Universidad de Chile

Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas

ESTRÉS DE RETÍCULO ENDOPLÁSMICO: UNA NUEVA VÍA

PARA ACTIVAR LA AUTOFAGIA MEDIADA POR CHAPERONA

Tesis para Optar al Grado Académico de Magíster en Bioquímica

Área de Especialización: Proteínas y Biotecnología

Memoria para Optar al Título de Bioquímica

ANDREA ELÍZABETH RODRÍGUEZ VILLARROEL

Director de Tesis
Dr. Sergio Lavandero González

2008
Dedicada a mi Madre
AGRADECIMIENTOS

Quiero agradecer en primer lugar al director de la tesis Dr. Sergio Lavandero, por la
confianza depositada en mí, por la preocupación por mi trabajo y mi bienestar personal,
y por sus valiosos consejos.

Mis sinceros agradecimientos a las integrantes de mi comisión. Dra. María Antonieta

Valenzuela, Dra. Jenny Fiedler y Dra. Margarita Vega, por la discusión crítica pero
constructiva de mi trabajo. Muchas gracias también por sus buenos consejos.

Agradezco especialmente a todos mis compañeros de Laboratorio, por la generosidad

con la que me han ayudado con sus conocimientos y por el cariño que me han
brindado.

Agradezco también a todos mis amigos y amigas por su apoyo incondicional, compañía
y cariño.

Finalmente quiero agradecer a mi familia, especialmente dar gracias a la lealtad y

cariño de mi hermano René, mi sobrina Michelle y de mi mamá. Porque todo lo que he
logrado en mi vida es gracias a ellos.
ÍNDICE GENERAL

ÍNDICE GENERAL iv
ÍNDICE DE FIGURAS vi
ÍNDICE DE TABLAS vii
ABREVIATURAS viii
RESUMEN x
SUMMARY xii

1 INTRODUCCIÓN 1
1.1 Importancia y consecuencias de mantener la calidad de las proteínas 1
1.2 El Retículo Endoplásmico, un organelo clave en la síntesis de proteínas 1
1.3 El correcto plegamiento es dirigido por chaperonas moleculares 2
1.4 Perturbaciones en el RE generan agregación de proteínas 3
1.5 La célula posee vías de degradación para eliminar proteínas agregadas 6
1.6 La autofagia mediada por chaperonas es un mecanismo selectivo de 8
degradación de proteínas
1.7 Mecanismos de degradación asociados al Retículo Endoplásmico 10

2 HIPÓTESIS 12

3 OBJETIVO GENERAL 12

4 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 12

5 MATERIALES Y MÉTODOS 13
5.1 Cultivo celular e inducción in vitro de estrés de retículo 13
5.2 Viabilidad celular 14
5.3 Ciclo celular y apoptosis 15
5.4 Western blot 15

iv
5.5 Densitometría 20
5.6 Fraccionamiento subcelular 20
5.7 Inmunocitoquímica 21
5.8 Producción y transducción lentiviral 21
5.9 Tratamiento de células MEF m5-7 23
5.10 Análisis estadístico 24

6 RESULTADOS 25
6.1 Estandarización de un modelo in vitro de ERE 25
6.2 Estudio de la autofagia mediada por chaperonas en células NIH3T3 31
expuestas a ERE
6.3 Estudio de la participación del ERE en la activación de la autofagia 38
mediada por chaperona mediante la intervención de elementos de estos
sistemas

7 DISCUSIÓN 45

8 CONCLUSIONES 51

9 REFERENCIAS 53

10 FINANCIAMIENTO 58

v
ÍNDICE DE FIGURAS

Figura 1 Respuesta del retículo endoplásmico a proteínas mal plegadas 5

Figura 2 Diferentes subtipos de autofagia 7

Figura 3 Tapsigargina aumenta los niveles proteicos de Chop en células NIH3T3 27

Figura 4 Efecto de la Tapsigargina (estímulo de ERE) en la viabilidad de células 28

NIH3T3

Figura 5 Efecto de la tapsigargina en la apoptosis de células NIH3T3 29

Figura 6 Ciclo celular en células NIH3T3 sometidas a ERE con tapsigargina 30

Figura 7 Tapsigargina aumenta los niveles de Lamp2A en células NIH3T3 32

Figura 8 El tratamiento con tapsigargina aumenta los niveles totales de Lamp2A 33

Figura 9 Tapsigargina aumenta la presencia de Lamp2A en la fracción lisosomal 34

en células estimuladas con TG 0,1 µM por 8 h

Figura 10 Lamp2A se localiza en los lisosomas 35

Figura 11 El tratamiento con tapsigargina redistribución de Hsc70 hacia los 36

lisosomas HSC70

Figura 12 El tratamiento con tapsigargina no cambia los niveles totales de HSC70 37

Figura 13 Generación de células knock down para Lamp2A 40

Figura 14 Efecto de la tapsigargina sobre los niveles de CHOP y LC3 I/II en 41

células carentes de Lamp2A

Figura 15 Efecto de la doxiciclina en la expresión de ATG5 en células MEF m5-7 42

Figura 16 Efecto de la TG en los niveles de Lamp2A en células carente de ATG5 44

Figura 17 Modelo Propuesto 52

vi
ÍNDICE DE TABLAS

Tabla 1 Fórmula de preparación de cada SDS-PAGE 17

Tabla 2 Volumen de Tampón Ripa según el tipo de placa de cultivo 18

Tabla 3 Anticuerpos primarios y secundarios usados en la tesis 19

Tabla 4 Cantidad de plasmidio usado para la transfección lentiviral 22

vii
ABREVIATURAS

ABA Acrilamida-bisacrilamida
AMC Autofagia Mediada por Chaperonas
AP-1 Proteína activadora
ATF Factor que activa la transcripción
ATG Proteínas relacionadas a la autofagia
ATP Adenosina trisfosfato
BIP Proteína que une la cadena pesada de la Inmunoglobulina
BSA Albúmina de suero bovino
CHOP Proteína homóloga a C/EBP
DMEM “Dulbecco's Modified Eagle's Medium”
DMSO Dimetilsulfóxido
DNA Ácido desoxirribonucleico
DOXI Doxiciclina
ECL Sustrato quimioluminicente
EDEM Proteína similar a α-manosidasa que aumenta la degradación del RE
EDTA Acido etilendiamino tetraacético
eIF Factor iniciador eucariótico
ERAD Degradación asociada al Retículo Endoplásmico
ERE Estrés de Retículo Endoplásmico
ET Extracto total
HSC Isoforma constitutiva de la familia de proteínas del shock térmico
HSP Proteína del shock térmico
IRE Proteína que requiere inositol
iRNA Interferente de RNA
I-kappaB Inhibidor del factor kappa B
JNK Proteína quinasa del N-terminal de c-Jun
L Lisosoma
LAMP Proteína de membrana lisosomal
LC3 Cadena liviana 3
LUC Luciferasa

viii
MAPK Proteína quinasa activada por mitógenos
MEF Fibroblastos embrionarios de ratón
mRNA RNA mensajero
NCS Suero de becerro recién nacido
NF-kappaB Factor nuclear kappa B
PBS Tampón fosfato salino
PERK Quinasa de RE similar a PKR
PVDF Fluoruro de polivinilideno
PI Yoduro de propidio
PKC Proteína quinasa C
PMSF Fluoruro de fenilmetilsulfonilo
PN Post-nuclear
PSA Persulfato de amonio
RE Retículo endoplásmico
RNA Ácido ribonucleico
RPM Revoluciones por minuto
SDS Dodecilsulfato de sodio
TBS Tampón tris salino
TG Tapsigargina
TRIS Tris borato EDTA
UPR Respuesta a proteínas mal plegadas
XBP Proteína que se une a la caja X

ix
RESUMEN

Para mantener la integridad, la célula debe controlar la cantidad y calidad de las

proteínas. El Retículo Endoplásmico (RE) es el organelo en donde se sintetizan todas
las proteínas transmembrana y la mayoría de las proteínas secretadas. Cuando se
altera la homeostasis del Retículo Endoplásmico se produce una acumulación de
proteínas mal plegadas en su lumen. Como respuesta a este estrés se activa una vía
de señalización RE-núcleo, en la que se bloquea la expresión general, aumenta la
expresión de chaperonas y se activan las vías proteolíticas del proteasoma y
macroautofagia. Un método para producir Estrés en el Retículo Endoplásmico (ERE)
es la eliminación del calcio reticular, necesario para el correcto plegamiento proteico.

