Glicolato de microalgas: una fuente de carbono

eficiente para aplicaciones biotecnológicas

Resumen
El glicolato se produce en células autótrofas a altas temperaturas y la limitación
de C i através de la oxigenación de ribulosa-1,5-bifosfato. En las algas unicelulares,
el glicolato se pierde por excreción o se metaboliza a través del ciclo C 2 al
consumir reductores, ATP y emisión de CO 2 (fotorrespiración). Por lo tanto, la
fotorrespiración es un proceso inhibitorio para la producción de biomasa. Sin
embargo, las células se pueden manipular de manera que se conviertan en
"fábricas celulares" productoras de glicolatos, cuando la proporción de
carboxilación / oxigenación es 2. Si en estas condiciones el C 2el ciclo se bloquea,
la excreción de glicolato se convierte en la única vía del flujo de carbono
fotosintético. El objetivo del estudio es probar la aplicabilidad biotecnológica de la
excreción de glicolato basada en algas como una nueva plataforma
biotecnológica. Se muestra que las células de Chlamydomonas se pueden cultivar
en condiciones específicas para establecer una excreción de glicolato estable
constante ya largo plazo durante la fase de luz. Los cultivos lograron una alta
eficiencia del 82% del carbono asimilado transferido a la biosíntesis de glicolato
sin pérdida de función en la vitalidad celular. Además, la acumulación de glicolato
en el medio es lo suficientemente alta como para ser utilizada directamente para la
fermentación microbiana, pero no muestra efectos tóxicos para las células
productoras de glicolato.

Introducción
La fotosíntesis es el proceso más eficiente para convertir el CO 2 de la atmósfera
en materia orgánica con la ayuda del agua y la luz solar. Sin embargo, la eficiencia
se vuelve más baja cuando la fotosíntesis impulsa la formación de biomasa, ya
que la formación de biomasa es un proceso regulado lento y complejo y,
finalmente, limita la eficiencia de conversión de energía (Wilhelm and
Jakob, 2011 ; Wilhelm and Selmar, 2011 ). Se han realizado muchos intentos para
mejorar la eficiencia de la formación de biomasa en plantas superiores (Zhu et
al ., 2010 ) y en algas (Beer et al ., 2009 ). Las microalgas han sido ampliamente
discutidas como una fuente potencial de productos a base de carbono como los
lípidos (revisado por Hoet al ., 2014 ), carbohidratos (por ejemplo, almidón;
revisado por Zachleder y Brányiková, 2014 ), proteínas (revisado por Bleakley y
Hayes, 2017 ) o productos de alto valor (por ejemplo, pigmentos, vitaminas o
antioxidantes; para una revisión, ver Chew et al. ., 2017 ). Sin embargo, el alto
potencial en biotecnología de algas todavía no se explota completamente debido a
varias razones. Aunque la tecnología de los fotobiorreactores se ha mejorado
significativamente, el aporte de energía para la mezcla, el suplemento de
nutrientes, la recolección y el refinamiento son todavía demasiado altos para
obtener un balance de emisiones de efecto invernadero significativamente
mejorado en comparación con los combustibles fósiles (Weinberg et
al ., 2012). Este es especialmente el caso cuando la bioenergía, por ejemplo, los
biocombustibles, son la sustancia objetivo (Dassey et al ., 2014 ; Quinn et
al ., 2014 ). Se han probado diferentes enfoques para superar estas
limitaciones. Una estrategia es "ordeñar" las células mediante la extracción in situ
de la sustancia objetivo (Hejazi y Wijffels, 2004 ; Racheva et al ., 2018). Aunque
esta idea se publicó hace más de 10 años, la disponibilidad tecnológica de este
enfoque aún se encuentra en el nivel de investigación y el ordeño por extracción in
situ aún separa el crecimiento de algas y la recolección en dos fases de
producción diferentes y no se logra una bioproducción continua, por lo que , se
reduce la eficiencia de conversión de energía.

Sobre la base de estas limitaciones, Günther et al . ( 2012) han propuesto un

nuevo enfoque para utilizar la excreción de glicolato como un proceso natural de
ordeño en C de las células. Se ha demostrado que el glicolato se puede usar
directamente para la fermentación anaeróbica para producir metano. Este enfoque
es diferente de la producción convencional de biocombustible basada en biomasa,
ya que posee una serie de ventajas intrínsecas. La biosíntesis de glicolato drena el
carbono asimilado de la biomasa que forma las vías celulares e implica muchos
menos pasos de reacción que la producción de biomasa celular. De esta manera,
los costos metabólicos de las células se reducen drásticamente. La excreción
activa de glicolato por las células de algas evita aún más los procesos de
recolección y refinamiento que son necesarios en los enfoques basados en
biomasa. Finalmente, el suplemento con nutrientes (excepto de CO 2).) se reducirá
drásticamente ya que el glicolato es una molécula de hidrocarburo puro y está
destinado a drenar la energía fotosintética y el carbono asimilado de la producción
de biomasa a la producción de glicolato de la manera más eficiente posible. Sin
embargo, este enfoque elegante se puede aplicar con éxito solo si las siguientes
preguntas se pueden responder de manera positiva.

