Engenharia Enzimática

Imobilização de enzimas

Prof. Karina G. Fiametti Colombo

Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia
 Sumário

1. Introdução
2. Métodos de imobilização
3. Suportes para a imobilização de enzimas
4. Efeitos da imobilização de enzimas
5. Exemplo de imobilização
 Definição:

• Entende-se por enzima imobilizada, aquela física ou

quimicamente associada a um suporte ou matriz ,
usualmente sólida, insolúvel em água e inerte, que
não seja essencial a sua atividade.

Objetivos da imobilização :
1- Reutilizar a enzima (enzimas são caras)
2- Aumento da estabilidade
3 – Remover a enzima que permanece contaminando o
produto (custo extra de purificação)
 Histórico do uso de enzimas
imobilizadas
1- Em 1916, ocorreu a primeira utilização de enzima imobilizada
(invertase em carvão vegetal).

2- Em 1969, os processos com enzimas imobilizadas também têm

utilização industrial em larga escala usando L- aminoacilase
imobilizada em DEAE–Sephadex para produção L-
aminoácidos.

• Quase simultaneamente foi colocado em operação ao

mesmo tempo o processo de produção de xaropes de frutose a
partir de amido de milho usando glicose isomerase
imobilizada.

3- Maior uso de enzimas imobilizadas é na produção de xaropes

de frutose através da glicose-isomerase imobilizada é realizada
em grande escala nos Estados Unidos
Vantagens e desvantagens do uso de
enzimas imobilizadas
VANTAGENS

• Desenvolvimento de sistemas contínuos

• Maior estabilidade enzimática
• Uso mais eficiente do catalisador através de reutilizações
• Efluentes livres de catalisadores
• Maior versatilidade na etapa de separação

DESVANTAGENS

1) Custo adicional do suporte, reagentes e da operação de imobilização

2) Perdas de atividade durante a imobilização
3) Técnica pouco adequada a substratos insolúveis ou de alta massa molar
4) Maiores riscos de contaminação na operação contínua de reatores
5) Restrições difusionais
Escolha dos métodos e suportes para
imobilização

• Dependerá das características das enzimas e

das condições de uso da enzima imobilizada;

• O binômio suporte-método mais adequado será

aquele que propiciar uma maior atividade após
imobilização
 Suportes para Imobilização

• Enzima Suporte

Propriedades Características
bioquimicas químicas

Tipo de reação e cinética Propriedades

mecânicas

Métodos Efeitos de transferência Estabilidade

imobilização de massa operacional

Desempenho
- rendimento
- capacidade de carga
 Suportes para imobilização de enzimas
1. Inerte.
2. Fisicamente forte e estável.
3. Baixo custo.
4. Melhor se puder ser regenerada após o uso e meia-vida
da enzima.
5. Superfície disponível para a enzima.

Adsorção de enzimas em suportes insolúveis

1) Misturar a enzima com o adsorvente (em condições
apropriadas de pH e força iônica)
2) Incubar
3) Lavar a enzima que não ficou ligada ou que ficou
fracamente ligada
 Critérios para avaliação de um
sistema enzima-suporte
•Estabilidade de fixação - a enzima deve estar bem fixa ao
suporte.

•Estabilidade enzimática - a enzima não deve sofrer

modificações como desnaturação.

•Resistência mecânica - o suporte deve resistir a várias

condições desfavoráveis como, o peso do suporte dentro do
reator.

•Capacidade de carga - o suporte deve fixar um número

elevado de unidades enzimáticas por unidade de área - um
pequeno reator uma grande capacidade catalítica.
Suportes de Imobilização
 Tipos de suportes

silica
Alumina
vidro

Fibra de casca de coco

 Efeitos causados pela imobilização
Retenção da Atividade Enzimática

1) algumas moléculas enzimáticas podem estar imobilizadas em

uma configuração que impede completamente o acesso do
substrato ao centro ativo;

2) o grupo reativo do centro ativo pode estar envolvido a ligação

ao suporte

3) moléculas da enzima podem ter se ligado em uma configuração

que as torne inativas;

4) as condições de reação no processo de imobilização podem

causar desnaturação ou inativação.
Parâmetros cinéticos para a invertase livre e imobilizada

Parâmetro Invertase livre Invertase imobilizada

KM 26 mM 8,1 mM (alginato de cálcio)
52,2 (quitina)
32,2 (polietileno ativado)
Vmax 1,1 U 0,25 (alginato de cálcio)
0,74 (quitina)
0,32 (polietileno ativado)
(Vitolo, 2001)
 Por Oclusão ou Aprisionamento - encapsulamento
Oclusão em matrizes:
Podem ser géis (amido, borracha, nylon, poliacrilamida, sílica, alginato
de cálcio, agarose, polietileno glicol) ou fibras.
Nos géis ocorre o aprisionamento da enzima nos espaços intersticiais
da rede polimérica (enzima confinada no interior de micelas),
enquanto que nas fibras o aprisionamento se dá nas micro-cavidades.
Microencapsulamento
Reticulação ou ligação cruzada
 Adsorção física
Utiliza força de Van der Waals; método simples que se baseia
na adsorção física em superfícies sólidas, como alumina,
carvão, argila, sílica gel, colágeno, vidro, por ligações iônicas,
polares ou de Van der Waals.

