Está en la página 1de 25

Manipulación de la expresión génica en procariotas

Un gran número de factores afectan el nivel de expresión de un gen extraño en un


huésped procariótico. Estos incluyen el promotor transcripcional que regula la
expresión del gen objetivo, la región reguladora de la traducción que se encuentra
corriente arriba de la región codificante de cada gen, la similitud de los codones
utilizados por el organismo huésped y el gen objetivo, la estabilidad de ambas
proteínas recombinantes. y su ARNm, el funcionamiento metabólico de la célula
huésped y la localización del gen extraño introducido, así como la proteína que
codifica.

Tabla 6.1 Producción de proteínas humanas recombinantes en varios hospedadores


biológicos

Promotores

El requisito mínimo para un sistema de expresión génica eficaz es la presencia de una


secuencia promotora fuerte y regulable en sentido ascendente a partir de un gen
clonado. Un promotor fuerte es uno que tiene una alta afinidad por la enzima ARN
polimerasa, con la consecuencia de que la región posterior adyacente se transcribe
con frecuencia. La capacidad de regular el funcionamiento de un promotor le permite
al investigador controlar el alcance de la transcripción.

La razón detrás del uso de promotores fuertes y regulables es que la expresión de un


gen clonado bajo el control de un promotor fuerte continuamente activado (es decir,
constitutivo) probablemente produciría un alto nivel de expresión continua de un gen
clonado, que a menudo es perjudicial a la célula huésped porque crea un drenaje de
energía, lo que perjudica las funciones esenciales de la célula huésped. Además, todo o
una parte del plásmido que lleva un gen clonado expresado de forma constitutiva
puede perderse después de varios ciclos de división celular, ya que las células sin un
plásmido crecen más rápido y finalmente se hacen cargo del cultivo. Para superar este
problema potencial, es deseable controlar la transcripción de modo que un gen
clonado se exprese solo en una etapa específica en el ciclo de crecimiento de la célula
huésped y solo por una duración específica. Esto se puede lograr usando un promotor
regulable fuerte. Los plásmidos construidos para realizar esta tarea se denominan
vectores de expresión. Para la producción de proteínas extrañas en células de E. coli,
se usan comúnmente unos pocos promotores fuertes y regulables, incluidos los de
operones de E. coli lac (lactosa) y trp (triptófano); el promotor tac, que se construye a
partir de la región -10 (es decir, 10 pares de nucleótidos en sentido ascendente desde
el sitio de inicio de la transcripción) del promotor lac y la región -35 del promotor trp;
los promotores hacia la izquierda y hacia la derecha, o pL y pR, del bacteriófago λ; y el
promotor del gen 10 del bacteriófago T7. Cada uno de estos promotores interactúa
con proteínas reguladoras (es decir, represores o inductores), que proporcionan un
interruptor controlable para activar o desactivar la transcripción de los genes clonados
adyacentes. Cada uno de estos promotores es reconocido por la forma principal de la
holoenzima de la polimerasa de ARN de E. coli. Esta holoenzima se forma cuando una
proteína, llamada factor sigma, se combina con las proteínas centrales (es decir, dos
subunidades α, una β y una β ') de la ARN polimerasa. El factor sigma dirige la unión de
la holoenzima a las regiones promotoras en el ADN.

Un sistema de expresión comúnmente utilizado utiliza el promotor del gen 10 del


bacteriófago T7 (Fig. 6.1). Este promotor no es reconocido por la ARN polimerasa de E.
coli, sino que requiere la ARN polimerasa T7 para que se produzca la transcripción.
Para que este sistema funcione en E. coli, el gen que codifica la polimerasa T7 a
menudo se inserta en el cromosoma de E. coli bajo el control transcripcional del
promotor y operador lac de E. coli. Las células huésped de E. coli también deben
contener el gen lacI de E. coli, que codifica el represor lac. El represor lac forma un
tetrámero que se une al operador lac y evita que se produzca la ARN polimerasa T7
antes de que sea necesario. Después de la transformación de las células hospedadoras
de E. coli con un plásmido que contiene el gen diana clonado bajo el control
transcripcional del promotor T7, se agrega el compuesto isopropil-β-d-
tiogalactopiranósido (IPTG) al medio de crecimiento. En estas condiciones, IPTG se une
al represor lac, eliminándolo así del operador lac y permitiendo que el promotor lac se
transcriba de modo que la ARN polimerasa de T7 pueda sintetizarse. La ARN
polimerasa de T7 se une al promotor T7 y transcribe el gen de interés. Para garantizar
que la síntesis de la proteína diana no interfiera con el metabolismo celular, agotando
potencialmente los recursos celulares, en ausencia de IPTG, el operador lac se inserta a
menudo entre el promotor T7 y el gen diana, de modo que la expresión del gen diana
también es negativa. Controlado por el represor lac. Con esta disposición de regiones
reguladoras, no hay síntesis del gen objetivo. Sin embargo, tras la adición de IPTG, y
después de un retraso de aproximadamente 1 h, se produce un gran estallido de
síntesis de la proteína objetivo. Si bien las características de las construcciones de ADN
pueden variar cuando se usan otros promotores fuertes y regulables, el diseño
experimental es similar e incluye la entrada de las células huésped en una fase de
crecimiento, cuando la proteína objetivo no se expresa, lo que es seguido por una
inducción. Fase cuando la proteína objetivo se expresa en un nivel alto.
Figura 6.1 Regulación de la expresión génica controlada por el promotor para el gen 10
del bacteriófago T7 (pT7). En ausencia del inductor IPTG, el represor lac producido de
forma constitutiva, el producto del gen lacI, que está bajo el control del promotor lacI,
placI, reprime la transcripción de la ARN polimerasa T7 y el gen diana, ambos negativos
regulado por la unión de cuatro moléculas del represor lac al operador lac (olac). En
ausencia de ARN polimerasa de T7, el gen diana, que se encuentra bajo el control
transcripcional de pT7, no se transcribe. Cuando se agrega lactosa o IPTG al medio, se
une al represor lac, evitando así que reprima la transcripción del gen de la ARN
polimerasa T7 dirigida por el promotor lac (plac) y el gen diana dirigido por pT7. En
presencia de ARN polimerasa de T7, el gen diana se transcribe. TT, secuencia de
terminación de la transcripción. doi: 10.1128 / 9781555818890.ch6.f6.1

Un problema con el sistema de expresión T7 es que con la tasa muy alta de


transcripción de la ARN polimerasa T7 en comparación con la de la enzima nativa de E.
coli (la enzima T7 transcribe el ADN en ARNm ocho veces más rápido), la proteína
recombinante puede no plegarse Adecuadamente y por lo tanto formar cuerpos de
inclusión insolubles. Además, cuando la proteína objetivo es una proteína de
membrana, niveles muy altos pueden ser tóxicos para la célula. Para evitar estos
problemas, es posible regular a la baja (atenuar) la actividad de la ARN polimerasa de
T7 produciendo la inhibidora de lisozima T7. Además, la cantidad de lisozima T7 en la
célula se puede regular de manera definitiva colocando el gen que codifica esta enzima
bajo el control transcripcional del promotor prhaBAD (Fig. 6.2). Este promotor está
regulado por un amplio rango en la concentración de (el azúcar desoxi) l-ramnosa (es
decir, de 10 a 2,000 μM). De este modo, al disminuir la cantidad de ARN polimerasa de
T7, la cantidad máxima de una proteína diana se puede sintetizar sin la producción de
cuerpos de inclusión para proteínas solubles o niveles tóxicos del huésped para
proteínas de membrana.

