Universidad Nacional de Colombia

Facultad de Ciencias – Departamento de Química

Curso de Bioquímica para la carrera de Química
Código 2015585

Alumnos: _______________________ Código __________________

_______________________ __________________

Fecha de realización de la práctica: 09 de Octubre de 2018

Informe. Práctica Nº 6
Aminoácidos: curvas de titulación
Y separación por intercambio iónico

Objetivos

● Realizar la curva de titulación para Treonina, Ácido glutámico y Glicina.

● Separar una mezcla de histidina, ácido aspártico y lisina, sobre una
resina de intercambio catiónico.
● Seguir la separación a través de reacción con ninhidrina, para detectar
la presencia de aminoácidos.

Fundamento teórico y reacciones

Cromatografía de intercambio iónico

El principio básico de la cromatografía de intercambio iónico es que las

moléculas cargadas se adhieren a los intercambiadores de forma reversible de
modo que dichas moléculas pueden ser asociadas o disociadas cambiando el
ambiente iónico. La separación mediante intercambiadores iónicos se realiza
por lo general, en dos fases: en la primera las sustancias a separar se unen al
intercambiador utilizando condiciones que originan una unión fuerte y estable;
a continuación, se eluye de la columna con buffers de diferentes pH o diferente
fuerza iónica, compitiendo los componentes del buffer con el material por los
sitios de unión.
R+A- es un intercambiador aniónico en la forma A- y B- representa a los aniones
en la disolución.

𝑅+ 𝑅− + 𝑅− ⇌ 𝑅 + 𝑅− + 𝑅−

Esta técnica está basada en cuatro etapas:

1. Equilibrio: De la fase estacionaria con las condiciones iniciales deseadas.

2. Aplicación y lavado: Sembrar la muestra mediante un lavado específico
con un buffer del mismo pH y fuerza iónica que el buffer inicial.
3. Elusión: Las que posean menos densidad de carga eluirán antes,
mientras que para las de mayor carga neta el tiempo de retención será
mayor.
También se puede eluir por cambios en el pH del solvente en donde los
aminoácidos aniónicos aparecen primero y los más catiónicos aparecen
posteriormente (con un intercambiador catiónico).
4. Regeneración: Se remueven las partículas que aún están asociadas al
intercambiador.2

Reacción de ninhidrina

La ninhidrina reacciona específicamente con el grupo alfa-amino de los

aminoácidos ya sean libres o unidos mediante enlaces peptídicos.

La ninhidrina a pH entre 4 y 8 es un oxidante muy fuerte y siempre reacciona

con los grupos alfa-amino liberando amonio, el cual se condensa con la
ninhidrina reducida y con otra molécula de ninhidrina formando un compuesto
coloreado que varía de azul a violeta intenso. Este producto (llamado púrpura
de Ruhemann) se estabiliza por resonancia1.
Tablas de datos y resultados

Curvas de titulación

a. Nombre del aminoácido titulado: Treonina 0,1M

Volumen de la alícuota: 10 mL
Normalidad del HCl: 0,1 N Normalidad de NaOH: 0,105 N

Tabla 1. Titulación de Treonina

HCl (ml) HCl (meq) pH NaOH NaOH pH
(ml) (meq)
0,0 0,0 5,12 0 0,0 5,13
0,5 15,3 3,15 0,5 26,6 7,96
1,0 30,7 2,80 1,0 53,3 8,35
1,5 46,0 2,62 1,5 79,9 8,61
 2,0 61,4 2,50 2,0 106,5 8,79
2,5 76,7 2,40 2,5 133,1 8,95
3,0 92,1 2,31 3,0 159,8 9,07
3,5 107,4 2,24 3,5 186,4 9,19
4,0 122,7 2,17 4,0 213,0 9,30
4,5 138,1 2,11 4,5 239,6 9,41
5,0 153,4 2,05 5,0 266,3 9,53
5,5 168,8 1,99 5,5 292,9 9,65
6,0 184,1 1,94 6,0 319,5 9,74
6,5 199,5 1,89 6,5 346,1 9,88
7,0 214,8 1,85 7,0 372,8 10,05
7,5 230,1 1,81 7,5 399,4 10,26
8,0 245,5 1,77 8,0 426,0 10,54
8,5 260,8 1,73 8,5 452,6 11,00
9,0 276,2 1,69 9,0 479,3 11,68
9,5 291,5 1,66 9,5 505,9 12,07
10,0 306,8 1,62 10,0 532,5 12,28
10,5 322,2 1,59 10,5 559,1 12,42
11,0 337,5 1,57 11,0 585,8 12,51
11,5 352,9 1,54 11,5 612,4 12,58
12,0 368,2 1,51
pKa1: 2,88 pKa2: 7,63
pIa: 5,26
 Figura 1. Perfil de titulación de la treonina

b. Nombre del aminoácido titulado: Ácido glutámico 0,1M

Volumen de la alícuota: 10 mL
Normalidad del HCl: 0,1 N Normalidad de NaOH: 0,105 N