La autofagia mediada por chaperonas (AMC) es un sistema proteolítico que

requiere la acción de chaperonas citosólicas para seleccionar, desplegar y dirigir
proteínas mal plegadas al interior del lisosoma. Sus actores principales son el receptor
lisosomal Lamp2A y la chaperona Hsc70. Se ha descrito la activación de AMC durante
la privación prolongada de suero y durante el estrés oxidativo, pero no existen
antecedentes de la activación durante el ERE, lo cual constituye el objetivo de esta
tesis.

Se usó como modelo de estudio células NIH3T3. En estas células se indujo

ERE con Tapsigargina (TG), eliminando el calcio en el RE. Mediante western blot se
comprobó la aparición de Chop, un factor transcripcional usado clásicamente como
marcador de ERE. TG no aumentó la muerte celular, pero produjo un bloqueo en la
división celular, deteniendo el ciclo en la etapa G1. Lo anterior se observó mediante
citometría de flujo, usando yoduro de propidio como trazador.

Mediante inmunocitoquímica y western blot se observó un aumento en los

niveles totales de Lamp2A. Esto se relaciona al aumento de Lamp2A en la fracción
lisosomal. Además la chaperona Hsc70 se relocaliza hacia la fracción lisosomal en
respuesta al estímulo con TG. Estos eventos, el aumento del receptor Lamp2A y
relocalización de la chaperona Hcs 70, se han relacionado anteriormente con aumento
en la actividad de AMC.

x
 Células que expresan constitutivamente un iRNA contra Lamp2A, lo que las
hace deficientes en AMC, aumentan la macroautofagia basal. La compensación de
macroautofagia es mayor durante un evento de ERE. La mayor actividad de la
macroautofagia se refleja en una menor expresión de Chop, que pudiese estar siendo
degradado por macroautofagia.

Células carentes de ATG5, que no activan macroautofagia, aumentan los

niveles totales de Lamp2A. Este es un mecanismo compensatorio, que activa la AMC
cuando la macroautofagia no está presente. Sin embargo, la TG disminuyó los niveles
totales de Lamp2A. Este inesperado comportamiento puede estar ligado a la activación
del proteasoma.

En síntesis, esta tesis muestra el primer indicio de la activación de AMC durante

un evento de ERE. Esta activación esta dada principalmente por un aumento en los
niveles de Lamp2A, que solo se ha visto durante estrés oxidativo. Además muestra que
las vías degradativas se comunican para eliminar las proteínas mal plegadas durante el
ERE.

xi
SUMMARY

To maintain the integrity, cells must control the quantity and quality of the
proteins. Endoplasmic Reticulum (ER) is the organelle where all transmembrane protein
and the most secretory protein are synthesized. Disturbances in the ER homeostasis
lead to the accumulation of disfolding proteins in its lumen. In response to this stress a
reticulum-nucleus signaling pathway is activated, inducing the selective expression of
some genes (i.e. those related to chaperones) and the stimulation of proteolytic
systems, including proteasome and macroautophagy. The removal of the calcium
reticulum, necessary for the correct protein folding, produces ER stress.

Chaperone-mediated autophagy (CMA) is another proteolytic system that

requires the action of cytosolic chaperones to select, unfold and pull the unfolded
substrate into the lysosomes. Its principal actors are the lysosomal receptor Lamp2A
and the chaperone Hsc70. CMA is activated by long serum deprivation and oxidative
stress. However it remains unknown whether CMA is stimulated during the ER stress,
which it is the main aim of this thesis.

The NIH3T3 cells were the study model used. In these cells, Thapsigargin (TG)
induces ER stress through the removal ER calcium. Western blot showed an increase
in the Chop level, a classic ER stress transcriptional factor. TG didn’t stimulate cell
death but arrested cell cycle at G1 stage. This was showed through FACS, using
propidium iodide dye.

Immunocytochemistry and western blot studies showed that TG increases the

Lamp2A total levels. Another observation is the increase of Lamp2A level in the
lysosomal fraction. Also, we have seen increases in the hsc70 localization in to the
lysosomal fraction. These events, the rise in Lamp2A levels and Hsc70 lysosomal
localization, previously have being related with an increase in the CMA activity.

Constitutive Lamp2A-siRNA cells, CMA deficient cells, increased basal

macroautophagy. Also this macroautophagy compensation is most important during ER
stress. The higher macroautophagy activity was associated with low expression of
Chop, showing a probable degradation the Chop by macroautophagy.

xii
 ATG5 knock out cells, macroautophagy deficient cells, showed an increase in
the Lamp2A total levels. This cells revealing a compensatory effect of the CMA when
the macroautophagy is inactive. However, TG produces a decrease of the levels of
Lamp2A.This unexpected behavior is probably related to the proteasome activation.

In synthesis, this tesis show by the first time the CMA activation during ER
stress. This activation is related to the total Lamp2A increase, only before seen in
oxidative stress. Also we show the connection between the proteolytic pathways in the
unfolding protein degradation, during ER stress.

xiii
1. INTRODUCCION

1.1. Importancia y consecuencias de mantener la calidad de las proteínas

Para que las proteínas cumplan adecuadamente sus funciones celulares se

requiere de mecanismos que controlen su síntesis, correcto plegamiento y
degradación. Alteraciones en cualquiera de estos pasos conducen a la agregación de
proteínas, trastornando la homeostasis hasta el punto de comprometer la viabilidad
celular.

Las células post-mitóticas son especialmente vulnerables al efecto dañino de

los agregados y/o proteínas mal plegadas, debido a su incapacidad de diluir las
especies potencialmente dañinas mediante la división celular. Un ejemplo clásico de
patologías producidas por agregados proteicos son las enfermedades
neurodegenerativas. En las enfermedades de Alzheimer, Huntington y priones, entre
otras patologías, se produce acumulación de proteínas mal plegadas en inclusiones
amiloidales, que tienen un efecto tóxico para las neuronas (1).

Asimismo, el proceso de envejecimiento produce acumulación de proteínas,

debido a una disminución en la actividad de las chaperonas moleculares y las vías
degradativas (2).

1.2. El retículo endoplásmico, un organelo clave en la síntesis de proteínas

El retículo endoplásmico (RE) tiene un papel central en la biosíntesis de lípidos

y proteínas. Además actúa como un reservorio de calcio intracelular, necesario para
variados eventos de señalización. El RE está formado por túbulos membranosos que
continúan la membrana nuclear externa y que se extienden formando una red a través
de todo el citosol. La membrana del RE es el lugar donde se producen todas las
proteínas de transmembrana y la mayoría de los lípidos de los organelos subcelulares.
Casi todas las proteínas secretadas, además de las destinadas al lumen del Golgi o
lisosoma, tienen como primer destino el lumen del RE (3).

Las proteínas que residen en el RE tienen una señal de retención, compuesta

por 4 aminoácidos en su extremo C-terminal. Muchas de estas proteínas funcionan

1
como catalizadores, ayudando en el transporte co-traduccional hacia el RE, o bien en
las modificaciones y plegamiento post-traduccional (3). En el lumen del RE, las
proteínas se ensamblan y oligomerizan, se forman enlaces bisulfuro y se agregan N-
glicosilaciones. Además se produce el corte de secuencias señal y la isomerización de
aminoácidos (4).