E. coli no es necesariamente el microorganismo de elección para la expresión de todas


las proteínas extrañas. Sin embargo, la comprensión de la genética y la biología
molecular de la mayoría de los otros microorganismos no está tan bien desarrollada.
Además, no existe un sistema de vector o promotor-represor que proporcione niveles
óptimos de expresión génica en todas las bacterias, o incluso en todas las bacterias
gramnegativas. Afortunadamente, la mayoría de las estrategias que se han
desarrollado para E. coli también son útiles con una amplia gama de microorganismos,
así como con otras células huésped.

Figura 6.2 Atenuación de la actividad de la ARN polimerasa de T7 por el inhibidor de la


lisozima T7. La cantidad de lisozima T7 se controla mediante el nivel de l-ramnosa
agregada al sistema (que activa el promotor prhaBAD). TT, secuencia de terminación
de la transcripción. doi: 10.1128 / 9781555818890.ch6.f6.2

Regulación traslacional

La colocación de un gen clonado bajo el control de un promotor fuerte regulable,


aunque es esencial, puede no ser suficiente para maximizar el rendimiento del
producto génico clonado. Otros factores, como la eficiencia de la traducción y la
estabilidad de la proteína génica clonada recién sintetizada, también pueden afectar la
cantidad de producto. En las células procarióticas, varias proteínas no se sintetizan
necesariamente con la misma eficacia. De hecho, pueden producirse en niveles muy
diferentes (hasta varios cientos de veces) incluso si están codificados dentro del mismo
ARNm policistrónico. Las diferencias en la eficiencia de la traducción y en la regulación
transcripcional permiten que la célula tenga cientos o incluso miles de copias de
algunas proteínas y solo unas pocas de otras.

La base molecular para la traducción diferencial de los ARNm bacterianos es la


presencia de una señal de iniciación de la traducción llamada un sitio de unión al
ribosoma que precede a la porción codificadora de proteínas del ARNm. Un sitio de
unión al ribosoma es una secuencia de seis a ocho nucleótidos en el ARNm que puede
emparejarse con una secuencia de nucleótidos complementaria en el componente de
ARN 16S de la subunidad ribosomal pequeña. En general, cuanto más fuerte sea la
unión del ARNm al ARNr, mayor será la eficacia de la iniciación de la traducción.

Por lo tanto, muchos vectores de expresión de E. coli se han diseñado para garantizar
que el ARNm de un gen clonado contenga un fuerte sitio de unión a ribosoma. La
inclusión de un sitio de unión al ribosoma de E. coli justo corriente arriba del marco de
lectura abierto que codifica la proteína garantiza que los genes procarióticos y
eucarióticos heterólogos se puedan traducir fácilmente en E. coli. Sin embargo, ciertas
condiciones deben cumplirse para que este enfoque funcione correctamente. Primero,
la secuencia de unión al ribosoma debe ubicarse a una corta distancia (generalmente
de 2 a 20 nucleótidos) del codón de inicio de la traducción del gen clonado. A nivel de
ARN, el codón de traducción suele ser AUG (adenosina, uridina y guanidina). En el
ADN, la cadena codificante contiene la secuencia ATG (donde T es timidina) que
funciona como un codón de inicio, y la cadena complementaria no codificadora es una
plantilla para la transcripción. En segundo lugar, la secuencia de ADN que incluye el
sitio de unión al ribosoma a través de los primeros codones del gen de interés no debe
contener secuencias de nucleótidos que tengan regiones de complementariedad y
puedan replegarse (formando bucles intrastrand) después de la transcripción (Fig. 6.3),
por lo tanto Bloqueando la interacción del mRNA con el ribosoma. La estructura
secundaria local del ARNm, que puede proteger o exponer el sitio de unión al
ribosoma, determina el grado en que el ARNm puede unirse a la secuencia apropiada
en el ribosoma e iniciar la traducción. Por lo tanto, para cada gen clonado, es
importante asegurarse de que el ARNm contenga un fuerte sitio de unión al ribosoma
y que la estructura secundaria del ARNm no impida su acceso al ribosoma. Sin
embargo, dado que las secuencias de nucleótidos que codifican los aminoácidos en la
región N-terminal de la proteína objetivo varían de un gen a otro, no es posible diseñar
un vector que elimine la posibilidad de repliegue del ARNm en todos los casos. Por lo
tanto, ninguna región de iniciación traduccional optimizada puede garantizar una alta
tasa de iniciación de traducción para todos los genes clonados. En consecuencia, la
optimización de la iniciación de la traducción debe realizarse sobre una base de gen
por gen.

Figura 6.3 Ejemplo de estructura secundaria del extremo 5 'de un ARNm que evitaría
una traducción eficiente. En este ejemplo, el sitio de unión al ribosoma es GGGGG, el
codón iniciador es AUG (se muestra en rojo) y los primeros codones son CAG-CAU-
GAU-UUA-UUU. El ARNm está orientado con su extremo 5 'a la izquierda y su extremo
3' a la derecha. Tenga en cuenta que además de los tradicionales pares de bases A⋅U y
G⋅C en el ARNm, G también puede emparejarse en cierta medida con U. doi: 10.1128 /
9781555818890.ch6.f6.3
Uso del codón

