Brettanomyces:

Mitos y Realidades

Pascal CHATONNET* ; Alvin Miranda** y Antonio PALACIOS***

* **
Laboratoire EXCELL, Parc Innolin, 10 rue du golf, 33700 MERIGNAC, France,. Laboratorio Excell Sudamérica,
***
C/ Magdalena 275, Santiago de Chile, Chile; Laboratorio Excell Ibérica, C/ Planillo Nº 12, 26006 Logroño, La
Rioja. Tel. 941-445106, excelliberica@labexcell.com. www.labexcell.com

1-. Introducción:

Brettanomyces es una levadura conocida ya desde hace mucho tiempo, pero de forma extensa solo
recientemente. Es un concepto que no puede dejar de estar sometido a las modas, polémicas, mitos,
contradicciones y correcciones milagrosas que surgen como legiones salvadoras y que contribuyen a
complicar enormemente un problema grave, pero tan complejo, que algunos prefieren no creer que
existe... La abundancia de información sobre el tema de diversa índole y calidad afecta a su gestión y
a la solución del problema Brettanomyces, centrado principalmente en los vinos tintos. Este artículo
tiene por objetivo poner el punto sobre los elementos claves que pueden influir significativamente
en el desarrollo de este microorganismo en los vinos e identificar las herramientas prácticas y
eficaces para el control de su desarrollo.

Es una levadura descubierta inicialmente en la cerveza por Claussen (1905)1 y en la fermentación de

mostos (Kufferath, 1921)2 y finalmente en vinos, por Custer (1940) y por Peynaud y Domercq (1956)3.
Esta levadura, que pertenece a la familia de Saccharomycetaceae (tales como Saccharomyces) existe
en vinos principalmente a través de la especie bruxellensis sp. Fue descrita originalmente como
problemática debido a su capacidad de re-fermentación en vinos dulces y por la interferencia
ocasionada durante la fermentación alcohólica de Saccharomyces sp. formando alta cantidad de
ácido acético. De hecho, si este problema ya existe con Brettanomyces, la alteración mucho más
común y potencialmente más problemática es muy diferente. En efecto, esta levadura es capaz de
descarboxilar los ácidos cinámicos naturalmente presentes en uvas y en vino (ácido p-cumárico,
ferúlico y cafeico) produciendo los vinil-fenoles, luego reducirlos en etil-fenoles (4-etil-fenol
principalmente , 4-etil-guayacol y secundariamente 4-etil catecol) que se acumulan en el vino. Estas
moléculas volátiles son olorosas y muy estables, capaces de comunicar el carácter aromático llamado
en vino "fenolado", muy característico de lo que finalmente llamamos familiarmente el carácter
"Brett". El contenido en precursores de etil-fenoles nunca es un factor limitante, todos los vinos
contienen suficiente ácido p-cumárico (el ácido cinámico más abundante) para producir varios
miligramos de 4-etil-fenol por litro. Después de varios años de controversia innecesaria y con una

1
capacidad de producción variable en función de las cepas, se ha demostrado4 que sólo
Brettanomyces es capaz de formar en vinos tintos grandes cantidades de etil-fenoles causando el
carácter "Brett".

El carácter "fenolado" o "Brett" es relativamente común en vinos tintos y afecta gravemente a las
variedades aromáticas más típicas. Es aquí donde principalmente, por no escribir únicamente, que
Brettanomyces es un problema grave en la enología. En efecto, si dejamos a Brettanomyces que
evolucione de forma natural en los vinos, ya sea de Burdeos, California, Sudáfrica, Merlot, Syrah o
Tempranillo, al final todos tendrían el mismo aroma! Adiós a la tipología varietal y a la identidad
geográfica. Dicho esto, en cuestión de vinos, lo más importante se centra en los estilos y gustos
diferenciados que podemos encontrar en el mercado. Algunos productores y aficionados aprecian o
buscan este tipo de sabor, no importa, ya se invocó hace tiempo a la "tipicidad" del famoso "terroir"
o de la variedad de uva para explicar el olor de "cuero" y "de orina del caballo" que exhalan estos
vinos: pero esto es el pasado y es sólo el olor de Brettanomyces....

No existen estadísticas fiables sobre la frecuencia de carácter "Brett" en vinos. Sin embargo, sólo los
vinos tintos, veremos por qué más adelante, se ven afectados por este problema. Un análisis
realizado hace algún tiempo en un gran número de botellas5 en el mercado ha mostrado que
aproximadamente un tercio estaban afectadas por un defecto potencialmente detectable en la
degustación (con una concentración de etil-fenol por encima del umbral de percepción en el vino
tinto, que es más de 600 μg/L para la mezcla de 4-etil-fenol/4-etil-guaiacol (en una proporción de 8:1
observada en mayor frecuencia). Parece que la proporción es ahora más importante y que algunas
regiones están más afectadas que otras... Por lo tanto, parece necesario revisar los mitos y realidades
en torno a este sujeto para aportar soluciones prácticas a aquellos que deseen verdaderamente
dominar la contaminación en cuestión.

Figura 1: Representación de puntuación en cata hedónica frente a unidades olfativas de

etil-fenoles de vinos Tempranillo 2008 con crianza en barrica. (cata con la participación
de 4 expertos catadores internacionales).
3,5

3
y = -0,065x + 3,8825
Etilfenoles / umbral sensorial

R² = 0,5085
2,5

1,5

0,5

0
30 35 40 45 50 55 60 65
-0,5
Puntuacion en cata

Como ejemplo práctico y real, en el gráfico de la figura 1 se muestra la representación de 13 vinos de

la variedad Tempranillo 2008 con crianza en madera catados a ciegas por 4 expertos en análisis
sensorial de carácter internacional mediante evaluación hedónica. Se representan sus puntuaciones
frente a las unidades olfativas calculadas según la concentración de etil-fenoles en relación a su
umbral de percepción. Como se puede observar, parece que para obtener una alta valoración

2
cualitativa del vino si es necesario mantener una concentración baja de etil-fenoles, sin embargo, su
ausencia o baja concentración, no garantiza el éxito. Por esta última razón el coeficiente de
correlación de la recta no es muy elevado.