(1) Toxicidad de glicolato

Glicolato se produce en el cloroplasto por el proceso photorespiratory donde la
enzima ribulosa-bifosfato-carboxilasa / oxigenasa (RUBISCO) utiliza oxígeno
molecular en lugar de CO 2 como sustrato. Sin embargo, el glicolato también es un
metabolito tóxico para el proceso de asimilación C (Dellero et al ., 2016 ). Por lo
tanto, el glicolato debe ser exportado inmediatamente desde el cloroplasto y
metabolizado para mantener la viabilidad celular en organismos
fotosintéticos. Esto se logra mediante la actividad de la fosfoglicolato fosfatasa que
desfosporila el glicolato de 2P a glicolato libre, que es el sustrato de un
transportador de glicolato unido a la membrana (Pick et al ., 2013). El glicolato se
oxida luego a glioxilato y se metaboliza aún más en el ciclo C 2 (Stabenau y
Winkler, 2005 ). Rademacher et al . ( 2016 ) pudieron demostrar que las células de
algas rojas con reducida capacidad de glicolato oxidasa no pueden sobrevivir bajo
CO ambiente 2 a causa de la acumulación de glicolato en las células. En plantas
superiores, la inactivación del ciclo C 2 conduce a cambios en el patrón de
asignación de carbono y una senescencia anterior. Sin embargo, en algunas algas
verdes, como Chlamydomonas , la inactivación del ciclo C 2 no induce la
acumulación de glicolato dentro de las células debido a una excreción activa de
glicolato (Garbayo et al.., 2005 ; Vílchez et al ., 1991 ). Para un uso biotecnológico
de la excreción de glicolato por las células de algas, se requiere una alta
concentración de glicolato en el medio circundante (ver más abajo). Sin embargo,
es completamente desconocido si tales altas concentraciones de glicolato
extracelular tienen un impacto negativo en el rendimiento fotosintético y la vitalidad
celular.

(2) Regulación de la asimilación de carbono y excreción de glicolato.

El proceso fotorrespiratorio pierde carbono celular por el ciclo de C 2 o por la

excreción directa de glicolato que podría conducir finalmente a la muerte
celular. Por lo tanto, para utilizar la excreción de glicolato como un proceso
biotecnológico, las células deben estar habilitadas para reabastecer la pérdida de
carbono fotorrespiratoria en paralelo a la excreción de glicolato. Esto requiere un
cambio continuo de RubisCO entre la carboxilación y la reacción de
oxigenación. Normalmente, es muy difícil manipular flujos de C específicos en la
célula. Sin embargo, en este caso, las características cinéticas de RubisCO son de
gran ayuda. Si los mecanismos de concentración de carbono están
completamente inactivados (ver más abajo), la relación O 2 / CO 2 define el modo
de acción del RubisCO. Esto significa en la práctica que una baja proporción de
O2 / CO 2 (por ejemplo, aire ambiente enriquecido con CO 2 ) promueve la reacción
de carboxilación, mientras que una alta proporción de O 2 / CO 2 (por ejemplo, aire
ambiente enriquecido con O 2 ) cambia a RubisCO al modo de oxigenación. Por lo
tanto, la composición del gas debe ajustarse a un O 2 / CO 2específico.nivel que
idealmente permite dos reacciones de carboxilación por una reacción de
oxigenación por tiempo. De esta manera, se podría lograr la producción
maximizada de glicolato sin drenar el carbono estructural de las células, pero
también sin canalizar el carbono asimilado hacia la producción de biomasa
nueva. Para una excreción eficiente de glicolatos, no solo se requiere la
inactivación de todos los mecanismos de concentración de carbono (CCM;
Hagemann et al ., 2016 ) sino también la inhibición de la metabolización del
glicolato por el ciclo C 2 (por ejemplo, mediante la inhibición de la glicolato
deshidrogenasa; GlyDH). Se demostró que los CCM y GlyDH se pueden bloquear
mediante manipulación genética (Van et al ., 2001 ) o mediante la adición de
inhibidores específicos (Zuo et al.., 2014). Encontramos que el inhibidor 6-etoxi-2-
benzotiazolesulfonamida (EZA) bloquea ambos, los MCP y la GlyDH, de manera
muy eficiente. Sin embargo, se desconoce por completo cuánto tiempo pueden
sobrevivir las células de algas verdes sin ninguna división celular y qué sucede
con la actividad fotosintética bajo una alta carga fotorrespiratoria permanente.

(3) Dependencia de la temperatura de la fotorrespiración.

La fotorrespiración depende en gran medida de la temperatura (Aboelmy y

Peterhansel, 2014 ). Si la fotorrespiración se usa como un mecanismo fisiológico
para medios biotecnológicos, debe demostrarse que la excreción de glicolato es
un proceso robusto también en los regímenes de luz y temperatura oscilantes
como lo experimentan las células de algas en un biorreactor en condiciones
ambientales al aire libre.

(4) Concentración suficiente de glicolato en el medio.

Finalmente, por razones biotecnológicas, la concentración de glicolato en el medio

debe producir un nivel lo suficientemente alto como para ser utilizado directamente
para alimentar el proceso de fermentación. De lo contrario, el medio de algas
enriquecido con glicolato no se puede utilizar para la fermentación sin un paso de
concentración adicional, lo que sería una desventaja importante del proceso
completo. Esto significa, sin embargo, que las células tienen que producir y
excretar glicolato durante un largo período de tiempo. Actualmente, no se sabe si
es posible mantener las células de algas en condiciones fotorrespiratorias durante
el período de tiempo requerido de varias semanas.

En el presente estudio, las células del alga verde Chlamydomonas reinhardtii se

cultivaron en condiciones de cultivo específicas para responder a las preguntas
planteadas anteriormente y con el objetivo de probar la aplicabilidad
biotecnológica de la excreción de glicolato basada en algas como una nueva
plataforma biotecnológica.

