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METODOLOGIA

BIOPROCESO

El proceso de producción de bio-butanol se compone básicamente de un proceso de


fermentación ABE, es decir, un proceso biocatalítico que se da por la acción
combinada de un grupo de bacterias anaeróbicas para procesar los hidratos de
carbono y producir solventes como: la acetona, butanol y etanol.

PRETRATAMIENTO
Para llevar a cabo los procesos de obtención del butanol basados en la fermentación del
lactosuero es conveniente realizar un fraccionamiento previo total o parcial, con el fin de extraer
y/o concentrar los componentes que han de ser utilizados como sustrato. El fraccionamiento
convierte al lactosuero en una materia prima útil, logrando lactosueros desproteinizados,
desmineralizados, y con altas concentraciones de lactosa [1].

El lactosuero se pretrato por medio de hidrólisis, logrando obtener una fuente de nitrógeno
adecuado para promover el crecimiento, y eliminar o reducir la necesidad de costosos
suplementos.

Con el fin de adecuar el inóculo al sustrato y despertar el metabolismo del consorcio, se


hace necesario el pre tratamiento de cada uno. Se utilizó una cepa mutante de clostridium
acetobutylicum ATCC 824 resistente.

La cepa de C. acetobutylicum ATCC 824 es resembrada con una periodicidad de 14 dias


sobre medio solido para C. acetobutylicum. Cada resiembra es incubada a 35-37ºC
durante 48 horas en condiciones de anaerobiosis y posteriormente almacenada en
refrigeración a 4ªC hasta su uso.

Para el uso del suero de leche fresco se mantiene en refrigeración a 4ºC hasta ser
utilizado. Se realiza una desproteinización ajustando el pH del mismo a 5.2 empleando
HCl 1M y se esteriliza en autoclave a 14psi-115ºC durante 15 minutos, esta temperatura
no debe pasar de este punto ya que es posible que puedan caramelizarse los azucares
del suero.
Al ajustar el pH a este valor se busca retirar la mayor cantidad de proteínas presentes en
el lactosuero como por ejemplo la β-lactoglobulina que es la más abundante en este y
presenta una concentración de 2 a 4 mg/mL; algunas otras proteínas que no son retiradas
en este proceso, sirven como fuente de nitrógeno para el microorganismo.
Una vez se esteriliza el suero, se filtra para eliminar las proteínas precipitadas filtrándolas
en primera instancia con manta de cielo para retener las partículas de mayor tamaño y
posteriormente empleando filtro cuantitativo, todo esto en condiciones asépticas y con
material esteril.
Posteriormente el pH del suero es reajustado a 7.0 empleando NaOH 1M esteril para ser
almacenado en refrigeración a 4ºC como se dijo en un principio para ser empleado en las
fermentaciones.

La hidrólisis enzimática de la proteína de suero se realizó usando Flavourzyme (1000 LAPU / g,


Novozymes Australia Ltd., producida por Aspergillus oryzae, que contiene actividades endo y
exopeptidasa). Se añadió una enzima de 0,01, 0,02 y 0,05% al lactosuero y se incubó a 50 ° C en un
baño de agua durante 30 minutos. Después de 30 min de hidrólisis, el pH se reajustó a 7,0 usando
NaOH 0,5 N. Se anotó la cantidad de base requerida para recuperar un pH de 7.0. Posteriormente,
el hidrolizado se calentó a 85°C durante 6 a 7 minutos para inactivar la enzima y detener la
hidrólisis adicional. Las muestras enfriadas se mantuvieron en congelación (−20 ° C) para un
análisis adicional.

El porcentaje del grado de hidrólisis (GH) que se define como el porcentaje de enlaces peptídicos
que son rotos por la enzima se determina de acuerdo con el método de consumo de base según la
técnica de pH stat de Adler-Nissen (1986). El cálculo del GH se realizó de la siguiente manera y se
expresó como porcentaje.

𝐺𝑟𝑎𝑑𝑜 𝑑𝑒 ℎ𝑖𝑑𝑟ó𝑙𝑖𝑠𝑖𝑠 (𝐺𝐻) = 𝐵 × 𝑁𝑏 × (1/𝛼) × (1/𝑀𝑃) × (1/ℎ𝑡𝑜𝑡) × 100

Donde B es el consumo de base en ml (NaOH); Nb, es la normalidad de la base (0.5 N); MP, masa
total de proteína hidrolizada en g; htot, número total de enlaces peptídicos en el sustrato proteico
( meq / g proteína para el lactosuero htot = 8,8 ); α, grado medio de disociación de los grupos α-
NH2. Estos se calcularon tomando los valores de pKa para diferentes aminoácidos a diferentes
temperaturas y el pH y el factor 1 / α de 2.27 se consideró como factor de calibración a pH 7.0 y
50° C (Adler-Nissen 1986).

El contenido de proteína del lactosuero se determinó según el método descrito por Lowry et al.
(1951) utilizando el reactivo de Folin-Ciocalteu comercial.

Ghosh, B. C., Prasad, L. N., & Saha, N. P. (2017). Enzymatic hydrolysis of whey and its
analysis. Journal of food science and technology, 54(6), 1476–1483. doi:10.1007/s13197-017-
2574-z