1.3. El correcto plegamiento de proteínas es dirigido por chaperonas moleculares

Si bien la secuencia peptídica posee toda la información necesaria para que las
proteínas adopten su estructura terciaria, el ambiente celular hace que este proceso no
sea espontáneo. Las chaperonas moleculares son las encargadas de escoger el lugar
y el momento adecuado en que las proteínas deben plegarse (5).

Las chaperonas son abundantes en el citoplasma, mitocondria y retículo

endoplásmico, pudiendo aumentar sus niveles frente a condiciones de estrés. Existen
6 grandes familias de chaperonas moleculares llamadas Hsp (proteínas del shock
térmico), que se clasifican por su peso molecular, Hsp100, Hsp90, Hsp70, Hsp60,
Hsp40 y las pequeñas Hsp. Estas proteínas se unen a los polipéptidos y dirigen su
plegamiento de una manera dependiente de ATP (2).

BIP (proteína que une la cadena pesada de la Inmunoglobulina) es la

chaperona molecular más importante del RE. BIP integra la familia de chaperonas
Hsp70 y cumple diversas funciones, siendo la más importante ayudar al ingreso de las
proteínas recién sintetizadas al lumen del RE (6). Además BIP reconoce proteínas
incorrectamente plegadas, mediante la unión a secuencias expuestas que
normalmente están ocultas en el interior de la estructura de la proteína (7). Otras
chaperonas importantes del RE son la calnexina y la calreticulina, que son
dependientes de calcio y que se unen carbohidratos de glicoproteínas
incompletamente plegadas, reteniéndolas en el RE (3).

Bajo ciertas condiciones de estrés donde las chaperonas no pueden resolver el

mal plegamiento, estas despliegan y guían su sustrato hacia las vías de degradación
de proteínas (2), mecanismo que es descrito más adelante en el texto.

2
1.4. Perturbaciones en el retículo endoplásmico generan agregación de proteínas

Pese a la ayuda de las chaperonas, más del 80% de las moléculas proteicas
ingresadas al RE, no logra su correcto estado de plegamiento (3). Cuando además se
altera la homeostasis del RE, que impide que éste trabaje de manera óptima, se
produce una acumulación excesiva de proteínas mal plegadas en su interior. Esta
alteración se conoce como Estrés de Retículo Endoplásmico (ERE) y se produce por
cambios en la concentración de calcio, alteraciones en el estado redox que impiden la
formación de enlaces bisulfuro, alteraciones en la glicosilación o en el transporte al
complejo de Golgi.

Como UPR (en inglés “unfolded protein response”) se conoce a la respuesta

celular en respuesta al ERE. La UPR es una vía de señalización entre el RE y el
núcleo, que produce una inhibición general de la traducción, excepto por la expresión
de chaperonas del RE, y elementos necesarios para degradación de proteínas (8). En
células animales, PERK (quinasa de RE similar a PKR), IRE1 (proteína que requiere
inositol-1) y ATF6 (factor que activa la transcripción 6) sensan la presencia de
proteínas mal plegadas en el lumen del RE y traducen señales al citoplasma y al
núcleo. En condiciones basales, los receptores se encuentran inactivos gracias a la
unión de BIP (7) (Figura 1).

Al activarse, PERK se oligomeriza y activa la función quinasa de su dominio

citosólico. PERK fosforila al factor de iniciación traduccional eIF2α (factor iniciador
eucariótico 2), un cofactor ubicuo requerido para el ensamblaje de la subunidad 80S
del ribosoma al codón iniciador del mRNA. La fosforilación de eIF2α inhibe su función
y disminuye la síntesis proteica en la célula (9, 10). Un pequeño grupo de mRNAs, que
tienen un marco de lectura abierto en el extremo 5´ no traducido, aumenta su
traducción cuando eIF2α está fosforilado. Entre estos mRNA se encuentra ATF4, un
factor transcripcional cuyos blancos incluyen chaperonas del RE (11).

IRE1 lidera la vía de señalización de la UPR filogenéticamente más conservada.

La oligomerización y autofosforilación del sensor IRE1, activa un dominio
endoribonucleasa en su porción citosólica. Este dominio genera el corte del mRNA de
XBP1 en dos posiciones, produciendo la eliminación de un intrón. Los exones
resultantes son unidos por una RNA ligasa, generando un mRNA para un factor
3
transcripcional que promueve la expresión de chaperonas y otros genes de la UPR (12,
13).

En respuesta a ERE, ATF6 se moviliza desde el RE al Golgi, donde proteasas

específicas cortan su dominio transmembrana, y el fragmento N-terminal migra al
núcleo, actuando como factor transcripcional de genes que aumentan la capacidad de
RE para plegar proteínas (14, 15).

Cuando todos los esfuerzos pro-sobrevida fallan en corregir la acumulación de

proteínas en el RE, se activan vías que llevan a la muerte por apoptosis. Entre estos
eventos se encuentra la activación de JNK (proteína quinasa del N-terminal de c-Jun)
por la vía de IRE1, la activación de la caspasa 12 y la actividad de Bax-Bak (16, 17).

Chop (proteína homóloga a C/EBP) es otro factor proapoptótico que aumenta

su expresión por acción de ATF4 y ATF6 (18). Es un factor transcripcional que
contiene un dominio B-ZIP (cierre básico de leucina), que promueve la apoptosis
inhibiendo la expresión de la proteína Bcl2 (19). Chop puede formar heterodímeros
con otros factores trancripcionales miembros de la familia C/EBP y fos-jun (20, 21)

4
 Núcleo

Bloqueo
Traduccional Expresión
Síntesis y transporte de
Génica aminoácidos

Respuesta a Estrés
Reacciones Redox
Chop

Expresión
Chaperonas
Génica XBP1
Chop

Expresión
Chaperonas
Génica Degradación
de Proteínas

P58IPK

Figura 1. Respuesta del retículo endoplásmico a proteínas mal plegadas.

Durante la agregación de proteínas en el RE, BIP (Grp78) se disocia de los
receptores de stress, PERK, ATF6 e IRE1, permitiendo su activación. Esta activación
desencadena una vía de señalización desde el RE hacia el núcleo, la cual es
mediada por los factores transcripcionales ATF4, ATF6 y sXBP1. El objetivo de esta
señalización es aumentar la capacidad de plegamiento de RE y activar vías
degradativas para eliminar las proteínas mal plegadas (22).

5
1.5. La célula posee vías de degradación para eliminar proteínas agregadas

Las vías proteasomal y lisosomal son los principales mecanismos proteolíticos

de la célula. El proteasoma es una gran proteasa multicatalítica citoplasmática que
degrada proteínas poliubiquitinadas para generar pequeños péptidos (23). El lisosoma
es un organelo ácido rodeado de membrana que contiene enzimas hidrolíticas y que
está implicado en procesos de degradación de proteínas y partículas exógenas, así
como proteínas y organelos intracelulares. La vía que degrada proteínas intracelulares
asociada al lisosoma se denomina autofagia (23).

La autofagia en su forma más simple, se puede definir como un mecanismo de

adaptación a la privación de nutrientes, en donde la célula devora sus elementos
prescindibles para sobrevivir. Asimismo la actividad de la autofagia es necesaria para
eliminar proteínas dañadas y agregados proteicos. Se conocen tres subtipos de
autofagia: macroautofagia, microautofagia y autofagia mediada por chaperonas, las
cuales difieren en sus mecanismos y funciones (24) (Figura 2)

6
Figura 2. Diferentes subtipos de autofagia. La microautofagía es un mecanismo
constitutivo, en donde componentes citosólicos son secuestrados por los lisosomas
mediante la invaginación de su membrana. La macroautofagia degrada proteínas de
vida media larga, proteínas agregadas y organelos en exceso o defectuosos. En la
macroautofagia, una membrana cuyo origen aún se discute, rodea áreas del
citoplasma para formar el autofagosoma, el que posteriormente se fusiona con el
lisosoma. Las macromoléculas resultantes de la degradación son devueltas al citosol
a través de permeasas. La macroautofagia es una vía no selectiva de degradación,
regulada por la actividad de las proteínas ATG (proteínas relacionadas a la
autofagia). Durante la autofagia mediada por chaperonas, proteínas son reconocidas
específicamente y translocadas directamente al interior del lisosoma (24).