Tabla 2. Titulación de Ácido glutámico

HCl (ml) HCl (meq) pH NaOH NaOH pH
(ml) (meq)
0,0 0,0 3,08 0 0,0 3,07
0,5 15,3 2,76 0,5 26,6 3,30
1,0 30,7 2,53 1,0 53,3 3,57
1,5 46,0 2,36 1,5 79,9 3,81
2,0 61,4 2,22 2,0 106,5 4,03
2,5 76,7 2,11 2,5 133,1 4,26
3,0 92,1 2,02 3,0 159,8 4,53
3,5 107,4 1,94 3,5 186,4 4,94
4,0 122,7 1,87 4,0 213,0 6,47
4,5 138,1 1,81 4,5 239,6 8,88
5,0 153,4 1,74 5,0 266,3 9,39
 5,5 168,8 1,69 5,5 292,9 9,67
6,0 184,1 1,65 6,0 319,5 9,90
6,5 199,5 1,61 6,5 346,1 10,11
7,0 214,8 1,57 7,0 372,8 10,30
7,5 230,1 1,54 7,5 399,4 10,53
8,0 245,5 1,50 8,0 426,0 10,79
8,5 452,6 11,13
9,0 479,3 11,60
9,5 505,9 11,97
10,0 532,5 12,18
10,5 559,1 12,32
11,0 585,8 12,41
11,5 612,4 12,50
12,0 639,0 12,56

pKa1: 2,22 pKa2: 4,52 pKa3: 8,24

pIa: 3,37

Figura 2. Perfil de titulación del ácido glutámico.

c. Nombre del aminoácido titulado: Glicina 0,101M

Volumen de la alícuota: 10 mL
Normalidad del HCl: 0,1 N Normalidad de NaOH: 0,105 N

Tabla 3. Titulación de Glicina

HCl (ml) HCl (meq) pH NaOH NaOH pH
(ml) (meq)
0,0 0,0 6,93 0 0,0 6,92
0,5 15,3 3,40 0,5 26,6 8,59
1,0 30,7 2,96 1,0 53,3 8,97
1,5 46,0 2,76 1,5 79,9 9,22
2,0 61,4 2,61 2,0 106,5 9,39
2,5 76,7 2,51 2,5 133,1 9,54
3,0 92,1 2,41 3,0 159,8 9,67
3,5 107,4 2,33 3,5 186,4 9,79
4,0 122,7 2,25 4,0 213,0 9,90
4,5 138,1 2,19 4,5 239,6 10,01
5,0 153,4 2,14 5,0 266,3 10,12
5,5 168,8 2,08 5,5 292,9 10,23
6,0 184,1 2,01 6,0 319,5 10,35
6,5 199,5 1,96 6,5 346,1 10,47
7,0 214,8 1,91 7,0 372,8 10,60
7,5 230,1 1,86 7,5 399,4 10,75
8,0 245,5 1,81 8,0 426,0 10,94
8,5 260,8 1,77 8,5 452,6 11,18
9,0 276,2 1,73 9,0 479,3 11,49
9,5 291,5 1,69 9,5 505,9 11,82
10,0 306,8 1,65 10,0 532,5 12,06
10,5 322,2 1,62 10,5 559,1 12,23
11,0 337,5 1,58 11,0 585,8 12,35
11,5 352,9 1,56 11,5 612,4 12,44
12,0 368,2 1,53 12,0 639,0 12,51
12,5 383,6 1,50 12,5 665,6 12,56

pKa1: 2,92 pKa2: 9,84

pIa: 6,38
 Figura 3. Perfil de titulación de la glicina

Muestra de cálculos:

1 meq HCl = 36,5 g /1000 = 0,0365 g

1,12 𝑅 1 𝑅𝑅𝑅
0,5 𝑅𝑅 𝑅 𝑅 = 15,3 𝑅𝑅𝑅
𝑅𝑅 0,0365 𝑅

pI = (pKa1 + pKa2) / 2

pI = (2,92 + 9,84) / 2 = 6,38

Cromatografía de intercambio iónico

Resina utilizada: Pendiente Tamaño de la columna: ___ cm x ____ cm

Volumen de la resina empacada: _____ mL
Composición de la muestra aplicada: Ácido aspártico, histidina y lisina
Volumen de la muestra aplicada: 0,9 mL

Elución con: Buffer Citrato Velocidad del flujo: _____ mL/min

Tabla 4.
Fracción No. Abs 570 nm Fracción No. Abs 570 nm
1 0,125 11 0,006
2 1,426 12 0,008
3 0,314 13 0,007
4 0,169 14 0,011
5 0,009 15 0,000
6 0,000 16 0,005
7 0,000 17 0,002
8 0,009 18 0,003
9 0,001 19 0,004
10 0,004 20 0,000

