos con los informados por estos autores, se evidencia que las enzimas
producidas por la cepa EC-623 pueden conservarse en agua sin pérdida
significativa de su actividad PFasa residual (15%) en 24 h. Esta es una opción
atractiva, puesto que la extracción de la enzima con agua es favorable desde el
punto de vista económico, por ser un solvente abundante y disponible en la
naturaleza. Por otra parte, también puede inferirse que el crudo enzimático de la
cepa EC-623 presenta propiedades más estables que la cepa J-1, puesto que se
conservó mejor en tampón fosfato, perdiendo menos del 20% de su actividad
enzimática PFasa en 24 h.

No obstante, los mayores valores de actividad PFasa residual de este estudio se


obtienen utilizando los tampones acetato de sodio a pH 5 y citrato de sodio a pH
4,8 (ver Tablas en Anexo 1).

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 45
3.5. Cálculo del costo de la investigación

Dentro del costo de producción de un proceso se encuentra el costo de


investigación y desarrollo. Teniendo en cuenta que el resultado de este trabajo, es
sólo el comienzo de un proceso investigativo y se llevó a cabo a escala de
laboratorio no tiene sentido realizar análisis de factibilidad económica, por tanto los
resultados obtenidos se consideran preliminares y como alternativa se determinó
el costo de la investigación realizada.

El análisis consistió en la determinación de los costos totales que se dividen en


costos directos e indirectos.

Dentro de los costos directos se encuentran el costo de las materias primas,


equipamiento, recursos humanos y otros gastos; mediante las ecuaciones 7, 8, 9,
10 y 11 se calcularon sus valores y las Tablas de la 3.7 a la 3.10 muestran sus
resultados.

( ) ( ) ( )

( ) ( ) ( )

Donde:

Pc: Potencia consumida (kW)

( )
( )
( )

Donde:

CAET: costo de adquisición del equipamiento tecnológico (CUP)

( ) ( ) ( )

Para calcular los costos indirectos se consideran que representan el 12 % de los


costos directos y los costos totales (CT) constituyen la suma de los costos directos
(CD) y los indirectos (CI) (ecuación 11).Todos los costos obtenidos en CUC fueron
convertidos utilizando la relación: 1 CUC = 10 CUP.

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 46
( )

Tabla 3.7. Costo de las materias primas

Descripción Consumo Precio (CUP/kg) Costo (CUP)


(kg)
Ácido cítrico dihidratado 0,147 88,000 12,936
Citrato de sodio dihidratado 0,206 68,000 14,008
Acetato de sodio 0,336 62,000 20,832
Ácido acético 0,064 41,000 2,624
(NH4)2SO4 0,020 56,600 1,132
KH2PO4 0,015 93,200 1,398
3,5 DNS 0,029 188,800 5,475
Agar 0,040 180,000 7,200
Agar Malta 0,800 103,000 82,400
NaOH 0,400 10,260 4,104
Tartrato de sodio y potasio 0,861 60,000 51,660
Glucosa 0,003 15,600 0,0468
Tween 80 0,005 21,600 0,108
Papel de filtro - - 17,88
Nitrato de sodio 0,006 80,000 0,480
Cloruro de potasio 0,001 130,000 0,130
MnSO4 0,001 296,000 0,296
urea 0,200 47,000 9,400
Celulosa cristalina 0,001 200,000 0,200
Carboxi-metil-celulasa 0,001 120,000 0,120
Gelatina 0,120 300,000 36,000
Almidón 0,005 210,000 1,050
Reactivo Lugol 0,180 280,000 50,400
CaCl2 0,030 81,300 2,439
FeSO4*7H2O 0,001 197,200 0,197
ZnSO4*7H2O 0,001 208,200 0,208
Na2HPO4 0,009 190,000 1,710
H2SO4 0,012 176,000 2,112
Costo total 326,5464

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 47
Tabla 3.8. Recursos humanos

Tutores Salario(CUP) t. de investigación Costo


(meses) (CUP)
Dr. Julio César Dustet Mendoza 975 7 341,25
MSc. Matilde Anaya Villalpanda 980 7 343
Costo total 684,25

