Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
Actinobacillus pleuropneumoniae
INDICE
Pág.
1. Antecedentes teóricos 1
1.1 Enzima 4
1.2 Hidrolasas 6
1.3 Fosfatasas 6
1.4 Fosfatasas ácidas 7
1.5 Parámetros cinéticos 8
1.5.1 Temperatura 8
1.5.2 pH 8
1.5.3 Efecto de la concentración de sustrato 8
1.5.4 Efecto de Inhibidores 9
2. Justificación 10
3. Objetivos 10
3.1 Objetivo General 10
3.2 Objetivos Específicos 10
4.. Secuencia experimental 11
5 Metodología 12
5.1. Cepas y cultivos bacterianos 12
5.2. Lavado e células 12
5.3. Extracción de la enzima a partir de las células 12
5.4. Determinación de Actividad de Fosfatasa Ácida 12
5.5. Cuantificación de proteínas 13
5.6. Efecto de Temperatura 13
5.7. Efecto de pH 13
5.8. Determinación de Km y Vmax 13
5.9. Efecto de Inhibidores 14
6 Resultados y Discusión 15
6.1 Cepas y cultivos bacterianos 15
6.2 Curva tipo de p-NPP 15
6.3 Cuantificación de proteínas 16
6.4 Actividad enzimática y concentración de proteínas 18
6.5 Efecto de Temperatura 19
6.5.1 Temperatura de inactivación 20
6.6 Efecto de pH 23
OROZCO SOLIS JENNY 1
DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS DE LA ACTIVIDAD DE FOSFATASA ÁCIDA DE
Actinobacillus pleuropneumoniae
INDICE DE TABLAS
Pág
INDICE DE GRÁFICAS
Pág
AGRADECIMIENTOS
A DIOS
Quiero agradecer antes que nada a Dios, por darme la oportunidad de estar viva y así
consumar una de las metas más importantes en la vida, el término de mi carrera y por
darme la Familia que tengo.
A MIS PADRES
Que me dieron el mayor regalo que se le puede dar a una persona, la vida.
Por inculcarme los valores, darme la familia, el ejemplo que me ha llevado hasta
donde estoy. Por tenerme la paciencia, comprensión y entenderme en los momentos
más difíciles de la carrera, con todas mis presiones provocando que no estuviera todo
el tiempo que me necesitaban consigo y por estar conmigo siempre ahora que
concluye una de las etapas mas importantes de mi vida, Gracias. (Víctor y Leonor)
A MIS HERMANAS
Quienes me han enseñado a luchar por alcanzar los sueños, a no desistir en el camino
y sobre todo, por la dicha de poder compartir la vida con ellas, Gracias. (Erika y
Claudia)
A MI CUÑADO
Por haber llegado a nuestra vida, ayudarme a superar mis miedos y a ser una persona
independiente. Gracias (Álvaro)
A MIS TIOS
Por enseñarme que el mejor camino para conseguir lo que quieres es trabajando,
Gracias (Martín y Lilia).
PROFESOR RODRIGO
Gracias por haberme permitido estar en esta investigación, le agradezco su
disposición para asesorarme en este trabajo, por su confianza, por sus consejos y
enseñanzas.
A MIS AMIGOS
Por haber estado en los momentos en el cual yo los necesite, por confiar en mi, y por
ser mis amigos, Gracias (Jacqueline, Susana, Ana Luisa, Cristina, Gemma, Marisol,
Oscar y Anayeli)
Introducción. La producción y consumo de carne de cerdo es pH óptimo no muy estrechos, mientras que en el lado alcalino se
de gran importancia nacional. La industria porcícola se ve observa actividad entre pH 7.5 y 8 esto nos indica que tenemos
afectada económicamente por una gran variedad de la presencia de mas de una fosfatasa, sin embargo nuestro
enfermedades que puede contraer el cerdo. El Actinobacillus extracto está enriquecido en fosfatasas ácidas.
