PRACTICA N° 1.

AISLAMIENTO DE
S. aureus COAGULASA POSITIVO
 AISLAMIENTO DE S. aureus COAGULASA POSITIVO

CARACTERISTICAS GENERALES

• Pertenece al phylum Firmicutes, clase III Bacilli, orden I Bacillales,

familia VIII Staphylococcaceae .
• 18 especies de importancia en alimentos.
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ECOLOGIA

• Tamaño entre 0,5 a 1,5 μm, no esporulada (asporógena)

e inmóvil.

• Facultativa, mesófila, amplios rangos de pH y Aw.

• Resistente a condiciones ambientales adversas: muy

resistente a la congelación y a la descongelación.
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Crecimiento de S. aureus
Parámetros
Óptimo Rango
Temperatura (°C) 37 7 a 48
pH 6-7 4 a 10
1
0,83 a > 0,99
aw 0,98 2
0,90 a > 0,99
NaCl (%) 0 0 – 20
Potencial redox (Eh) (mV) > + 200 < - 200 a > + 200
Atmósfera Aerobia Anaerobia
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PATOGENICIDAD

• Sustancias asociadas a su virulencia:

 Componentes de la pared
 Exoenzimas: estafiloquinasa, hialoronidasa,
fosfatasas, coagulasas, catalasas, proteasas,
lipasas, nucleasas, leucocidinas y hemolisinas
y enterotoxinas.
 Enterotoxina termoresistente SEA, SEB, SEC,
SED y SEE

• Altamente termorresistentes según el

tipo: 5 - 10 minutos a 121°C hasta
varias horas a 180°C.

• Rango de producción: 10 a 48°C con

un óptimo de producción entre 40 y
45°C.
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SINTOMAS DE LA ENFERMEDAD Y
ALIMENTOS IMPLICADOS

• Vómitos, náuseas, espasmos

abdominales y diarrea.

• Lácteos, principalmente queso, carne

molida insuficientemente cocida,
cárnicos procesados; los alimentos
crudos son un vehículo poco frecuente.

• Alimentos más frecuentes: Productos

que impliquen alta manipulación como
ensaladas, sandwiches, pollo
desmenuzado, arroz con pollo, entre
otros.
PROCEDIMIENTO
 AISLAMIENTO EMPLEANDO EL MÉTODO DE RECUENTO EN
PLACA

• A partir de la muestra tomar, en forma aséptica, 10 g y homogenizar en

90 mL de agua peptonada 0,1% (dilución 10-1). Preparar diluciones 10-2
y 10-3 tomando 1 mL de la dilución respectiva en 9 mL de agua
peptonada 0,1%.
• Inocular en superficie 0,1 mL en caja de petri con agar Baird Parker, de
las diluciones 10-3 y 10-2.
• Repartir el inóculo uniformemente sobre la superficie del agar,
ayudándose del asa de Hockey. Dejar secar las cajas durante 15
minutos.
• Invertir e incubar a 37°C durante 24 a 48 horas.
• Seleccionar las placas que tengan entre 20-200 colonias aisladas y
contar , para el caso del agar Baird Parker, las que sean negras y
brillantes con bordes reducidos blancos, rodeadas de zonas claras que
contrastan con el medio opaco, zona de precipitado; Tomar un mínimo
de tres colonias típicas y realizar la prueba de la coagulasa
 AISLAMIENTO EMPLEANDO METODO DEL NÚMERO MÁS
PROBABLE (NMP)

PRUEBA PRESUNTIVA

• A partir de las diluciones preparadas, inocular 1 ml de cada dilución

sobre 3 tubos conteniendo 10 mL de caldo de enriquecimiento
Giolitti –Cantoni.
• Cubrir cada tubo con una capa de parafina estéril y dejar solidificar
para evitar el crecimiento de Micrococcus spp.
• Incubar todos los tubos a 35ºC +/- 2ºC por 24 - 48 horas. El
ennegrecimiento del medio pone de manifiesto la posible presencia
de S. aureus al reducir el telurito a teluro metálico.
• Realizar lectura de los tubos que presenten ennegrecimiento en
cada serie de tres tubos y confrontar los resultados con la tabla del
NMP.
PRUEBA CONFIRMATIVA

• A partir de los tubos que a las 48 horas presenten ennegrecimiento

remover la capa de parafina e inocular 0.1 mL en placas de Petri que
contengan Agar Baird Parker.
• Incubar a 35ºC +/- 2ºC por 24 - 48 horas, haciendo lectura a las 24 horas.
• Observar colonias típicas y de estas tomar algunas colonias inoculando
en caldo BHI para su confirmación.
• Realizar prueba de coagulasa y termonucleasa.
 PRUEBA DE LA COAGULASA

• La coagulasa es una enzima que coagula el plasma humano y de

conejo, al transformar el fibrinógeno a fibrina produciendo la
formación de un coágulo y está relacionada con la producción de
enterotoxina por parte de S.aureus.

• Transferir el número de colonias a confirmar en el mismo número de

tubos que contienen 5 mL de Caldo Infusión Cerebro Corazón (BHI).
Incubar a 35 ± 2ºC durante 18-24 horas.
• Pasado este tiempo pasar 0,3 mL de cada caldo BHI a tubos que
contienen 0,3 mL de plasma deshidratado de conejo-EDTA. Incubar
a 35 ± 2ºC.
• Observar cada hora durante seis horas, en caso negativo descartar
hasta las 24 horas. Una vez finalizado el tiempo de incubación,
realizar la lectura, con base en los tubos que presenten coagulación
del plasma.
 ACTIVIDAD TERMONUCLEASA

La termonucleasa es una enzima que se caracteriza por depolimerizar el

ADN y por su termorresistencia (desoxirribonucleasa); es elaborada
principalmente por las cepas patógenas de S. aureus.

Técnica

Método A
• A partir de las colonias típicas crecidas sobre el medio selectivo, sembrar
en estrías radiales o en una sola estría, sobre la superficie de agar DNAsa.
• Incubar a 37°C durante 18 a 24 horas.
• Añadir sobre el crecimiento ácido clorhídrico 1N y se espera unos
minutos a que se produzca la reacción, que consiste en la aparición de
una zona transparente alrededor, lo que indica que la bacteria en
estudio ha liberado Desoxirribonucleasa. Se puede sustituir el ácido
clorhídrico 1N por solución de azul de Toluidina. En este caso la reacción
positiva se manifiesta por la aparición de un halo rosa que rodea la zona
de crecimiento.
Método B

• La cepa se siembra sobre el medio de Baird Parker. Incubar a 37°C.

• Cuando las colonias se hacen visibles, sin tener en cuenta la formación
de zonas de aclaramiento, se coloca la placa en incubadora a 60°C
durante 2 horas.
• Pasado este tiempo, cubrir la superficie del medio con una capa de
agar DNAsa Azul de Toluidina. Cuando se solidifique la capa de agar,
incubar la placa a 37°C/3-4 horas. La reacción positiva se manifiesta
por la aparición de un halo rosa alrededor de las colonias, lo que indica
que la cepa en estudio ha elaborado una DNAsa termorresistente.

Método C

• Preparar placas de DNAsa Azul de toluidina, dejar solidificar.

• Con tubos capilares perforar el medio.
• Hervir durante 15 minutos el caldo BHI (después de incubado con la
cepa en cuestión).
• Tomar 3 µL del caldo BHI e inocular en cada perforación.
• Incubar a 37°C durante 3 a 4 horas.
• La aparición de un halo rosa alrededor de la perforación indica
termonucleasa positiva.