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LABORATORIO DE FISIOLOGÍA #1

MICROSCOPÍA

M.E. GONZÁLEZ PINZÓN; M. LLANES BAQUERO; S. NARANJO ZÚÑIGA

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA. FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y DE ZOOTECNIA.


PROGRAMA DE ZOOTECNIA. ASIGNATURA FISIOLOGÍA VEGETAL
BOGOTÁ D.C.

MARCO TEÓRICO

El microscopio es una herramienta muy útil que revolucionó la ciencia tal como la conocíamos, desde
su invención la humanidad ha tenido grandes descubrimientos y su uso se ha masificado de tal forma
que sería impensable el desarrollo de muchas disciplinas sin él, tal son los casos de la microbiología y
la entomología, también grandes avances en otros innumerables disciplinas en la que destaca la
medicina, ingeniería, cristalografía, química, física, ciencias forenses, bacteriología, etc. Como es el
caso en la fisiología vegetal no es una excepción y este instrumento es fundamental para poder
identificar las partes de las plantas con sus respectivas funciones, además aquellos microorganismos
con los que se establecen relaciones (simbióticas, parasitarias, mutualismo, competencia, entre otras),
por ello en este laboratorio se aprendieron generalidades en el uso del microscopio y la observación de
algunas muestras in vivo tomadas de dos fuentes de agua.

Para contextualizarnos es preciso conocer que existen diferentes tipos de microscopios como señalan
Arraiza, Viguria, Navarro y Ainciburu (2010), los podemos clasificar en dos grandes grupos,
microscopía electrónica y microscopía óptica, esta última tiene dos sub grupos:

-M. Simple: como son las lupas mono y binoculares. Está conformado por sistema de

-M. Compuesto: -Estereomicroscopios: Son microscopios dobles que permiten visualizar las
imágenes con relieve o 3D, la iluminación de estos es por transparencia o por incidencia.

-De luz ultravioleta: Posee una longitud de onda entre 180-400 nanómetros. Esta técnica es bastante
útil en estudio de sustancias que tienen absorción ultravioleta, pues no requiere tinción, aun así suele
tener algunos inconvenientes prácticos.

-De fluorescencia: Según El Instituto de Parasitología y Biomedicina "López-Neyra” (2015) se


conoce el término fluorescencia a una sustancia natural o colorante aplicado al corte que es
estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energía absorbida como rayas luminosas. La luz
fluorescente de mayor longitud de onda se observa como si viniera directamente del colorante.
Para este microscopio en específico existen: una fuente de luz que emite un rango de onda desde el
ultravioleta al infrarrojo por lo cual es común ver barras de protección para evitar lastimar los ojos, un
filtro que delimita la banda de excitación, que normalmente es la ultravioleta, una muestra
fluorescente, después de la cual, encontramos un segundo filtro (“filtro de barrera"), que corta los
restos de la luz de excitación y deja pasar sólo la fluorescencia. Existen tres tipos de esta microscopia:
Primaria, secundaria e inmunofluorescencia.

-De contraste de fases: En base al módulo de docencia del instituto Tecnológico de Chascomús por
Claudia Herrmann (2012) esta microscopia se fundamenta en el retraso de las ondas de luz que al
atravesar objetos de distintos índices de refracción, puede aprovecharlas y convertirlas en índices de
refracciones variables y detectables por el ojo. Se usa principalmente para aumentar el contraste entre
las partes claras y oscuras de las células sin colorear, permite estudios sin fijación de muestras, así
como límites y estructuras internas bastante evidentes (ipb, 2015).

-De campo oscuro: Este tipo de microscopios producen un efecto consistente en un fondo oscuro
sobre el que se ven los objetos intensamente iluminados. El poder ver un objeto depende del contraste
existente entre él y el medio que le rodea, para poderse realizar el campo de visión del objetivo debe
estar en la zona hueca del cono de luz y sólo recoge la luz que se refleja en el objetivo. (Arraizaet al.,
2010)

-De polarización: Son microscopios de luz polarizada, que se construyen a partir de un microscopio
ordinario, colocando un polarizador entre la fuente de luz y el condensador, y un analizador entre el
objetivo y el ocular, usados principalmente en Petrografía y Mineralogía. (Rodak, 2002)

- Deluzreflejada: Según el diccionario de las ciencias de la tierra publicado por la universidad de


Oxford, este microscopio utiliza una fuente de luz que penetra perpendicularmente sobre la superficie
pulida de un mineral opaco, a diferencia de un microscopio convencional que se vería alterado por el
cubreobjetos, es usado principalmente para el estudio de minerales metálicos u opacos.