Elución con: Buffer Fosfatos pH 8 Velocidad del flujo: _____ mL/min

Tabla 5.
Fracción No. Abs 570 nm Fracción No. Abs 570 nm
1 0,007 11 0,573
2 0,009 12 0,586
3 0,002 13 0,480
4 0,004 14 0,416
5 0,000 15 0,238
6 0,008 16 0,201
7 0,035 17 0,190
8 0,200 18 0,454
9 0,300 19 0,226
10 0,402 20 0,190
Elución con: Buffer Fosfatos pH 11 Velocidad del flujo: _____ mL/min

Tabla 6.
Fracción No. Abs 570 nm Fracción No. Abs 570 nm
1 0,555 11 0,217
2 0,052 12 0,250
3 1,263 13 0,311
4 0,552 14 0,208
5 0,351 15 0,381
6 0,061 16 0,238
7 0,002 17 0,121
8 0,010 18 0,393
9 0,063 19 0,179
10 0,026 20 0,154

Figura 4. Perfil separación cromatográfica

Discusión de resultados

Se realizó el perfil de titulación de tres aminoácidos diferentes, a los cuales

inicialmente se le determinó el pH de partida y se adicionó 0,5 mL de agente
titulante usando una micropipeta y esperando el tiempo suficiente para lograr
estabilizar el pH, dichas adiciones se llevaron a cabo hasta alcanzar un pH
determinado; cuando se usaba HCl 0,1 M como titulante se llevaba hasta pH
1,5 y al usar NaOH 0,105 M se llevaba hasta pH 12,5.

Figura 5. Estructura de la treonina

En la tabla 1 se compilan los datos correspondientes a la titulación de la

treonina, el cual es un aminoácido polar neutro, como se puede observar en la
figura 6, al medir el pH inicial este era de 5,12 aproximadamente, el cual es
ligeramente ácido debido al grupo hidroxilo presente en su estructura. En la
figura 2+ se aprecia la gráfica del perfil de titulación de la treonina, como se
puede observar la curva naranja corresponde a la titulación realizada con
NaOH y la azul a la hecha con HCl, en el eje x se puede ver que los valores de
meq de titulante correspondientes a la titulación NaOH son negativos,estos no
tienen ningún significado físico, simplemente se cambió de signo con el fin de
observar de forma más continua la curva, por tanto estos datos se deben
tomar como el valor absoluto, dicha estrategia fue usada en las curvas de los
otros dos aminoácidos. En esta curva se puede apreciar que el el único cambio
brusco de pH se da entre las primeras adiciones de agente titulante, mientras
que los demás cambios de pH se dan de manera gradual, esto indica que dicho
aminoácido presenta una única pareja de grupos funciones que pueden
adquirir carga, los cuales corresponden a los grupos amino y ácido carboxilo
del aminoácido, el pH al cual su carga neta es igual a cero o punto isoeléctrico,
el cual es igual a 5,26 un valor bastante semejante al pH inicial.
 Figura 6. Estructura ácido glutámico.
El ácido glutámico a diferencia de la treonina presenta un grupo ácido
adicional, como se observa en la figura 6, por tanto dicho aminoácido a pH 7
se encuentra cargado negativamente, esto puede ser comprobado al observar
en la tabla 2 que su pH inicial es de 3,08 aproximadamente y al observar la
figura 2 en la curva ácida hay un pequeño sobresalto cerca al pH inicial y
nuevamente se da un cambio brusco de pH cerca a 7. En éste caso para
determinar el punto isoeléctrico se debe tener en consideración los equilibrios
ácido base que tiene el aminoácido (ver figura 7), donde la especie
zwitteriónica está después del primer cambio significativo de pH, por tanto
según los datos recolectados del ácido glutámico su pI es de 3,37.

Figura 7. Equilibrios ácido-base del ácido glutámico.

Finalmente, en el caso de la glicina, este es un aminoácido apolar neutro (ver
figura 8), por tanto su comportamiento se asemeja más al de la treonina que
al del ácido glutámico, el pH inicial de la glicina es de aproximadamente 6,93
siendo este totalmente neutro, el punto isoeléctrico determinado es igual a
6,38; En todos los casos los puntos isoeléctrico determinados se encuentra
muy cercanos al pH medido inicialmente. A continuación, se presenta una
tabla comparativa entre los valores de pI determinados y los reportados en
literatura, encontrando que el porcentaje de error en el peor de los casos no
supera el 15%.

