DETERMINACIÓN DE LA

ACTIVIDAD ENZIMÁTICA DE
LA POLIFENOLOXIDASA
(PPO)

PRÁCTICAS DE INGENIERÍA BIOQUÍMICA

Noelia Velázquez Medina

Elizabeth García Abarca
ÍNDICE
1. MATERIAL UTILIZADO
2. REACTIVOS
3. OBJETIVOS
4. PROCEDIMIENTO
5. RESULTADOS Y CONCLUSIONES

1. MATERIAL UTILIZADO
- Balanza de precisión
- Embudo de vidrio
- Espátula
- Espectrofotómetro VIS-UV
- 1 filtro de papel
- 1 vaso de precipitados de 100 mL
- 1 probeta de 50 mL
- Cubetas desechables para espectrofotómetro VIS-UV
- Cronómetro
- Mortero
- Cuchillo
- 1 pipeta 1 mL
- 1 pipeta 2 mL
- 1 micropipeta 500 L
- 1 micropipeta 100 L
- Propipeta
- Rotulador indeleble

2. REACTIVOS
- Champiñones
- Tampón fosfato de pH 7
- Disolución de dopamina de 2 mg/mL

3. OBJETIVOS
A través de esta práctica determinaremos la actividad de una enzima polifenol oxidasa
procedente de una muestra obtenida de champiñones, utilizando dopamina como
sustrato. Tendremos en cuenta el cambio en la intensidad del color pardo asociado a la
oxidación de la dopamina y su consiguiente formación de pigmentos.

4. PROCEDIMIENTO
Primero, cortaremos y pesaremos (aproximadamente) 10 g de champiñón. Los
trituraremos en el mortero, donde añadiremos 50 mL del tampón fosfato. Después, lo
filtraremos y pondremos la disolución en un baño de hielo.
 Por último, después de enfriar la disolución, prepararemos 4 mezclas y un blanco.
Cuantificaremos el aumento de absorbancia a 470nm con el tiempo a intervalos de 3
minutos (cada 20 segundos).

5. RESULTADOS Y CONCLUSIONES

Masa vegetal (g) 10,122

Muestra Blanco 1 2 3 4

Extracto enzimático (mL) 0,1 0,1 0,1 0,1 0,1

Sustrato (Dopamina) (mL) 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0

Tampón fosfato (mL) 2,9 2,4 1,9 1,4 0,9

TABLA 1. Composición de las diferentes disoluciones a estudiar.

Muestra 1
Extracto (mL) Dopamina (mL) Tampón fosfato (mL) t(s) Absorbancia
0,1 0,5 2,4 0 0,011
0,1 0,5 2,4 20 0,012
0,1 0,5 2,4 40 0,016
0,1 0,5 2,4 60 0,021
0,1 0,5 2,4 80 0,027
0,1 0,5 2,4 100 0,032
0,1 0,5 2,4 120 0,037
0,1 0,5 2,4 140 0,043
0,1 0,5 2,4 160 0,048
0,1 0,5 2,4 180 0,053

TABLA 2. Presentación de la variación de la absorbancia con el tiempo para la disolución de 0,5

mL de dopamina.
 Muestra 2
Dopamina
Extracto (mL) (mL) Tampón fosfato (mL) t(s) absorbancia
0,1 1,0 1,9 0 0,009
0,1 1,0 1,9 20 0,014
0,1 1,0 1,9 40 0,021
0,1 1,0 1,9 60 0,029
0,1 1,0 1,9 80 0,036
0,1 1,0 1,9 100 0,044
0,1 1,0 1,9 120 0,050
0,1 1,0 1,9 140 0,057
0,1 1,0 1,9 160 0,064
0,1 1,0 1,9 180 0,070

TABLA 3. Presentación de la variación de la absorbancia con el tiempo para la disolución de 1,0

mL de dopamina.