Tabla 3.9. Consumo eléctrico y depreciación del equipamiento

Equipos Pc tiempo Costo total


Depreciación(CUP)
(kW) (h) (CUP)
Incubadora 1,150 1000 373,277 476,780
Balanza analítica 0,010 10 53,821 53,830
Medidor de pH 0,005 20 63,512 63,251
Agitador magnético 0,004 4 20,224 20,225
Centrífuga 0,500 10 25,433 25,883
Refrigerador 0,550 3600 17,965 25,928
Baño de calentamiento 1,010 8 64,868 65,596
Espectrofotómetro 0,150 8 289,021 289,129
Microscopio 0,020 1 20,667 20,669
Bomba de vacío 0,060 2 27,833 27,844
Zaranda 1,000 5 6,800 7,250
Estufa 2,000 2000 11,333 371,333
Autoclave 0,400 20 87,824 88,544
Equipo de CMO 0,240 12 250 250,259
Costo total 1786,521
Nota: El precio de la electricidad es 0,09$/kW-h

Tabla 3.10. Costo de la investigación

Descripción Costo (CUP)


Costos directos 2797,317
Costos indirectos 335,678
Costo total 3132,995

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 48
Conclusiones
 Del almacén central de alimentos del IIIA se aislaron 36 cepas fúngicas, de
las cuales solo 11 presentaron elevada actividad celulolítica, predominando
los géneros Aspergillus sp. y Trichoderma sp.
 De las cepas aisladas 33 manifestaron actividad celulolítica, siendo la cepa
EC-623 (Aspergillus niger) la mayor productora de celulasas con 0,382
UPF/mL.
 El régimen de tratamiento magnético seleccionado para la cepa EC-623 fue
4mT aplicado por 4 h para realizar la extracción del crudo enzimático a las
48 h.
 Las enzimas de la cepa EC-623 son estables, manteniendo más del 80%
de la actividad inicial durante 24 h de almacenamiento en agua y en los
tampones acetato, fosfato y citrato de sodio.

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 49
Recomendaciones

 Evaluar los niveles de los factores para el tratamiento magnético aplicado en


FES con la cepa de Trichoderma sp no estudiada y la con otras cepas del
grupo biotecnológico del CIPRO con enzimas de buenas propiedades como
J-1 y 6.

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 50
Referencias Bibliográficas
1. Abrusci, C., Martín González, A., Del Amo, A., Catalina, F., Collado, J., Platas,
G.(2005). Isolatión and identificación of bacteria and fungi from cinematographic
films. Internacional Biodeterioratión and Biodegradation, 56, 58-68.

2. Adney, B., Baker, J. (2009). Measurement of Cellulase Activities.

3. Aguilar Valencia, D. (2011). Producción de etanol a partir de bagazo de caña


panelera mediante un sistema híbrido de fermentación y pervaporación. Tesis
presentada para optar por el título de Master en Ingeniería Química.,
Universidad Nacional de Colombia, Manizales, Colombia.

4. Alvarez, D. C., Perez, V.H., Justo, O.R., Alegre, R.M.(2006). Effect of the
extremely low frequency magnetic field on nisin production by Lactococcus lactis
subsp. lactis using cheese whey permeate. Process Biochem, 41, 1967-1973.

5. Amado, E., Roncacio, A. (2005). Estudio del efecto del campo electromagnético
en S. cerevisiae variedades Rhone y RV1. Paper presented at the Memorias de
las Jornadas Iberoamericanas de asimilación de tecnología para la producción
de bioetanol y el uso de sus residuales., Cartagena, Colombia.

6. Anaya, M. (2012). Tratamiento magnético como complemento tecnológico del


proceso cervecero en la fábrica “Guido Pérez”. Tesis presentada en opción al
grado académico de Master en Ingeniería Alimentaria., Instituto Superior
Politécnico "José Antonio Echeverria", La Habana, Cuba.