Mientras que el código genético para los aminoácidos, en promedio, incluye


aproximadamente tres codones diferentes (cualquier aminoácido en particular puede
tener de uno a seis codones), estos codones se utilizan en diferentes extensiones en
varios organismos vivos. Cualquier organismo, por ejemplo, E. coli, produce ARNt
afines para cada codón en aproximadamente la misma cantidad relativa que el codón
particular que se usa en la producción de sus proteínas. Varios organismos utilizan
preferentemente diferentes subconjuntos de codones (Tabla 6.2) y contienen diversas
cantidades de los aminoacil-ARNt afines para la síntesis de proteínas codificadas por
sus ARNm. Por lo tanto, la expresión de un gen extraño en un organismo huésped
particular puede resultar en una incompatibilidad celular que puede interferir con la
traducción eficiente cuando un gen clonado tiene codones que rara vez son utilizados
por la célula huésped. Por ejemplo, AGG, AGA, AUA, CUA y CGA son los codones
menos utilizados en E. coli. Cuando se expresa una proteína extraña.
Tabla 6.2 Código genético y uso de codones en E. coli y humanos

en niveles altos en E. coli, la célula huésped puede no producir suficientes de los


aminoacil-ARNt que reconocen estos codones raramente utilizados, y el rendimiento
de la proteína del gen clonado es mucho menor que el esperado o se pueden insertar
aminoácidos incorrectos en el proteína. Cualquier codón que se use en menos del 5 al
10% del tiempo por parte del organismo huésped puede causar problemas.
Particularmente perjudiciales para los altos niveles de expresión son las regiones de
ARNm en las que dos o más codones raramente usados están cerca o adyacentes a, o
aparecen en, la secuencia que codifica la porción N-terminal de la proteína.
Afortunadamente, existen varios enfoques experimentales que pueden utilizarse para
aliviar este problema. Primero, si el gen diana es eucariótico, puede clonarse y
expresarse en una célula huésped eucariótica. En segundo lugar, se puede sintetizar
químicamente una nueva versión del gen objetivo que contiene los codones más
comúnmente utilizados por la célula huésped (es decir, la optimización del codón). En
tercer lugar, se puede emplear una célula huésped de E. coli diseñada para
sobreexpresar varios ARNt raros. De hecho, algunas cepas de E. coli se han
transformado con plásmidos que codifican genes que conducen a la sobreproducción
de algunos ARNt que son específicos para ciertos codones de E. coli raros. Estas líneas
celulares de E. coli transformadas están disponibles comercialmente y con frecuencia
pueden facilitar un alto nivel de expresión de proteínas extrañas que utilizan estos
codones de E. coli raros (Fig. 6.4). Por ejemplo, con una de las líneas celulares de E. coli
disponibles en el mercado, fue posible sobreexpresar la proteína Ara h2, un alérgeno
del maní, aproximadamente 100 veces más que la cantidad que se sintetizó en las
células de E. coli convencionales. Con este enfoque, debería ser posible producir
grandes cantidades de una variedad de proteínas heterólogas que de otro modo serían
difíciles de expresar en diferentes hospedadores.

Estabilidad de la proteína
La expresión de algunas proteínas extrañas en cepas hospedadoras de E. coli, que
típicamente se cultivan a 37 ° C, a menudo resulta en la formación de cuerpos de
inclusión de proteínas inactivas. Esto ocurre porque la proteína extraña se pliega mal
cuando no puede alcanzar su conformación activa nativa. Se han desarrollado diversas
estrategias, aunque con un éxito limitado, para sortear este problema. El cultivo de
cepas recombinantes a temperaturas más bajas a veces facilita un plegamiento de
proteínas más lento y, por lo tanto, adecuado, lo que a menudo aumenta
significativamente la cantidad de proteína activa recuperable. Sin embargo, las
bacterias mesófilas como la E. coli crecen extremadamente lentamente a bajas
temperaturas. En un estudio, el gen chaperonin 60 (cpn60) y el gen cochaperonin 10
(cpn10) de la bacteria psicrofílica Oleispira antarctica se introdujeron en una cepa
huésped de E. coli, con el resultado de que la cepa de E. coli ganó la capacidad de
crecer y para expresar proteínas extrañas a una tasa alta a temperaturas de 4 a 10 ° C
(Fig. 6.5). Se ha sugerido que a temperaturas por debajo de los 20 ° C, las células de E.
coli no pueden crecer en una medida apreciable como consecuencia de la inactividad
inducida por el frío de varias chaperoninas de E. coli que normalmente facilitan el
plegamiento de proteínas en esta bacteria. . Por lo tanto, transformar E. coli con
chaperoninas de una bacteria tolerante al frío permitió que las proteínas introducidas
desempeñaran las funciones a baja temperatura que las proteínas de E. coli realizan a
temperaturas más altas. Aunque no se alcanzaron niveles muy altos de expresión del
gen clonado, este trabajo es un primer paso importante en el desarrollo de sistemas
de expresión para proteínas que son sensibles a altas temperaturas y que de otro
modo podrían ser difíciles de producir. El siguiente paso lógico en el desarrollo de este
sistema probablemente sería la construcción de una célula huésped de E. coli que
contenga copias integradas de forma estable de estos genes de chaperonina en el
cromosoma. Figura 6.4 Representación esquemática de dos plásmidos disponibles en
el comercio que pueden usarse para aumentar el conjunto de ciertos ARNt raros en E.
coli. El plásmido pSJS1244 porta 3 y el plásmido pRARE porta 10 genes de ARNt de E.
coli raros. p15A representa los orígenes de replicación de estos plásmidos. La
espectinomicina y el cloranfenicol son los antibióticos por los cuales los genes de
resistencia se transportan dentro de estos plásmidos (A). También se muestra la
expresión de proteínas extrañas en una célula huésped de E. coli típica; la
concentración de ARNt raros se muestra esquemáticamente (B) y en una célula
huésped de E. coli que se ha diseñado (mediante la introducción de uno de los
plásmidos que se muestra en el panel A) para sobreexpresar varios ARNt raros

Figura 6.4 Representación esquemática de dos plásmidos disponibles en el comercio


que pueden usarse para aumentar el conjunto de ciertos ARNt raros en E. coli. El
plásmido pSJS1244 porta 3 y el plásmido pRARE porta 10 genes de ARNt de E. coli
raros. p15A representa los orígenes de replicación de estos plásmidos. La
espectinomicina y el cloranfenicol son los antibióticos por los cuales los genes de
resistencia se transportan dentro de estos plásmidos (A). También se muestra la
expresión de proteínas extrañas en una célula huésped de E. coli típica; la
concentración de ARNt raros se muestra esquemáticamente (B) y en una célula
huésped de E. coli que se ha diseñado (mediante la introducción de uno de los
plásmidos que se muestra en el panel A) para sobreexpresar varios ARNt raros
Figura 6.5 La capacidad de E. coli no transformada y E. coli transformada para expresar
los genes de chaperonina transmitidos por plásmidos cpn10 y cpn60, que se aislaron
de una bacteria psicófila y, por lo tanto, crecen a bajas temperaturas.