2-. Ecología y origen de Brettanomyces en los vinos:

Este problema fundamental ha sido, desgraciadamente, tratado de forma polémica en los últimos
años, provocando muchos malentendidos y confusiones entre los profesionales. En primer lugar, el
microorganismo ha sido descrito como una "infección por levaduras", un término que sugiere que su
presencia se produce solo en vinos anormales o excepcionales, lo que no es del todo razonable o
cierto. De hecho, esta levadura está presente en todos los ambientes fermentativos o casi, vino
incluido. Entonces, varios estudios se han esforzado para demostrar que las uvas vienen ya repletas
de Brettanomyces, para sugerir que es la viña el origen principal de la fuente de "contaminación".
Obviamente, Brettanomyces no ha llegado de Marte en una nave espacial o incluso en un meteorito.
Sin embargo, todos los estudios ecológicos dejan claro que la frecuencia de detección de esta
levadura en la uva es baja o muy baja (0-3 % de las levaduras presentes en uva) en la gran mayoría de
los casos. Es sólo en configuraciones específicas, es decir (I) uva más o menos alterada con pérdida
de la integridad de su película6, o (II) en el caso de las parcelas posicionadas a favor del viento de las
fuentes de contaminación masiva (vertidos de bodegas elaboradoras o envasadoras) que pueden
llegar a tener poblaciones y consiguiente existe la posibilidad de presentarse como un problema para
la bodega posteriormente. Estas situaciones poco comunes deben ser identificadas de forma
temprana para programar un sulfitado de la cosecha a un nivel mayor de lo normal (7-8 g/hL) y luego
realizar una inoculación con un cultivo iniciador masivo conocido para poder controlar la vinificación
industrial y evitar las contaminaciones.

Pero en otras situaciones, ¿cuál es la fuente de contaminación por Brettanomyces? Bueno, como
todos los microorganismos responsables de la transformación de la uva en vino: pueden ser los
equipos de bodega! Sin embargo, Brettanomyces está muy poco presente o ausente, debido a que la
microbiota del proceso fermentativo, levaduras fermentativas y bacterias lácticas, normalmente se
multiplican más rápidamente que ella. Sin embargo, las características de su metabolismo y la
capacidad de adaptación a las condiciones difíciles, como en el caso de paradas o accidentes en la
ralentización de la cinética fermentativa, donde rápidamente pueden colonizar el medio y luego
producir diferentes alteraciones.

Comenzamos explicando el mayor desarrollo observado en ocasiones en barricas de roble nuevas8,

en sospecha por algunos enólogos como una fuente de contaminación potencial de los vinos al
fomentar el crecimiento de Brettanomyces desde un punto de vista técnico. De hecho, no es así! La
explicación es muy diferente. En primer lugar, Brettanomyces no es parte de la microbiota normal de
la madera. Además, las barricas se calientan en su fabricación entre 150 y 230 °C, lo que conduce a
su esterilización si es que estuviesen contaminadas... La cantidad de azúcares asimilables por
Brettanomyces liberados por la madera nueva es sólo una cantidad pequeña comparada con la que
existe ya de forma natural en los vinos2. Las barricas viejas siguen siendo una fuente mucho más
importante de contaminación que las nuevas, ya que contienen potencialmente inoculo y además,
pueden contener etil-fenoles en su masa porosa. Sin embargo, con la presencia potencial en el vino
inicialmente contaminado (es decir, en casi todos los casos como se explicó anteriormente), y

3
destacando que la cinética de desaparición de dióxido de azufre libre durante la crianza como único
antiséptico activo, es más rápida en barricas nuevas que en las usadas (potencial oxidativo más
elevado, mayor evaporación), resultando entonces activo de forma limitada contra Brettanomyces
(véase más adelante). Así, paradójicamente, se deduce que Brettanomyces en algunos casos pueden
crecer más rápido en las barricas nuevas que en las viejas, incluso a pesar de presentar un inoculo
inicial nulo o mucho más bajo. Entonces, el nivel de dióxido de azufre siempre se debe revisar con
más frecuencia en las barricas nuevas, especialmente de forma temprana durante la crianza, para
evitar sorpresas desagradables.

3-. ¿Cuáles son los factores y prácticas que influyen más en el desarrollo de Brettanomyces en el
vino?:

La maceración pre fermentativa es una práctica que a veces se utiliza para la vinificación de vinos
tintos con el objetivo de promover la extracción de color y de taninos, disminuyendo la velocidad de
la fermentación y obteniendo una fermentación alcohólica más regular. Esta práctica se considera en
algunas ocasiones un riesgo, pero esta afirmación no es exacta si la técnica se realiza correctamente.
En primer lugar, como se mencionó anteriormente, Brettanomyces no forma parte o muy poco de la
microbiota natural de la uva y menos aún, si el sulfitado se ha realizado correctamente para llevar a
cabo esta práctica (> 5 g/hL). Entonces, a no ser que el mosto está infectado de forma temprana (en
uvas alteradas o contaminadas por la bodega), la población de Brettanomyces no es detectable o se
encuentra en minoría (de 5 a 10 % de la microbiota formada por levaduras) a los 5 días de
maceración, que ya es mucho tiempo o al menos excesivo11. Pero si ella se encuentra en esta
población, entonces perdurará! La realización de maceración en frío inicial impone utilizar uva sana
suficientemente sulfitada y enfriada a una temperatura adecuada (<10 °C). En estas condiciones no
hay riesgo de contaminación. Además es aconsejable no manipular la uva por bombeo (para evitar la
contaminación a través del material de bodega) y no pasar de 5 días como tiempo máximo, para así
evitar cualquier riesgo de contaminación inesperada.

Cualquier accidente encontrado en el flujo de trabajo del proceso de fermentación representa una
oportunidad para el desarrollo de Brettanomyces, siendo el microorganismo contaminante
oportunista por excelencia. Los casos de contaminación después de una fermentación no son
infrecuentes, pero es especialmente importante en el caso de retrasos en el sulfitado después o
antes de la fermentación maloláctica, y si ésta presenta una cinética languideciente, el riesgo es más
alto. En estos casos, una inoculación temprana de bacterias lácticas es más que recomendable12,
desafortunadamente en la práctica, la eficacia de esta técnica se ve comprometida por las
dificultades del medio frente a la óptima implantación de las bacterias inoculadas para hacer frente
al problema. Otras alternativas técnicas son posibles, (ver más adelante).