Muestra 3
Extracto (mL) Dopamina (mL) Tampón fosfato (mL) t(s) absorbancia
0,1 1,5 1,4 0 0,024
0,1 1,5 1,4 20 0,038
0,1 1,5 1,4 40 0,046
0,1 1,5 1,4 60 0,061
0,1 1,5 1,4 80 0,072
0,1 1,5 1,4 100 0,084
0,1 1,5 1,4 120 0,097
0,1 1,5 1,4 140 0,109
0,1 1,5 1,4 160 0,121
0,1 1,5 1,4 180 0,131

TABLA 4. Presentación de la variación de la absorbancia con el tiempo para la disolución de 1,5

mL de dopamina.
 Muestra 4
Extracto (mL) Dopamina (mL) Tampón fosfato (mL) t(s) Absorbancia
0,1 2,0 0,9 0 0,058
0,1 2,0 0,9 20 0,072
0,1 2,0 0,9 40 0,088
0,1 2,0 0,9 60 0,103
0,1 2,0 0,9 80 0,117
0,1 2,0 0,9 100 0,133
0,1 2,0 0,9 120 0,146
0,1 2,0 0,9 140 0,161
0,1 2,0 0,9 160 0,175
0,1 2,0 0,9 180 0,189

TABLA 5. Presentación de la variación de la absorbancia con el tiempo para la disolución de 2,0

mL de dopamina.

0,200
0,180
0,160
0,140
absorbancia

0,120 0.5 mL
0,100 1,0 mL
0,080 1.5 mL
0,060
2,0 mL
0,040
0,020
0,000
0 50 100 150 200
t (s)

GRÁFICA 1. Representaremos la absorbancia frente al tiempo.

La actividad de la PPO se determina a partir de la pendiente de zona lineal de la curva de

absorbancia frente al tiempo. Para ello, previamente, deberá calcularse la masa del vegetal (0,02
g) en la muestra mediante la siguiente ecuación:
𝑚𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 𝑐ℎ𝑎𝑚𝑝𝑖ñó𝑛 (10,122𝑔)
𝑚𝑣𝑒𝑔𝑒𝑡𝑎𝑙 𝑒𝑛 𝑙𝑎 𝑚𝑢𝑒𝑠𝑡𝑟𝑎 (𝑔) = 𝑣𝑒𝑥𝑡𝑟𝑎𝑐𝑡𝑜 𝑒𝑛𝑧𝑖𝑚á𝑡𝑖𝑐𝑜 (0,1 𝑚𝐿) ∗ (𝐸𝑐. 1
𝑣𝑑𝑖𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛 𝑖𝑛𝑖𝑐𝑖𝑎𝑙 (50 𝑚𝐿)
Una unidad de actividad (U) de enzima se define como la cantidad de ésta que produce un
aumento de absorbancia de 0.001/min. De esta manera, la actividad de la enzima se puede
expresar en términos de U g vegetal-1.

Actividad enzimática= 𝑚/0,001 (EC.2)

Disolución Actividad enzimática (U

(mL) Pendiente g/vegetal)
0,5 2,48E-04 2,48E-01
1,0 3,48E-04 3,48E-01
1,5 6,00E-04 6,00E-01
2,0 7,30E-04 7,30E-01
TABLA 6. Presentación de los resultados de la pendiente y de la actividad enzimática.

Conclusión: Observando las gráficas de la representación de absorbancia frente a tiempo, y

sabiendo que a medida que transcurre el tiempo la disolución va adquiriendo progresivamente
el color pardo asociado a la oxidación de la dopamina y, por tanto, la consiguiente formación de
pigmento, se puede justificar el aumento de la absorbancia con respecto al tiempo. Además,
observando las pendientes de las diferentes disoluciones, se puede comprobar que, a mayor
concentración de sustrato, mayor cambio hay entre las señales que se obtienen del
espectrofotómetro y, mayor es su pendiente.

También, se concluye que la actividad enzimática es directamente proporcional a la

concentración de sustrato, ya que al aumentar la concentración de dopamina se consigue una
mayor cantidad de enzima activa presente.

Una vez obtenida la actividad enzimática, se prosigue con el cálculo de Km y Rm, para ello, se
utilizará la ecuación de Michaelis-Menten determinados por diferentes métodos: linealización y
ajuste de mínmos cuadrados no lineales.

𝑚𝑔 𝑑𝑜𝑝𝑎𝑚𝑖𝑛𝑎 1 1 𝑚𝑜𝑙
[S]=2 · 𝑉 𝑑𝑜𝑝𝑎𝑚𝑖𝑛𝑎(𝑚𝐿) · 3 𝑚𝑙 · 153,18 𝑔 𝑑𝑒 𝑑𝑜𝑝𝑎𝑚𝑖𝑛𝑎 (EC.2)
𝑚𝑙 𝑑𝑖𝑠𝑜𝑙𝑢𝑐𝑖ó𝑛

𝑟𝑜 = 𝑚(𝑝𝑒𝑛𝑑𝑖𝑒𝑛𝑡𝑒) · 60 𝑠 (EC.3)
 Disolución
SUSTRATO V (mL) C (mg/mL) [S] (mol/L) r (U/min)
1 0,5 0,33 2,18E-03 1,49E-02
2 1,0 0,67 4,35E-03 2,09E-02
3 1,5 1,00 6,53E-03 3,60E-02
4 2,0 1,33 8,70E-03 4,38E-02
TABLA 7. Presentación de concentración de sustrato y velocidad de reacción.

