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Practica 3.

BIOQUÍMICAS DE LAS PROTEÍNAS

INTRODUCCIÓN

Dada la importancia que tienen las Proteínas y los Aminoácidos, en el desarrollo de todos
los seres vivos y en el sostenimiento de la vida, se hace imprescindible para el área de la
bioquímica no solo su estudio por medio de textos, sino también por medio de la asistencia
al laboratorio de bioquímica en donde podemos traducir el conocimiento escrito en
practicas reales que nos enseñen la aplicación practica de tales conocimientos y nos
permitan familiarizarnos con sus características más notables.
OBJETIVOS

Entre los objetivos más sobresalientes de esta tercera practica resaltamos los siguientes:
 Comprender los conceptos básicos de Proteína y Aminoácido.
 Conocer la importancia que tienen para los seres vivos.
 Distinguir las tres principales reacciones químicas de los aminoácidos, a saber, las
debidas al grupo carboxilo, al grupo Amino y las del grupo R.
 Conocer y aprender el uso de los diferentes tipos de reactivos y los métodos usados
con ellos para determinar el tipo de Aminoácido o Proteína presente en una
sustancia.
.
Referente teórico de proteínas y aminoácidos.

Las proteínas son uno de los principales componentes de todas nuestras células. Los
aminoácidos (compuestos orgánicos) son los ladrillos de construcción de las proteínas. Los
aminoácidos se agrupan de acuerdo con su comportamiento químico. La síntesis de las
proteínas ocurre mediante la unión entre sí de las cadenas de aminoácidos. Los distintos
aminoácidos imparten diferentes comportamientos químicos en la estructura de
las proteínas. Debido a la presencia de diferentes aminoácidos en las uniones peptídicas
las proteínas reaccionan con una variedad de compuestos formando productos coloreados.

Los aminoácidos tiene tres tipos de reacciones químicas importantes: (1) reacciones debido
a la presencia del grupo carboxilo (COO- ), (2) reacciones debidas al grupo amino (NH), y
(3) reacciones debido al grupo R.
Las reacciones debidas al grupo carboxilo y al grupo amino son generales y se dan para
todos los aminoácidos. Las reacciones del radical R son reacciones específicas; por
ejemplo, cisteína da una reacción para azufre, triptófano da ciertas reacciones de color
debido a que su molécula contiene el grupo indol, tirosina da otras reacciones de color
debido a su grupo fenólico, etc.

Existen reacciones de coloración que son específicas para aminoácidos de esas proteínas y
son importantes tanto para la detección como para el dopaje de aminoácidos y proteínas.
Existen también reacciones generales porque sirven para caracterizar grupos comunes a
todas las proteínas como grupos amino o uniones

Tabla 1 Descripción de reactivos y métodos.


Método Descripción Desventajas
Biuret Gornell AG, C. J. Bardawill, and M. M. El método se usa para
DAVID. Determination of serum proteins soluciones que tienen de 0.5
by means of the biuret. reaction. J. BioZ. a 10 mg proteína/ml.
Chem. 177: 751-766, 1949
Se basa en la reacción de sales de Cu+2
Es un método poco sensible.
con moléculas que contienen más de dos
Es útil cuando se quiere
enlaces peptídicos en un medio alcalino; el
analizar grandes lotes de
cobre es reducido a Cu+ formando
proteína.
complejos color púrpura que tienen un
máximo de absorción a 540 nm.
Lowry Lowry, OH, NJ Rosbrough, AL Farr, and
RJ Randall. J. Biol. Chem. 193: 265. 1951

Este es un método muy


Resulta de la reacción de Biuret sobre los sensible, por lo que permite
enlaces peptídicos, además de la reducción trabajar con soluciones muy
del reactivo de fosfomolibdato- diluidas de proteínas (0.02 -
fosfotungstato (Folin-Ciocalteu) por las 0.5 mg proteína/ ml)
proteínas pretratadas con cobre en medio
alcalino, dando una coloración azul,
determinado a 650 nm.