pleuropneumoniae es un cocobacilo gramnegativo de la familia EDT A
Pasteurellaceae, es anaerobio facultativo. Las enzimas son en 10 0
60
E D T A ( mM )
Liasas, Ligasas. Las fosfatasas ácidas son producidas por
bacterias, hongos, levaduras, entre otros, presentan actividad
óptima a pH bajo, se localizan en lisosomas, algunas fosfatasa Gráfica 2. EDTA
ácidas están asociadas a la membrana celular en otros casos
En la gráfica 2 se observa que el EDTA disminuye la actividad
están secretadas al medio de cultivo, el sustrato utilizado a nivel
de la enzima, conforme se aumenta la concentración del mismo
laboratorio es p-nitrofenilfosfato (p-NPP), este puede actuar de
se puede ver que la actividad disminuye en un 50% con
manera especifica y no específica, depende de la reacción en la
aproximadamente 15mM de EDTA., la enzima requiere la
célula. Hay una serie de factores que se deben de tomar en
presencia de algún Ion metálico.
cuenta cuando se estudia la cinética de una reacción enzimática
Conclusiones. De acuerdo ala manipulación que se tuvo con el
entre los cuáles tenemos: Temperatura, pH, Efecto de la
Actinobacillus pleuropneumoniae, podemos decir que es una
concentración de sustrato, Efecto de inhibidores. Se debe
bacteria muy sensible, es por eso que se recomienda que se
establecer las condiciones óptimas en todos los factores para
debe de resembrar cada 10 días.
tener el máximo rendimiento en la actividad enzimática.
La temperatura óptima para la actividad de la enzima fue de
Metodología. Cepas y cultivos bacterianos. Se emplean para la
37ºC.
cepa de A. pleuropneumoniae, que crezca en medio Luria
Al someter la enzima a 10 minutos de calentamiento a 38ºC
Bertani con glucosa (LBG) líquido o Infusión Cerebro Corazón
inicia un proceso de desnaturalización, la cual alcanza su
(BHI) y mantener la cepa en el mismo agar del medio; en
máximo al calentar a 48 ºC.
cualquier caso el medio es suplementado con NAD. Emplear
Para la determinación del pH óptimo se encontró que este ocurre
cultivos de toda la noche, realizar Lavado de células;
entre 5 a 6.
Centrifugar, recuperar la pastilla y resuspender con
Los valores obtenidos de Vmax= 2.29 mM/ml y se pudo obtener
amortiguador., empleando Desoxicolato de Sodio. Se mide la
la Km= 1.031mM
actividad y se determina la cantidad de proteínas presentes. Y
La enzima requiere algún ión metáLa enzima no fue sensible a
por ultimo medir. :Efecto de Temperatura, Efecto de pH,
Tartrato y muy poco sensible a Molibdato
Determinación de Km y Vmax, Efecto de inhibidores.
La enzima es sensible a la inhibición por retroalimentación.
Resultados y discusión. Se logro determinar actividad
Perspectivas. Determinar si la molécula tiene un papel esencial
enzimática y cuantificación de proteínas .Se determinaron
en el metabolismo de la bacteria. Determinar la funcionalidad de
parámetros cinéticos de la actividad de fosfatasa ácida
la enzima en la bacteria. Realizar estudios de patogenicidad de
p H óp t i m o
la enzima en la bacteria.
2
Agradecimientos. Al Instituto Polit la Unidad Profesional
1, 6
1, 2
Interdisciplinaria deBiotecnología, al Departamento de
0,8
0,4 Bioquímica, al M. en C. Rodrigo Martinez Zúñiga.
Referencias.
0
4 5 6 7 8 9
pH
1. Fenwick B. (1994). Porcine Pleuropneumonia, JAVMA 204:
1334-1340
2. Lehninger, A.; “Bioquimica”, 2da. Edición, Ed. Omega,
Gráfica1 Efecto de pH,
Barcelona. 1978, pág 189 – 222.