Proteínas de fusión
Ocasionalmente, las proteínas extrañas se encuentran en cantidades más pequeñas de
lo esperado cuando se producen en células huésped heterólogas. Este aparente bajo
nivel de expresión puede deberse a la degradación de la proteína extraña dentro de la
célula huésped. Una solución es diseñar una construcción de ADN que codifique una
proteína diana en un marco con ADN que codifique una proteína huésped estable (Fig.
6.6). La proteína única combinada que se produce se denomina proteína de fusión y
protege el producto genético extraño clonado del ataque de las proteínas de la célula
huésped. En general, las proteínas de fusión son estables porque las proteínas diana se
fusionan con proteínas que no son especialmente susceptibles a la proteólisis.
Las proteínas de fusión se construyen ligando una porción de las regiones codificantes
de ADN de dos o más genes. En su forma más simple, un sistema de vector de fusión
conlleva la inserción de un gen diana en la región de codificación de un gen huésped
clonado o compañero de fusión (Fig. 6.6). La pareja de fusión puede colocarse en el
extremo N o C-terminal del gen objetivo. El conocimiento de las secuencias de
nucleótidos de los diversos segmentos de codificación unidos al nivel de ADN es
esencial para garantizar que el producto de ligadura mantenga el marco de lectura
correcto. Si el ADN combinado tiene un marco de lectura alterado, es decir, una
secuencia de codones sucesivos que produce un producto de traducción incompleto o
incorrecto, no se producirá una versión funcional de la proteína codificada por el gen
diana clonado.
Cuando la proteína codificada por el gen clonado se destina al uso humano,
generalmente es necesario eliminar la pareja de fusión del producto final. Esto se debe
a que las proteínas de fusión requieren pruebas más exhaustivas antes de ser
aprobadas por agencias reguladoras, como la Administración de Alimentos y
Medicamentos de los Estados Unidos (FDA). Por lo tanto, se han desarrollado
estrategias para eliminar la secuencia de aminoácidos no deseada de la proteína
objetivo. Una forma de hacer esto es unir el gen de la proteína diana al gen de la
pareja de fusión estabilizadora con oligonucleótidos específicos que codifican tramos
cortos de aminoácidos que son reconocidos por una proteasa no bacteriana particular.
Por ejemplo, un enlazador oligonucleotídico que codifica la secuencia de aminoácidos
Ile-Glu-Gly-Arg puede unirse al gen clonado. Después de la síntesis y purificación de la
proteína de fusión, se puede usar un factor de coagulación de la sangre llamado Xa
para liberar la proteína diana de la pareja de fusión, porque el factor Xa es una
proteasa específica que rompe los enlaces peptídicos únicamente en el lado C-terminal
del Secuencia Ile-Glu-Gly-Arg (Fig. 6.7). Además, debido a que esta secuencia peptídica
se produce con bastante frecuencia en proteínas nativas, este enfoque puede
utilizarse para recuperar muchos productos génicos clonados diferentes.
Las proteasas más comúnmente utilizadas para escindir una pareja de fusión de un
interés de proteína diana son la enterocinasa, la proteasa del virus del ataque del
tabaco, la trombina y el factor Xa. Sin embargo, siguiendo esta división, es necesario
realizar pasos de purificación adicionales para separar ambos

Figura 6.6 Representación esquemática de una construcción de ADN que codifica una
proteína de fusión. Un plásmido que lleva tal construcción también contendría un gen
marcador seleccionable. P, promotor transcripcional; RBS, sitio de unión al ribosoma;
TT, terminador transcripcional. La flecha indica la dirección de la transcripción.

Además de reducir la degradación de proteínas extrañas clonadas, se han desarrollado


varias proteínas de fusión para simplificar la purificación de proteínas recombinantes
(Tabla 6.3). Este enfoque es útil para la purificación de proteínas expresadas en
organismos huésped procarióticos o eucarióticos. Por ejemplo, un vector que contiene
el gen de la citoquina interleuquina-2 (IL-2) humana unido al ADN que codifica la
secuencia de la pareja de fusión (péptido marcador) Asp-Tyr-Lys-Asp-Asp-Asp-Asp-Lys
cumple la doble función. de reducir la degradación del producto del gen de IL-2
expresado y facilitar la purificación del producto. Después de la expresión de este
constructo, la proteína de fusión secretada se puede purificar en una sola etapa
mediante cromatografía de inmunoafinidad, en la que los anticuerpos monoclonales
dirigidos contra el péptido marcador se han inmovilizado en un soporte sólido y actúan
como ligandos para unirse a la proteína de fusión (Fig. 6.8 ). Debido a que este péptido
marcador en particular es relativamente pequeño, no disminuye significativamente la
cantidad de recursos de la célula hospedadora disponibles para la producción de IL-2;
por lo tanto, el rendimiento de IL-2 no se ve comprometido por la síntesis
concomitante del péptido marcador. Además, si bien la proteína de fusión tiene la
misma actividad biológica que la IL-2 nativa, como se mencionó anteriormente, para
satisfacer más fácilmente a las agencias gubernamentales que regulan el uso de
productos farmacéuticos, es necesario eliminar el péptido marcador si el producto está
destinado a uso humano
Alternativamente, se ha vuelto popular generar una proteína de fusión que contiene
seis u ocho residuos de histidina unidos al extremo N o C terminal de la proteína
objetivo. La proteína marcada con histidina, junto con otras proteínas celulares, se
pasa a través de una columna de afinidad de ácido níquel-nitrilotriacético. La proteína
marcada con histidina, pero no las otras proteínas celulares, se une fuertemente a la
columna. La proteína unida se puede eluir de la columna mediante la adición de
imidazol (la cadena lateral de histidina). Con este protocolo, algunas proteínas
clonadas y sobreexpresadas se han purificado hasta 100 veces, con una recuperación
de más del 90% en un solo paso.
Carga metabólica
La introducción y la expresión de ADN extraño en un organismo hospedador a menudo
cambian el metabolismo del organismo de manera que puede afectar el
funcionamiento celular normal (Fig. 6.9). Esta respuesta biológica se debe a una carga
metabólica (carga metabólica, drenaje metabólico) impuesta al huésped por la
presencia y expresión de ADN extraño. Una carga metabólica puede ocurrir como
resultado de una variedad de condiciones, incluyendo las siguientes.
• El aumento en el número y / o tamaño de copias del plásmido requiere cantidades
crecientes de energía celular para la replicación y el mantenimiento del plásmido.
• La cantidad limitada de oxígeno disuelto en el medio de crecimiento a menudo es
insuficiente tanto para el metabolismo de la célula huésped como para el
mantenimiento y la expresión del plásmido (consulte la sección sobre la superación del
límite de oxígeno).
itación abajo).
• La sobreproducción de proteínas diana y marcadora puede agotarse
los grupos de ciertos aminoacil-ARNt (consulte la sección sobre el uso del codón
anterior) y / o drenan la célula huésped de su energía (en forma de ATP o guanosina 5'-
trifosfato [GTP]).