El Cu+ y los grupos R de la tirosina,


triptofano y cisteína reaccionan con el
reactivo de Folin, produciendo un producto
inestable que es reducido a azul de
molibdeno/tungsteno.
Bradford Bradford, M. M. (1976) Anal. Biochem. Muestra interferencias con
72, 248 detergentes

Basado en el Azul Brillante de Coomasie


G-250 cambia de rojo a azul, al unirse a
residuos aromáticos y arginina en las
proteínas.
La reacción entre el colorante y la proteína
es muy rápida (aproximadamente 2 min), y
el completo proteína-colorante permanece
disperso en solución por un tiempo
relativamente largo.
Rango de detección: 0.5-10 mg
proteína/ml.

PROCEDIMIENTO Y MATERIALES
Tabla 2 Materiales y Materiales y reactivos.
Reactivos Materiales Cantidad
Reactivo ninhidrina Tubos de ensayo (140 mm*14mm) 15
NaOH Gradilla 2
Sulfato cúprico (CuSO) Pinza para tubos 2
Ácido acético(CH3COOH) Pipetas Pauster con bulbo 4
Cloruro de sodio (NaCl) Beaker o vaso precipitados de 500 mL 5
albúmina Estufa 1
Ácido nítrico (HNO3) Cámara de flujo laminas 1
Hidróxido de sodio (NaOH) Pipetas vidrio 0.5 ml, 1 ml, 5 ml 10 ml. 4
Acetato de Plomo Pera de goma para pipetas 4
α Naftol Vidrios reloj grandes
Hipoclorito de sodio Probeta 100 ml
Reactivo de Hopkins- Cole Balón aforado de 25 ml
Ácido sulfúrico (H2SO) Agitador de vidrio
Reactivo de Millón Balanza analítica
Aminoácidos: Glicina, tirosina, Espectrofotómetro
triptófano, fenilalanina y arginina
Fenol Micropipeta 10 μL
Albumina de huevo Micropipeta 20- 200 μL
Agua destilada Micropipeta 20- 200 μL
Ácido fosfórico Micropipeta 200-1000 μL
Etanol 1 caja con puntas de 200 μL (amarillas)
para micropipeta
1 caja con puntas de 200 μL (amarillas)
para micropipeta
1 caja con puntas de 1000 μL (azules)
para micropipeta.
Agitador vórtex múltiple para tubos
REACCIÓN DE BIURET
Entre las reacciones coloreadas específicas de las proteínas, que sirven por tanto para su
identificación, destaca la reacción del Biuret. Esta reacción la producen los péptidos y las
proteínas, pero no los aminoácidos ya que se debe a la presencia del enlace peptídico CO-
NH que se destruye al liberarse los aminoácidos. El reactivo de Biuret lleva sulfato de
Cobre (II) y sosa. El Cu, en un medio fuertemente alcalino, se une con los enlaces
peptídicos formando un complejo de color violeta (Biuret) cuya intensidad de color
depende de la concentración de proteínas.
Tabla 3 Procedimiento a realizar para la reacción de Biuret.
Tubo Cantidad Reactivo Procedimiento Cada tubo
CuSO4 al 1% Preparar los tubos de
con 3 mL de
ensayo.
solución de + 4 a 5 gotas de solución
1
Albúmina de  de CuSO4 al 1%
hidróxido
huevo 1%
sódico Añadir de 4 a 5 gotas de +
solución de CuSO4al 1%
con 3 mL de 2 ml hidróxido sódico
CuSO4 al 1%
solución de 
aminoácidos +
2 Añadir 2 ml de solución de
Tirosina,
hidróxido hidróxido sódico al 20%.
Triptófano o
sódico
Fenilalanina. 
CuSO4 al 1% Agitar para que se mezcle.
con 3 mL de + 
3
Leche 1%
hidróxido Observar y tomar apuntes
sódico de los cambios.
CuSO4 al 1%
con 3 mL de con 3 mL de solución
+ respectiva
4 Aceite de
cocina hidróxido +
sódico
Agitar y observar color
CuSO4 al 1% violeta, azul o
amarillo.
con 3 mL de +
5
Glucosa
hidróxido
sódico
REACCIÓN DE AMINOÁCIDOS AZUFRADOS
Se pone de manifiesto por la formación de un precipitado negruzco de sulfuro de plomo. Se
basa esta reacción en la separación mediante un álcali, del azufre de los aminoácidos, el
cual al reaccionar con una solución de acetato de plomo, forma el sulfuro de plomo.
Tabla 4 Reacción De Aminoácidos Azufrados, Grupos SH.
Tubo Cantidad Reactivo Procedimiento Cada tubo
hidróxido sódico Preparar los tubos de ensayo. 2 ml
con 3 mL de hidróxido
solución de +  sódico
1
Albúmina de acetato de plomo Añadir 2 ml de solución de
huevo 1% +
hidróxido sódico al 20%.
solución de
 acetato de
con 3 mL de hidróxido sódico
solución de Añadir 10 gotas de solución plomo al 5%
aminoácidos + de acetato de plomo al 5%
2 +
Tirosina, acetato de plomo
Triptófano o 
Fenilalanina. Calentar el tubo hasta
hidróxido sódico ebullición.