Los factores ambientales influyen en el metabolismo y en el crecimiento de Brettanomyces/Dekkera

sp13. En cuanto a la composición del vino, el contenido de etanol afecta negativamente en la
capacidad de Brettanomyces para crecer, pero no se debe soñar, ya que vinos de hasta 15,5 % de
etanol en volumen puede ser alterados por cepas adaptadas a este tipo de entorno! Un aumento del
pH facilita enormemente la multiplicación de Brettanomyces. El pH de los vinos blancos y rosados,
naturalmente más ácidos (pH < 3,5) normalmente los protege de cualquier desarrollo significativo de
Brettanomyces/Dekkera. Por debajo de 15 °C, el crecimiento se desacelera bruscamente. El aumento

4
de la temperatura favorece la multiplicación hasta 32 °C, lo que explica que la frecuencia de
contaminación es más baja en invierno y aumenta bruscamente en verano. A continuación, se tiende
a pensar que la disminución de la temperatura de las bodegas de crianza muy por debajo de 15 °C
reducirá el riesgo de desarrollo de Brettanomyces. Sin embargo, debe recordarse que la pareja
etanol/dióxido de azufre molecular en su correcto valor, es lo más eficaz en la limitación de las
poblaciones al incrementar significativamente la duración de su fase de latence12. Sin embargo, el
contenido de dióxido de azufre molecular depende, para un pH dado, de la cantidad de SO2 libre y de
la temperatura. Por lo tanto, en gran medida, reducir la temperatura de las bodegas alcanza un límite
en su eficacia muy rápidamente... Además, la reducción de la temperatura puede tener otra
desventaja (en el caso de acondicionamiento con aire seco artificial, el consumo de vino y la
oxidación es mayor, la proporción madera/vino es más importante y la velocidad de evolución del
vino además cambia). Por lo tanto, en la práctica, una temperatura comprendida entre 15 y 17 °C es
la ideal. Más allá de 20 °C, el riesgo de contaminación aumenta exponencialmente y la vigilancia debe
aplicarse en consecuencia al riesgo asumido. A continuación, otros tipos de problemas pueden
ocurrir.

El contenido del vino en azúcar residual es otro factor de sensibilidad positiva. El riesgo de
contaminación aumenta exponencialmente con el contenido de azúcar residual! Brettanomyces es
una levadura capaz de utilizar muchos azúcares diferentes, entre ellos algunos diholosidos como la
trealosa, que puede liberarse al final de la fermentación alcohólica a partir de Saccharomyces (sobre
todo si la levadura esta bajo condiciones de estrés) y durante la crianza sobre lías. Una cantidad
residual de azúcares (glucosa, fructosa, galactosa, arabinosa, sacarosa, trealosa) inferior a 0,35 g/L
puede ser suficiente para permitir el desarrollo de una población (1.000 células/mL) capaz de
sintetizar un contenido de etil-fenoles igual a su umbral de percepción (450 μg/L). Sin embargo, esta
cantidad de azúcar está disponible en una gran mayoría de vinos tintos después de la fermentación
alcohólica y malolactica8. Desde 1 g/L, el riesgo de contaminación aumenta peligrosamente. La
calidad y la velocidad de la finalización de los procesos de fermentación y la limitación de los recursos
energéticos disponibles, son los principales factores de control del riesgo de Bettanomyces.
Entonces, debido a la mayor disponibilidad de determinados sustratos procedentes de las lías y su
efecto protector frente al dióxido de azufre, la crianza sobre lías en vinos tintos sigue siendo una
práctica que indirectamente puede promover el desarrollo de Brettanomyces, por lo que debe
reservarse para situaciones saludables y siempre limitadas en el tiempo. Se recomienda entonces
una retirada de las lías antes del verano. Además, el seguimiento debe ser lo más riguroso posible,
sobre todo si el vino tiene factores de composición favorables (pH > 3,7 en particular).

El roble no es la causa más frecuente de la aparición del carácter "Brett" en vinos envejecidos en
barricas. Sin embargo, es evidente que la estructura micro-porosa de la madera es un refugio ideal
para los microorganismos en general. Las barricas usadas son una fuente obvia de contaminación;
Brettanomyces no solo crece muy bien, como ya hemos citado en las barricas nuevas, sino también
en los depósitos de material inerte. Por supuesto, es mucho más fácil limpiar y desinfectar los
tanques con una superficie lisa que las barricas o las cubas de madera. Así que la investigación en las
técnicas de control de higiene de los recipientes de madera que sean capaces de reducir el riesgo de
desarrollo de este microorganismo durante el envejecimiento de los vinos, es completamente
necesario llevarla a cabo, (ver más adelante).

5
Brettanomyces también puede desarrollarse durante el envejecimiento en botellas más o menos al
azar (o puede verse afectadas la totalidad de las botellas de un mismo lote). Este microorganismo
también ha sido constantemente detectado a partir de vinos viejos embotellados, por lo que reflejan
una notable capacidad para sobrevivir en el tiempo. En la mayoría de los casos, las poblaciones son
extremadamente bajas antes del embotellado. Debido a su resistencia al dióxido de azufre, las
concentraciones usadas en el embotellado no permiten destruir totalmente la levadura residual. Una
vez que el contenido de anhídrido sulfuroso libre de la botella ha disminuido lo suficiente (por la
oxidación natural), Brettanomyces puede volver a crecer y producir los suficientes fenoles volátiles
para causar un daño organoléptico a pesar de partir de una población muy baja. Las condiciones de
control y la eliminación de las poblaciones de forma preventiva, especialmente en estado quiescente
de Brettanomyces (difícil de detectar) representa un reto importante para garantizar el desarrollo
sano de los vinos embotellados, (ver más adelante).