• LINEALIZACIÓN DE LINEWEARVER-BURK:

Atendiendo a la siguiente ecuación (EC.4) y, siendo 1/r la variable y, 1/[S] la variable x, se

obtendrá rm como la inversa de la ordenada del origen y, Km como m (pendiente)·rm:

𝟏 𝑲𝑴 𝟏 𝟏
= + (EC.4)
𝒓 𝒓𝒎 [𝑺] 𝒓𝒎

Lineweaver-Burk
80

70

60
Rm (min/U)

50

40
y = 0,1275x + 10,912
30

20

10

0
100 175 250 325 400 475 550
1/[S] (L/mol)

GRÁFICA 2. Linealización de Lineweaver-Burk.

Siendo éstos los resultados obtenidos:

n 1,09E+01
Rm (U/min) 9,16E-02

m 1,27E-01
Km (mol/L) 1,17E-02
 • LINEALIZACIÓN DE EADIE-HOFSTEE:

Atendiendo a la siguiente ecuación (EC.5) y, siendo r la variable y, r/[S] la variable x, se obtendrá

rm como la ordenada del origen y, Km como la pendiete:

𝒓
𝒓 = 𝒓𝒎 − 𝑲 𝑴 (EC.5)
[𝑺]

Eadie-Hofstee
0,045

0,040
y = -0,0081x + 0,0738
0,035
R (U/min)

0,030

0,025

0,020

0,015

0,010
4,5 5 5,5 6 6,5 7
r/[s] (1/min)

GRÁFICA 38. Linealización de Eadie-Hofstee

Siendo los resultados obtenidos:

Rm (U/min) 7,38E-02

Km (mol/L) 8,10E-03

• AJUSTES POR MÍNIMOS CUADRADOS:

1. Se supone valores de partida para los parámetros a ajustar (rm y KM).

2. Se utiliza esos parámetros para obtener los valores calculados de la variable (r

calculada).

3. Variar los parámetros para minimizar una función objetivo que compare los valores
calculados y los experimentales (F.O. = S(rexp-rcalc)2).
 r expe r calculada (rcal-
[S] (mol/L) (U/min) (U/min) rexp)^2
2,18E-03 1,49E-02 1,25E-02 5,62E-06
4,35E-03 2,09E-02 2,39E-02 9,13E-06
6,53E-03 3,60E-02 3,44E-02 2,45E-06
8,70E-03 4,38E-02 4,41E-02 6,44E-08
F.O 1,73E-05

TABLA 8. Presentación de las velocidades teóricas y experimentales:

Resultados obtenidos mediante el método de ajustes por mínimos cuadrados no lineales:

Km (mol/L) 4,63E-02
Rm (U/min) 2,78E-01

CONCLUSIONES:

Comparando gráficamente los valores experimentales y teóricos, se observa que ambos

valores son similares, por tanto, concluímos que la práctica ha satisfecho el objetivo esperado.

5,00E-02
4,50E-02
4,00E-02
3,50E-02
Rm (U/min))

3,00E-02
2,50E-02
2,00E-02
1,50E-02 EXPERIMENTAL
1,00E-02 Teórica
5,00E-03
0,00E+00
2,00E-03 1,20E-02
[s] (mol/L)

GRÁFICA 4. Comparación entre los valores experimentales con los teóricos.

Comparando los resultados obtendios por los tres métodos empleados (tabla 9), observamos
variaciones entre ellos, esto se debe a errores experimentales y desviaciones de algunos de los
puntos gráficos.

Mínimos
Eadie-Hofstee
Lineweaver-Burk cuadrados
rm (U/min) 9,16E-02 7,38E-02 2,78E-01
Km (mol/L) 1,17E-02 8,10E-03 4,63E-02
Tabla 9. Comparación de los resultados por los tres métodos empleados.