+ 
con 3 mL de
3
Leche 1% acetato de plomo Observar y tomar apuntes de
los cambios.

 con 3 mL de
hidróxido sódico
solución
con 3 mL de + respectiva
4 Aceite de El precipitado de color
cocina acetato de plomo negruzco indica que se ha +
formado sulfuro de Calentar el
Plomo, utilizándose el azufre tubo hasta
hidróxido sódico
de los aminoácidos ebullición.
con 3 mL de +
5
Glucosa acetato de plomo
DETERMINACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE PROTEÍNAS: MÉTODO DE
BRADFORD.

Práctica sugerida de acuerdo a la disposición de los recursos.


INTRODUCCION

Existen varios métodos para determinar la concentración de proteínas de una muestra, tales
como la determinación de la absorbancia a 280 nm, o mediante la formación de derivados
coloreados de las proteínas, base de los métodos de BIURET o de LOWRY. En estos casos
se forma un complejo coloreado de cobre con el enlace peptídico; en el método de Lowry,
además del complejo anterior también se forma un derivado de las tirosinas que contribuye
a la absorbancia total.

El método de Bradford se basa en el empleo de emplea un colorante hidrofóbico cuyas


disoluciones acuosas en presencia de ácido fosfórico tienen un color pardo y que, al
encontrarse en el entorno hidrofóbico del interior de una proteína, origina un color azul
intenso que se puede medir fácilmente. Este método depende, pues de la interacción
relativamente inespecífica entre un colorante hidrofóbico y las proteínas, por lo que es
relativamente sensible a la presencia de contaminantes tales como restos de detergente y
líquidos orgánicos como el metanol.

La determinación de proteínas por el método de Bradford consiste en la cuantificación de la


unión de un colorante, el Azul de Coomassie G-250, a la proteína, comparando esta unión
con la de diferentes cantidades de una proteína estándar (Albúmina de Suero Bovino
(BSA)). La cuantificación se hace midiendo la absorbancia en un espectrofotómetro, a 595
nm, y graficando la absorbancia vs la concentración de proteínas, obteniendo una curva de
calibración de la proteína estándar. Con esta curva de calibración, se puede interpolar la
concentración de proteínas en una muestra al medir su absorbancia a 595 nm.

1- Reactivo de Bradford
Azul de coomasie G-250 5 mg
Etanol 2.5 ml
Ácido fosfórico 5 ml
Agua Hasta 50 ml
Mezclar en el orden indicado, disolver con agitación y a continuación filtrar
2-Patrón de albúmina. Disolver 10 mg de albúmina bovina en 10 ml de agua destilada, con
lo que tenemos una disolución madre con una concentración de 1 mg/ml.

1-Preparar la curva patrón de albúmina bovina en un rango desde 0 hasta 60 µg; de tal
manera que el volumen final en cada tubo sea de 300 µl.
Mezclar para ello el volumen adecuado de la disolución madre de albúmina bovina de un 1
mg/ml y el correspondiente volumen necesario de agua, de acuerdo con la siguiente tabla.