En la Gráfica 1 se observa la presencia de 2 picos de actividad a
pH ácido entre 5 y 6 muestra que nuestra enzima tiene límites de
OROZCO SOLIS JENNY BERENICE 5
DETERMINACIÓN DE PARAMETROS CINÉTICOS DE LA ACTIVIDAD DE FOSFATASA ÁCIDA DE
Actinobacillus pleuropneumoniae
ANTECEDENTES TEÓRICOS
En México, la producción y consumo de carne de cerdo es de gran importancia
nacional (15,16). La industria porcícola se ve afectada económicamente por una gran
variedad de enfermedades que puede contraer el cerdo. Entre ellas se encuentra la
Pleuroneumonía Contagiosa Porcina (PCP), una enfermedad de vías respiratorias
causada por Actinobacillus pleuropneumoniae, que se presenta a nivel mundial. La
bacteria induce una neumonía fibrinohemorrágica que eventualmente desencadena la
muerte de los cerdos. El primer brote se observó a principios de la década de los 60’s
en Argentina (8). (Fig. 1).
Para la PCP, la morbilidad puede exceder el 50%, alcanzando en ocasiones hasta un
90% con un índice de mortalidad variable alrededor del 10%(5).
1
OROZCO SOLIS JENNY 1
DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS DE LA ACTIVIDAD DE FOSFATASA ÁCIDA DE
Actinobacillus pleuropneumoniae
Desde las primeras descripciones, por Ligniers y Spitzen 1902 y la posterior fijación por
Brumpt en 1910, hasta la actualidad al género Actinobacillus se le han incorporado y
excluido diversos microorganismos: A. mallei fue traspasado a Pseudomona mallei,
mientras, Bacillus nephritidis equi (Meyer 1910) pasó a Shigella viscosa (Bergey 1930)
para ser incluida finalmente como A. equuli (Haupt 1934). La última incorporación ha sido
Haemophillus pleuropneumoniae y finalmente con los avances de Biología Molecular
surgió la clasificación mas apropiada como miembro del género Actinobacillus(3).
2
OROZCO SOLIS JENNY BERENICE 1
DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS DE LA ACTIVIDAD DE FOSFATASA ÁCIDA DE
Actinobacillus pleuropneumoniae
Fig 3.- Cultivo de A. pleuropneumoniae en medios sólidos. 2 A: colonias en agar chocolate. 2B: colonias
en agar PPLO enriquecido con NAD; 2C: satelitismo en agar sangre. 2D. Efecto CAMP; 2E: colonias
hemolíticas en la presencia sangre.
1.1 ENZIMAS
No hacen factibles las reacciones imposibles, sino que solamente aceleran las que
espontáneamente podrían producirse. Ello hace posible que en condiciones
fisiológicas tengan lugar reacciones que sin catalizador requerirían condiciones
extremas de presión, temperatura o pH.
Tienen pesos moleculares que oscilan entre 12,000 y un millón. Algunas enzimas son
proteínas conjugadas; ya que poseen un grupo no proteico o prostético.
(Fig. 5).
1.3 FOSFATASAS
Son un grupo de enzimas hidrolíticas que actúan sobre los ésteres del ácido fosfórico,
son capaces de desfosforilar compuestos orgánicos, realizan una ruptura hidrolítica de
enlaces ésteres fosfóricos o fosfoanhidridos, en general son enzimas de baja
especificidad aunque hay algunas con elevada especificidad principalmente las que
actúan sobre azúcares fosforilados. Algunas fosfatasas actúan específicamente sobre
un sustrato determinado, pero la mayoría actúan sobre diversos sustratos.