7
1.6. La autofagia mediada por chaperonas es un mecanismo selectivo de
degradación de proteínas

La autofagia mediada por chaperonas (AMC) es un subtipo de autofagia en

donde proteínas citosólicas son específicamente reconocidas, desplegadas y
destinadas al lisosoma para su degradación. Sus principales requisitos son: la
presencia de una secuencia específica en la proteína sustrato, la existencia de un
grupo de chaperonas citosólicas que identifiquen esta secuencia, un receptor lisosomal
que ligue al complejo y permita la translocación al interior del organelo y chaperonas al
interior del lisosoma que ayuden en la internalización el sustrato (25) (Figura 2).

Las proteínas sustratos de la vía poseen un motivo conservado,

bioquímicamente relacionado a la secuencia KFERQ (26). El motivo consiste de una Q
flanqueada en cualquiera de sus lados por 4 aminoácidos, uno ácido, uno básico, uno
hidrofóbico y finalmente uno ácido o hidrofóbico (27). Como esta secuencia está
presente en un gran porcentaje de proteínas, es muy posible que sea generada por
modificaciones post-traduccionales, como la deamidación (28).

El complejo de chaperonas citosólico está compuesto por la chaperona principal

Hsc70 y las cochaperonas Hsp90, Hsp40, Hop, Hip y Bag-1 (29). Hsc70 es el
integrante constitutivo de la familia Hsp70 y se encarga de reconocer específicamente
la secuencia KFERQ (30,31). Las cochaperonas modulan la interacción de Hsc70 y su
sustrato. El papel específico de cada una de las cochaperonas en la AMC se
desconoce, pero se tienen antecedentes de su acción en otros procesos fisiológicos.
Hsp40 estimula la actividad ATPasa de Hsc70, Hip ayuda al ensamblaje de Hsc70,
Hsp40 y el sustrato, Hsp90 mantiene al sustrato plegado, Hop liga a Hsc70 y Hsp90; y
Bag-1 consiste de isoformas que regulan positiva o negativamente a Hsc70 (28, 25).

La contraparte lisosomal de la chaperona Hsc70, es indispensable para que el

sustrato sea translocado al interior del lisosoma y la presencia de esta chaperona al
interior, capacita al lisosoma para tener actividad de AMC (32). Sin embargo, aún no
está claro el mecanismo de internalización de Hsc70 al lisosoma y si requiere de otras
cochaperonas lisosomales para llevar a cabo su función (25).

8
 La glicoproteína Lamp2A (proteína de membrana lisosomal 2, isoforma A) es el
receptor de la membrana lisosomal, encargado de la internalización del sustrato
durante la AMC (33). Lamp2A es una proteína con un dominio transmembrana, una
pequeña región citoplasmática, clave en la unión del sustrato y una región luminal muy
glicosilada. Se genera por splicing alternativo junto a otras dos isoformas, Lamp2B y
Lamp2C (34).

La interacción de Lamp2A con el complejo sustrato/chaperonas es la etapa

limitante de la AMC (35) y su presencia en la membrana lisosomal depende de su
degradación y reinserción desde la matriz lisosomal (36). Se han descrito
microdominios lipídicos en la membrana plasmática que concentran a Lamp2A durante
condiciones normales y de los cuales se libera al ser activada AMC. En estos dominios
lipídicos se produce la degradación del receptor por catepsina A (37, 25). Se ha
observado que el sustrato se liga al monómero de Lamp2A, mientras que su
translocación requiere la formación de un complejo compuesto por varias subunidades
del receptor (38, 36).

La AMC es responsable de la degradación del 30% de las proteínas citosólicas

en condiciones de privación prolongada de nutrientes y aunque se activa en la mayoría
de los tipos celulares, se ha estudiado principalmente en fibroblastos, hígado y riñón
(28). La AMC se activa durante la privación prolongada de suero, aportando
aminoácidos esenciales para sobrevivir (39). El estrés oxidativo activa la vía,
involucrando un aumento en la expresión de Lamp2A, mecanismo que no se observa
para ningún otro estímulo (40). La AMC disminuye su actividad en ratas de edad
avanzada, lo que se relaciona con menores niveles de Lamp2A en la membrana (41).

Se ha logrado bloquear Lamp2A usando iRNA, observando una sobreactivación

de la macroautofagia, aunque este proceso es incapaz de compensar todas las
funciones de AMC (42). Además se han estudiados los eventos tempranos luego del
bloqueo, y se ha observado que existen alteraciones funcionales en la macroautofagia
y en el sistema ubiquitina-proteasoma, que son progresivamente corregidos hasta
lograr su sobreactivación (43). Por otro lado, en células deficientes de ATG5, una
molécula clave para la macroautofagia, se ha observado una sobreactivación basal de
la AMC (44). La alteración general de los sistemas proteolíticos, argumenta a favor de

9
un funcionamiento coordinado de todos ellos, aunque resta por descubrir las vías
transduccionales que los comunican entre si.

1.7. Mecanismos de degradación asociados al retículo endoplásmico

La vía de Degradación Asociada al Retículo Endoplásmico (ERAD) es el

mecanismo que se encarga de eliminar las proteínas que se acumulan en la membrana
o el lumen del RE durante el ERE, mediante su transporte (retrotranslocación) hacia el
citosol (45). El ERAD puede dividirse en 3 pasos: reconocimiento y unión del sustrato
mal plegado al aparato de translocación, transporte a través de la membrana del RE, y
la liberación y degradación del sustrato. El mecanismo de cada uno de estos pasos
todavía no se conoce a cabalidad, pero existe un creciente número de reportes que
intentan caracterizar su maquinaria (20).

El reconocimiento de sustrato y su unión a la maquinaria de retrotranslocación

es mediado, al menos en parte, por el grado de glicosilación. Las glicoproteínas
interactúan con las chaperonas calnexina/calreticulina durante su plegamiento, las que
monitorean el procesamiento cíclico de N-glicanos. Si se altera este ciclo, el sustrato es
reconocido por la proteína EDEM (proteína similar a α-manosidasa que aumenta la
degradación del RE) que lo guía hacia la retrotranslocación a través de Derlin-2 y
Derlin-3 (46, 47, 48). La unión de BIP a proteínas no glicosiladas, las conduce hacia el
retrotranslocón compuesto por Derlin-1, Herp, p97 y Hrd1 (49). Sec-61 es el canal por
el cual las proteínas recién sintetizadas ingresan al lumen del RE pero también se le ha
relacionado con la salida de sustratos del ERAD, mostrando una bidireccionalidad (50).

El siguiente paso del ERAD es la degradación del sustrato. Se ha descrito que

las dos vías degradativas principales, proteasomal y lisosomal, actúan eliminando la
sobrecarga de proteínas durante el ERE.

El proteasoma es la vía degradativa clásicamente estudiada que se encarga de

la eliminación de los sustratos del ERAD. Existen enzimas que conjugan ubiquitina en
la membrana del RE. Luego de la retrotranslocación, una serie de proteínas que ligan
ubiquitina guían el sustrato ubiquitinado desde la membrana del RE hacia el
proteasoma (45).