4-. Control preventivo contra Brettanomyces:

 Control de Brettanomyces, lo primero es el viñedo: Esto puede sonar extraño después de lo

escrito, pero el factor agronómico influye en gran medida en el riesgo de contaminaciones
embarazosas. No porque la fuente de inoculación se encuentra en las uvas, sino debido a que
la composición de la uva influye significativamente en la sensibilidad del vino en el desarrollo
de Brettanomyces. De hecho, el desequilibrio en la nutrición mineral de la vid, incluyendo el
exceso de potasio, conduce inevitablemente a un aumento del pH de los mostos y vinos. En
algunos casos, si la acidez no se corrige a tiempo, será imposible utilizar el sulfuroso para
inhibir el crecimiento de Brettanomyces. Por el contrario, la falta de fertilización con
nitrógeno, por ejemplo, la excesiva competencia (mal control de malas hierbas) o el estrés
hídrico excesivo (baja reserva en agua del suelo o riego mal manejado), puede producir uvas
difíciles de fermentar. Sin suplementos correctivos en bodega, las uvas experimentarán una
fermentación lenta o encontraremos situaciones de fermentaciones incompletas, ideales
para promover el desarrollo de Brettanomyces a corto o medio plazo. Por lo tanto, no puede
haber expresión del "terroir" naturalmente en estos casos donde se favorece el desarrollo
de este germen. Es responsabilidad del enólogo y el bodeguero en especial, corregir o
prevenir estas situaciones para así evitar los fenómenos de desequilibrios negativos
posteriormente en el vino.

 Utilización de la sulfitación: El dióxido de azufre es el único antiséptico autorizado en el vino,

pero Brettanomyes/Dekkera es relativamente resistente a este antiséptico. El contenido de
dióxido de azufre molecular activo, el único que tiene propiedades antisépticas, depende
principalmente del contenido de dióxido de azufre libre y del pH (0,2 unidades de pH
equivale a + 50 % SO2 activo); en segundo lugar, de la temperatura (1°C = 7 % de SO2 activo)
y del contenido en etanol del vino (1 % vol. = 5 % SO2 activo). Una concentración de dióxido
de azufre activo molecular de 0,5 mg/L es suficiente para inhibir la proliferación sin impedirla
completamente. De 0,7 a 0,8 mg/L, el contenido se convierte en letal si la temperatura es
suficientemente alta. Así, si un nivel de 25 mg/L es suficiente para controlar el desarrollo de
Brettanomyces a pH 3,60, se necesitará al menos 35 mg/L a un pH de 3,75 y
aproximadamente 60 mg/L a pH 3, 90... Por tanto, es claro que el uso de sulfuroso está

6
 severamente limitado por la acidez real de vino, este parámetro representa un elemento
clave de la "resistencia natural" del vino frente a la contaminación por este tipo de germen.
El sulfitado del vino criado en barricas nuevas debe ser aún más cuidadoso, ya que la
estabilidad de dióxido de azufre en estas condiciones es mucho más aleatorio. El tapón en
posición lateral durante las crianzas prolongadas, la ausencia de relleno como pretexto de
utilizar tapones de silicona más estancos, la reducción de la dosis de dióxido de azufre o la
ausencia de trasiegos regulares para limitar el trabajo en la bodega, son todos factores que
han causado una explosión de contaminaciones en bodega en los últimos años. Por último,
siempre hay que considerar el sulfitado del vino como una herramienta de lucha preventiva y
no como un tratamiento curativo.

 Mechado de barricas: El mechado de las barricas después de su limpieza mediante

combustión de azufre es una práctica a menudo abandonada a causa de su incomodidad, e
incluso recientemente puesta en duda en términos legales. Sin embargo, la acción del
dióxido de azufre gaseoso es particularmente interesante para la desinfección de la
superficie y de los primeros escasos milímetros de las duelas de las barriques9. La práctica del
mechado ha demostrado su eficacia en la prevención de la contaminación por
Brettanomyces cuando otros medios de desinfección (especialmente el vapor) no están
disponibles en bodega. Su sustitución por técnicas alternativas, tales como lavado con agua
ozonizada, está en estudio para verificar si puede o no producir exactamente el mismo
resultado debido a la acción, en parte superficial, del componente activo. Entre los
tratamientos físicos alternativos, incluyendo los físicos, no hay una solución con la sencillez,
la productividad, la eficiencia y el costo competitivo como el mechado básico... Por tanto, se
espera que esta práctica siga existiendo, incluso por un tiempo ilimitado si fuese posible.

Figura 2: Fotografía al microscopio electrónico de células de Brettanomyces en

poros de la madera. Cortesía de Dr. J.A. Scott, School of Chemical Engineering,
University of Bath, Bath, UK. http://www.liddil.com/photo/photo.html

 La higiene y la desinfección de equipos de bodega: Los equipos de bodega y los depósitos

vinarios representan el principal reservorio de Brettanomyces en el vino. Es a partir de estos
reservorios que la contaminación, limitada a un lote de vino en el inicio, puede ser ampliada
a discreción hacia todo el volumen a partir de los movimientos de los vinos y el uso de los

7
 equipos de bodega. La desinfección de los mismos es crucial para el control de estos
gérmenes, pero ninguna desinfección es efectiva salvo después de una limpieza suficiente. La
situación es más complicada en la madera, que tiene un área de desarrollo mucho mayor que
el acero inoxidable o la resina epoxi. Además, este material es delicado y los procedimientos
de limpieza y desinfección no debe degradarla. Se dedicó al tema una publicación especial y
se remite a los lectores a su consulta para obtener toda la información necesaria1.

 Coinoculación levaduras/bacterias lácticas: a pesar de todos los avances en el control de la

fermentación maloláctica, siguen existiendo problemas en su inducción en algunos vinos. La
presencia de alcohol y de otros compuestos tóxicos para las bacterias lácticas que son
productos de la FA, el pH bajo y la competencia con levaduras, hacen del vino un medio
hostil para los cultivos iniciadores. Desde el principio se consideró que la adición de bacterias
lácticas antes de la finalización de la fermentación alcohólica representa un riesgo para que
las bacterias degraden azúcares y provoque el nombrado picado láctico. Algunos autores
(Beelman y Kunkee, 1985; King y Beelman, 1986) han realizado estudios que demuestran que
la coinoculación de las BL con levaduras no sólo no implica antagonismo entre ellas, sino que
incluso las bacterias lácticas se aclimatan mejor. La ausencia de etanol y el contenido en
nutrientes del mosto, consiguen que la población de bacterias lácticas se aclimate mejor al
medio y la fermentación maloláctica se desarrolla mejor, impidiendo además el desarrollo de
Brettanomyces entre ambas fermentaciones, por lo que empieza a ser una práctica cada vez
más popular en bodega aunque solo sea por esta razón.