Algunas de estas enzimas son secretadas fuera de la membrana plasmática. Entre los
grupos bacterianos se han determinado además diversas fosfatasas producidas como
proteínas periplásmicas o como lipoproteínas unidas a membrana. Estas enzimas
bacterianas se les ha denominado fosfatasas ácidas no especificas, se piensa que su
función esencial es la de proveer nutrientes requeridos por la célula, son capaces de
desfosforilar un amplio grupo de sustratos no relacionados estructuralmente y exhiben
actividad catalítica óptima en valores de pH ácido o neutro, aunque algunas han
Las fosfatasas ácidas son producidas por bacterias, hongos, levaduras, protozoarios,
micorrizas, raíces de plantas entre otras, presentan actividad óptima a pH bajo, se
localizan en lisosomas, sus pesos moleculares van de 18 a 130KDa. Algunas fosfatasa
ácidas están asociadas a la membrana celular; en otros casos están secretadas al
medio de cultivo, el sustrato utilizado a nivel laboratorio es p-nitrofenilfosfato (p-NPP),
este puede actuar de manera especifica y no específica, depende de la reacción en la
célula.
diésteres, son inhibidas por EDTA, Ca++ y por nucleósidos, resisten bajas
concentraciones de SDS y su actividad es estimulada por Mg++.
Hay una serie de factores que se deben de tomar en cuenta cuando se estudia la
cinética de una reacción enzimatica entre los cuáles tenemos:
• Temperatura
• pH
• Efecto de la concentración de sustrato
• Efecto de inhibidores
Se debe establecer las condiciones óptimas en todos los factores para tener el
máximo rendimiento en la actividad enzimática.
1.5.1 Temperatura
La temperatura Influye en toda actividad de las enzimas. Generalmente a
temperaturas muy bajas, la actividad de las enzimas sobre sus sustratos disminuye,
mientras que la elevación de la temperatura aumenta la velocidad de la reacción hasta
un punto en que ocurre su desnaturalización.
1.5.2 pH
La acción catalitica de las enzimas tiene lugar dentro de los limites de pH. Cada
reacción enzimatica posee un pH óptimo, el cual depende de los sustratos
involucrados y de las condiciones de reacción (tiempo, temperatura, concentración de
sustrato, etc.)
Un pH muy alto o muy bajo causará por lo general, una desnaturalización irreversible
de las enzimas.
La influencia del pH sobre la actividad enzimática se puede utilizar para retardar
reacciones enzimáticas o acelerar las deseables, por medio del control del pH del
medio.
2. JUSTIFICACIÓN
3. OBJETIVOS
SECUENCIA EXPERIMENTAL
Obtención de
Células
Extracción de periplasma
Efecto de:
• pH
• Temperatura
• Inhibidores
METODOLOGÍA
5.7 Efecto de pH
Colocar 450µl de sustrato para fosfatasas p-Nitrofenolfosfato (p-NPP) a diferentes
concentraciones, agregar 50µl de la muestra problema, incubar a 37ºC durante 2hrs,
al terminó de la incubación la reacción se detiene con 1.1ml NaOH 1M, dejar reposar
por 15 min. y leer en el espectrofotómetro a una absorbancia de 415 nm.
14
OROZCO SOLIS JENNY BERENICE 13
DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS DE LA ACTIVIDAD DE FOSFATASA ÁCIDA DE
Actinobacillus pleuropneumoniae
6. RESULTADOS Y DISCUCIÓN
6.1. Cepas y cultivos bacterianos
Se tuvo una serie de problemas para poder mantener la cepa viable, ya que s muy
sensible a la manipulación, esta se mantiene congelada a -25ºC hasta su utilización
puede permanecer viable hasta 6 meses. Este es un microorganismo muy sencible,
por lo cuál se determinó que en cada resiembra se debe realizar con extremas
medidas de esterilidad. No olvidar adicionar el factor NAD y al día siguiente de la
resiembra volver a resembrar un control para corroborar que sea Actinobacillus
pleuropneumoniae, este procedimiento se sigue también al realizar los ensayos de
extracción (medio liquido) para cerciorarse que se este llevando a cabo la extracción
de la enzima deseada del microorganismo.