Figura 8. Estructura de la glicina

Tabla 7. Resumen de resultados

Datos de literatura: http://www.quimitube.com/wp-

content/uploads/2014/10/punto-isoelectrico-y-pk-aminoacidos-neutros-
acidos-basicos.png
También se llevó a cabo la separación cromatográfica de una mezcla de
aminoácidos (ácido aspártico, histidina y lisina) usando intercambiador
aniónico y tres soluciones amortiguadoras a diferentes pH. Antes de realizar la
siembra se verificó que la columna se encontraba en un pH de 3,5 o cercano,
para ésto se añadió a la columna una cantidad de buffer citrato hasta obtener
el pH deseado, el cual tras haber sido alcanzado se procedió a hacer la siembra
de 0,9 mL de la mezcla de aminoácidos, tras esperar 10 minutos se procedió a
iniciar la recolección de las fracciones 20 por cada buffer, las cuales una vez
recolectadas se procedió a realizar la prueba de ninhidrina la cual permitía
seguir la elución por medio de espectroscopia UV y construir el perfil
cromatográfico que se muestra en la figura 4, donde el azul corresponde a la
fracción de pH 3,5, la naranja a la fracción de pH 8,0 y la gris a la fracción de
pH 11,5; en esta se puede observar que de las fracciones del 1 al 4 recolectadas
del buffer 3,5 presentan absorbancia indicando que en estas se encuentra el
primer aminoácido, el cual corresponde al ácido aspártico ya que este tiene un
pI de 2,97 por tanto a un pH de 3,5 tiene carga negativa y es repelido por la
resina, posteriormente tras recolectar 20 fracciones se procedió a cambiar el
buffer por uno de pH 8,0 haciendo que el siguiente aminoácido cambiara su
carga, en este caso la histidina con un pI de 7,58 y eluyera junto con el buffer,
a diferencia del caso anterior, el número de fracciones en las que se encuentra
el buffer aumenta lo que hace que el pico en el perfil se vea más ancho,
finalmente se cambia el pH por última vez para que el último aminoácido
eluya, el pH usado al final fue de 11,5 y el aminoácido eluido fue la lisina con
un pI de 9,74, en el perfil se puede observar que la última grupo de fracciones
pueden contener parte del aminoácido anterior al inicio y al final el aminoácido
de interés, ya que hacia el medio de las fracciones se observa una disminución.

Conclusiones
● Los puntos isoeléctricos determinado por medio del perfil de titulación
para la treonina, ácido glutámico y glicina son 5,26, 3,37 y 6,38
respectivamente y presentan un porcentaje de error inferior al 15%
respecto a los reportados en literatura.
● El orden de elución de la mezcla de aminoácidos es ácido aspártico,
histidina y lisina y la resolución de los picos cromatográfico disminuye a
medida que aumenta el número de fracciones.

Bibliografía

[1] Moreno, M. Tecnología médica. Bioquímica. Universidad Latina de Panamá.

2015.

[2] Lehninger, A. L., Nelson, D. L., & Cox, M. M. Lehninger principles of

biochemistry. New York: Worth Publishers. 2000
Cuestionario

Practica No. 2: Aminoácidos: curvas de titulación y separación por intercambio iónico.

a) ¿En qué orden eluyen los aminoácidos de la columna y por qué?

Al cambiar los buffer los aminoácidos van eluyendo debido a los cambios de fuerza
iónica a los que se ven sometidos, esto también depende de su punto isoeléctrico. Para
los aminoácidos obtenidos en la mezcla se obtiene que el ácido aspártico eluye primero,
seguido por la histidina y por último la lisina. [5]
b) El pH intracelular y el pH de la sangre son cercanos a 7,4. A ese pH, ¿los
aminoácidos son un buen buffer?.

En el caso de aminoácidos como la histidina (que tiene un pK de 6) es un buen buffer

debido a que a pH 7,4 se encuentra tanto en su forma disociada como protonada. [5]

c) ¿Qué resultado hubiera obtenido si la titulación de los aminoácidos se hubiera

hecho en presencia de formaldehído?

El formaldehido reacciona con los grupos amino permitiendo que en la titulación solo
se titulen los grupos carboxilo del aminoácido.[8]

d) ¿Qué instrumentos se utilizan actualmente para el análisis de mezclas de

aminoácidos, y cuál es el fundamento de la separación?

Por interacciones electrostáticas se pueden separar los aminoácidos por electroforesis.

Al realizar reacciones de derivatización también se pueden separar los aminoácidos

(inclusive los enantiómeros) usando un equipo de HPLC.

En la cromatografía de afinidad también se permite la separación de los aminoácidos

debido a que la fase interacciona de forma selectiva con ellos. [5]

Bibliografía:

[5]CAMPBELL, P. SMIT, A. Bioquímica ilustrada. Quinta edición. Masson. Barcelona,

España. 2006. Sección4.

[8]GENNARO, A. Remington Farmacia. Tomo 1. 20ª edición. Editorial medica

panamericana. Buenos Aires, Argentina. 2003. Pág 659.