7. Anaya, M., Castro, M., Cobo, H., Guzmán, T. (2011). Posibles efectos del
campo magnético de baja frecuencia sobre la microbiota del aire. Paper
presented at the X Congreso Latinoamericano & VII Iberoamericano en Alta
Tensión y Aislamiento., La Habana, Cuba.

8. Anaya, M., Guzmán, T.M., Acea, C.M. (2011). Tratamieto magnético aplicado a
la industria alimentaria. Ciencia y Tecnología de los Alimentos, 21(2), 61-67.

9. Bogomolova, E. V., Kirtsideli, I. . (2009). Airborne fungi in four stations of the St.
Petersburg underground railway system. International Biodeterioration and
Biodegradation., 63, 156-160.

10. Borrego, S., Guiamet, P., Gómez de Saravia, S., Battistoni, P., García, M.,
Lavín, P., Perdomo, I. (2010). The quality of air at archives and the
biodeterioration of photographs. International Biodeterioration and
Biodegradation., 64, 139-145.

11. Borrego, S. F., Perdomo, I. (2012). Aerobiological investigations inside


reposities of the National Archive of the Republic of Cuba. Journal of
Aerobiology, 28, 303-316.

12. Campos, M., Camué, H., González, A., Pardo, A.M . (1999). Estudio del efecto
genotóxico del campo electromagnético de baja frecuencia sobre el crecimiento
del hongo Aspergillus nidulans. Tecnología Química, 16(2), 32-39.

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 51
13. Castro, M., Perera, R., Pedrouzo, J. . (2009). Los campos electromagnéticos de
baja frecuencia y sus posibles influencias en la salud humana: un tema a
analizar. Paper presented at the III Evento Internacional de Electromagnetismo
Aplicado CNEA 2009, La Habana, Cuba.

14. CDC. (2010). Centro de control y prevención de enfermedades ,Manual de


Bioseguridad en laboratorios de microbiología y biomedicina (4 ed.).

15. Cefalas, A. C., Kobe, S., Dražžiicc, G., Sarantopoulou, E., Kollia, Z.,
Stražžiiššar, J., Meden, A.(2008). Nanocrystallization of CaCO3 solid/liquid
interfaces in magnetic field: at quantum approach. Applied Surface Science,
254.

16. Claassen, P., Van Lier, J., López, A., Van Niel, E., Sijtsma, L., Stams, A., De
Vries, S., Weusthuis, R. (1999). Utilization of biomass for the supply of energy
carriers. Applied Microbiology and Biotechnology, 52, 741-755.

17. Couri, S., da Costa, S., Saavedra, G., Pereira, S., da Costa, A. . (2000).
Hydrolytic enzyme production in solid-state fermentation by Aspergillus niger
3T5B8. Process Biochemistry 36, 255-261.

18. Duque, A. (2010). Características de los crudos de celulasas de diferentes


cepas de hongos filamentosos obtenidos mediante la técnica de fermentación
en estado sólido. Tesis para optar por el título de Ingeniería Química., Instituto
Superior Politécnico “José Antonio Echeverría”. La Habana, Cuba.

19. Dustet, J. C. (1999). Contribución al estudio y al desarrollo de la fermentación


en estado sólido de materiales lignocelulósicos. Tesis presentada en opción al
Grado Científico de Doctor en Ciencias. Instituto Superior Politecnico "José
Antonio Echeverria", La Habana, Cuba.

20. Gaceta Oficial de la Republica de Cuba ,Decreto de ley No. 190 (2008).

21. Galbe, M., Zacchi, G. . (2007). Pretreatment of Lignocellulosic Materials for


Efficient Bioethanol Production. Advances in Biochemical
Engineering/Biotechnology., 108, 41-65.

22. García, E. (2006). Procedimiento para la obtención de un preparado enzimático


de celulasas de la cepa Aspergillus niger (J-1). Tesis presentada en opción al
Grado Científico de Master en Ciencias. Instituto Superior Politecnico "José
Antonio Echeverria", La Habana, Cuba.

23. Ghose, T. K. (1987). Measurement of Cellulase Activities. Pure and Applied


Chemistry, 59, 257-258.