[ PNP ] Abs
(nM/ml) (415 nm)
50 0.0326
100 0.1873
200 0.4496
400 0.8463
600 1.3726
800 1.847
15
OROZCO SOLIS JENNY BERENICE 14
DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS DE LA ACTIVIDAD DE FOSFATASA ÁCIDA DE
Actinobacillus pleuropneumoniae
2
1,8
1,6
1,4
Abs (415nm)
1,2
1
0,8
0,6
0,4 y = 0,0024x - 0,0977
0,2 R2 = 0,9973
0
0 200 400 600 800 1000
[p-NP] nM/ml
BSA Abs
(µg/ml) (595nm)
20 0.087
40 0.15
60 0.207
80 0.262
100 0.305
0,35
0,3
0,25
Abs (595 nm)
0,2
0,15
0,1
y = 0,0027x + 0,0378
0,05 R2 = 0,9956
0
10 20 30 40 50
Β Σ Α[µ g/m l]
Se realizó una curva tipo para la cuantificación de proteínas donde se utilizó como
proteína patrón Albúmina Sérica Bovina (BSA) ya que ésta es la mas común para este
tipo de ensayos, se utilizaron concentraciones de 0 a 50µg/ml y se completa el
volumen correspondiente con NaCl 0.15M de 150 a 200µg/ml, por último se le agrega
el reactivo de Bradford. Las Absorbancias se leen en el espectrofotómetro a una
longitud de onda de 595nm.
M1 M2 M1 M2
(180rpm) (180rpm) (220rpm) (220rpm)
Actividad
1.241 1.299 1.459 1.450
(As)
M1 M2
(180rpm) (220rpm)
Actividad
1.241 1.454
(As)
Con este ensayo tomamos la decisión de ajustar nuestro extracto para que al realizar
nuestros siguientes experimentos todos fueran realizados con 2.5 Unidades de Enzima
con un tiempo de reacción de 2hrs.
4 0.66
25 1.35
30 1.77
37 2.19
50 0.74
60 0.44
Temperatura óptima
2,5
2
Uez(mM/ml)
1,5
0,5
0
0 10 20 30 40 50 60
T (ºC)
60 0.46
70 0.48
80 0.46
92 0.48
Temperatura de Inactivación
1,4
1,2
1
Uez(nM/ml)
0,8
0,6
0,4
0,2
0
38 40 42 44 46 48
T (ºC)
Los ensayos se realizaron con 2.5 Unidades de Enzima y la actividad procedió durante
2 hrs..
Unidad de Enzima
pH
(nM/ml)
4.5 0.813
5 1.64
5.5 1.73
6 1.73
6.5 1.15
7 0.80
7.5 1.015
8 1.031
8.5 0.855
9 0.82
pH óptimo
1,6
Uez(nM/ml)
1,2
0,8
0,4
0
4 5 6 7 8 9
pH
Michaelis-Menten
2.5
2
Uez (mM/ml)
1.5
0.5
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8
p-NPP(m M)
Lineaweaver-Burk
2.5
1.5
1/UEz
y = 0.4505x + 0.4366
0.5 2
R = 0.9939
0
0 1 2 3 4 5
1/[pNPP]
Determinar Vmax y Km
27
OROZCO SOLIS JENNY BERENICE 26
DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS DE LA ACTIVIDAD DE FOSFATASA ÁCIDA DE
Actinobacillus pleuropneumoniae
EDTA
% Actividad
(mM)
Control 100
1 99.8
5 94.7
10 76.9
15 46
20 36.6
40 28
60 22.4
EDTA
100
90
80
70
% Actividad
60
50
40
30
20
10
0
0 1 5 10 15 20 40 60
EDTA (m M)
Gráfica 8. EDTA
Fósforo
% Actividad
(mM)
Control 100
10 98.