Para el caso de la microscopia electrónica los dos tipos que más resaltan son los de barrido y de
transmisión, cabe resaltar que la mayoría de microscopias tienen sus técnicas para el montaje de
muestras y pueden variar en dificultad según la finalidad que se desea.

OBJETIVO

Mediante la práctica se busca comprender la importancia del microscopio como una herramienta de
aprendizaje en las ciencias y por ende, identificar las partes que conformar un microscopio, el manejo
adecuado que se le debe brindar a este y aprender a usar más herramientas del mismo como la reglilla
de los oculares y de la laminilla. Además, manejar con seguridad las perillas micrométricas y
macrométricas para lograr una muestra con mayor nitidez y enfoque.

Con respecto a lo anterior, se identificarán algunos microorganismos observados en las muestras de


agua.

1. MATERIALES Y MÉTODOS

Todos los procedimientos fueron realizados en el laboratorio de Fisiología Vegetal del Departamento
de Biología de la Universidad Nacional de Colombia, Sede Bogotá.

Para las prácticas se utilizó un microscopio óptico con oculares 16x, láminas portaobjetos, laminillas
cubreobjetos, papel milimetrado, muestras de agua de diferente procedencia (viveros, lago), pipetas y
alcohol.

1.1. Conocer un Microscopio y Realizar Mediciones

En esta primera práctica se identificaron las partes del microscopio y cómo debían ser usadas para una
correcta observación de las muestras. Seguido de esto, se procedió a hacer mediciones indirectas con
base en el diámetro del campo óptico; para ello se preparó una muestra para ser observada colocando
una gota de agua sobre una lámina portaobjetos y encima de esta gota un pequeño cuadrado de papel
milimetrado (montaje húmedo) de 1 mm de lado. Una vez hecho el montaje primero se utilizó el
objetivo de menor aumento (3.2x), se ubicó la muestra de tal manera que solo el borde de la hoja se
viera en el campo, se leyó la medición en la reglilla que se encuentra en la platina la cual tiene 2
escalas una al lado de la otra, de 0 a 10 µ y la otra de 0 a 40 mm y según los números que coincidan
se lee el tamaño de la muestra en µ después se mueve la muestra hasta que en el campo se vea el otro
extremo del borde de la hoja y se procede a leer nuevamente el número de la reglilla, una vez se
tienen los 2 números se restan y el número final es el tamaño de la muestra , de esta misma manera se
procede con los objetivos de 10 x y 40 x.

1.2. Observar una Muestra de Agua

Para esta segunda parte del laboratorio se montó en una lámina portaobjetos una gota de agua de
diferentes muestras con ayuda de una pipeta (para este caso Vivero 1 y agua del Lago). De la misma
manera anteriormente descrita en el numeral 1.1.

Estando la muestra en el microscopio se procedió a observar primero la gota del Vivero 1 pasándola
por cada uno de los objetivos (3.2x, 10x, 40x) y seguida de esta la gota del Lago.

Para el objetivo 3.2x se no tono en el campo visual una idea general de la muestra sin demasiado
detalle, para el objetivo 10x algunos microorganismos fueron observados y para el de 40x solo
algunas partes eran diferenciables dentro del conjunto.

2. RESULTADOS

2.1 Conocer un Microscopio y Realizar Mediciones

El uso del microscopio óptico se implementó para del siglo XVII cuando el holandés Anton Van
Leeuwenhoek, tallando lentes observó que hay un mundo microscópico el cual el hombre no puede
detallar a simple vista (Caobos, 2012). No obstante, el microscopio fue evolucionando al pasar de los
años, simultáneamente a la tecnología innovadora que la época le ofrecía hasta la actualidad.

De esta manera, el microscopio es un instrumento de precisión muy utilizado en laboratorios, ya que


nos permite la amplificación (desde cien a cientos miles de veces) de organismos que no son
observables a simple vista (Olivas & Alarcón, 2004).

Este consta de dos partes unidas mediante un brazo, la parte mecánica que es la estructura que sirve
como base de la parte óptica, en esta podemos encontrar la columna que se encuentra ubicada sobre la
base rectangular, esta sostiene un tubo cilíndrico y una plataforma que tiene en el centro un orificio de
un centímetro de diámetro aproximadamente. Además, en el microscopio de campo claro con el cual
hemos trabajado, en la parte inferior del platino se encuentra el condensador, diafragma y una
pequeña lámpara que tiene una palanca para graduar la intensidad de luz adecuada para la muestra,
cabe resaltar que estos están ubicados en el respectivo orden dicho anteriormente. (García, 2004)

La parte óptica es aquella compuesta por los lentes lo cuales son el ocular, donde se aproxima el ojo y
los aumentos más utilizados son el de 5x y 10x pero en el caso de la presente práctica de microscopía
utilizamos un ocular de 16x. El segundo lente es el objetivo el cual está más cerca del elemento a
observar, en este está el revólver que se asemeja a un disco que gira y tiene diferentes aumentos según
corresponda (ULA, 2016) en la presente se presentan aumentos de 3.2x, 10x, 40x y 100x.