5-. Control curativo frente a Brettanomyces:

 Tratamientos físicos térmicos: El tratamiento térmico de vino, también llamado flash

pasteurización, es una técnica eficaz para la destrucción de todos los tipos de
microorganismos. Las condiciones de procesamiento deben adaptarse a las características de
resistencia de cada uno. Las características de destrucción térmica de Brettanomyces son
conocidas y dependen de las condiciones ambientales. El tiempo de reducción decimal (R.D.)
es de 0,3 a 0,4 min. a 55 °C cualquiera que sea el estado fisiológico de las células, el factor Z,
que reduce la temperatura de muerte (D.T.) por 10, es de 5 °C. Estos parámetros también se
pueden aplicar a la desinfección térmica de barricas. Pero una vez tratado, hay que
considerar que el vino puede contaminarse de nuevo con facilidad. Además, el
calentamiento del vino durante unos segundos, seguido de su enfriamiento, debe hacerse
perfectamente libre de aire para no causar una oxidación perjudicial. Este proceso es
ventajoso para bloquear un fulgurante desarrollo en los vinos jóvenes, eventualmente dulces
y difíciles de filtrar.

 Tratamientos físicos separativos: La filtración es una técnica clásica llevada a cabo para
eliminar microorganismos. La calidad del resultado depende de la porosidad de los medios
filtrantes, que debe adaptarse a los microorganismos diana. En el caso de Brettanomyces,
especialmente al final de la crianza del vino, las células son pequeñas y requieren un filtro
con un poro de menos de 1 micra (idealmente menos de 0,65 micras) si queremos garantizar
la eliminación total. Es ridículo pensar que la filtración puede afectar negativamente a la
calidad del vino si está bien realizada y bien diseñada. Si la filtración a este nivel de porosidad

8
 afecta gravemente a la calidad, es que esta calidad está basada, por su tamaño, en los
elementos muy poco estables... De hecho, la colmatación es perjudicial para la calidad, es
decir, la filtración sobre presión en un medio de baja porosidad, puede eliminar elementos
positivos para la calidad sensorial. Para evitar afectar la calidad del vino adversamente
durante la filtración, a menudo es necesario proceder a etapas sucesivas de filtración (3 y 1
micras), a una pre-filtración, o a un pre tratamiento enzimático para evitar la obstrucción del
medio y la esterilización del vino16. La medida única de la turbidez no informa sobre la
filtrabilidad real del vino. La determinación del índice de colmatación17 puede ayudar a
adaptar la estrategia para preparar el vino antes de su filtración. Por lo tanto, la filtración
está especialmente recomendada antes del embotellado, cuando el vino tiene un perfil de
riesgo determinado o cuando ha sido detectada la presencia de una población de
Brettanomyces durante un control antes de su trasiego, (ver más adelante).

 Otros tratamientos físicos: Se han propuesto y ensayado otros tratamientos físicos, como la
esterilización UV (germicida UV-A), que no es adecuado para el tratamiento de vinos tintos
debido a la fuerte absorción de la radiación ultravioleta por los polifenoles presentes. El
tratamiento de alta presión (destrucción de células más allá de 200 MPa) es ciertamente
eficaz, pero extremadamente costoso, sin proporcionar suficiente flujo (tratamiento
discontinuo). El tratamiento por electroporación (perforación de las membranas celulares
bajo el efecto de una diferencia de potencial aplicada en una celda en tratamiento continuo)
también tiene cierta eficacia1, pero de nuevo, la falta de equipamiento disponible y los altos
costes de procesamiento, limitan significativamente el valor práctico de esta tecnología
actualmente.

 Utilización del Chitosano: El Chitosano es un polímero natural de N-acetilglucosamina,

derivado de la chitina desacetilada química o enzimáticamente. La chitina se encuentra
especialmente en los caparazones de los crustáceos, cefalópodos y en la pared de los hongos
filamentosos. El tratamiento de la chitina produce el chitosano. Este polímero debe tener un
cierto grado de desacetilación muy especial para ser eficaz vis-a-vis frente a
Brettanomyces/Dekkera. El grado de desacetilación del chitosano también afecta a la
solubilidad y la viscosidad de la suspensión. Actualmente, sólo el chitosano de origen fúngico,
que puede estar acompañado por más o menos -glucanos, se permitepor parte de la OIV
en vinificación... La principal fuente de chitosano en el mundo, a saber, es la fuente animal,
mucho más abundante y menos cara, pero no está sujeto a una aprobación y por lo tanto,
está prohibido. Es probable que el potencial alergénico de los crustáceos en contra de los
hongos sea el motivo de su "no autorización". Sin embargo, el chitosano de los
crustáceos/cefalópodos también se usa ampliamente en la industria de la alimentación y la
farmacia sin restricciones... Por tanto, es válido verificar las posibilidades para que el
chitosano de origen animal sea permitido en su uso enológico, lo que puede abaratar su
utilización. El modo exacto de acción del chitosano es desconocido. Su acción puede deberse
a que este polímero catiónico se une a las paredes de Brettanomyces/Dekkera en receptores
relativamente específicos (efecto físico) y causa una alteración de la integridad de la
membrana (efecto biológico); Saccharomyces sp. o Oenococcus sp. presentes al mismo
tiempo, no se ven afectados, por lo que se puede considerar su utilización durante la
vinificación en el caso de fermentaciones problemáticas o cuando se sufren retrasos en la
finalización de la fermentación maloláctica. Durante la crianza, el chitosano en una dosis de 4

9
 a 6 g/hL puede destruir poblaciones grandes de Brettanomyces en unos pocos días; las
células destruidas entonces no pueden formar etil-fenoles. Sin embargo, dado el carácter
insoluble del chitosano activo vis-a-vis frente a Brettanomyces, su eficacia suele ser más
elevada y posee una mayor duración de la protección en grandes envases que en pequeños
contenedores. Su sedimentación es más rápida en las barricas, por lo que puede requerirse
una puesta regular en suspensión (agitación) para mantener su actividad. Su tendencia a
causar una pequeña desacidificación de los vinos, hay que tenerla en cuenta.