24. González, A., Serguera, M. (2002). Estudio preliminar sobre la influencia del
campo electromagnético en el crecimiento de Verticillum lecanii por
fermentación en estado sólido. Rev. Tecn. Qca., 22(2), 51-61.

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 52
25. Goyal, A., Gosh, B., Eveleigh, D. (1991). Characteristics of fungal Cellulases.
Bioresource Technology, 36, 37-50.

26. Haramboure, T. (1998). Caracterización de celulasas fúngicas obtenidas en


Fermentación en Estado Sólido. Tesis de Maestría., Instituto Superior
Politécnico “José Antonio Echeverría”.

27. Hung, W., Su, S.L., Shin, L.Y., Roam, G.D., Chang, T.C. (2011). "Rapid,
identification of allergenic and pathogenic molds in enviromental air." BMC
Infectious Diseases 11: 91-95.

28. FEDECAI (2007). Programa de certificación de calidad ambiental en interiores.


Criterios de muestreo. Madrid, España.

29. Lehninger, A. (2005). Principios de Bioquímica.

30. Li, H., Kim, N., Jiang, M., Kang, J., Chang, H. (2009). Simultaneous
saccharification and fermentation of lignocellulosic residues pretreated with
phosphoric acid–acetone for bioethanol production., 100, 3245-3251.

31. Mandels, M., Andreotti, R., Roche, C. (1976). Measurement of saccharifying


cellulose. Biotechnology and Bioengineering Symposium. , 6, 21-34.

32. Martí Tamayo, M. (2013). Hidrólisis enzimática del bagazo de caña de azúcar
empleando enzimas provenientes de cepas de origen nacional. Tesis para optar
por el título de Ingeniería Química., Instituto Superior Politecnico “Jose Antonio
Echeverría”, La Habana, Cuba.

33. Martín, C., Galbe, M., Nilvebrant, N., Jonsson, L. (2002). Comparison of the
Fermentability of Enzymatic Hydrolyzates of Sugarcane Bagasse Pretreated by
Steam Explosion Using Different Impregnating Agents. Applied Biochemistry
and Biotechnology. , 98, 81-90.

34. Mas Diego, S., González A., Campos, M., Cabeza, D. (1999). Influencia del
Campo Electromagnético en la Propagación de Trichoderma viride mediante
Fermentación en Estado Sólido (FES). Tecnología Química, 29(3), 1-6.

35. Mas Diego, S., Martínez C., Simón, F., Furigo, A. (2010). Fermenters with
Magnetic Fields for Agriculture. Technological and Practical Issues. XVIIth World
Congress of the International Commission of Agricultural and Biosystems
Engineering.

36. Mas Diego, S., Martínez, C., Simón, F., Furigo, A. (2013). Consideraciones
sobre la introducción de la Tecnología del Campo Magnético a la producción de
Bioplaguicidas en Cuba. Investigación y Saberes, 2(1), 1-19.

37. Membrillo, I. (2008). Efecto de la tipificación del bagazo de caña sobre el perfil
de producción de enzimas lignocelulolíticas de Pleurotus ostreatus. Tesis
presentada para obtener el grado de Doctor en Biotecnología., Universidad
Autónoma Metropolitana, Mexico D.F.

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 53
38. Méndez, K. (2010). Análisis del proceso de obtención de celulasas usando la
técnica de fermentación en estado sólido. Tesis presentada con opcion a la
obtencion del titulo de Ingeniero Químico., Instituto Superior Politécnico "José
Antonio Echeverria", La Habana, Cuba.

39. Mengxiang, G., Jialang, Z., Hao, F. (2011). Extremely Low Frequency Magnetic
Field Effects on Metabolite of Aspergillus Niger. Bioelectromagnetics, 32, 73-78.

40. Miller, G. L. (1959). Use of Dinitrosalicylic Acid Reagent for Determination of


Reducing Sugar. Analytical Chemistry. , 31, 426-428.

41. Molina Veloso, A. (2012). Estudio de la Calidad Microbiológica del Ambiente


Interior de la Mapoteca del Archivo Nacional de la Republica de Cuba y del
Biodeterioro en Mapas. Tesis en opción al título académico de Licenciado en
Microbiología y Virología., Universidad de La Habana, La Habana, Cuba.