Figura 6.7(A) Escisión proteolítica de una proteína de fusión por el factor de


coagulación de la sangre Xa. La secuencia de reconocimiento del factor Xa (secuencia
del enlazador Xa) se encuentra entre las secuencias de aminoácidos de dos proteínas
diferentes. Una proteína génica clonada funcional (con Val en su extremo N) se libera
después de la escisión. (B) Representación esquemática de una proteína de fusión
tripartita que incluye una pareja de fusión estable, un péptido enlazador y la proteína
diana clonada
Figura 6.8 Purificación por cromatografía de inmunoafinidad de una proteína de fusión
que incluye una proteína marcadora e IL-2. Un anticuerpo monoclonal que se une al
péptido marcador de la proteína de fusión (anticuerpo péptido anti-marcador) se une
a un soporte de matriz sólida. Las proteínas secretadas (A) se pasan a través de la
columna que contiene el anticuerpo unido. La porción peptídica marcadora de la
proteína de fusión se une al anticuerpo (B), y las otras proteínas pasan a través. La
proteína de fusión inmunopurificada se puede eluir de la columna mediante la adición
de un péptido marcador puro.

Figura 6.9 Representación esquemática de células de E. coli no transformadas que


contienen un alto nivel de bloques de construcción celulares y células de energía y E.
coli transformadas con ADN plasmídico (círculo) que codifica la síntesis de una
proteína extraña (mostrada en azul), lo que agota al huésped. Célula de gran parte de
sus bloques de construcción celular y energía. La sobreexpresión de una proteína
extraña impide que la célula obtenga suficiente energía y recursos para su crecimiento
y metabolismo, por lo que es menos capaz de crecer rápidamente y alcanzar una alta
densidad celular. doi: 10.1128 / 9781555818890.ch6.f6.9
 Cuando una proteína extraña se sobreexpresa y luego se exporta desde el
citoplasma a la membrana celular, al periplasma o al medio externo, puede
"atascar" los sitios de exportación de la membrana y evitar la localización adecuada
de otras proteínas de la célula huésped.

• Una proteína extraña a veces puede interferir con el funcionamiento de la célula


huésped, por ejemplo, al convertir un intermedio metabólico importante y necesario
en un compuesto que es irrelevante, o incluso tóxico, para la célula.

Una de las consecuencias más comúnmente observadas de una carga metabólica es


una disminución en la tasa de crecimiento celular después de la introducción de ADN
extraño. A veces, una carga metabólica puede hacer que las células que contienen
plásmidos pierdan todo o una parte del ADN plasmídico. Esto es especialmente
problemático durante el crecimiento a gran escala de un hospedador transformado
porque este paso generalmente se lleva a cabo en ausencia de presión selectiva.
Debido a que las células que crecen en presencia de una carga metabólica
generalmente tienen un nivel reducido de energía para las funciones celulares, los
procesos metabólicos que requieren mucha energía, como la síntesis de proteínas, se
ven afectados de manera adversa por una carga metabólica. Una carga metabólica
también puede conducir a cambios en el tamaño y la forma de la célula huésped y a
aumentos en la cantidad de polisacárido extracelular producido por la célula huésped
bacteriana. Este carbohidrato extracelular adicional puede hacer que las células se
peguen entre sí, lo que dificulta la recolección, por ejemplo, mediante procedimientos
de microfiltración de flujo cruzado y la purificación de proteínas.

Cuando un aminoacil-ARNt particular se vuelve limitante, como ocurre a menudo


cuando una proteína extraña se sobreexpresa en E. coli, existe una mayor probabilidad
de que se inserte un aminoácido incorrecto en lugar del aminoácido limitante.
Además, es probable que la precisión de la traducción, que depende de la
disponibilidad de GTP como parte de un mecanismo de corrección de pruebas,
disminuya aún más como consecuencia de una carga metabólica de la sobreexpresión
de proteínas extrañas. En un caso, un alto nivel de expresión del factor de crecimiento
epidérmico de ratón en E. coli provocó que se incorporaran aproximadamente 10
veces la cantidad normal de aminoácidos incorrectos en la proteína recombinante.
Este aumento en la frecuencia de errores puede disminuir dramáticamente la utilidad
de la proteína diana como agente terapéutico.

La extensión de la carga metabólica puede reducirse utilizando un vector de plásmido


de bajo número de copias en lugar de un número de copias alto. Una estrategia aún
mejor sería evitar el uso de vectores plasmídicos e integrar el ADN extraño introducido
directamente en el ADN cromosómico del organismo huésped (consulte la sección a
continuación sobre la integración de genes extraños en el ADN cromosómico
huésped). En este caso, la inestabilidad del plásmido no será un problema. Con un gen
clonado integrado, sin un vector plasmídico, la célula huésped transformada no
desperdiciará sus recursos sintetizando productos de genes marcadores de resistencia
a antibióticos no deseados e innecesarios. El uso de promotores fuertes pero
regulables también es un medio eficaz para reducir la carga metabólica (consulte la
sección sobre promotores más arriba). En este caso, el proceso de fermentación a
escala de producción se puede realizar en dos etapas. Durante la primera etapa, o
etapa de crecimiento, el promotor que controla la transcripción del gen diana se
desactiva, mientras que durante la segunda etapa, o fase de inducción, este promotor
se activa.

Cuando el uso de codones del gen extraño es diferente del uso de codones del
organismo huésped, se puede evitar el agotamiento de grupos específicos de
aminoacil-ARNt sintetizando completa o parcialmente el gen diana para reflejar mejor
el uso de codones del organismo huésped (ver la sección sobre el uso del codón
arriba). En un estudio, se encontró que los niveles de la proteína estreptavidina eran
10 veces más altos en E. coli cuando la expresión estaba dirigida por un gen sintético
con un contenido de G + C del 54% que cuando estaba dirigida por el gen natural con
una Contenido de G + C del 69%.

Aunque a primera vista pueda parecer contrario a la intuición, una forma de aumentar
la cantidad de proteína extraña producida durante el proceso de fermentación es
aceptar un nivel modesto de expresión de genes extraños (tal vez el 5% de la proteína
celular total) y, en cambio, concentrarse en alcanzar un alto densidad de la célula
huésped. Así, por ejemplo, un organismo con un nivel de expresión de proteína
extraña al 5% y un bajo nivel de carga metabólica que puede crecer hasta una
densidad de 40 g (peso seco) por litro produce más proteína objetivo que uno con un
15%. nivel de expresión para la misma proteína y una densidad celular de solo 5 a 10 g
(peso seco) por litro.