Figura 3: Esquema molecular del polímero de Chitosano.

OH
OH H2N O
O OH O
O
O O OH
O NH2
OH
NH
OH
COCH3

 Utilización de dimetil-dicarbonato (DMDC): Aparte del dióxido de azufre, como el único

antiséptico químico utilizado en el vino, se encuentra el dicarbonato de dimetilo. Este
producto (Velcorin™) se hidroliza rápidamente en el vino y por lo tanto, es pertinente en la
"esterilización en frío" para la sustitución de la filtración o de los tratamientos térmicos antes
de ser el vino embotellado. Uno de los productos de hidrólisis, el metanol, limita la dosis
máxima utilizable, que no puede exceder para que su concentración no sobrepase la máxima
permitida en los vinos tintos (300 mg/L). Este límite de utilización ha sido validado
especialmente como alto... Se debe utilizar por lo menos 250 mg/L (lo que representa una
liberación de más de 110 mg/L de metanol) para asegurar un buen rendimiento frente a
Brettanomyces/Dekkera. También debemos recordar que, por ahora, el uso de DMDC se
limita a los vinos que contienen más de 5 g/L de azúcar residual. Su uso está limitado al
momento del embotellado, pero esta técnica da excelentes resultados a largo plazo y elimina
la necesidad de filtración esterilizante de vinos más difíciles de manejar.

 Utilización de antibioticos: El uso de antibióticos está prohibido desde los orígenes de la

reglamentación en la enología. La natamicina o pimaricina, es una toxina anti-hongos
producida naturalmente por algunas bacterias del género Streptomyces, sin embargo, figura
como un aditivo (E235) utilizado ampliamente en la industria alimentaria (lo que es cierto
sólo para el tratamiento externo de algunos quesos y embutidos secos ...). A pesar de su
eficacia, su uso está totalmente prohibido en el vino. Ha existido una grave crisis ocurrida
recientemente en América del Sur (especialmente en Argentina) por el uso incontrolado de
este producto. El uso de toxinas killer producidas por levaduras pertenecientes más o menos
a la microbiota natural del vino (Kluyveromyces wickerhamii, Pichia anomala) mostró cierta
eficacia en los laboratorios que las experimentaron. Otros péptidos (derivados de la
lactoferrina bovina) también mostraron una toxicidad vis-a-vis, pero con diferentes

10
 eficiencias dependiendo de la cepa. Estas soluciones representan vías interesantes para el
control biológico en un futuro quizás próximos.

6-. Tratamiento correctivos para eliminación de etil-fenoles:

 Clarificación del vino: práctica comúnmente usada en bodega para la limpieza del vino. Para
ellos e pueden utilizar productos adsorbentes de uso in enología: el PVPP a dosis de 60-480
mg/L y el carbón enológico de origen vegetal desodorante a dosis de 15-240 mg/L han sido
utilizados para eliminar en parte el contenido en fenoles volátiles, si bien, las dosis a
emplear para tener resultados significativos, son demasiado elevadas y los efectos
colaterales a nivel organoléptico son importantes por su agresividad sobre el vino. También
se han empleado polímeros de celulosa, como el acetato y propionato de celulosa, con
reducciones del 30%.

 En soluciones modelo el empleo de levaduras secar activas (LSA) como clarificantes han
conseguido eliminar proporciones importantes los fenóles volátiles, sin embargo, las dosis
para conseguirlo son muy elevadas, lo que encarece la aplicación, además de tener también
efectos colaterales sobre la calidad del vino. En esta línea, también se han ensayado cortezas
de levaduras específicas con la idea de tener una mayor superficie absorbente, pero los
resultados no son muy prometedores por el momento.

 La técnica que parece más eficaz en cuanto a la eliminación selectiva de etil-fenoles es la

nanofiltración del vino, donde se puede obtener un permeato con un 35-40% de los etil-
fenoles totales del vino y posterior retención en resinas específicas para que estos sean
eliminados por retención. A modo de ejemplo mostramos los resultados de una prueba
industrial sobre un vino Tempranillo 2009 con crianza en barrica (figura ). El contenido inicial
del vino en etil-fenoles era de 1,4 mg/L, después del tratamiento bajo a 0,81 mg/L gracias a la
retención total de dichos compuestos al pasar a través de la resina específica una vez
obtenido el permeato con nanofiltración tangencial.

Figura 4: Concentraciones de etil-fenoles y valor de acidez volátil del vino y del permeato
antes y después del tratamiento de nanofiltración tangencial y resinas.

1,6
1,4
1,2
1
0,8 Avidez volátil (g/L)
0,6 Etilfenoles (mg/L)
0,4
0,2
0
Permeato Permeato Vino antes Vino
antes después después

11
7-. Medios de diagnóstico y control del desarrollo de Dekkera/Brettanomyces en el vinos

a) Observación microscópica: es a veces evocada como técnica válida para "identificar" la

presencia de Brettanomyces. Por lo tanto, es útil precisar que es totalmente irreal distinguir
de forma precisa, y mucho menos identificar
finamente, qué tipo de levaduras existen en el vino,
ya que no hay tipos morfológicos característicos que
no puedan mudar su forma dependiendo de las
condiciones físico-químicas del vino! Los que
identifican Brettanomyces únicamente mediante
observación al microscopio, son en su mayoría
víctimas de alucinaciones.

b) Análisis de etil-fenoles: permite diagnosticar con claridad la presencia actual o pasada de

Brettanomyces/Dekkera en el vino. Su seguimiento periódico (mensual en verano) durante la
crianza permite, del mismo modo que el seguimiento de la evolución de las bacterias acéticas
por la determinación de la acidez volátil, seguir el desarrollo de las poblaciones de la
levadura contaminante antes de que alcance un umbral crítico. Esta técnica se ha puesto en
marcha para controlar el envejecimiento en barricas desde hace varios años (ej: Suivi Brett®),
es una técnica simple (tomando una muestra representativa de varias barricas) y rápida (24
horas), lo que fácilmente permite reaccionar proactivamente en bodega (trasiegos, sulfitado,
filtrado o ejecución de acciones más enérgicas) de acuerdo con la intensidad del desarrollo
del problema identificado según el cambio de los niveles de fenoles volátiles en el vino.