Resultados y discusión
De acuerdo con el diferente estado fisiológico de las células, los resultados del
enfoque experimental se dividieron en tres fases: (i) la fase productora de
biomasa, (ii) la fase de transición de biomasa a condiciones productoras de
glicolato y (iii) la fase larga Fase de producción de glicolato a largo plazo.

Condiciones de producción de biomasa.

La fase de producción de biomasa sirvió como condición de referencia y permitió
comparar el potencial de producción de biomasa con la tasa de producción de
glicolato, posteriormente. Se aplicó una configuración de fotobiorreactor con un
gradiente de iluminación y temperatura cerca de las condiciones naturales durante
un día de verano (Figura 1 ). Después de 5 días de cultivo continuo de C.
reinhardtii , las células se aclimataron a estas condiciones, lo que se reflejó
en una concentración de clorofila muy constante y en el número de células
(Tabla 1 ). Las condiciones de crecimiento similares al exterior indujeron una alta
tasa de crecimiento con una producción primaria diaria de 3.5 m M DEcarbono por
mg de Chl a .
Figura 1
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Curso diario de gradientes de temperatura y luz durante un período de 2 días. La
temperatura cambió de 15 ° C en la fase oscura a 30 ° C en el máximo del mediodía. La
irradiación se aplicó con una forma sinusoidal y una intensidad máxima de 1700 μmol
fotones / m 2 / s.
Tabla 1. Cultivo y parámetros fisiológicos de C. reinhardtii en condiciones de producción
de biomasa y glicolato

Produccion de biomasa Producción de glicolato

Valor medio Desviación estándar Valor medio Desviación estándar

Chl a [mg / L] 2.01 0.16 2,75 0.50

Número de celda [10 9 / L] 2,35 0,20 3,27 0.50

Crecimiento µ / [día] 2,22 0.12 0 0

Peso en seco [mg / (mg Chla )] 37.61 2,30 Dakota del Norte -
 Produccion de biomasa Producción de glicolato

Valor medio Desviación estándar Valor medio Desviación estándar

C BM [mmol C / (mg Chl a ) / día] 3,50 - Dakota del Norte -

Min. prod. diaria gly [m M / day] Dakota del Norte - 1.14 0.06

Max. prod. diaria gly [m M / day] Dakota del Norte - 2.62 0.06

Max. c gly [m M ] Dakota del Norte - 40.63 0.81

Min. C espera : C alcanzado [%] 36

Max. C espera : C alcanzado [%] 82

 Concentración de Chl a , Chl a en suspensión de algas; µ, tasa de crecimiento; C BM , tasa

de producción de biomasa basada en carbono; Prod gly , tasa de producción de
glicolato; c gly , concentración de glicolato en medio de cultivo; C esperado , tasa esperada de
asimilación de carbono; C alcanzado , la tasa de asimilación de carbono medida como
glicolato excretado.

De la Figura 2 , es evidente que las tasas de fotosíntesis y respiración en estas

condiciones fueron fuertemente dependientes de la luz y la temperatura. En
consecuencia, la producción bruta de oxígeno alcanzó un valor máximo de hasta
800 μmol O 2 / (mg Chl a ) / h en el pico de irradiancia y temperatura. Esto fue
acompañado por un fuerte aumento de las tasas de respiración en correlación con
los cambios en la irradiancia y la temperatura. La fotosíntesis obtenida y las tasas
de respiración están de acuerdo con los datos de los estudios de Torzillo et
al . ( 2009 ) y Yang y Gao ( 2003 ) que se obtuvieron bajo alto CO 2 suplemento
durante el cultivo. Obviamente, C. reinhardtii. Fue capaz de aclimatarse
perfectamente a estas condiciones y las células no mostraron signos de
fotoinhibición durante la irradiación máxima.

Figura 2
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Tasas brutas de producción de oxígeno (a) y consumo a través de la respiración (b)
durante una fase de iluminación de 14 h en condiciones de producción de biomasa.

Fase de transición de biomasa a producción de

glicolato.
Los cultivos se forzaron en la fase productora de glicolato mediante el cambio de
la aireación de 5% de CO 2 a una mezcla de 40% de O 2 / 0,2 % de CO 2 y mediante
la adición del inhibidor EZA. La Figura 3a muestra que el primer día la producción
de glicolato sigue las tasas de fotosíntesis; sin embargo, hubo un estancamiento
en las tasas de producción de glicolato durante el mediodía. Este estancamiento
desapareció a partir del día 2 en condiciones de producción de glicolato
(Figura 3 b). Se debe enfatizar que esta tasa de producción inicial de glicolato ya
era tres veces mayor que la reportada anteriormente (Günther et al ., 2012 ). La
concentración de glicolato alcanzó un valor de 1,25 M.en el primer día y hasta 2,75
m M en el segundo día (Figura 4 ). Debe destacarse que no hubo degradación del
glicolato en el medio de cultivo durante la fase nocturna. Esto excluye una
recaptación de glicolato por las células de algas o una degradación del glicolato en
el medio.
figura 3
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Las tasas de producción de glicolato (a, b) y la concentración de Chla (c, d) de los cultivos
de Chlamydomonas reinhardtii durante el primer (a, c) y el segundo día (b, d) en
condiciones fotorrespiratorias. Los datos se obtuvieron de dos cultivos de algas
independientes (Cultura 1, círculos cerrados; Cultura 2, diamantes abiertos).
Figura 4
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Acumulación de glicolato [mM] en el medio de dos cultivos de algas independientes
(cultivo 1, círculos cerrados; cultivo 2, diamantes abiertos) durante los dos períodos
iniciales de iluminación en condiciones fotorrespiratorias. El área de Greyshaded
representa la fase oscura entre los períodos de iluminación.