Integración cromosómica

Como consecuencia de la carga metabólica, una fracción de la población celular a


menudo pierde sus plásmidos durante el crecimiento celular. Además, las células que
carecen de plásmidos crecen más rápido que las que los retienen, por lo que las células
sin plásmidos finalmente dominan el cultivo. Después de varias generaciones de
crecimiento celular, la pérdida de células que contienen plásmidos disminuye el
rendimiento del producto génico clonado. Las células que contienen plásmidos se
pueden mantener haciendo crecer las células en presencia de un antibiótico o un
metabolito esencial que permita que solo las células que llevan plásmidos prosperen.
Pero la adición de antibióticos o metabolitos a las fermentaciones a escala industrial
puede ser extremadamente costosa, y es imperativo que todo lo que se agregue a la
fermentación, como un antibiótico o un metabolito, se elimine por completo antes de
certificar el ajuste del producto. uso humano Por esta razón, el ADN clonado a menudo
se introduce directamente en el ADN cromosómico del organismo huésped. Cuando el
ADN es parte del ADN cromosómico del huésped, es bastante estable y se puede
mantener indefinidamente en ausencia de agentes selectivos.
Figura 6.10 Inserción de un gen extraño en un sitio único predeterminado en un
cromosoma bacteriano. En el paso 1, un gen marcador se integra en el ADN
cromosómico de la célula huésped mediante recombinación homóloga. En el paso 2, el
gen marcador seleccionable es reemplazado por el gen objetivo. doi: 10.1128 /
9781555818890.ch6.f6.10

Para la integración del ADN en un sitio cromosómico, el ADN de entrada debe


compartir cierta similitud de secuencia, generalmente al menos 50 nucleótidos, con el
ADN cromosómico, y debe haber un intercambio físico (recombinación) entre las dos
moléculas de ADN. Para integrar el ADN en el cromosoma del huésped, primero es
necesario identificar un sitio de integración cromosómica deseado, es decir, un
segmento de ADN en el cromosoma del huésped que puede romperse sin afectar las
funciones normales de la célula. Una vez que el sitio de integración cromosómica se ha
aislado y empalmado en un plásmido, se inserta un gen marcador en medio del sitio de
integración cromosómica clonado (Fig. 6.10). El ADN en el plásmido puede
emparejarse con secuencias idénticas en el cromosoma huésped y posteriormente
integrarse en el cromosoma huésped como resultado de un doble catalizador
catalizado por enzimas del huésped.

cruce En este caso, los transformantes se seleccionan para la adquisición del gen
marcador (a menudo un gen de resistencia a antibióticos). Luego, el gen objetivo, bajo
el control de un promotor regulable, se inserta en medio del sitio de integración
cromosómica clonado en un plásmido diferente. Este constructo de plásmido se usa
para transformar células huésped que contienen el gen marcador integrado en su
cromosoma, y luego de un doble cruce catalizado por una enzima huésped, el gen
diana y su región reguladora transcripcional se insertan en el cromosoma en lugar del
gen marcador. La construcción final se selecciona para la pérdida del gen marcador.
También se pueden usar otros métodos para integrar genes extraños en el ADN
cromosómico del huésped. Por ejemplo, cuando un gen marcador está marcado por
ciertas secuencias cortas específicas de ADN y luego se inserta en un plásmido o en un
ADN cromosómico, el gen puede extirparse mediante el tratamiento del constructo
con una enzima que reconoce las secuencias de ADN que fallan y las elimina. ellos (fig.
6.11). Una combinación de una secuencia de enzima y ADN que es útil para este tipo
de manipulación es el sistema de recombinación Cre-loxP, que consiste en la enzima
recombinasaCre y dos sitios de recombinación loxP de 34 pb. El gen marcador que se
eliminará está marcado por los sitios loxP, y después de la integración del plásmido en
el ADN cromosómico, el gen marcador se elimina por la enzima Cre. El gen que codifica
la enzima Cre se encuentra en su propio plásmido, que puede introducirse en las
células huésped transformadas cromosómicamente. La escisión del gen marcador se
desencadena por la adición de IPTG al medio de crecimiento; esto elimina la presión
del gen lacI (que codifica el represor lac), que activa el promotor-operador lac de E.
coli, que estaba presente antes del gen Cre, y hace que la enzima Cre se sintetice. Una
vez que ya no hay necesidad de la enzima Cre, el plásmido que contiene el gen para
esta enzima bajo el control del promotor lac puede eliminarse de las células huésped
simplemente elevando la temperatura. Este plásmido tiene un replicón sensible a la
temperatura que le permite mantenerse en la célula a 30 ° C, pero no por encima de
37 ° C.

Figura 6.11 Eliminación de un gen marcador seleccionable luego de la integración del


ADN plasmídico en un cromosoma bacteriano. Se produce un único evento cruzado (×)
entre el ADN cromosómico y un fragmento de ADN homólogo (sombreado) en un
plásmido, lo que resulta en la integración de todo el plásmido en el ADN cromosómico.
El gen marcador seleccionable, que está marcado por los sitios loxP, se escinde por la
acción de la enzima Cre, dejando un sitio loxP en el plásmido integrado. La enzima Cre
se encuentra en un plásmido separado dentro de la misma célula bajo el control
transcripcional del promotor lac de E. coli, por lo que se induce la escisión cuando se
agrega IPTG al medio de crecimiento.
Secreción creciente
Para la mayoría de las proteínas de E. coli, la secreción implica el tránsito a través de la
membrana celular interna (citoplásmica) hacia el periplasma. Dirigir una proteína
extraña al periplasma, en lugar del citoplasma, hace que su purificación sea más fácil y
menos costosa, ya que hay muchas menos proteínas presentes aquí que en el
citoplasma.
Además, la estabilidad de una proteína clonada depende de su ubicación celular en E.
coli. Por ejemplo, la proinsulina recombinante es aproximadamente 10 veces más
estable si se secreta (se exporta) al periplasma que si se localiza en el citoplasma.
Además, la secreción de proteínas al periplasma a menudo facilita la correcta
formación de disulfuros de enlaces porque el periplasma proporciona un ambiente
oxidativo, en oposición al entorno más reductor del citoplasma. La Tabla 6.4
proporciona algunos ejemplos de las cantidades de proteínas farmacéuticas
recombinantes secretadas que se pueden obtener con varias células huésped
bacterianas.
Normalmente, una secuencia de aminoácidos llamada péptido señal (también llamada
secuencia señal o péptido líder), ubicada en el extremo N-terminal de una proteína
recién sintetizada, facilita su exportación al permitir que la proteína pase a través de la
membrana celular (Fig. 6.12). A veces es posible diseñar una proteína para la secreción
del periplasma agregando el ADN