c) En esta etapa, el control microbiológico es de menos interés. El control microbiológico

durante el envejecimiento del vino es mucho más complicado (toma de muestras estériles),
es una técnica lenta (5-8 días) y difícil de interpretar si procede de medios de cultivo (ver más
adelante). En efecto, porque (I) existen variaciones de una cepa a otra en términos de ajuste
de la cinética de crecimiento y (II), las diferencias en la capacidad de producción de etil-
fenoles de una cepa a otra1, no existiendo una relación clara entre la población viable y el
contenido en fenoles volátiles. En
consecuencia, durante la crianza no
importa finalmente conocer la población de
Brettanomyces/Dekkera, es mejor conocer
la concentración y la evolución del
contenido de etil-fenoles para poder
predecir las consecuencias prácticas en
términos de calidad del vino. Esta técnica
debe ser generalizada en las bodegas que
envejecen vino de alta calidad y tenida en
cuenta en un número importante de
barricas para evitar desarrollos indeseables.

12
d) Control y detección de poblaciones de microorganismos en medios de cultivo: El
conocimiento de las poblaciones Bretanomyces/Dekkera es una práctica indispensable a
realizar antes del embotellado para estimar el riesgo futuro de la desviación en la botella! Es
incomprensible que los vinos pueden hoy en día ser acondicionados sin controles
microbiológicos. La estimación de la población se puede lograr utilizando diferentes técnicas,
pero todas las recogidas de muestras deben realizarse en un vino previamente
homogeneizado de cara a Brettanomyces, ya que no es un germen móvil y por lo tanto,
tiende a depositarse en el fondo de lo recipientes. Si lo que se desea es únicamente la
detección, es mejor no mover el vino y realizar una toma aséptica directamente del fondo de
la barrica o del depósito.

El primer método es la enumeración de poblaciones viables obtenidas después de cultivos en

medios específicos. Esta metodología tiene tres limitaciones principales. La primera es la
especificidad de los llamados medios de cultivo utilizados. Resulta que la gran mayoría de los
laboratorios y medios de cultivo comercializados hoy en día, no son estrictamente los
entornos mas específicos para Brettanomyces/Dekkera. Ellos son (en el mejor de los casos)
mas específicos para levaduras Non Saccharomyces (uso de cicloheximida como agente
selectivo). El vino (especialmente aquellos en barricas) puede albergar hongos que crecen en
estos medios de cultivo (Pichia sp., Hansenula sp., Zygosaccharomycodes, Hanseniaspora
sp.), pero hasta el momento no hay riesgo de producir un carácter "fenol" con estas especies
de microorganismos. El uso de estos medios de crecimiento tiene una tendencia a
sobreestimar la población de estas especies, a veces muy presentes en los vinos muestreados
en barricas. Además, el recuento de células viables en el vino requiere de un período de
cultivo de entre 5 y 8 días, tiempo suficiente para desarrollar una alteración si el vino está
notablemente contaminado... Por último, la enumeración mediante medios de cultivo no
tiene en cuenta "gérmenes viable no cultivable" (VNC), que se corresponden con las células
que están en un estado de estrés fisiológico y son incapaces de multiplicarse en un corto
plazo de tiempo, considerándolas conjuntamente con las células muertas, cuando en realidad
son capaces de multiplicarse en el medio a largo plazo. Los VNC lamentablemente pueden
representar a la mayoría (70-90 %) de los microorganismos
presentes en los vinos cuando están listos para el embotellado
(después de la clarificación, filtración y con los niveles de dióxido
de azufre activo ajustados para reducir al mínimo la presencia
microbiológica en general). De ello, se deduce que cuando se
utiliza la microbiología tradicional existe una subestimación
continua del riesgo real. Si se utilizan, deberá al menos, usarse
los medios más selectivos posibles (ej: Excell Brett medio
selectivo©).

e) Recuento mediante técnicas de biología molecular específicos y rápidos: la técnica

mediante PCR cuantitativa sirve para detectar y cuantificar los gérmenes pertenecientes al
género Dekkera/Brettanomyces, (Reacción en Cadena de la Polimerasa) en tiempo real (RT-
PCR) que permite medir con precisión y sensibilidad (10 células/mL) el número de células
presentes según el número de copias de fracciones específicas amplificadas a partir del

13
 genoma de la levadura. La detección es simultánea a la amplificación, con resultados casi en
tiempo real después de extraer y purificar el contenido de ADN de las células. Los resultados
de laboratorio son obtenidos en el día, lo que es extremadamente útil de cara a la bodega. El
análisis del contenido de ADN de las células íntegras teóricamente puede medir únicamente
las células viables, ya estén en un estado quiescente o no. En la práctica, esta tecnología
tiende a sobreestimar ligeramente la población real, ya que lleva de varios días a varias
semanas entre la muerte y la pérdida de integridad de la célula y la desaparición total del
ADN amplificable. Con la RT-PCR, por lo tanto, se mide el total de las células. Algunos
cambios en el protocolo (EMA-RTPCR) antes de la amplificación (intercalación de bromuro de
etidio mono-ácido) permiten ahora identificar de forma específica las células reales "viables".
Esta técnica (Excell Gen Brett®) es particularmente útil en el control de calidad durante la
preparación de vinos a embotellar para poder determinar la eficacia de una estabilización
microbiológica y especificar, si es necesario, el medio de filtración óptimo. También controla
la eficiencia del proceso en línea antes del final de la construcción de los vinos mediante
mezcla y así poder hacerlo con verdadero conocimiento del riesgo a correr. Con otros tipos
de sondas de ácidos nucleicos, esta misma técnica se puede utilizar para medir (en la misma
muestra y al mismo tiempo) el total de levaduras, ya que algunas de ellas suponen otros
posibles tipos de contaminación (por ejemplo, la levadura Zygosaccharomyces bailli), las
principales bacterias lácticas contaminantes (Lactobacillus sp. y Pediococcus sp.) y las
bacterias acéticas del vino (Acetobacter sp y Gluconobacter).