42. Nagy, P. (2005). The effect of the Inductivity Static Magnetic field on Some Plant
pathogen fungi. Central European Agriculture, 6(2), 167-171.

43. Pandey, A., Soccol, C. R., Mitchell, D. A. (2000). New developments in solid-
state fermentation. I. Bioprocesses and products. Process Biochemistry, 35,
1153-1169.

44. Paredes, D., Alvarez, M., Silva, M. (2010). Obtención de Enzimas Celulasas por
Fermentación Sólida de Hongos para ser Utilizadas en el Proceso de Obtención
de Bioalcohol de Residuos del Cultivo de Banano. Revista Tecnológica ESPOL-
RTE, 23(1), 81-88.

45. Pasquarella, C., Pitzurra, O., Savino A.(2000). The index of microbial air
contamination. Journal of Hospital Infection, 46, 241-256.

46. Pérez, M. (2000). Estudio de la estabilidad de crudos enzimáticos ricos en


celulasas de Aspergillus niger, Trichoderma viride y Penicillium implicatum.
Tesis presentada con opción al titulo de Ingeniero Químico. Instituto Superior
Politécnico "José Antonio Echeverria", La Habana, Cuba.

47. Ramos, A., Forchiassin, F. (1996). Producción de endoglucanasa en cuatro


especies del género Saccobulus. Revista Argentina de Microbiología, 28, 55-62.

48. Rani, R., Kumar, A., Soccol,C. R., Pandey, A. (2009). Recent Advances in solid-
state fermentation. Biochemical Engineering Journal. , 44, 13-18.

49. Rodríguez, U., Sánchez, C., Bertucci, V., Couri, S., Crestana, S.(2011).
Produção de celulases por Aspergillus niger por fermentação em estado sólido.
Pesq. agropec. bras., 46(8), 912-919.

50. Roussos, S., Raimbault, M., Saucedo, G., Viniegra, G., Lonsane, B. K. . (1991).
Kinetics and ratios of CMCase and PFase activities of the cellulolytic enzymes
produced by Trichoderma harzianum on different substrate in solid state
fermentation. Mycology Neotropical Applied. , 4, 19-40.

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 54
51. Sabanero, M., Barbosa, G., Sandoval, G., Córdova, T., Viridiana, D.(2008).
Efectos Biológicos de los campos magnéticos. Biología, Tecnología y Sociedad.

52. Sassner, P., Martensson, C., Galbe, M., Zacchi, G. (2008). Steam pretreatment
of H2SO4-impregnated Salix for the production of bioethanol. Bioresource
Technology, 99, 137-145.

53. Turiño, L. (2011). Hidrólisis del bagazo de caña de azúcar con enzimas
celulasas. Tesis para optar por el título de Ingeniería Química., Instituto Superior
Politécnico “José Antonio Echeverría”, La Habana, Cuba.

54. Ülger, C., Sağlam, N. (2001). Partitioning of industrial cellulase inaqueous two-
phase systems from Trichoderma viride QM9414. Process Biochemistry, 36,
1075-1080.

55. Vargas Tangua, F., Guerrero, W. (2010). Transformación Microbiana del


Bagazo de Caña Panelera en Azúcares Fermentables útiles para la obtención
de Bioetanol. Monografia presentada para optar por el titulo de Especialista en
Química Ambiental., Universidad Industrial de Santander, Bucaramanga,
Colombia.

56. Vilches, L. (2002). Determinación de la actividad de exoglucanasas de cepas


fúngicas nativas de las provincias de Huaylas y Huaraz. Tesis de Diploma.,
Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Lima, Perú.

57. Viniegra, G., Favela-Torres, E., Noe, C., Romero-Gómez, S., Díaz-Godínez, G.,
Augur, C.(2003). Advantages of fungal enzyme production in solid state over
liquid fermentation systems. Biochemical Engineering Journal. , 13, 157-167.

58. Walters, L., Wilson, D. (1991). Enzymatic Hydrolysis of cellulose: An overview.


Biosource Techn, 36, 3-14.