METODO

1- Preparar la curva patrón de albúmina bovina en un rango desde 0 hasta 60 µg; de tal
manera que el volumen final en cada tubo sea de 300 µl. Mezclar para ello el
volumen adecuado de la disolución madre de albúmina bovina de un 1 mg/ml y el
correspondiente volumen necesario de agua, de acuerdo con la siguiente tabla.
2-
Tabla 5 Preparar la curva patrón de albúmina bovina en un rango desde 0 hasta.
µg (prot) 0 10 20 30 40 50 60
µl (alb) 0 10 20 30 40 50 60
µl (agua) 300 290 280 270 260 250 240
µl total 300 300 300 300 300 300 300

2-Preparación de tres diluciones de la muestra problema:


Hacer una dilución 1:20 de la leche comercial; a continuación, realizar las diferentes
diluciones de acuerdo con la siguiente tabla.

Tabla 6 Preparar la curva patrón de albúmina bovina en un rango desde 0 hasta


Leche diluida A B C
V. leche (µl) 20 25 30
V. agua (µl) 280 275 270
V. total 300 300 300
Finalmente añadir 3 ml del reactivo de Bradford a todos los tubos; tanto a las diluciones
que contienen la albúmina como a las que contienen la leche diluida. Agitar los tubos y a
continuación proceder a la lectura de la absorbancia a 595 nm en el colorimetro.

RESULTADOS
1- Elaboración de la recta patrón. Para ello representar en el papel milimetrado adjunto
la absorbancia de cada uno de los tubos que contenían albúmina bovina frente a la
cantidad de proteínas correspondiente. Si se dispone de una calculadora con
capacidad para hacer rectas de regresión, compruebe el coeficiente de correlación de
la recta obtenida. En cualquier caso determine la pendiente de la recta.

2- Para las tres diluciones del problema, interpolar la absorbancia obtenidas sobre la
recta representada para saber la cantidad de proteínas presentes en cada una de ellas.
Alternativamente, haga el cálculo mediante la pendiente de la recta.

3- Teniendo en cuenta los volúmenes de muestra usados en cada caso y teniendo en


cuenta la dilución realizada, calcúlese la concentración de proteínas en la muestra
analizada. Dar el resultado en gramos de proteínapor 100 ml de leche.
PREGUNTAS:

¿Cuáles son los principales métodos colorimétricos usados en la determinación de


proteínas?
ensayo absorción mecanismo límite de ventajas desventajas
detección

incompatible
pequeño volumen condetergentes y
absorción de
absorción 0.1-100 de muestra,
280 nm tirosina y agentes
UV ug/ml rápido,
triptófano desnaturalizantes,
económico
alta variabilidad

reducción de compatible con


cobre (Cu2+ a detergentes y compatibilidad con
ácido 20-2000
562 nm Cu1+), agentes agentes reductores
bicinconínico ug/ml
Reacción del desnaturalizantes, baja o nula
BCA con Cu1+ baja variabilidad
formación de
complejo
Bradford o
entre el compatible con
azul brillante 20-2000 incompatible con
470 nm colorante azul agentes
de ug/ml detergentes
brillante de reductores, rápido
Coomassie
Coomassie y
las proteínas
reducción de
cobre por
incompatible con
proteínas,
detergentes y
reducción de
10-1000 alta sensibilidad y agentes
Lowry 750 nm Folin
ug/ml precisión reductores,
Ciocalteu por
procedimiento
el complejo de
largo
cobre con
proteína

¿Cuál es la reacción de un alfa-aminoácido y ninhidrina?