Tabla 6.4 Rendimientos de varias proteínas recombinantes secretadas producidas en


diferentes bacterias

secuencia que codifica un péptido señal para el gen clonado. Cuando la proteína
recombinante se secreta al periplasma, el péptido señal es eliminado con precisión por
el aparato de secreción de la célula, por lo que el extremo N-terminal de la proteína
diana es idéntico a la proteína natural.
Desafortunadamente, la fusión de un gen diana con un fragmento de ADN que
codificauna secuencia peptídica señal no garantiza necesariamente una alta secreción.
Cuando se encuentra que esta estrategia simple es ineficaz para producir un producto
proteico secretado, es necesario emplear estrategias alternativas. Un enfoque que
resultó exitoso para la secreción de la citoquina IL-2 fue la fusión del gen IL-2 en
sentido descendente del gen para la proteína de unión a la maltosa del propéptido
completo, en lugar de solo la secuencia señal de la proteína de unión a la maltosa. con
el ADN que codifica el sitio de reconocimiento del factor Xa como un péptido
enlazador que separa estos dos genes (Fig. 6.13). Cuando esta fusión genética, en un
vector plasmídico, se usó para transformar células de E. coli, como se esperaba, se
encontró una gran fracción de la proteína de fusión localizada en el periplasma de la
célula huésped. La IL-2 funcional podría luego liberarse de la proteína de fusión por
digestión con factor Xa.
A veces, un nivel demasiado alto de traducción de una proteína extraña puede
sobrecargar la maquinaria de secreción de la célula e inhibir la secreción de esa
proteína. Por lo tanto, para garantizar que la secreción de una proteína diana se
produzca de manera más eficiente, es necesario disminuir el nivel de expresión de esa
proteína.
E. coli y otros microorganismos gramnegativos generalmente no pueden segregar
proteínas en el medio circundante debido a la presencia de una membrana externa
(además de la membrana interna o citoplásmica) que restringe este proceso. Por
supuesto, es posible utilizar como organismos huésped procariotas grampositivos o
células eucariotas, las cuales carecen de una membrana externa y, por lo tanto,
pueden secretar proteínas directamente en el medio. Alternativamente, es posible
aprovechar el hecho de que algunas bacterias gramnegativas pueden secretar una
proteína bactericida llamada bacteriocina en el medio. Un mecanismo en cascada es
responsable de esta secreción específica. Una proteína liberadora de bacteriocina
activa la fosfolipasa A, que está presente en la membrana interna bacteriana, y escinde
los fosfolípidos de membrana para que las membranas interna y externa sean
permeabilizadas (Fig. 6.14A). Esto da como resultado algo de citoplasma y
periplásmica.

Figura 6.12 Representación esquemática de la secreción de proteínas. El ribosoma está


unido a una membrana celular, y el péptido señal en el extremo N se transporta,
mediante el aparato de secreción, a través de la membrana citoplásmica, seguido del
resto de los aminoácidos que constituyen la proteína madura. Una vez que el péptido
señal ha cruzado la membrana, se escinde del resto de la proteína por una enzima
asociada con la membrana llamada peptidasa señal. Las proteínas de membrana y las
proteínas secretadas generalmente contienen un péptido señal (antes de su
eliminación por procesamiento).
doi: 10.1128 / 9781555818890.ch6.f6.12

Figura 6.13 Ingeniería de la secreción de IL-2. Cuando la IL-2 se fusiona con la proteína
de unión a la maltosa de E. coli y su péptido señal, con las dos proteínas unidas por un
péptido enlazador, se produce la secreción al periplasma. Después de la purificación de
la proteína de fusión secretada, la proteína de unión a maltosa y el péptido enlazador
se eliminan mediante digestión confactor Xa. doi: 10.1128 / 9781555818890.ch6.f6.13
Figura 6.14Representación esquemática de una proteína recombinante de liberación
de bacteriocina que activa la fosfolipasa A (presente en la membrana interna de E. coli)
para permeabilizar las membranas celulares (A). También se muestran esquemas de
células de E. coli diseñadas para secretar una proteína extraña al periplasma
fusionando el gen de interés (verde) a una señal de secreción (B) y al medio de
crecimiento mediante la permeabilización de las membranas celulares con una
proteína de liberación de bacteriocina codificada en Otro plásmido (rojo) (C). doi:
10.1128 / 9781555818890.ch6.f6.14

Las proteínas se liberan en el medio de cultivo. Por lo tanto, al colocar el gen de la


proteína liberadora de bacteriocina en un plásmido bajo el control de un promotor
regulable, las células de E. coli pueden ser permeabilizadas a voluntad. Las células de E.
coli que llevan el gen de la proteína liberadora de bacteriocina en un plásmido se
transforman con otro plásmido que lleva un gen clonado que se ha fusionado con una
secuencia peptídica señal de secreción que hace que la proteína diana se secrete en el
periplasma. El gen clonado se coloca bajo el mismo control regulador de la
transcripción que el gen de la proteína liberadora de bacteriocina, de manera que los
dos genes se pueden inducir simultáneamente, y la proteína del gen clonado se
secreta en el medio (Fig. 6.14B y C).
Superando la limitación de oxígeno
E. coli y la mayoría de los otros microorganismos que se usan para expresar proteínas
extrañas generalmente requieren oxígeno para un crecimiento óptimo.
Desafortunadamente, el oxígeno tiene solo una solubilidad limitada en medios
acuosos. Por lo tanto, a medida que aumenta la densidad celular de un cultivo en
crecimiento, las células agotan rápidamente el medio de crecimiento del oxígeno
disuelto. Cuando las células se limitan al oxígeno, el crecimiento exponencial
disminuye y el cultivo entra rápidamente en una fase estacionaria durante la cual
cambia el metabolismo celular. Una consecuencia de la fase estacionaria es la
producción por parte de las células huésped de proteasas que pueden degradar
proteínas extrañas. El oxígeno se disuelve en el medio de crecimiento muy
lentamente, por lo que la cantidad de oxígeno disuelto disponible para las células en
crecimiento a menudo no aumenta lo suficientemente rápido cuando se agregan
grandes cantidades de aire u oxígeno al medio de crecimiento, incluso con altas
velocidades de agitación. La modificación de la configuración del fermentador
(biorreactor) para optimizar la aireación y agitación de las células y la adición de
sustancias químicas al medio de crecimiento para aumentar la solubilidad del oxígeno
se ha intentado para tratar la cantidad limitada de oxígeno disuelto. Sin embargo,
estos esfuerzos han tenido un éxito limitado.
Algunas cepas de la bacteria Vitreoscilla, un aerobio obligado gramnegativo,
normalmente viven en ambientes pobres en oxígeno, como estanques estancados.
Para obtener una cantidad suficiente de oxígeno para su crecimiento y metabolismo,
estos organismos sintetizan una molécula similar a la hemoglobina que se une
estrechamente al oxígeno del ambiente y posteriormente aumenta el nivel de oxígeno
disponible dentro de las células (Fig. 6.15). Cuando el gen para esta proteína se
expresa en E. coli, los transformantes muestran niveles más altos de síntesis proteica
de proteínas tanto celulares como recombinantes, niveles más altos de respiración
celular, una mayor tasa de producción de ATP y contenidos más altos de ATP,
especialmente a niveles bajos de Oxígeno disuelto (0.25 a 1.0%) en el medio de
crecimiento, que las células no transformadas. En estos transformantes, la
hemoglobina de Vitreoscilla aumenta la concentración de oxígeno intracelular, lo que
aumenta las actividades de los citocromos d y o. Esto provoca un aumento en el
bombeo de protones, con la generación subsiguiente de ATP, proporcionando así
energía adicional para los procesos metabólicos celulares (Fig. 6.15). Para que esta
estrategia sea efectiva en diferentes células hospedadoras, no solo la Vitreoscillasp. El
gen de la hemoglobina se expresa de manera eficiente, pero también las células
huésped deben poder sintetizar la porción hemo de la molécula de hemoglobina. Una
vez cumplidas estas condiciones, esta estrategiase puede usar para mejorar el
crecimiento y la expresión de genes extraños en una variedad de diferentes bacterias
industrialmente importantes, incluida la E. coli. Así, las células hospedadoras que
expresan la Vitreoscillasp. El gen de la hemoglobina a menudo experimenta varias
duplicaciones adicionales antes de entrar en la fase estacionaria, lo que produce una
densidad celular mucho mayor y un rendimiento mucho mayor de la proteína
recombinante diana.