59. Xin, F., Geng, A. (2010). Horticultural waste as the substrate for cellulase and
hemicellulase production by Trichoderma reesei under solid-state fermentation.
Applied Biochemistry and Biotechnology., 162, 295-306.

60. Zapata, J. E., Moreno O., Márquez, G. (2005). Acción de un campo magnético
sobre un cultivo aireado de Saccharomyces cerevisiae. Asociación Interciencia,
30(7).

Página consultada en internet:

http://www.porquebiotecnologia.com.ar/index.php

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 55
Anexos
Anexo 1. Datos de la calibración del equipo de campo magnético oscilante de
60 Hz
Tabla 1. Calibración del equipo de campo magnético oscilante (60 Hz)
Campo Campo
Voltaje Voltaje
magnético magnético
(V) (V)
(mT) (mT)
1,3 10 6 70
1,5 12,5 6,3 75
1,7 15 6,7 80
2,1 20 7,0 85
2,3 22 7,4 90
2,5 25 7,8 95
2,7 28,5 8,2 100
2,9 30 8,5 105
3,3 35 8,9 110
3,5 38 9,3 115
3,7 40 9,6 120
4,1 45 10 125
4,2 48,5 10,3 130
4,4 50 10,6 135
4,8 55 11 140
5,2 60 11,3 145
5,6 65 11,6 150

Tabla 2. Valores de campo magnético a aplicar durante el experimento Utilizando el


modelo obtenido con la curva de calibración
CM=0,0742 V + 0,6769
CM (mT) V (V)
2,0 18
2,5 25
3,0 31
3,5 38
4,0 45

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 56
Figura 1. Curva de calibración de mayor ajuste para equipo de campo magnético oscilante de
(60 Hz)

Tabla 3. Consumo de potencia para diferentes valores de voltaje

Voltaje (V) 25 50 75 100 140 160 180 200


Intensidad (A) 2,9 4,8 5,4 7,0 9,9 11,5 13,0 14,4
Impedancia (Ω) 8,62 10,41 13,89 14,29 1,0 13,91 13,84 13,89
Potencia (W) 72,5 240 405 700 1 386 1 840 2 340 2 880

Tabla 4.Equivalencia de las unidades de medida del CMO


Campo magnético
1T 104 G
1 mT 10 G
0,1 mT 1G
100 µT 1G
1 µT 0,01 G
0,1 µT 1 mG

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 57
Anexo 2. Estudio de estabilidad de la actividad PFasa del crudo enzimático
de la cepa EC-623 (A. niger)
Tabla 5. Estabilidad del crudo enzimático extraído con diferentes tampones y
conservado a temperatura ambiente.

Agua (pH=6,9) Tampón citrato (pH=4,8)

Tiempo
% Actividad % Actividad
(h)
UPF/m residual residual
UPF/mL
L PFasa PFasa
0 0,350 100,00± 13,56 0,444 100,00 ± 3,32
0,5 0,334 96,55±1,83 0,350 80,00± 0,95
1 0,346 100,00±0,61 0,424 97,65± 0,1
2 0,331 95,69±0,61 0,394 88,58± 3,32
4 0,287 80,15±1,83 0,350 81,01± 0,1
24 0,294 84,90±8,54 0,370 83,26± 0,47

Acetato de sodio (pH=5) Fosfato de potasio (pH=7)

Tiempo
% Actividad % Actividad
(h)
UPF/m residual residual
UPF/mL
L PFasa PFasa
0 0,450 100,00 ± 1,86 0,332 100,00 ± 2,47
0,5 0,364 80,25±3,26 0,277 81,92 ± 8,11
1 0,386 85,19 ±2,79 0,338 100,00 ± 3,74
2 0,360 80,00± 3,72 0,279 82,36 ± 2,49
4 0,453 100,0± 3,26 0,274 81,04 ± 9,26
24 0,392 86,50± 5,59 0,272 81,02 ± 5,59

“Producción de celulasas a partir de una nueva cepa aislada del almacén central de alimentos del IIIA” 58