INFORME N°1

CENTRIFUGACIÓN Y CUANTIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS POR ESPECTROSCOPIA
DE ABSORCIÓN MÉTODO DE BRADFORD

Integrantes
Yannis Baldu P.
Priscilla Loyola A.
Diego Meza I.
Jocelyn Vejar A.
Fecha Práctico
05/06/2019
Sección
4
Profesor
Jorge Cortés
 Introducción

Las células, tanto animales como vegetales, están compuestas por organelos (estructuras
internas que cumplen importantes funciones). Estos organelos pueden ser visualizados a
través de un microscopio para estudiarlos, sin embargo, para lograr tal objetivo es necesario
aislarlos con tal de que estén en fracciones puras, lo que facilita su visualización. Para lograr
este objetivo se pueden emplear técnicas físico-químicas para aislar estos organelos con el
fin de analizarlos. Una de ellas es la centrifugación diferencial que permite separar
componentes celulares por diferencias de coeficiente de sedimentación.

Estas estructuras tienen sus propias características que las diferencian de una con la otra,
pero tienen una en común: absorber radiación electromagnética. Esta característica permite
que a través de la espectrofotometría UV-visible (técnica analítica que permite determinar la
concentración de un compuesto en solución), podamos cuantificar proteínas
(específicamente determinar concentración). Como la concentración que se estudiará y
cuantificara es muy baja, se requiere de un método que sea útil para bajas concentraciones
y el método Bradford cumple con tal especificación (rango medible de 10 a 800 µg de
proteínas).

El método Bradford consiste específicamente en añadir reactivo de Bradford a la solución

para que se forme un complejo con un color característico (azul), ya que absorbe fuertemente
a una longitud de 595 nm, lo que es ideal para que el espectrofotómetro haga una lectura de
absorbancias coherente y clara, y luego determinar la concentración de proteínas de la
muestra interpolando la absorbancia de la misma en una curva confeccionada con las lecturas
de absorbancia v/s concentración de una proteína conocida.
 Procedimientos

 Se seleccionaron como muestras arvejas y lentejas, las cuales se molieron

debidamente por separado logrando una pasta (homogeneización).
 Luego se extrajeron 0.1 g de cada una y se colocaron en un tubo Eppendorf por
separado junto con 1000𝜇𝑙 de solución de extracción en cada una (𝐾2 𝑆𝑂4 , 5%, 𝑝𝐻 7).
 Se agitaron ambas y se dejaron reposar. Posteriormente los tubos Eppendorf se
llevaron a la centrífuga para la realización de una centrifugación diferencial con los
siguientes especificaciones en el instrumento:

Porcentaje de temperatura Tiempo Revoluciones Rotor g

freno por min.

8% 4∘ 𝑐 10 min. 10.000 12148 9168

 Mientras terminaba el proceso de centrifugación se preparó una batería de 8 tubos de

solución conocida en un rango de 0.1 a 0.8 mg/ml a partir de una solución stock de
BSA (albúmina de suero de bovino) llegando a 1000𝜇𝑙 en cada uno.
 Luego se tomaron 100𝜇𝑙 de cada solución en tubos y se sometieron a una máquina
que generaba un vórtice en la solución de los tubos para mezclar de manera uniforme
y se agregaron 5 ml de reactivo de Bradford a cada tubo hasta la aparición del color
característico de este método (color azul).
 Se preparó un blanco de 100𝜇𝑙 de agua destilada con 5 ml de reactivo de Bradford.
 Se llevaron el conjunto de soluciones al espectrofotómetro configurado previamente a
una longitud de onda de 595 nm, de la cual se elaboró una recta estándar para la
determinación de albúminas de las muestras.
 Al terminar la centrifugación se extrajeron los sobrenadantes de las muestras y se
diluyeron 10 veces, de los cuales se sacó 100 𝜇𝑙 de cada uno y se pasaron a unos
tubos vortex con 5 ml de reactivo de Bradford, se mezcló y se dejó reposar hasta la
aparición de color. Se llevaron las muestras al espectrofotómetro y se midió la
absorbancia, registrando cada dato obtenido para su posterior análisis.
 Resultados