La ninhidrina es específica para aminoácidos y proteínas, para diferenciar entre


carbohidratos y aminoácidos y proteínas. Reacciona con todos los α-aminoácidos
contenidos en la proteína dando lugar a la formación de un complejo color purpura cuyo
pH se encuentra entre 4 y 8, a excepción de la prolina e hidroxi-prolina que dan lugar a
complejos de color amarillo. Este complejo colorido (llamado púrpura de Ruhemann) se
estabiliza por resonancia, el cual es independiente de la coloración original del aminoácido
y/o proteína. Esta prueba es positiva tanto para proteínas como para aminoácidos. Por
ejemplo, en aquellos casos donde la prueba de Biuret es negativa y positiva la de
Ninhidrina, indica que no hay proteínas, pero si hay aminoácidos libres.
¿Cuál es la reacción con el reactivo de Biuret?
Esta reacción la producen los péptidos y las proteínas, pero no los aminoácidos ya que se
debe a la presencia del enlace peptídico CO-NH que se destruye al liberarse los
aminoácidos. El reactivo de Biuret forma un complejo de color violeta (Biuret) cuya
intensidad de color depende de la concentración de proteínas.

¿Qué proteínas dan positivas con la prueba de Hopkins-cole?


La reacción de Hopkins-Cole, también conocida como reacción de Adamkiewiczs, es
una prueba estándar para el triptófano y para las proteínas que contienen triptófano. La
solución que se va a examinar se mezcla con ácido glioxílico y se agrega ácido
sulfúrico concentrado. Un anillo entre violeta y rojo en la unión de los dos líquidos indica
que la reacción es positiva
1.¿Cómo se manifiesta la desnaturalización de la clara de huevo?
En forma rápida, podemos resumir que se manifiesta al cambiar sus propiedades por efecto
de un agente externo, como un ácido, una base o una sal como cloruro férrico.
La clara se vuelve opaca porque las proteínas se descomponen o se desnaturalizan.

2. ¿Cuál de los tres agentes utilizados tiene mayor poder de desnaturalización?


Los agentes desnaturalizantes son aquellos factores químicos o físicos que producen la
desnaturalización de las proteínas. Entre los más comunes podemos citar:
- Temperatura
- Ph
- polaridad del disolvente
- fuerza iónica
El ejemplo más famoso para ilustrar la desnaturalización de proteínas es la cocción del
huevo. La clara del huevo está compuesta en gran parte por agua y albúminas, un tipo de
proteínas. Al aumentar la temperatura las proteínas de la clara del huevo se
desnaturalizan, pierden su solubilidad y la clara del huevo deja ser líquida y transparente y
pasa a ser opaca de color blanco y sólida.
La temperatura cuando se eleva, aumenta la energía cinética de las moléculas con lo que se
desorganiza la envoltura acuosa de las proteínas y se desnaturalizan. Así mismo un
aumento de temperatura destruye las interacciones débiles y desorganiza la estructura de la
proteína y se produce la agregación y la precipitación de la proteína.
3. ¿Cómo podríamos saber que una sustancia desconocida es una proteína?
La prueba general para determinar proteínas es la de Biuret, en la que un color violeta
indica positivo. En realidad, se determina la presencia del enlace peptídico --CONH2 unido
a otro --CONH2. Pruebas físicas sencillas como la coagulación y precipitación en sales
neutras, también confirman la presencia de proteínas

4. ¿Qué coloración da la reacción del Biuret?


El reactivo de Biuret forma un complejo de color violeta (Biuret) cuya intensidad de color
depende de la concentración de proteínas.

5. ¿Una proteína coagulada podría dar la reacción del Biuret?


Por supuesto que puede darse, ya que el reactivo de Biuret reacciona con proteínas
independiente de su estado, ya sea solidas o liquidas.

6. Si se realiza la reacción del Biuret sobre un aminoácido como la Glicina ¿es


positiva o negativa? ¿Por qué?
La reacción será negativa.
Porque al analizar un solo aminoácido, no hay ningún enlace peptídico puesto que este
enlace seda entre aminoácidos (plural), y la reacción dará positivo cuando exista este enlace
coordinándose en el Cu en medio alcalino
CONCLUSIONES

Este trabajo practico nos ha permitido entender mejor la importancia de los aminoácidos y
las proteínas en los procesos celulares más importantes, incluido la replicación y
duplicación del ADN y su relación con las funciones de ARN. Además, pudimos ver en el
laboratorio los procesos obtenidos en las reacciones químicas usando reactivos para
determinar la composición proteica y aminoácida en las sustancias estudiadas