Es importante tener en cuenta que, paralelamente a la inducción de la excreción

de glicolato, el crecimiento celular se detuvo por completo en 24 h. Esto se deduce
de los cambios de la concentración de Chl a de la suspensión de cultivo
(Figura 3 c, d). Aunque la concentración de Chl a aumentó significativamente
durante el primer día en condiciones de producción de glicolato, se mantuvo
constante a partir del día 2. Un efecto similar se observó por el aumento de los
números de células en paralelo a la concentración de Chl a(datos no
mostrados). Esto significa que el O 2 / CO 2La relación puede ajustarse de manera
que después de un período de aclimatación de las células, cualquier carbono
asimilado se excreta como glicolato en lugar de formación de biomasa. Como
consecuencia práctica, los cultivos ya no se diluyeron con medio fresco para evitar
una disminución de la biomasa en los fotobiorreactores.

Durante el cambio de las condiciones de producción de biomasa a las de

producción de glicolato, las células sufrieron cambios severos en su
metabolismo. Esto se dedujo a partir de los cambios en el patrón macromolecular
medidos por FTIR (Figura 5 A; Figura S1 ). En condiciones de producción de
biomasa, los carbohidratos se acumularon en la luz y se transfirieron a otras
piscinas macromoleculares (proteínas y lípidos) durante la noche. Dichos cambios
diurnos en la composición macromolecular son típicos de las células
de Chlamydomonas en cultivo en ciclo de luz / oscuridad (Langner et
al ., 2009).). En contraste, bajo las condiciones iniciales de producción de glicolato,
la composición macromolecular no cambió en el transcurso del período de
iluminación. Esto se debió muy probablemente al hecho de que el carbono
asimilado se canalizó preferentemente hacia la vía de excreción de glicolato en
lugar de la formación de biomasa.

Figura 5
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(a) Proporciones de picos de la banda de vibración de carbohidratos (1152 cm- 1 ) a la
banda de vibración de amida I asociada a la proteína (1654 cm- 1 ) derivada de los
espectros FTIR. Las mediciones se realizaron cada 2 h durante el período de iluminación
de 14 h en muestras de células en condiciones de producción de biomasa (triángulos
cerrados), el día 1 (círculos cerrados), el día 2 (círculos abiertos) y el día 14 (círculos
grises) en condiciones de producción de glicolato . (b) Máxima eficiencia cuántica del
fotosistema II (Fv / Fm) de células adaptadas a la oscuridad para biomasa (BM; triángulos
cerrados) y condiciones productoras de glicolato (círculos abiertos).
A partir de estos resultados, se podría concluir que las condiciones de producción
de glicolato indujeron un nuevo estado celular fisiológico que necesita un proceso
de aclimatación molecular. Este supuesto se apoya en la severa disminución de la
eficiencia cuántica máxima en PSII (Fv / Fm) de un valor promedio de 0.76 en
condiciones de producción de biomasa a 0.61 y 0.58 en el primer y segundo día
en condiciones de producción de glicolato, respectivamente (Figura 5 b). Se
encontró una observación comparable en, por ejemplo, hojas de maíz con un ciclo
fotorrespiratorio interrumpido y en presencia de glicolato o glioxilato (González-
Moro et al ., 2003 ). Desde la excreción de glicolato en Chlamydomonas.se mejoró
fuertemente con el tratamiento con EZA, se debe concluir que el metabolismo
fotorrespiratorio del glicolato estaba completamente bloqueado. Por lo tanto, la
disminución de la eficacia cuántica del PSII es una indicación de una acumulación
inhibitoria de productos fotorrespiratorios en las células
de Chlamydomonas . Dicha acumulación también inhibe la actividad de RubisCO
(Zelitch et al ., 2009 ) que explicaría el estancamiento de la excreción de glicolato
en comparación con las tasas de fotosíntesis durante el mediodía (ver arriba).

Producción de glicolato en experimento a largo plazo.

Para una aplicación biotecnológica de algas excretantes de glicolato, es esencial
que la producción de glicolato pueda mantenerse constantemente alta durante un
largo período de tiempo sin un impacto negativo en la fotoasimilación. Por lo tanto,
la investigación de la estabilidad a largo plazo de la excreción de glicolato fue una
cuestión central del presente estudio.

En el presente estudio, la excreción de glicolato se monitorizó durante un período