Por último pero no menos importante, para poder observar con mayor nitidez la muestra es necesario
que el observador la enfoque de manera adecuada, para ello existen dos perillas o mandos mecánicos.
Las perillas más grandes ubicadas en la parte lateral inferior se denominan macrométricos que
permiten desplazamientos grandes entre la platina (donde se encuentra la muestra) y el objetivo, por
otra parte, las perillas pequeñas son los micrométricos que brinda un ajuste mucho más pequeño
(Rodak, 2002)

En el siguiente dibujo digital hecho por el grupo se podrán encontrar las partes del microscopio:

● Pasos para realizar un montaje húmedo

1. Preparar un lámina portaobjetos limpia


2. Tomar una gota de agua (con la ayuda de una pipeta) y colocarla en la parte central de la
lámina
3. Tomar la muestra a tratar (en este caso papel milimetrado) y colocarlo en la gota de agua
4. Ahora se toma una laminilla cubreobjetos y de manera muy cuidadosa se deja caer sobre la
muestra de tal manera que los bordes de esta concuerden con los del portaobjetos y la gota de
agua quede distribuida de manera uniforme sobre la muestra.
5. Por último se toma todo el montaje y se coloca en la platina del microscopio para observarla a
través de los oculares.
● Dibujo de las Observaciones con la Hoja Milimetrada

Tomada de: http://datateca.unad.edu.co/contenidos/201101/curso/imagenes/mil4X.jpg

Se puede notar un poco de la estructura fibrosa del papel y gracias a los cuadrados observados es más
fácil determinar el tamaño del mismo con el método de medición de la reglilla ya mencionado.

En la imagen se puede ver el papel milimetrado a un aumento de 512x en donde aún se pueden
diferenciar las líneas y contarlas; a medida que el objetivo aumenta la muestra se hace menos clara
para observar, por tanto es más sencillo tomar la medida con un objetivo de 3.2x 10x y en dado caso
de ser necesario hacer la respectiva operación para determinar el tamaño a un objetivo mayor.

● Tabla con los valores del objetivo, el ocular, el aumento y el diámetro del campo óptico

Aumento (Objetivo) Ocular Tamaño de la Muestra

3.2x (512x) 16x 4.0 µ

10x (160x) 16x 1.2 µ

40x (640x) 16x 24.1 µ


Tabla N° 1. Resultados de Mediciones con Reglilla del Microscopio

● 3.2x: Borde 1: 93.6 Borde 2: 89.6 (93.6-89.6= 4.0 µ)


● 10 x: Borde 1: 92, Borde2: 90.8 (92 – 90.8= 1.2 µ)
● 40x: 24.1 µ

2.2.Observar una Muestra de Agua

● Fotografías de Microorganismos observados en las muestras


A continuación observaremos las muestras de los microorganismos identificados en el agua
del Lago y en el agua de Vivero con su respectiva descripción.
❖ Muestra de Agua del Lago

Imagen Descripción

Gota de agua con objetivo 3.2x, oculares 16x,


aumento 512x.

Se pueden observar gran cantidad de detritos


del agua dulce del lago, con una coloración
amarillenta clara a café oscura con manchas
negras distribuidas a lo largo de la muestra.

Gota de agua con objetivo 40x, oculares 16x,


aumento 640 x.

A este aumento se logró observar un


microorganismo de forma más bien ovalada, con
muchos cilios y una corona en la parte superior
con vellosidades más cortas en la zona más
delgada. De color verde oscuro con partes
negras y sin ningún movimiento. Según esto se
puede inferir que es un microorganismo ciliado.

Gota de agua con objetivo 10x, oculares 16x,


aumento 160x

La rotífera constituye una división de animales


pseudocelomados microscópicos que miden
entre 0.1mm a 0.5mm. Estos se caracterizan por
tener forma alargada constituído por cabeza,
tronco y pie (dividido en dos dedos).

Gota de agua con objetivo 10x, ocular 16x,


aumento 160x.

Se puede observar una estructura larga a manera


de filamento y delgada que atraviesa todo el
campo, de un color verde claro con
transparencias, con pequeñas divisiones y sin
ningún movimiento.
Dada su morfología se puede inferir que es un
alga.
❖ Muestras Vivero 1

Imagen Descripción

Gota de agua con objetivo 10x, ocular 16x,


aumento 160x.