10
 La única via lisosomal que se ha estudiado durante el ERAD es la
macroautofagia. La primera relación se estableció en levaduras por Yoritmitsu y cols.
(51), quienes demostraron que tunicamicina y ditiotreitol estimulan el ensamblaje de
estructuras preautofagosomales y que esta inducción depende de la proteína ATG11.
Posteriormente se ha observado la activación de macroautofagia en diversos tipos de
eucariontes superiores, lo cual muestra que este mecanismo de degradación es
conservado (52,53).

La fosforilación de eIF2 es necesaria para la estimulación de macroautofagia

inducida por repeticiones patogénicas de poliglutamina y su activación contrarresta la
muerte gatillada por estos agregados citoplasmáticos (54). Otro trabajo ha mostrado
que la desfosforilación de eIF2α, ausencia de ATG5, además del uso de inhibidores de
las hidrolasas lisosomales producen la acumulación de la mutante de disferlina en el
RE (55).

Adicionalmente se ha caracterizado el proceso denominado Retículo

Endoplásmico-Fagia, en el cual levaduras expuestas a ERE y que, por lo tanto, han
generado UPR, aumentan 5 veces el tamaño de su RE. Este aumento de tamaño se
acompaña de la activación de macroautofagia, la cual actuaría reduciendo el tamaño
del organelo (56).

Actualmente existen pocos trabajos que estudien el mecanismo que activa la

macroautofagia en respuesta a ERE. Se ha descrito que PKC (Proteína quinasa C)
theta se fosforila en respuesta a ERE, induciendo su colocalización con
autofagosomas. Además se ha observado que la inhibición de PKC theta previene
activación de la autofagia en respuesta a ERE. Esta activación es dependiente del tipo
de estímulo y no requiere la actividad de la vía de señalización de la UPR (57). Por otro
lado, BIP se requiere para que se active la macroautofagia en respuesta a ERE. En
células en las que se han interferido la expresión de BIP, estudios de microscopia
electrónica muestran que el RE se expande y se desorganiza (58).

Si bien comienzan a ser sólidos los antecedentes que vinculan a la

macroautofagia con el ERE, no existen trabajos que establezcan el papel de la AMC
durante el ERAD. Dado que la acumulación de proteínas mal plegadas en el RE lleva

11
a la activación de vías degradativas, en esta tesis se propuso dilucidar si la AMC
cumple alguna función en este evento.

2. HIPÓTESIS

“Células NIH3T3 (línea celular de fibroblastos de ratón) sometidas a estrés de retículo

presentan activación de la autofagia mediada por chaperonas”.

3. OBJETIVO GENERAL

Establecer una relación entre la autofagia mediada por chaperonas y el estrés de

retículo en células NIH3T3.

4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS

4.1 Estandarizar un modelo in vitro de ERE.

4.2 Estudiar la AMC en células NIH3T3 expuestas a ERE.

4.3 Estudiar la participación del ERE en la activación de AMC mediante la intervención

de elementos de estos sistemas.

12
5. MATERIALES Y MÉTODOS

5.1. Cultivo celular e inducción in vitro de estrés de retículo

Reactivos y soluciones

 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM). Sigma, (St. Louis, EEUU).

 Newborn calf serum (NCS). GIBCO, Invitrogen (Carlsbad, CA, EEUU).

 Antibióticos: Penicilina 10 U/mL y Streptomicina 10 µg/mL. Biological Industries

(Kibbutz Beit Haemek, Israel). Presente en todos los medios de cultivos, a
menos que se indique lo contrario.

 Dimetilsulfóxido (DMSO). Merck (Darmstadt, Alemania).

 PBS pH 7,2 estéril. Para 1 L: NaCl 80g y KCl 2g, ambos Winkler (Santiago,
Chile); Na2HPO4 14,4 g y KH2PO4 2,4 g ambos Merck (Darmstadt, Alemania).
Este tampón se utilizó en la mayoría de los métodos que se describen en la
presente tesis, en los cuales solo se menciona como PBS.

 Tripsina-EDTA 10x. Biological Industries (kibbutz beit haemek, Israel). Se lleva

a la solución de trabajo 1x con PBS estéril.

 Tapsigargina. Biomol Inc. (Plymouth Meeting, PA, EEUU). La solución stock

tiene una concentración 1 mM en DMSO. A partir de este stock fueron
preparadas soluciones de trabajo 200 µM y 2 µM, en PBS y medio de cultivo,
respectivamente.

 Azul de Tripán. Sigma-Aldrich, CO. (St. Louis, MO, EEUU).

13
Método

El stock de células NIH3T3 (pasaje 14) se mantuvo en medio DMEM 10% NCS
con DMSO al 5% en nitrógeno líquido. A partir del stock, las células se descongelaron
periódicamente. El proceso de descongelado se realizó rápidamente, poniendo el tubo
en un baño a 37°C y en seguida traspasando las células a una placa de 10 cm con
medio DMEM 10% NCS.

Para sembrar las células, la placa se lavó 1 vez con PBS y luego se agregó 1
mL de tripsina 1x, hasta que se observaban células en suspensión. La tripsina se
inactivó agregando medio con suero a la placa. Para sembrar la cantidad indicada para
cada método, las células viables se contaron mediante el método de azul de tripán y se
sembraron 24 h antes del estímulo en medio DMEM 10% NCS.

Al realizar el estímulo, el medio de cultivo se renovó para llevarlas al mismo

estado metabólico. Para ello se agregó el volumen de medio necesario, dependiendo
del tipo de placa, y una hora después se adicionó la TG disuelta en medio de cultivo.
Se cuidó que los distintos tiempos de estímulo tuviesen el mismo tiempo de sembrado.

5.2. Viabilidad celular

Reactivos y soluciones

 Yoduro de propidio. Sigma-Aldrich, CO. (St. Louis, MO, EEUU). La solución

stock usada tenía una concentración de 1 mg/ml en agua nanopura.

Método

Para este ensayo se siembran 30.000 células por pocillo en placas de 12

pocillos y se estimulan con TG. Luego las células se suspendieron agregando 200 µL
de tripsina, la que se inactivó con el mismo medio de cultivo. Después de centrifugar a
1000 x g por 5 min a temperatura ambiente, la pella celular se resuspendió en 400 µL

14
de PBS. La tinción se lleva a cabo justo antes de pasar las células por el citómetro de
flujo, agregando 4 µL de la solución stock de yoduro de propidio.

5.3. Ciclo celular y apoptosis

Reactivos y soluciones

 Etanol. Merk (Darmstadt, Alemania).

 RNasa A Amresco Inc. (Solon, Ohio, EEUU) El stock tiene una concentración
de 50 mg/mL.

Método

Para este ensayo se sembraron 100.000 células en placas de 6 pocillos. Luego

de estimular, las células se soltaron con 200 µL de tripsina y se inactivó la tripsina con
el mismo medio de cultivo. Las células se centrifugaron a 1000 x g por 5 min, a
temperatura ambiente. El pellet se resuspendió en 1 mL de etanol 100% con agitación
constante y posteriormente se dejó a -20°C, al menos 24 h y no más de 48 h. Después
el pellet se centrifugó a 1000 x g por 5 min y se resuspendió en 500 µL de PBS.

Para poder eliminar el RNA que interfiere en la determinación, se le agregó 1 µL

del stock de RNAsa A, se incubó 1 h a temperatura ambiente y luego se mantuvo en
hielo. Justo antes de pasar por el citómetro de flujo se agregó 4 µL de yoduro de
propidio 1 mg/ml.

5.4. Western blot

Reactivos y soluciones

 Tampón RIPA pH 7,2. NaCl 150 mM, Winkler (Santiago, Chile); Tris 10 mM pH
7,2, Bio-Rad (Hercules, CA, EEUU); Ácido deoxicólico 1% Sigma-Aldrich, CO.

15
 (St. Louis, MO, EEUU); EDTA 5 mM, Winkler (Santiago, Chile); SDS 0,1%,
Amresco Inc. (Solon, Ohio, EEUU); Tritón X100 1%, Merk (Darmstadt,
Alemania).