de hasta 21 días. La figura 6 A muestra que glicolato acumula en el medio hasta
una concentración de 41 m M dentro de los 21 días. El experimento se detuvo en
este momento debido al limitado volumen disponible de suspensión de algas para
el muestreo. Es importante destacar que la tasa de excreción diaria de glicolato no
solo se mantuvo constante sino que tendió a aumentar aún más durante este
período de 21 días. De la Figura 6 b, se podría deducir que en particular la tasa
máxima excreción glicolato al mediodía aumentó de manera constante durante
todo el período experimental. En consecuencia, la tasa máxima de producción de
glicolato aumentó de 0.13 m M / h en el día 1 a aproximadamente 0.35 m M/ h en el
día 15. Obviamente, las células de C. reinhardtii se aclimataron a las condiciones
fotorrespiratorias y pudieron equilibrar perfectamente el flujo de captación de
energía de la luz al flujo de carbono. Por un lado, este es un resultado
sorprendente, ya que las células fotosintéticas generalmente intentan mantener la
fotorrespiración a un nivel mínimo (por ejemplo, mediante la activación de los
MCP) para evitar la inevitable pérdida de carbono asimilado. Por otro lado, en
presencia de concentraciones incrementadas de oxígeno, la actividad de la
oxigenasa de RubisCO es inevitable y la evitación de la acumulación de glicolato
(tóxica) por el ciclo fotorrespiratorio o por la excreción de glicolato puede verse
como la función básica de la fotorrespiración (Zelitch et al. ., 2009) y es esencial
mantener esta función activa incluso en períodos a largo plazo. Además, debe
destacarse que las células de C. reinhardtii del presente estudio se encontraban
en una situación inusual de alta actividad metabólica pero canalizaron la energía
fotosintética y el carbono asimilado completamente en la síntesis de glicolato en
lugar de la producción de biomasa. En consecuencia, se debe suponer que ningún
carbono asimilado dejó a los cloroplastos en forma de fosfatasa y previno
completamente la síntesis celular de azúcar. Se sabe que los azúcares (p. Ej.,
Glucosa, sacarosa) y la acumulación de azúcar son factores desencadenantes del
desarrollo y están involucrados en la regulación del crecimiento de las plantas. En
particular, la hexocinasa es un elemento importante de detección y señalización
(revisado en Rolland et al ., 2006).). Por lo que sabemos, el efecto descrito de las
células metabólicamente altamente activas pero no en crecimiento no se observó
antes y podría contribuir a la interpretación de la función de la fotorrespiración y al
crecimiento celular de regulación en las algas unicelulares (Davis et al ., 2013 ).

Figura 6
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(a) Acumulación total de glicolato [m M ] en el medio de cultivo en condiciones
fotorrespiratorias dentro del período experimental de 20 días y (b) tasas máximas de
producción de glicolato [m M / h] medidas en el pico diario de irradiancia y temperatura
dentro del experimental Período de 14 días.

La mejora de la producción de glicolato fue acompañada por un aumento

constante de la eficiencia cuántica en PSII entre el día 2 y el día 15
(Figura 5segundo). Por lo tanto, las células obviamente pudieron equilibrar el flujo
de la captación de energía de la luz al flujo de carbono en estas
condiciones. También significa que el aumento de la concentración de glicolato en
el medio circundante y la presencia constante del inhibidor EZA no afectaron
negativamente la aptitud de las células. También se debe tener en cuenta que la
EZA obviamente no se degradó durante la condición de producción de glicolato, lo
cual es un aspecto importante para una aplicación biotecnológica. Cabe señalar
que los valores de Fv / Fm en condiciones de producción de glicolato se
mantuvieron siempre ligeramente más bajos que los valores en condiciones de
producción de biomasa. Se podría suponer que esta observación se debe a un
efecto inhibitorio general de la fotorrespiración, ya sea directamente sobre la
eficiencia cuántica y el transporte de electrones fuera del PSII (Messant et
al.., 2018 ) o sobre la actividad RubisCO (González ‐ Moro et al ., 1997 ).

Aplicabilidad biotecnológica.
Se deben considerar varios aspectos para calificar las algas productoras de
glicolato para una aplicación biotecnológica en un proceso de producción
continuo. Estos incluyen un estado celular fisiológico estable (idealmente
homeostasis), una alta eficiencia de la producción de glicolato a partir de carbono
asimilado, y un título de producto suficiente para evitar etapas de concentración
adicionales.

Los espectros FTIR medidos el día 2, el día 8 (datos no mostrados) y el día 15

(Figura 5a , Figura S1 ) revelaron solo ligeros cambios de la composición de las
células macromoleculares en el transcurso del período de iluminación diaria. Dicha
composición macromolecular estable es una característica típica de las células
metabólicamente homeostáticas (Wagner et al ., 2014).). Por lo tanto, incluso en
condiciones de fotorrespiración a largo plazo, las células estaban en un estado
equilibrado y la asignación de carbono asimilado que no se excreta como glicolato
se optimizó para seguir siendo la actividad fisiológica de las células
independientemente del cese del crecimiento. Esto está en línea con la
recuperación observada de la actividad del aparato fotosintético en condiciones de
producción de glicolato (ver arriba). Tal estado celular metabólico homeostático es
una condición sólida para la práctica biotecnológica y un proceso de producción
continuo.

La eficiencia de la excreción de glicolato se evaluó comparando lo teóricamente

esperado con la tasa de producción de glicolato prácticamente alcanzada. La tasa
de producción de glicolato esperada se estimó a partir de la tasa de asimilación de
carbono en condiciones de producción de biomasa con el supuesto de que
representa la carboxilación y, por lo tanto, la actividad total de RubisCO. Se
considera además que la biosíntesis de glicolato requiere una reacción de
oxigenación por parte de RubisCO, pero dos reacciones de carboxilación
adicionales para re-asimilar dos moléculas de carbono que se excretan como
glicolato. En consecuencia, a partir de la tasa de asimilación de carbono medida
en condiciones de producción de biomasa (Tabla 1 ), se espera una excreción de
carbono basada en glicolato esperada de 2,33 mmol C / (mg Chl a) / día (es igual
a 1.17 mmol de glicolato / (mg Chl a ) / día) fue estimado. La comparación de
estos valores esperados con la excreción de glicolato lograda reveló un fuerte
aumento de la eficiencia del proceso del 36% durante la fase inicial al 82% al final
del período experimental en condiciones de producción de glicolato (después de 3
semanas; Tabla 1 ).