Ligação Iônica

Ligação de grupos com cargas opostas através de forças

eletrostáticas. Processo simples, suave e não deletério para
a maioria das enzimas, sendo inclusive desprezíveis os
efeitos difusionais.
Ligação Metálica

Forma quelatos pela ativação da superfície do suporte

por meio do metal ou por seu óxido.

Nos dois primeiros métodos por adsorção, as forças são

fracas levando a pequenas modificações
conformacionais na enzima e, conseqüentemente,
possibilidade de dissolução da mesma (perda).

De uma forma geral, os processos de imobilização

por ligação são preferidos quando se confronta
eficiência, apesar da inclusão em géis ou matrizes
ser mais barato.
Atividade:

Para amanhã, 07/11:

Buscar um artigo sobre imobilização enzimática,
em grupos de 4 alunos e trazer para a aula para
discutirmos.
1 grupo: site Novozymes: buscar os tipos de
suportes utilizados, bem como a área superficial
da enzima imobilizada.
 Efeitos difusionais
• Quando a enzima é imobilizada, o substrato tem que
difundir na solução através de um filme líquido
estacionário presente nas superfícies do suporte e, se
este é poroso, através dos poros até alcançar o sitio
ativo das enzimas - pode restringir a taxa de reação

• velocidade de difusão do substrato < velocidade de

transformação pela enzima - Vmáx mais baixa -não se
atinge a saturação.

• efetividade (f) = (v’) / (v), f é função de [S]

 Resistência difusional
• Efeitos difusionais Externos
Surgem devido ao fato de que o substrato deve ser
transportado do seio da solução até a superfície de
catalise,devendo, por conseguinte atravessar uma camada
líquida, assim o consumo de substrato através da membrana
líquida pode ser imaginado como resultado de um gradiente.

• Os efeitos de difusão externa afetarão o transporte de massa e

podem ser minimizados tanto pelo aumento da agitação, caso
de reatores continuamente agitados (CSTR), quanto pelo
aumento do fluxo de substrato, caso do reator pistonado (PFR).

• Efeitos Difusionais Internos

Surgem devido à movimentação do substrato no interior do meio
catalítico. - difusão e reação ocorre simultaneamente
• Efeitos Microambientais
A enzima ao ser imobilizada passa a ser circundada por um
ambiente diferente do que quando estava livre, especialmente se a
matriz ou suporte possui carga.

Os efeitos de circunvizinhança, que dependem da natureza física e

química do suporte, podem acarretar uma distribuição desigual do
substrato, produtos e cofatores entre a região vizinha ao sistema
imobilizado e o resto da solução.

• Efeitos Acessibilidade
resultado de impedimento físico, formado pelo suporte, ao acesso
de moléculas grandes ao centro ativo da enzima.

• Efeitos na Estabilidade
enzimas durante a imobilização apresentem mudanças na
estabilidade térmica.
 Alguns usos industriais das enzimas imobilizadas
Enzima EC number Produto

Aminoacilase 3.5.1.14 L-Aminoacidos

Aspartato amonia-liase 4.3.1.1 L-Aspartico

Aspartato 4-decarboxilase 4.1.1.12 L-Alanina

Glucoamilase 3.2.1.3 D-Glucose

Glucose isomerase 5.3.1.5 Xarope de frutose
Hidantoinasea 3.5.2.2 D- e L-amino acidos
Invertase 3.2.1.26 Açúcar invertido
Lactase 3.2.1.23 leite e soro
Lipase 3.1.1.3 Cocoa butter substitutes
Nitrile hidratase 4.2.I.x Acrilamida
Penicilina amidases 3.5.1.11 Penicilinas
Rafinase 3.2.1.22 Rafinose-free solutions
Termolisina 3.2.24.4 Aspartame
• http://www.chiralvision.com/index.htm
ChiralVision offers a range of immobilized
enzymes under the name Immozymes.
Immobilization offers easier separation
and reuse of enzymes thereby making
your production process more cost
effective. Additionally process conditions
can be chosen with increased flexibility.
 Lignocelulosico pre-tratado

imobilizada

Estabilidade térmica
(a 50, 55, 60 e 65 oC)

Perda de atividade a cada

ciclo de uso da enzima devido
a etapa de precipitação para
recuperação da enzima
imobilizada