Tabla 1

Solución recta estándar Método de Bradford

TUBO Concentración Volumen Volumen de Volumen de Volumen Abs a 595

(mg/ml) de BSA 1 Agua sol estándar Reactivo de nm
mg/ml destilada Bradford

Blanco 0 0 500 µl 100 µl 5 ml 0

1 0,1 100 µl 900 µl 100 µl 5 ml 0,043

2 0,2 200 µl 800 µl 100 µl 5 ml 0,107

3 0,3 300 µl 700 µl 100 µl 5 ml 0,154

4 0,4 400 µl 600 µl 100 µl 5 ml 0,211

5 0,5 500 µl 500 µl 100 µl 5 ml 0,050

6 0,6 600 µl 400 µl 100 µl 5 ml 0,304

7 0,7 700 µl 300 µl 100 µl 5 ml 0,338

8 0,8 800 µl 200 µl 100 µl 5 ml 0,470

Concentración y absorbancias de solución BSA

Tabla 2

tubos Concentración (mg/ml) Absorbancia (a 595 nm)

blanco 0 0
1 0,1 0,043
2 0,2 0,107
3 0,3 0,154
4 0,4 0,211
5 0,5 0,050 (*)
6 0,6 0,304
7 0,7 0,338
8 0,8 0,470
Concentración de cada tubo y absorbancias a 𝜆 = 595 𝑛𝑚
(*) Absorbancia no conforme (no será considerada en construcción de recta estándar)
 Gráfico

Recta Estándar
Concentración BSA v/s Absorbancia
0.5
y = 0.5449x - 0.0078
R² = 0.9811
0.4

0.3
Absorbancia

0.2

0.1

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9

-0.1
Concentración BSA (mg/ml)

Concentración (𝑚𝑔/𝑚𝑙) 𝑣/𝑠 absorbancia

Recta obtenida

Y = 0,5449X - 0,0078
Relación Lineal

Tabla 3

Muestras Absorbancia Conc. Diluida concentración

Arvejas 0,139 0,241 𝑚𝑔/𝑚𝑙 2,41 𝑚𝑔/𝑚𝑙

Lentejas 0,238 0,422 𝑚𝑔/𝑚𝑙 4,22 𝑚𝑔/𝑚𝑙

Absorbancia de las muestras a 595 nm y las concentraciones obtenidas por relación lineal

Tabla 4

Muestras Cantidad de masada (mg) % de proteína obtenido

Arvejas 100 mg 2,41%

Lentejas 100 mg 4,22%

Relación entre la masada de la muestra y él % de proteínas obtenidas experimentalmente

Discusión
Conclusión

Considerando las muestras seleccionadas, los métodos aplicados, la instrumentación que

utilizamos y la teoría estudiada concluimos que pudimos lograr el objetivo propuesto el cual
fue determinar la concentración de proteínas en arvejas y lentejas. Si bien es cierto durante
el procedimiento hubo un cierto grado de desorganización con respecto a la distribución de
tareas, logramos analizar y procesar los datos obtenidos de una manera adecuada.

La recta obtenida es coherente de acuerdo a lo que se midió con el espectrofotómetro y al

interpolar la absorbancias de las muestras en la relación lineal, el resultado obtenido se alinea
a lo que esperábamos. Nos dimos cuenta que el porcentaje de proteínas identificado es
bastante bajo, lo que nos da una idea aterrizada del aporte proteico que otorgan estas
legumbres a nuestra alimentación.

La metodología y lo aprendido nos da una clara señal que existen procedimientos reales y
factibles para lograr, a través de la investigación y aplicación, determinar las concentraciones
de lo que deseemos, aportando de manera significativa conocimiento y técnicas bioquímicas
para nuestro desempeño como futuros Ingenieros Químicos.