La alta eficiencia de la producción de glicolato fue acompañada por la acumulación

de glicolato en el medio circundante hasta una concentración de 3.1 g / L. Esto es
significativamente más alto que la concentración de glicolato que se evaluó como
la carga máxima de un reactor de biogás que fermenta con glicolato (1,8 g / L;
Günther et al ., 2018 ). Sobre la base de estos resultados, no es necesaria una
concentración adicional del producto que consume energía. Junto con la alta
eficiencia de la producción de glicolato y el potencial de producción estimado
(véase más adelante), que promueve fuertemente la energía basada en el
glicolato y CO 2 tecnología de conversión.
Estimación del potencial de la producción de metano a
base de glicolato
En Günther et al . ( 2012 ), se demostró que se puede producir metano a partir de
glicolato con un rendimiento de 0.173 m 3 / kg. Sobre la base de la tasa de
producción máxima de glicolato medida en el presente estudio (Tabla 1 ) y otras
suposiciones (consulte la sección Procedimientos experimentales ), se puede
estimar el potencial de producción de metano y representa el potencial actual de la
producción de metano a base de glicolato. Por consiguiente, se estimó una tasa
de producción de glicolato de aproximadamente 800 g / m 2 / a y una tasa de
producción de metano resultante de aproximadamente 1400 m 3 / ha / a. Esto es
equivalente a un rendimiento energético de 50 GJ por hectárea y año.

En el presente estudio, el fotobiorreactor se operó a una concentración celular

relativamente baja para permitir una medición en línea confiable de la densidad
celular y la fluorescencia de Chl variable y para mantener los cultivos celulares en
un estado celular homeostático. Sin embargo, los fotobiorreactores generalmente
se operan a altas concentraciones de Chl para mejorar la productividad de su
área. Basado en las propiedades de absorción de las células de C. reinhardtii.,
una concentración de biomasa de 300 mg Chl por m² corresponde a una eficiencia
de absorción de la irradiación incidente de aproximadamente el 90%. Sobre la
base de la tasa de producción media de glicolato medida de 60 μmol / (mg Chl) / h,
la producción estimada de metano aumenta a 5300 m³ / ha / a y es equivalente a
un rendimiento energético de 191 GJ por hectárea y año. Incluso teniendo en
cuenta las pérdidas de energía para la operación de un fotobiorreactor basado en
biopelículas propuesto y para la producción de biogás (28% de la producción de
energía bruta; Weinberg et al ., 2012 ), el rendimiento energético neto estimado de
138 GJ / ha / a es significativamente mayor que el rendimiento energético
promedio de 90–100 GJ / ha / a del maíz de planta de energía convencional más
eficiente (Felten et al ., 2013). A la luz del debate "alimentos versus combustible",
la producción de energía empleando biomasa de algas cultivada en
fotobiorreactores posee una ventaja intrínseca. Sin embargo, debido a la alta
demanda de energía para, por ejemplo, la provisión de nutrientes y la recolección
de biomasa de algas, generalmente no se obtiene una ganancia neta de energía
positiva obtenida de la fermentación de biomasa de algas o la producción de
biodiesel a partir de aceite de algas (Jorquera et al ., 2010 ; Razon y
Tan, 2011 ). Por el contrario, en el enfoque basado en glicolato, la situación
cambia completamente porque la provisión de nutrientes puede reducirse
drásticamente, se evita completamente la recolección de biomasa y, por lo tanto,
se logra una ganancia de energía positiva.

Conclusiones
En el presente estudio, el alga verde C. reinhardtii se cultivó continuamente en un
fotobiorreactor en condiciones de producción de glicolato. Los resultados
experimentales permiten responder preguntas básicas como requisitos previos
para una aplicación biotecnológica de este enfoque. (i) La alta actividad
fotosintética de las células dio como resultado una tasa de producción de glicolato
estable alta y a largo plazo. Las células de algas demostraron ser tolerantes contra
la carga fotorrespiratoria permanente y la alta acumulación de glicolato en el
medio de cultivo al final del período experimental. (ii) Las concentraciones de
glicolato logradas permiten un uso directo para los procesos de fermentación sin
ningún otro paso de concentración. (iii) El O 2 / CO 2La relación se puede ajustar
de manera que el carbono asimilado se excreta completamente como glicolato. El
cese del crecimiento resultante abre la posibilidad de utilizar una tecnología de
biopelículas de algas en lugar de cultivos en suspensión que aumentarán
considerablemente la eficiencia energética del sistema de producción. Por lo tanto,
la excreción de glicolato basada en algas puede ejecutarse como un proceso
continuo en el que no es necesaria la recolección de biomasa de algas. (iv) La
excreción de glicolato basada en algas demostró ser un proceso robusto incluso
en condiciones con luz oscilante y condiciones de temperatura.

Procedimientos experimentales
Condiciones de cultura
El alga verde Chlamydomonas reinhardtii (SAG 11‐32b, Colección de cultivos de
algas, Göttingen, Alemania) se cultivó en un precultivo discontinuo a 20 ° C ya una
intensidad de luz de 100 μmol fotones / m 2 / s de luz blanca (L36W / 840 , Osram,
Munich, Alemania) con un ciclo de luz / oscuridad de 14/10 h. Se utilizó un medio
mínimo modificado de Tris-Fosfato (TP) (Gorman y Levine, 1965 ) con tampón Tris
doble (39,95 m M ), la adición de 3.08 μ M FeSO 4 × 7H 2 O más 2.3 μ M Na 2 ‐
TATA y El uso de la solución de metales traza del medio Basal de Bold (Bischoff y
Bold, 1963).) en lugar de la solución de elementos traza Hunter. El pH del medio
se ajustó a un valor de 7,0.