En la muestra se observó materia orgánica que


formaba una mancha café irregular y tan solo un
microorganismo que por su forma ovalada y con
tricocitos pudiera ser un protozoario; los cuales
se alimentan de materia orgánica.

En ambas muestras se observaron microorganismos de agua dulce los cuales presentan variedad de
formas, pero de los cuales se encontró un mayor número en la muestra del lago en donde tenían
mucha movilidad en el campo y algunos eran de un tamaño muy pequeño ya que incluso en 40x no se
distinguían mayores estructuras.

3. DISCUSIÓN

3.1. Conocer un Microscopio y Realizar Mediciones

a) ¿Para qué sirven el diafragma y el condensador?

El condensador en general es el lente que concentra los rayos de luz hacia el objeto a observar, el
diafragma nos permite regular la cantidad de luz que ingresa al condensador.

b) ¿Cuáles pueden ser las causas de las rupturas de los micropreparados?

Una de las causas principales es el mal manejo de las perillas micrométricas desplazan generalmente
de arriba a abajo la platina, así que, cuando el observador está enfocando la muestra puede estar
pendiente sólo del ocular y sube mucho la platina de tal manera que pegue con el objetivos y se
rompa.

c) ¿Cuáles pueden ser las causas del daño de las lentes de un microscopio?

Básicamente el inadecuado mantenimiento del microscopio, limpiar las lentes con un trapo que sea
poco delicado y haga que la estas se rayen. Por otra parte pueden tener un “error de fábrica” dejando
un espacio entre lentes el cual es un lugar perfecto para albergar hongos causados por diferentes
condiciones en el medio como por ejemplo la humedad
d) ¿Cuáles pueden ser las causas de “un mal enfoque”?

Existen muchas causantes de un mal enfoque como un mal uso del micro y micrométricos, una
inadecuada intensidad lumínica, una muestra muy gruesa, daño de los objetivos, oculares o
condensador, una mala distancia de trabajo, etc.

CONCLUSIONES

En primera instancia, reconocer la importancia del uso del microscopio en las diferentes ciencias y
como gracias a este se han dado diferentes descubrimientos al pasar de los años hasta la actualidad.
Por otra parte, nuestro grupo trabajó con un microscopio óptico de campo de luz, el cual contaba con
cada una de las partes correspondientes tal como lo dice (García, 2004) como lo son la base con su
lámpara de luz y su palanca para la graduación de intensidad, el diafragma, el condensador, los
oculares, los objetivos, etc.

Además, constatamos que para poder observar la muestra con mayor nitidez es importante manejar
adecuadamente las perillas macrométricas y micrométricas (Rodak, 2002)

BIBLIOGRAFÍA

García, V. (2004). Microscopio de Luz: Descripción y funcionamiento. En V. García, Introducción a


la Microbiología (págs. 23-26). Costa Rica: Editorial Universidad Estatal a Distancia (EUNED).

Herrmann, C. (6 de Octubre de 2012). Microscopía. Argentina.

Instituto de Parasitología y Biomedicina "López-Neyra”. (11 de Mayo de 2015). Microscopia a


grandes rasgos.

N.Arraiza, P. V. (2010). Manual de microscopia. AUXILAB, S.L.

Murcia, J. A. (Enero-Abril de 2012). La historia del microscopio (Primera parte). Revista de


divulgación científica y tecnológica de la universidad de Veracruz, XXV(1),
https://www.uv.mx/cienciahombre/revistae/vol25num1/articulos/historia/.

Olivas, E., & Alarcón, L. R. (2004). Microscopio y Microscopía. En E. Olivas, & L. R. Alarcón,
Manual de prácticas de microbilogía básica y microbilogía de los alimentos (págs. 9-10). Editorial de
Universidad Autónoma de Ciudad de Juaréz.

Oxford University (2004) Diccionario de las Ciencias de la Tierra. Microscopio de luz reflejada (pág.
507). Madrid: Editorial Complutence.

Rodak, B. F. (2002). Cuidado y uso del microscopio. En B. F. Rodak, Hematología: Fundamentos y


aplicaciones clínicas (págs. 34-41). Montevideo: Editorial Medica Panamericana.

ULA. (2016). La microscopía: Herramienta para estudiar células y tejidos. Recuperado el 15 de


Agosto de 2016, de Universidad de los Andes Venezuela:
http://www.medic.ula.ve/histologia/anexos/microscopweb/MONOWEB/capitulo4_4.htm
6.ANEXOS

6.1. Conocer un Microscopio y Realizar Mediciones

a) ¿Por qué es importante utilizar un microscopio?