Figura 6.15 (A) Representación esquemática de la unión de O2 por la hemoglobina de


Vitreoscilla, la utilización de este O2 en el bombeo (por proteínas como los citocromos)
H + del citoplasma al periplasma y el posterior acoplamiento de la captación de H +
(por ATPasa) a Generación de ATP. (B) Las células hospedadoras diseñadas para
expresar la hemoglobina de Vitreoscilla son más eficientes para absorber el oxígeno
del medio de crecimiento.
doi: 10.1128 / 9781555818890.ch6.f6.15

Acetato reductor
A menudo es difícil lograr altos niveles de expresión de genes extraños y una alta
densidad de células hospedadoras al mismo tiempo debido a la acumulación de
productos de desecho dañinos, especialmente acetato, que inhibe el crecimiento
celular y la producción de proteínas, y también desperdicia carbono disponible.
Recursos energéticos. Dado que el acetato a menudo se asocia con el uso de glucosa
como fuente de carbono, generalmente se obtienen niveles más bajos de acetato y,
por lo tanto, rendimientos más altos de proteína cuando se usa fructosa o manosa
como fuente de carbono. Además, se han desarrollado varios tipos diferentes de
células huésped de E. coli manipuladas genéticamente que producen niveles más bajos
de acetato. Una de estas cepas modificadas se produjo mediante la introducción de un
gen (de B. subtilis) que codifica la enzima acetolactatosintasa en las células huésped de
E. coli. Esta enzima cataliza la formación de acetolactato a partir de piruvato,
disminuyendo así el flujo a través de acetil coenzima A a acetato (Fig. 6.16). En la
práctica, los genes de acetolactatosintasa se introducen en la célula en un plásmido,
mientras que el gen diana (que codifica la proteína que se va a sobreexpresar en E.
coli) se introduce en un segundo plásmido de un grupo de incompatibilidad diferente.
Las células que se transformaron con los genes de acetolactatosintasa produjeron un
75% menos de acetato que las células no transformadas y en su lugar sintetizaron
acetoína, que es aproximadamente 50 veces menos tóxica para las células que el
acetato. El rendimiento de la proteína recombinante también se duplicó.
En otro enfoque para reducir el nivel de acetato, los investigadores transformaron las
células huésped de E. coli con un gen bacteriano para la enzima piruvatocarboxilasa,
que convierte el piruvato directamente en oxaloacetato y no está presente en E. coli
(Fig. 6.17). Con la introducción de la piruvatocarboxilasa, los niveles de acetato
disminuyeron a menos del 50% de su nivel normal, el rendimiento celular aumentó en
más del 40% y la cantidad de proteína extraña sintetizada aumentó en casi el 70%. Este
resultado refleja el hecho de que la adición de piruvatocarboxilasa permite que las
células de E. coli utilicen el carbono disponible de manera más eficiente, alejándolo de
la producción de acetato hacia la biomasa y la formación de proteínas.
De manera similar a la estrategia discutida anteriormente, el ciclo del ácido
tricarboxílico (TCA) también se puede reponer al convertir el aspartato en fumarato
(Fig. 6.17). Para hacer esto, las células huésped de E. coli se transformaron con el gen
para la l-aspartato amoníaco liasa (aspartasa) bajo el control del promotor tac fuerte
en un plásmido estable de bajo número de copias. La proteína recombinante diana se
introdujo en un plásmido separado. Usando este sistema, la actividad de la aspartasa
se indujo mediante la adición de IPTG en el medio paraFase logarítmica tardía de
crecimiento. Cuando las células de E. coli recombinantes se cultivaron en un medio
mínimo que contenía aspartato, la producción de diferentes proteínas recombinantes
podría aumentarse hasta cinco veces, con un 30 a 40% más de producción de biomasa.

Figura 6.16 Representación esquemática de las vías para el metabolismo de la glucosa


en una cepa de E. coli que se ha transformado con un plásmido que lleva los genes de
las subunidades de proteínas de la acetolactatosintasa (ALS). La introducción de esta
vía da como resultado la síntesis de acetoína. Tenga en cuenta que la conversión de
glucosa a biomasa es un proceso de varios pasos. Acetil-CoA, acetil coenzima A. doi:
10.1128 / 9781555818890.ch6.f6.16
Figura 6.17 Reposición del ciclo de TCA en E. coli por la introducción de un gen que
codifica la piruvatocarboxilasa. Esto evita la conversión de piruvato a acetato. El ciclo
del TCA también se puede reponer mediante la introducción de un gen que codifica la
aspartasa, convirtiendo el aspartato en el medio en fumarato. Tenga en cuenta que la
conversión de glucosa a biomasa es un proceso de varios pasos. Acetil-CoA, acetil
coenzima A.

Plegamiento de proteínas
El uso de condiciones que resultan en tasas muy altas de expresión de genes extraños
en E. coli a menudo también conduce a la producción de proteínas mal plegadas que
pueden agregarse y formar cuerpos de inclusión insolubles dentro de la célula
huésped. Si bien es posible solubilizar cuerpos de inclusión y posteriormente
establecer condiciones que permitan que al menos una parte de la proteína
recombinante se pliegue correctamente, esto es típicamente un proceso tedioso,
ineficaz, costoso y lento, y es mejor evitarlo si es posible. . Una estrategia simple para
evitar la formación de proteínas mal plegadas y, por lo tanto, los cuerpos de inclusión
implica reducir la velocidad de síntesis del producto del gen diana.