Purificación de green fluorescent protein (GFP)

1. Introducción:
La GFP (Green Fluorescent Protein, GFP, por sus siglas en inglés), es una
proteína expresada naturalmente en muchas medusas bioluminicentes, fue
aislada de la medusa Aequorea victoria, ha tenido un gran impacto dentro de la
comunidad científica. En octubre de 2008, los investigadores Osamu
Shimomura, Martin Chalfie y Roger Tsien fueron galardonados con el Premio
Nobel de Química por sus trabajos con la proteína verde fluorescente. El
descubrimiento tuvo gran importancia al observar que la GFP conservaba su
propiedad fluorescente incluso dentro de organismos distintos al de la medusa,
lo que representaba una gran ventaja respecto a otros tipos celulares (Chalfie et
al., 1994). El gen que codifica esta proteína, que ya ha sido clonado, se utiliza
habitualmente en biología molecular como marcador. (Perez & Becu, 2009).

La GFP posee 239 aminoácidos y un peso molecular de 26.9 KD, la estructura

terciaria de la proteína tiene la forma de un barril de 40 Å, formado por once
hojas β antiparalelas, en el centro del cual se encuentra una hélice alfa y el
cromóforo fluorescente (Franco & Marinez, 2009).

El cromóforo está formado por tres aminoácidos adyacentes, Ser – Tyr – Gly
(posiciones 65, 66 y 67), los cuales bajo una serie de reacciones de ciclización
forman el cromóforo activo, el cual producirá absorbancia y fluorescencia.
Cuando la luz UV o luz azul impacta sobre el cromóforo, éste toma la energía de
la luz y se excita. En la fase siguiente, el cromóforo se libera de la energía
emitiendo luz en longitud de onda verde (BIO-RAD)
 Cromatografía de Interacción Hidrofóbica (HIC)

Técnica utilizada para separar moléculas hidrofóbicas. Consiste en dejar fluir una
solución de proteínas (Muestra) y una elevada concentración de una sal cosmotrofa, a
través de una fase estacionaria de Sepharosa la cual tiene grupos hidrofóbicos unidos a
su superficie (fenil, metil, butil). Los aniones producto de la disolución de la sal
interactúan con la superficie de la proteína GFP y con las moléculas de agua en su
superficie inmediata. Incrementando la tensión superficial del agua y exponiendo la
región hidrofóbica de la proteína la cual mediante fuerzas de van der wall quedará
anclada a la superficie hidrofóbica de la resina. Soluciones menos concentradas de sal
son utilizadas para eluir a las proteínas.

2. Materiales
 Cepas de E. coli expresando GFP
 Extracto lisado de bacteria con lisozima
 Columna cromatografica (HIC)
 Lámpara de luz UV
 Buffer de Equilibrio (NH4)2SO4 2M
 Buffer de Unión (NH4)2SO4 4M
 Buffer de lavado (NH4)2SO4 1.3M
 TE
 Pipetas
 Tubos
 Gradillas
3. Procedimiento
1. Preparar la columna, agregar 2 mL de buffer de equilibrio a la columna,
dejar gotear hasta que el buffer llegue a la marca de 1 mL.

2. Preparar la muestra, (a) transferir 250 uL del extracto lisado a un

eppendorf limpio, (b) luego agregar 250 uL de Buffer de unión y mezclar.

3. Dejar gotear la columna en un tubo hasta que el buffer de equilibrio llegue al

ras de la resina, en ese momento agregar cuidadosamente 250 uL de la
mezcla extracto lisado + buffer de unión.
 4. Transferir la columna a un tubo 2, agregar 250 uL de buffer de lavado y
dejar que el buffer pase por la columna. Analizar la columna con la lámpara
UV

5. Agregar 750 ul de TE y analizar la columna con la lámpara UV.

6. Analizar los 3 tubos con la lámpara UV.

Referencias:

BIO-RAD. Instruction Manual: Green Fluorescent Protein (GFP) Purification Kit.

http//explorer.bio-rad.com
Chalfie, M; Euskirchen, G; Ward, W; Prasher, D. (1994). Green Fluorescent Protein
as a marker for gene expression. Science. 263 (5148): 802-805.
Perez, M & Becu, D. 2009. La Proteina Verde Fluorescente Ilumina La Biociencia
Medicina Buenos Aires; 69: 370-374
Franco, A. & Longart, M. 2009. Applications of Green Fluorescent Protein (GFP) in
Cell Biology and Visualization of the Nervous System. Revista de Estudios
Transdisciplinarios Vol. 1. Nº 2. Serie verde – Caracas.