 Inhibidores: PMSF 1 mM, Amresco Inc. (Solon, Ohio, EEUU); Leupeptina 2

µg/ml, Amresco Inc. (Solon Industrial Parkway Solon, Ohio, EEUU); Aprotinina 5
µg/ml, Amresco Inc. (Solon, Ohio, EEUU); Ortovanadato de sodio 100 µM
(Sigma).

 Bio-Rad Protein Assay (Reactivo de Bradford). Bio-Rad (Hercules, CA, EEUU).

La reacción se realizó en placas de 96 pocillos, mezclando 159 µL de agua
nanopura, 40 µL de Reactivo de Bradford y 1 µL de muestra. Se determinó la
absorbancia a 595 nm en un espectrofotómetro de placa.

 Tampón de carga 4x. Para 100 mL: Glicerol Puro 25,2 g, Merck (Darmstadt,
Alemania; 2-Mercaptoetanol 10 mL, Merck (Darmstadt, Alemania); SDS 5 g,
Amresco Inc. (Solon, Ohio, EEUU); Tris base, 1,51 g, Bio-Rad (Hercules, CA,
EEUU); Azul de Bromofenol 0,01 g, Sigma-Aldrich, CO. (St. Louis, MO, EEUU).

 PageRuler, Pretained Protein Ladder (Estándar de proteínas). Fermentas

International Inc. (Burlington, Ontario, Canada)

 Acrilamida-bisacrilamida (ABA): Para 100 mL: Acrilamida 29,2 g y bisacrilamida

0,8 g; ambas compradas a Amresco Inc. (Solon, Ohio, EEUU).

 Lower 4x pH 8,8. Para 100mL: Tris base 1,5 M, Bio-Rad (Hercules, CA, EEUU);
SDS 10%, Amresco Inc. (Solon, Ohio, EEUU).

 Upper 4x pH 6,8. Para 100 mL: Tris base 1,5 M, Bio-Rad (Hercules, CA, EEUU);
SDS 10%, Amresco Inc. (Solon, Ohio, EEUU).

 TEMED Winkler (Santiago, Chile).

 Persulfato de Amonio (PSA). Merck (Darmstadt, Alemania).

 Tampón de electroforesis 10x. Para 1 L: Tris base 30,25 g, Bio-Rad (Hercules,

CA, EEUU; Glicina 144 g, Winkler (Santiago, Chile); SDS 10g, (Solon, Ohio,
EEUU). A partir de esta solución se preparó la solución 1x con agua destilada.

16
  Tampón de transferencia 10x: Para 1 L: Tris base 30,25 g, Bio-Rad (Hercules,
CA, EEUU); Glicina 144g, Winkler (Santiago, Chile). A partir de esta solución se
preparó la solución 1x con agua destilada.

 Metanol. Merk (Darmstadt, Alemania).

 TBS Tween 20 pH 7,4. Para 1 L: NaCl 80 g y KCl 2 g, ambos Winkler (Santiago,

Chile); Tris base 30 g Bio-Rad (Hercules, CA, EEUU); Tween 20 0,1%,Winkler
(Santiago, Chile). En la metodología se menciona sólo como TBS

 Leche libre de grasas

 Anticuerpos: los antecedentes de los anticuerpos se muestran en la Tabla 3.

Además se indica la cantidad de proteínas que es necesario cargar y la
concentración del gel concentrador y separador usados para observar cada
proteína.

 ECL Western Blotting Substrate. Pierce (Rockford, IL, EEUU).

 BioMax MR Film. Kodak (Rochester, NY, EEUU)

 Solución de revelado. Kodak (Rochester, NY, EEUU)

 Solución de fijación. Kodak (Rochester, NY, EEUU)

Tabla 1. Fórmula de preparación de cada SDS-PAGE.

Acrilamida Concentrador Separador Agua Temed PSA

5% 0,8 mL 1,3 mL - 2,9 mL 5 µL 45 µL

10% 2,5 mL - 1,9 mL 3,1 mL 4 µL 34 µL

12% 3 mL - 1,9 mL 2,6 mL 4 µL 34 µL

15% 3,75 mL - 1,9 mL 1,85 mL 4 µL 34 µL

17
Método

Para este ensayo se utilizaron distintos tipos de placas dependiendo de la

cantidad células que se debía sembrar, las cuales a su vez dependían de la cantidad
de proteínas a cargar (se detalla en Tabla 3) .

La placa estimulada se lavó dos veces con PBS frío y se agregó un volumen de
tampón RIPA con inhibidores, dependiendo del tipo de placa:

Tabla 2 Volumen de tampón RIPA según el tipo de placa de cultivo.

Placa 10 mm 60 mm 6 pocillos 12 pocillos

Volumen de RIPA 100 µL 80 µL 60 µL 40 µL

El lisado se transfirió a tubo plástico de 1,5 mL y se centrifugó a 10.000 x g por

10 min a 4°C para eliminar las células integras. La concentración de proteínas se
determinó por el método de Bradford y el volumen de muestra necesario se hirvió por 5
min junto al tampón de carga 1x.

La muestra se cargó en el SDS-PAGE elaborado según se indica en la Tabla 1.

Las proteínas se resolvieron realizando la electroforesis a voltaje constante de 100V.
Luego se realizó la electrotransferencia hacia membranas de nitrocelulosa o PDVF a
0,45 mA por 90 min. Las membranas se trataron con tampón de bloqueo con leche al
5% en TBS por media hora e incubadas con el anticuerpo primario durante toda la
noche. A continuación la membrana se lavó 3 veces con TBS y se incubó con el
anticuerpo secundario por 1 h. Ambos anticuerpos se disolvieron en leche al 5% en
TBS, llevándolos a la concentración que se indica en la Tabla 3. Luego, la membrana
se lavó 3 veces con TBS e incubada con ECL, el tiempo necesario para que la reacción
de quimioluminicencia se llevara a cabo. Finalmente la membrana se expuso a una
placa fotográfica, reveló y fijó en la oscuridad.

18
Tabla 3. Anticuerpos primarios y secundarios usados en la tesis

Anticuerpos primarios

Dilución Proteína Concentración

Proteína Peso Isotipo Reconoce Hecho en Proveedor Clonalidad WB a cargar Gel Dilución IF

Bip 78 KDa Rabbit 1 en 5000 20 µg (ET) 5/10 % -

Chop 32 KDa IgG H-M-R Rabbit Santa Cruz Polyclonal 1 en 2500 20 µg (ET) 5/10 % -
β-actina 42 KDa IgG H-M-R Mouse Calbiochem Monoclonal 1 en 1000 20 µg (ET) 5/10 % -
Hsc70 70 KDa IgM M-H Mouse AbCam Monoclonal 1 en 5000 20 µg (ET) 5/10 % 1 en 500
Lamp2A 96 KDa IgG R Rabbit Zymed Policlonal 1 en 5000 30 µg (L) - 100 µg (ET) 5/12 % 1 en 300
Lamp1 120 KDa IgG M Goat RyD Policlonal 1 en 5000 30 µg (L) 5/12 % 1 en 200
Atg5 55 KDa IgG H-M-R Rabbit Cell Signaling Policlonal 1 en 500 50 µg 5/10 % -
LC3 14-16KDa IgG H-M-R Rabbit Cell Signaling Policlonal 1 en 1000 30 µg 5/15% 1 en 100

ET: extracto total, L: extracto lisosoma

Anticuerpos secundarios

Anticuerpo Dilución Enzima Marca Anticuerpo Color Dilución Fluoróforo Marca

Rabbit 1 en 30000 Peroxidasa Calbiochem Rabbit Rojo 1 en 500 Cy3 Molecular Probes
Mouse 1 en 40000 Peroxidasa Calbiochem Rabbit Verde 1 en 500 FitC Molecular Probes
Goat 1 en 10000 Peroxidasa Jackson Mouse Rojo 1 en 500 Cy3 Molecular Probes
IgM 1 en 5000 Peroxidasa Mouse Verde 1 en 500 FitC Molecular Probes
Goat Verde 1 en 200 FitC Jackson
IgM Rojo 1 en 300 Cy5

19
5.5. Densitometría

Las placas fotográficas se escanearon y el análisis densitométrico se realizó

usando el programa UN-SCAN-IT de Silk Scientifics, Inc.