Figura 5: Curvas de ciclos de multiplicación del DNA espicífico en la identificación de Brettanomyces

en un muestreo y recta de calibración de ciclos umbrales para su cuantificación.

g) Citometría de flujo es una técnica diseñada para el recuento de células de microorganismos

independientemente de su tamaño y estructura (granulometría y densidad) y/o por marcaje
con un anticuerpo específico acoplado a un fluorocromo (sin tinción en sentido estricto). El
fluorocromo es excitado por un láser que emite fluorescencia medible. Esta técnica es
atractiva por su sencillez y velocidad. No obstante, la técnica básica implica generalmente el
empleo de una sonda propuesta que no es específica para Brettanomyces/Dekkera. Los
promotores de esta tecnología distinguen este tipo de germen de otras levaduras por un
criterio de tamaño, suponiendo que las células más pequeña (3 micras) corresponden a
Brettanomyces/Dekkera... Se sabe que su forma estándar o tamaño no es muy fiable en las
condiciones físico-químicas de los vinos. Los gérmenes VNC pueden tener un tamaño
relativamente pequeño, pero también una afinidad por los anticuerpos-fluorocromos baja o

14
 por lo menos variable. De ello, se deduce que la tasa
de detección en el vino por citometría de flujo de
gérmenes sospechosos de ser Brettanomyces es
bastante alta (> 200 células/mL) y la especificidad del
método muy relativa.

h) Técnicas FISH: el desarrollo de los diferentes reactivos

colorantes utilizados en fluorescencia de hibridación in
situ con el ADN (FISH), o mejor, el acoplamiento de
FISH-Ácido nucleico péptico (PNA-FISH) más sensible y
más robusto, permite comprobar por epifluorescencia y citometría de flujo (CMF-FISH) de
forma muy específica y sensible (100 células/mL) la presencia de contaminantes. En una
próxima versión de esta técnica que se está estudiando, se puede distinguir válidamente
células vivas de las muertas mediante el acoplamiento de la tinción de ANP-FISH con una
coloración específica de las células vivientes con la tecnología Backlight™.

i) Alternativas de diagnóstico cualitativas: el test SNIF BRETT® consiste en un medio de cultivo

líquido del vino para la detección de la presencia de Brettanomyces por el aroma de los etil-
fenoles después de varios días de incubación, la intensidad relativa de riesgo es
inversamente proporcional al tiempo de aparición del olor... Sin embargo, detectar el olor de
fenoles volátiles está íntimamente relacionada con la sensibilidad de cada uno y algunas
personas realmente no son muy sensibles a este aroma. Además, como ya hemos
mencionado anteriormente, no existe una relación estrecha entre la producción de fenoles
volátiles y la población de levaduras contaminantes. Por último, el tiempo de respuesta de la
prueba es largo. En conclusión, sólo las pruebas positivas permiten llegar a una conclusión,
pero entonces ya puede ser demasiado tarde... Un resultado negativo con éste método no
concluye con certeza, pero su repetición periódica a corto plazo, puede proporcionar sin
embargo algún tipo de vigilancia que es útil en bodega y puede hacer sonar la alarma para
intervenir con otras técnicas más finas.

j) Técnicas inmunológicas: la detección de Brettanomyces mediante reacción inmunológica de

anticuerpos acoplados a una reacción enzimática coloreada (ELISA) ha sido objeto de varias
tentativas. La única fórmula comercial aparentemente todavía disponible (Z-Z-Brett™ para
enología) utiliza una banda de fluoruro de polivinilideno impregnado con reactivos
inmovilizados en la que se deposita un volumen de vino centrifugado a estudiar. La respuesta
se traduce después de la reacción completa con un color más claro o más oscuro que puede
estar relacionado cualitativamente con la presencia de Brettanomyces, lo que es una
referencia. La prueba es fácil de implementar y lo suficientemente rápida. La sensibilidad se
anuncia ambiciosa (10 o 100 células/mL) pero requiere una concentración significativa de la
muestra por centrifugación para lograrlo, por lo que no es fácil conseguir una buena
reproducibilidad. Además, los anticuerpos son policlonales y en realidad no específicos para
Brettanomyces/Dekkera, reaccionan también frente a Zygosaccharomyces sp, Pichia, Candida
sp... que están presentes de nuevo en los vinos envejecidos en barricas, lo que hace
reaccionar y alterar el resultado mediante la exageración de la respuesta. Esta prueba, por lo

15
 tanto, se asemeja más a un método de detección binario positivo/negativo de poblaciones
de hecho muy altas (> 1000 células/mL).

8-. Conclusión:

El problema Brettanomyces/Dekkera es cada vez más importante en todo el mundo y los elementos
básicos que influyen en su desarrollo en los vinos son conocidos desde hace algún tiempo. Sin
embargo, tal vez debido a un debate innecesario en los últimos tiempos, la proporción de vinos
tintos alterados con un carácter "Brett" se pronuncia claramente en crecimiento. La gestión de
Brettanomyces no necesita normalmente una respuesta o métodos de curación sistemáticos y
excesivamente complejos. No hay duda, y ciertamente no es necesario tratar de prohibir totalmente
en las bodegas a Brettanomyces como microbiota natural, pero sí parece conveniente aprender a
manejarla en un nivel seguro en la elaboración de vino de principio a fin. Para ello, se deben seguir
ciertos principios y reglas de sentido común que ahora están documentados científicamente,
comenzando así en la viña, que es a menudo subestimada, mal entendida o, peor aún, ignorada y a
continuación, llevar a cabo fermentaciones de buena calidad. En medio de todas las herramientas
que se ofrecen a los productores y bodegueros para seguir, analizar y diagnosticar en los vinos la
presencia de Brettanomyces en las diferentes etapas de su desarrollo, es esencial hacer una buena
selección de todas ellas. Una buena profilaxis en la supervisión general y precisa de cada paso, es la
clave para utilizar métodos más adecuados en el control completo de un microorganismo muy
brillante como oportunista y que parece adecuarse perfectamente a las condiciones del vino. El
mínimo error o relajarse, promueve que Brettanomyces/Dekkera siempre esté ahí para llenar un
vacío que la naturaleza aborrece!

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