Para los experimentos, las células fueron cultivadas continuamente en un 400 ml

fotobiorreactor plana (FMT 150, PSI, Drasov, República Checa) con un área
iluminada de 0.016 m², en el medio de TP modificado y se aireó con CO 2 aire
enriquecido (21% O 2 /5% CO 2 ). Se aplicaron gradientes de temperatura (15–30 °
C) y condiciones de luz dinámica (1700 μmol fotones / m / s de irradiancia
máxima) para simular las condiciones al aire libre de un día de verano en la zona
templada (14/10 h de luz / oscuridad) (Figura 1 ).

Los cultivos de algas se mantuvieron a una concentración de clorofila a (Chl a )

entre 2 y 3 mg Chl a / L mediante dilución continua con medio fresco. La dilución
con medio se controló mediante una medición en línea de la densidad óptica (OD)
a 680 nm. Las mediciones fisiológicas se iniciaron después de 1 semana de
crecimiento estable.

Las tasas de crecimiento diarias (μ) se calcularon de acuerdo con las siguientes
ecuaciones:

(1)

(2)
donde D es la tasa de dilución diaria, f es el volumen de dilución, V es el volumen del
recipiente de cultivo y d x es el cambio en la concentración de Chl a del intervalo de
tiempo d t .

Determinación del peso celular seco, número de células

y contenido de clorofila.
Para la determinación del peso seco celular, se recogieron 25 ml de los cultivos de
algas por centrifugación (2500 xg , 10 min, 5 ° C; Sigma 2‐16k; Sigma, Osterode
am Harz, Alemania). Después de resuspender y lavar las células dos veces con 25
ml de agua desionizada, las células se recogieron en 1,5 ml de agua desionizada y
se liofilizaron (Labconco Freezone 2,5; Ilmvac GmbH, Ilmenau, Alemania). El
número de células se contó por medio de un contador de células (Z2 Coulter
Counter, Coulter Electronics Inc., Miami, FL). Las muestras para las mediciones
del contenido de Chl se tomaron al comienzo del período de luz y en el momento
de máxima irradiancia y temperatura. La determinación de la concentración de Chl
se realizó espectrofotométricamente correspondiente a Ziegler y Egle ( 1965). Por
lo tanto, se recogieron 5-10 ml de suspensión de algas en un filtro de fibra de
vidrio (MN 85/70 Ø 25 mm, Macherey-Nagel, Dueren, Alemania). Después de la
adición de 2,5 ml de acetona al 80% y 2,5 g de perlas de vidrio (∅ 0,25-0,3 / 1,00-
1,05 mm; 3: 1), las células se rompieron en un homogeneizador de células (20 s a
6500 rpm; Precellys Evolution, Bertin Technologies, París , Francia). El extracto de
pigmento se centrifugó durante 2,5 minutos a 16 000 x g(Sigma 1‐14; Sigma) y la
absorción se midió en las longitudes de onda de 664 y 647 nm (espectrofotómetro
U2000, Hitachi, Tokio, Japón).

Determinación de la evolución del oxígeno y

fluorescencia variable de la clorofila.
Las tasas de evolución del oxígeno y los parámetros de fluorescencia se midieron
simultáneamente por medio de una combinación de fluorómetro de modulación de
amplitud de pulso (PAM) (unidad 101/103, Walz, Effeltrich, Alemania) y pipeta
ligera (Illuminova, Uppsala, Suecia) equipada con un especial cubeta (Topgallant
LLC, Salt Lake City, UT) que conecta el emisor y la unidad de detección del
fluorómetro PAM. La pipeta de luz se usó como fuente de luz actínica (Xenophot
Longlife HLX64642; Osram, Munich, Alemania) y para las mediciones de evolución
de oxígeno usando un electrodo de tipo Clark (MI 730; Microelectrodes Inc.,
Bedford, New Hampshire, MA). Durante la fase de luz, cada hora se extrajeron 3
ml de la suspensión de algas del fotobiorreactor y se colocaron en la cubeta del
dispositivo. Tasas netas de evolución del oxígeno [μmol O 2 / (mg Chla ) / h] se
midieron durante 10 minutos a cinco intensidades de luz actínica diferentes (91,
341, 691, 1064, 1386 μmol fotones / m 2 / s) y temperaturas (15, 17, 20, 24, 27, 30
° C ) Tener en cuenta el curso diario de irradiancia y temperatura en el
fotobiorreactor. Las tasas de respiración [μmol O 2/ (mg Chl a ) / h] se midieron
después de la iluminación correspondiente durante 10 minutos en la oscuridad. La
tasa de fotosíntesis bruta se derivó de la corrección de las tasas de evolución neta
de oxígeno para la tasa de respiración oscura correspondiente.

El rendimiento cuántico máximo del fotosistema II (Fv / Fm) se midió directamente

en los cultivos en el fotobiorreactor al final del período de oscuridad justo antes del
inicio de la fase de luz diaria (PSI, Drasov, República Checa). Los principios del
método de fluorescencia se basan en Schreiber et al . ( 1995 ). Los datos de
fluorescencia en línea se utilizaron para estimar el estado fisiológico de los cultivos
en condiciones de producción de glicolato.

Cálculo de la producción primaria.

Para la estimación de la producción primaria, se utilizaron los valores medidos del
peso seco (DW) [mg / (mg Chl a )] y la tasa de crecimiento (μ) / día según la
ecuación (3):

(3)
donde m C es el peso molecular del carbono (12.01 g / mol) y f c es la proporción de
carbono por masa seca. Según Langner et al . ( 2009 ) f c es 2 para C. reinhardtii .