5.6. Fraccionamiento subcelular

Reactivos y soluciones

 Sacarosa. Winkler (Santiago, Chile).

Método

Para realizar este ensayo se utilizaron 4 placas de 10 cm a un 80% de

confluencia. Luego de terminado el estímulo, las placas se trataron con tripsina, la cual
se inactivó con el mismo medio de cultivo y se colectó en tubos de 10 mL. Las células
se centrifugaron a 500 x g por 5 min a 4ºC y se eliminó el sobrenadante. Se lavó con 3
volúmenes de sacarosa 0,25 M y se repitió la centrifugación, cuidando siempre
mantener en hielo.

Las células se homogeneizaron en 3 volúmenes de sacarosa 0,25 M en un

homogeneizador vidrio-teflón a 1000 rpm, mediante 10 golpes de 5 seg. En seguida,
se realizaron dos centrifugaciones a 6800 x g por 5 min a 4 °C, lavando el pellet con 3
volúmenes de sacarosa 0,25 M.

Los sobrenadante se recolectaron y centrifugaron a 17000 x g por 12 min a 4°C.

El pellet se resuspendió en la mitad de volumen de sacarosa 0,25 M y se centrifugó
nuevamente a 17000 x g por 12 min a 4 °C. El pellet resultante es la fracción
lisosomal-mitocondrial, que se resuspendió en 50 µL de sacarosa 0,25 M.

20
5.7. Inmunocitoquímica

Reactivos
 Metanol. Merk (Darmstadt, Alemania).
 Albúmina de suero bovino (BSA). Winkler (Santiago, Chile).
 Anticuerpos: los antecedentes y diluciones de los anticuerpos se muestran en la
Tabla 3
 DAKO. Dako (Via Real Carpinteria, CA, EEUU)
 Tinción Hoechst

Método

Este ensayo se realizó con 100.000 células sembradas en placas de 6 pocillos

con cubreobjetos, en medio DMEM 10% NCS. Terminado el estímulo, cada pocillo se
lavó 2 veces con PBS frío y se les adicionó 2 mL de metanol durante 20 min a -20°C.
Terminada la incubación, los pocillos se lavaron con PBS 2 veces y las células trataron
con BSA-PBS al 5% por 1 h.

Terminado el bloqueo, cada pocillo se lavó 2 veces con PBS e incubado toda la
noche con 12 µL de anticuerpo primario diluido en BSA/PBS 5% estéril.
Posteriormente, el cubreobjeto se lavó 2 veces con PBS e incubado durante 1 h, esta
vez con el anticuerpo secundario y en la oscuridad. Finalmente, el cubreobjeto se lavó
2 veces con PBS y montado sobre un portaobjeto con 12 µL de DAKO. El portaobjeto
se mantuvo en una caja oscura a 4°C, hasta ser observado en microscopio de
fluorescencia y/o confocal.

5.8. Producción y transducción lentiviral

Reactivos
 Fetal Bovine Serum (FBS). HyClone (Logan, Utah, EEUU)
 Lipofectamina 2000. Invitrogen (Carlsbad, CA, EEUU)

21
  Bromuro de hexadimetrino (Polibrene). Sigma-Aldrich, CO. (St. Louis, MO,
EEUU). La solución stock tenía una concentración de 8 mg/mL en agua
nanopura estéril.
 Plamidios: Se detallan en la Tabla 4 y se obtuvieron por colaboración de la Dra.
Ana María Cuervo, Albert Einstein College of Medicine, Bronx, NY, EEUU.
Además se muestra el volumen de solución de plasmidio 0,1 µg/µL que se usó
para la transfección.

Tabla 4. Cantidad de plasmidio usado para la transfección lentiviral.

Plasmidio Control Luciferasa (-) Lamp2A (-)

pMD2VSV.G 3,8 µL 3,8 µL

pMDLg/pRRE 19,1 µL 19,1 µL

pRSV-Ver 19,1 µL 19,1 µL

Luc (-) 38,2 µL L2A (-) 38,2 µL

Medio 419,8 µL Medio 419,8 µL

Soluciones

A. 8 µg de DNA en 500 µL de DMEM sin antibióticos. (según Tabla 4) Mezclar

suavemente.

B. 16 µL de lipofectamina (mezclar antes de usar) en 484 µL de medio DMEM sin

antibióticos. Mezclar suavemente e incubar por 5 min.

22
Método

Células 293T se sembraron en placas de 60 mm en 5 mL de medio DMEM 10%

FBS, 24 h antes de la transfección. Se cuidó especialmente que el pasaje de las
células no fuese superior a P12-P15 y que las células tuviesen una confluencia de
90%, en el momento de la transfección.

Dos horas antes de la transfección, las células se lavaron con 2 mL de PBS y

se les agregó 4 mL de medio DMEM sin antibióticos. A continuación, las soluciones A y
B se mezclaron suavemente e incubadas por 20 min a temperatura ambiente. Luego la
mezcla se agregó suavemente sobre las células, incubando por 4 h a 37ºC.

Finalizada la incubación, el medio se reemplazó por 3 mL de DMEM 10%FBS

con antibióticos (Penicilina y Streptomicina), el cual fue mantenido por 48 h. En último
lugar, el medio se pasó a través de un filtro de 0,45 µm y se utilizó de inmediato para la
transducción.

La transducción se realizó en placas de 6 pocillos, sembradas con 100.000

células NIH3T3 por pocillo. Se añadió 1 mL del sobrenadante que contenía el vector
lentiviral y para mejorar la eficiencia de la infección se utilizó polibrene a una
concentración de 8 µg/mL. Las células se mantuvieron en este medio a 37ºC por 24 h,
luego el medio se cambió por 2 mL de medio DMEM 10%FBS por 72 h. La expresión
de GFP se verificó mediante microscopia óptica de fluorescencia o mediante citometría
de flujo.

5.9. Tratamiento de células MEF m5-7

Reactivos

 Hidroclorohemietalonato de doxiciclina hemihidratado (Sigma) 10 mg/mL en

agua nanopura.

 Dihidroclorhidraro de Puromicina (Sigma) 1 mg/mL en agua nanopura.

23
Método

Las células MEF m5-7 se mantuvieron en medio DMEM 10% FBS con
puromicina 4 µg/mL, para mantener la selección generada en la construcción del
sitema Tet-off que poseen. Para eliminar la expresión de ATG5 se agregó diariamente
durante una semana doxiciclina 100 ηg/mL. Terminada la semana de tratamiento las
células se trataron con tripsina y sembraron en dos placas, una de las cuales mantuvo
el tratamiento con doxiciclina y la otra se mantuvo en DMEM 10% FBS con puromicina,
durante 24 h más.

5.10. Análisis estadístico

El software GraphPad Prism 4 fue usado para hacer el análisis de Anova y T-

Test y el post-test de Tukey. Cada experimento se realizó 3 veces independientes y los
resultados son expresados como el promedio más la desviación estándar.

24
6. RESULTADOS

6.1. Estandarización de un modelo in vitro de estrés de retículo endoplásmico

El primer desafío de esta tesis consistió en estandarizar las condiciones

experimentales de estrés de retículo endoplásmico (ERE) en las células NIH3T3 de
ratón. Este tipo celular se escogió como modelo debido a que estos fibroblastos
embrionarios de ratón “Swiss” han sido ampliamente utilizados tanto en el estudio de
ERE como en la autofagia mediada por chaperonas (59, 42).