20 95.8
40 68.8
60 42.5
80 37.8
100 17.7
Fósforo
100
90
80
70
% Actividad
60
50
40
30
20
10
0
0 10 20 40 60 80 100
P(m M)
Gráfica 9 Fósforo
Molibdato de Sodio
% Actividad
(mM)
Control 100
1 94.97
5 91.5
10 90.9
25 89.4
50 84.7
100 80.1
Molibdato de Sodio
100
80
% Actividad
60
40
20
0
0 1 5 10 25 50 100
Molibdato (mM)
Tartrato de Sodio
% Actividad
(mM)
Control 100
20 98.9
40 103.6
60 99.9
80 102.4
100 101.1
Tartrato de Sodio
100
90
80
% Actividad
70
60
50
40
30
20
10
0
0 20 40 60 80 100
resistentes tartrato son de bajo peso molecular inferior a 40 kDa, esto es reforzado
dado que en estudios preliminares se han obtenido datos en ese sentido, que la
enzima en cuestión tiene un peso molecular de alrededor de 40kDa.
7. CONCLUSIONES
9. BIBLIOGRAFIA
BIBLIOGRAFIAS DE INTERNET
ANEXO 1 REACTIVOS
INGREDIENTE CANTIDAD
Infusión de cerebro de 200 g
ternera
Infusión de corazón de res 250 g
Peptona de gelatina 10 g
Cloruro de sodio 5g
Fosfato disodico 2.5 g
Dextrosa 2g
• p-Nitrofenilfosfato 5mM
0.0185g de p-NPP, 10ml de regulador de acetato 0.2M pH 5.5
• p-Nitrofenilfosfato 4mM
0.0148g de p-NPP, 10ml de regulador de acetato 0.2M pH 5.5
• p-Nitrofenilfosfato 3mM
0.0111g de p-NPP, 10ml de regulador de acetato 0.2M pH 5.5
• p-Nitrofenilfosfato 2mM
0.0074g de p-NPP, 10ml de regulador de acetato 0.2M pH 5.5
• p-Nitrofenilfosfato 1mM
0.0037g de p-NPP, 10ml de regulador de acetato 0.2M pH 5.5
Reactivos para la determinación de inhibidores
• Solución tipo Fosforo 5M
6.8g de K2HPO4 , 10ml de agua desionizada.
• EDTA 1mM
0.0018g de EDTA, 5ml de agua desionizada
• EDTA 5mM
0.0093g de EDTA, 5ml de agua desionizada
• EDTA 10mM
0.018g de EDTA, 5ml de agua desionizada
• EDTA 15mM
0.027g de EDTA, 5ml de agua desionizada
• EDTA 20mM
0.0372g de EDTA, 5ml de agua desionizada
• EDTA 40mM
0.074g de EDTA, 5ml de agua desionizada
• EDTA 1M
0.1116g de EDTA, 5ml de agua desionizada
• Molibdato de Sodio 1mM
0.0012g de Molibdato de Sodio, 5ml de agua desionizada
• Molibdato de Sodio 5mM
0.006g de Molibdato de Sodio, 5ml de agua desionizada
• Molibdato de Sodio 10mM
0.012g de Molibdato de Sodio, 5ml de agua desionizada
• Molibdato de Sodio 25mM
0.030g de Molibdato de Sodio, 5ml de agua desionizada
• Molibdato de Sodio 50mM 39
OROZCO SOLIS JENNY BERENICE 38
DETERMINACIÓN DE PARÁMETROS CINÉTICOS DE LA ACTIVIDAD DE FOSFATASA ÁCIDA DE
Actinobacillus pleuropneumoniae
Anexo 2 Técnicas
• Metodo de congelación
Utiliza Glicerol 60% estéril
Se mezcla el cultivo nuevo con el glicerol 1:1, se mete a congelar y se va resembrando
el 1ro en 15 días y los siguientes después de cada semana así se ve cuál es la
resistencia de la bacteria y su resistencia ideal.
• Reactivo de Bradford
Azul de Coomassie G-250
Etanol 95%
Ácido Fosforito (H3PO4) 85%
Disolver 100mg de azul brillante de Coomassie G-250 en 50ml de etanol al 95% a esta
solución se le agrega 100ml de Ácido Fosforito al 85% y aforar con agua destilada a
1Litro.
Agitar durante toda la noche y filtrar la solución con papel Whatman, guardar el
reactivo a 4ºC hasta su uso.
El reactivo se mantiene estable hasta por 6 meses.