Configuración experimental para la producción de

glicolato y determinación de las tasas de excreción de
glicolato
Para la producción / excreción de glicolato, la aireación de los cultivos de algas se
cambió de las condiciones de producción de biomasa (21% O 2 /5% CO 2 ) a
condiciones fotorrespiratorias con 40% O 2 y 0.2% CO 2 . Se añadió el inhibidor
EZA (6-etoxi-2-benzotiazolesulfonamida; Sigma-Aldrich, Darmstadt, Alemania) a
una concentración de 0,05 m Mpara prevenir la inducción de mecanismos de
concentración de carbono en condiciones fotorrespiratorias. Para la determinación
de la concentración de glicolato en el medio de los cultivos de algas, las muestras
(2 ml) se recogieron cada hora durante la fase de iluminación los primeros 2 días y
más tarde cada dos días 1 h antes y después del máximo de luz, se filtraron de
forma estéril (PES 0,22 μm; Carl Roth , Karlsruhe, Alemania) y almacenado a −20
° C hasta su uso posterior.

Para la determinación cuantitativa de la concentración de glicolato, se utilizó el

método colorimétrico con 2,7-dihidroxinaftaleno (Takahashi, 1972 ). En
consecuencia, se disolvieron 50 μl de la muestra en 1,5 ml del reactivo de tinción y
se incubaron en un baño de agua a 100 ° C durante 20 min. La reacción se detuvo
en hielo y la absorbancia de las muestras se midió a 540 nm (Specord M250,
Zeiss, Jena, Alemania).
Comparación de la asignación de carbono mediante
espectroscopia FTIR
Para la evaluación de la asignación de carbono durante las diferentes condiciones,
se realizó un análisis de espectroscopia infrarroja de transformación de Fourier
(FTIR, por sus siglas en inglés) según lo descrito por Fanesi et al . ( 2017 ). Las
condiciones de producción de biomasa y glicolato se tomaron cada dos horas
durante la fase de luz. Las células se recogieron mediante centrifugación de 1,5 ml
de suspensión de algas durante 2 minutos a 2500 x g(Minispin, Eppendorf,
Hamburgo, Alemania). El sedimento se resuspendió dos veces en 1 ml de agua
destilada para eliminar fragmentos de células y residuos de sal y se centrifugó
nuevamente. Dependiendo de la concentración celular final, el sedimento se
resuspendió en 25-90 μL de agua destilada, para alcanzar una concentración
celular final para registrar espectros con una absorción máxima entre 0,15 y 0,3
unidades de absorbancia. Se colocaron 2 μl de la suspensión celular concentrada
en una microplaca de silicio 384 (Bruker Optics, Ettlingen, Alemania) y se secaron
a 40 ° C durante al menos 30 minutos (secador de gabinete, Thermo Fisher
Scientific, Hanau, Alemania). La grabación de los espectros se llevó a cabo en
modo de transmisión con 32 exploraciones. En el rango espectral de 4000–700
cm −1, los espectros fueron co-agregados y promediados. Las mediciones fueron
controladas por computadora (software OpusLab v. 5.0, Bruker Optics, Ettlingen,
Alemania) y se llevaron a cabo con un espectrómetro Bruker Vector 22 conectado
a un lector de microplacas HTS-XT (Bruker Optics, Ettlingen, Alemania). Los
espectros registrados se corrigieron con el algoritmo de la banda de goma
(software OPUS v. 5.0). Se calculó la relación de picos de la banda de vibración
asociada a los carbohidratos (1152 cm- 1 ) y la banda de vibración de la amida I
(proteína) (1654 cm- 1 ). Se midieron cinco réplicas técnicas de dos muestras
biológicas y finalmente se normalizaron a la banda de vibración de la amida I
(1654 cm- 1 ) para una presentación comparativa.

Estimación de la producción de metano a base de

glicolato
Para demostrar el potencial biotecnológico del enfoque presentado, se estimó la
producción de metano basada en glicolato esperada. La producción de metano a
base de glicolato se estimó para dos escenarios diferentes: (i) un aumento de
escala de la configuración actual del fotobiorreactor con un contenido
de Chl a entre 2 y 2.8 mg / L (es igual a 50–70 mg Chl a/ m 2 ) y una iluminación
área de 0.04 m 2 / L de suspensión de algas, y b) un hipotético fotobiorreactor
configurado con una alta concentración de Chl de hasta 300 mg Chl a / m 2 . En
este último escenario, se supone que la misma tasa de producción de glicolato [p.
Ej. Glicolato de mmol / (mg Chl a) / h] se logra como en la configuración actual del
fotobiorreactor. Además, se supone un "período de vegetación" de abril a
septiembre con T> 10 ° C. Para este período, se deriva un total de 2240 h de
insolación solar para una ubicación en el centro de Alemania sobre la base de la
insolación solar diaria (menos 2 h para el amanecer y el anochecer). Con estas
suposiciones, la producción de glicolato basada en el área se estimó y convirtió en
la cantidad esperada de metano mediante el factor medido de 0.173 L por kg de
glicolato (Günther et al ., 2012 ). A partir de la producción de metano, el
rendimiento energético esperado se calculó con el supuesto de 36 MJ por m³ de
metano.

Expresiones de gratitud
Los autores agradecen al Sächsische Aufbaubank (SAB) por la financiación de
este proyecto de investigación (subvenciones 100 211 511, 100 300 939).

Conflicto de intereses
Los autores declaran no tener intereses financieros en competencia.