Es fundamental para entender a partir de observación como primera instancia el micro-universo del
que están formadas las cosas y seres que nos rodean, sin el nunca hubiésemos podido comprender por
ejemplo que las células poseen diferentes tipos de organelos, que estas mismas forman comunidades,
tejidos y órganos, tampoco que existen millones de microorganismos, las texturas de diferentes
materiales, anatomía de los insectos, en fin nos permite entender desde un un punto de vista más
exacto muchas situaciones, mecanismos, estructuras con el fin de analizarlas, comprenderlas e incluso
darle solución a muchos problemas que la humanidad ha tenido que enfrentar.

b) Indique algunas diferencias entre dos clases de microscopios.

Microscopio Óptico Microscopio electrónico de barrido


(MEB)

Portaobjetos Vidrio Rejillas de cobre

Capacidad de aumento 15000-2000X 20000X

Tipos de lentes Cristal Electromagnéticos

Poder de resolución 0,2 μm 10 nm o 10000 μm

Observación in vivo si no

imagen o fotografía blanco y negro/ color blanco y negro con posibilidad de


colorear mediante software
especializado

imagenes en 3D No Mediante diversas técnicas como


stereofotometria (4 imágenes),
fotogrametría (2 imágenes)

Precios desde 622.870 a 7.321.879 pueden llegar a valer 1.168.390.564


COP COP, por lo cual se suele alquilar por
horas o fotogramas

c) ¿Qué diferencia existe entre la distancia frontal y la distancia focal?

La distancia focal hace referencia a la distancia que posee el foco de la lente al centro de la misma, es
decir del centro de la lente al punto donde convergen los rayos de luz, este varía según el material del
lente y el medio en el que se encuentra (a mayor distancia focal, la lente posee mayor aumento). En
cambio la distancia frontal hace referencia a la distancia que tiene el objetivo del microscopio a la
laminilla y de forma indirecta afecta al diafragma que cambia la intensidad luminosa con el fin de
obtener una mayor nitidez en la imagen (a mayor aumento del objetivo, menor distancia frontal y
mayor apertura del diafragma).
d) El microscopio electrónico posee mayor poder de resolución que el microscopio óptico ¿por qué?

La principal razón es que mientras el microscopio óptico usa fotones como fuente de luz, el
electrónico usa electrones como fuente y este al poseer una longitud de onda menor permite un mayor
aumento y a su vez en algunos casos con el uso de sensores nos da imágenes más exactas de lo que se
desea analizar.

e) ¿Qué es una escala y cómo se representa?

Una escala es una relación matemática entre una imagen/dibujo y sus dimensiones en la realidad, se
representan en forma de razones que indican el valor en el dibujo y cuanto representa en la vida real,
por ejemplo una escala 2:1 significa que en el plano las medidas son el doble que en la realidad.

f) ¿A cuántos micrones (µm) equivale un m µ?

Una milimicra equivale a la milésima parte de una micra, 1 mµ =0,001 µm por lo cual en una micra
hay 1000 mµ.

g) ¿A cuántos µm equivale un nanómetro (nm)?

Un metro equivale a 1000000000 nanómetros, en cambio un metro es 1000000 µm, por lo cual un
nanómetro es igual 0,001 micras o una micra es igual 1000 nanómetros.

6.2 .Observar una Muestra de Agua

a) ¿Es posible observar preparaciones in vivo con el microscopio electrónico?

Los microscopios electrónicos están encerrados en tubos que se someten al vacío, debido a que la
fuente no son fotones sino electrones y estos podrían chocar con el aire, este vacío exige que la
muestra se deshidrate y se fije, por lo cual no es posible realizar observaciones in vivo.

b) ¿Por qué es importante conocer el tamaño de un organismo microscópico?

Según el fin de análisis del microorganismo conocer su tamaño es fundamental, por ejemplo si deseo
filtrar ciertas bacteria se puede crear filtros con poros de tamaños determinados, también es
fundamental para conocer morfología y clasificación taxonómica, como conocer si un organismo
puede pasar a ciertos sistemas, también en diseño de chips y otros aparatos electrónicos.

c) Calcule el tamaño de un organismo en µm (micrones) con base en los siguientes datos: Diámetro de
campo de visión con el objetivo de 10x= 1.4 mm. El organismo ocupa la mitad del diámetro del
campo de visión con el objetivo de 45x, es decir, es igual al radio.

(10/45)*1,4= 0,311mm que es el diámetro, como el organismo ocupa la mitad mide 0,155 mm que es
igual a 155,55 micras.