Entre los compuestos típicamente utilizados para inducir ERE están A23187 y
Tapsigargina (TG) que intervienen en la homeostasis del calcio, tunicamicina que
suprime la glicosilación y brefeldina A que inhibe el transporte al Golgi (8). Para inducir
ERE se eligió a TG, inhibidor de bombas de Ca2+ de membranas intracelulares. A
concentraciones de 0,1 µM es un efectivo inhibidor de la bomba Ca2+ATPasa del
retículo sarcoplásmico (SERCA). Se descartó el uso de tunicamicina ya que la proteína
Lamp2A es fuertemente glicosilada en el RE y el Golgi (60).

Las células NIH3T3 se expusieron a ERE, evitando que se produzca muerte por
apoptosis y así poder observar la etapa adaptativa frente al ERE. Esta etapa adaptativa
se caracteriza por la activación de mecanismos que aumenten la capacidad plegadora
de proteínas del RE y de mecanismos degradativos que eliminan la sobrecarga de
proteínas mal plegadas en el RE. La estrategia experimental contempló dos pasos
principales, el seguimiento de marcadores de ERE a través de western blot y la
determinación de la viabilidad y ciclo celular mediante citometría de flujo.

Durante la primera parte de este objetivo, nos enfocamos en asegurar que

efectivamente se produjera ERE por la TG. Con este fin se evaluaron los niveles
proteicos del factor transcripcional Chop, un marcador clásico de ERE. La Figura 3A-B
muestra los cambios en los niveles de Chop entre las 2 y las 24 h. El aumento de Chop
fue transitorio, teniendo un máximo entre las 6 y 8 h, para las 3 concentraciones de TG
estudiadas. Además se observó la cantidad de este marcador en función de la
confluencia de las células en la placa (Figura 3C), indicando que debe mantenerse la
confluencia entre un 70 y 80% para que la inducción de ERE sea efectiva.

25
 Otro marcador de ERE es el aumento en la expresión de la chaperona BIP, que
seguimos mediante western blot. Los niveles de esta chaperona tendieron a aumentar
a tiempos de exposición más tardíos, pero estos cambios no fueron estadísticamente
significativos (datos no mostrados). Estos resultados revelaron que la inducción de la
expresión de este marcador debe estudiarse a nivel de mRNA, porque en general
todas las células tienen altos niveles proteicos de BIP.

En seguida nos enfocamos en evaluar la muerte celular en presencia de TG.

Tanto para la viabilidad como para determinar el ciclo celular, se utilizó como trazador
el yoduro de propidio (PI). PI es una sonda que emite fluorescencia al intercalarse al
DNA, pero que es impermeable a la membrana celular, por lo que sólo las células que
tienen alterada la integridad de su membrana lo incorporan.

Para determinar la viabilidad total, las células se estimularon con TG durante el

tiempo y utilizando las concentraciones indicadas en la Figura 4 y en seguida las
células vivas se incubaron con PI. No se observó un aumento en la muerte a ninguna
de las concentraciones de TG ensayadas.

Luego se evaluó el ciclo celular para investigar si hay apoptosis y cambios en la

proliferación celular durante el evento de ERE. Para este fin, las células se
permeabilizaron con etanol e incubaron con PI, de manera de teñir el DNA de todas las
células y clasificar las distintas subpoblaciones por citometría de flujo de acuerdo a la
cantidad de DNA que poseen.

La población apoptótica se muestra en el perfil del ciclo celular como la fracción

sub G1, ya que la fragmentación del DNA es característica para este tipo de muerte. La
Figura 5 muestra que no aumentó la población apoptótica en las concentraciones y
tiempos analizados. Además se cuantificó el porcentaje de células en etapa G1 y G0
del ciclo celular, como una manera de evaluar proliferación. La Figura 6 muestra que
hubo un aumento significativo de la población en esta fase, lo cual fue más evidente a
medida que se incrementó el tiempo de exposición a TG. Este efecto ya había sido
observado por Brewer et al (61) y es un evento anexo a la generación de ERE por la
TG.

26
A

Chop

β -actina

0 0,1 0,5 1 0,1 0,5 1 0,1 0,5 1 0,1 0,5 1 0,1 0,5 1 0,1 0,5 1 0,1 0,5 1 (µM)

C 2 4 6 8 12 18 24 (h)

B 25
Niveles Relativos de Chop

20

15

10

0
C 2 4 6 8 12 18 24 2 4 6 8 12 18 24 2 4 6 8 1218 24 h

0 0,1 0,5 1 M
C 15
Niveles de CHOP (u)

Chop
10

β -actina 5

0
C (80) 30 50 80 100 (% Confluencia)
C (80%)

100%
30%

50%

80%

0 0,1 (M TG)

Figura 3. Tapsigargina aumenta los niveles proteicos de Chop en células NIH3T3.

La presencia de este marcador se evaluó mediante western blot. Panel A muestra un
western blot representativo de los niveles proteicos de Chop y β-actina. Panel B
muestra el gráfico que representa la densitometría de los niveles proteicos de Chop,
normalizado por -actina y relativizado por la cantidad de Chop a las 4 h. Los estímulos
usados son 0,1, 0,5 y 1 µM de TG entre 2 y 24 h. Como control se utilizó DMSO a una
concentración equivalente a la que se encuentra en 1 µM de TG (promedio ± DS, n=3).
Panel C muestra los niveles proteicos de Chop en función de la confluencia celular
para el estímulo de TG 0,1 µM por 8 h.

27
 A

Figura 4. Efecto de la Tapsigargina (estímulo de ERE) en la viabilidad de células

NIH3T3. La viabilidad celular se cuantificó mediante el uso de citometría de flujo
(FACS) y usando PI como trazador. Panel A se muestran los histogramas
representativos para el control DMSO y TG 1 µM por 24 h. P4 corresponde a la
población de células vivas, que no incorporan PI. P5 es la población que incorpora PI,
por lo que aumenta su fluorescencia. Panel B muestra el porcentaje de células
positivas para PI con los estímulos de 0,1, 0,5 y 1 µM de TG, durante 8-12-18-24 horas
(promedio ± DE, n=3). Se utilizó como control DMSO a una concentración equivalente
a la que se encuentra en 1 µM de TG durante 24 horas y como control positivo
peróxido de hidrógeno al 1% durante 8 h.

28
 A

C
100
Células en Sub G1 (%)

80

60

40

20

0
C 8 12 18 24 8 12 18 24 8 12 18 24 (h)

0 0,1 0,5 1 (M TG)

Figura 5. Efecto de la Tapsigargina en la apoptosis de células NIH3T3. Para este

ensayo, las células permeabilizadas con etanol y teñidas con PI, se analizaron
mediante citometría de flujo. Panel A esquema que muestra el perfil del ciclo celular
para este tipo de ensayos. Panel B histogramas representativos para el control con
DMSO y TG 1 µM por 24 h. P3 corresponde a la población de células apoptóticas.
Panel C muestra el porcentaje de células sub-G1 con los estímulos de 0,1, 0,5 y 1 µM
de TG, durante 8-12-18-24 h (promedio ± DE, n=3). Como control se utilizó DMSO a
una concentración equivalente a la que se encuentra en 1 µM de TG durante 24 h.

29
 A

B
**
100
Células en G1/G0 (%)

80

60

40

20

0
C 8 12 18 24 8 12 18 24 8 12 18 24 (h)

0 0,1 0,5 1 (M TG)

Figura 6. Ciclo celular en células NIH3T3 sometidas a ERE con Tapsigargina.

Mediante citometría de flujo se analizaron células permeabilizadas y teñidas con PI.
Panel A muestra histogramas representativos para el control con DMSO, TG 0,1 µM
por 8 h ó TG 1 µM por 24 h. P4 corresponde a la población en fase G1 y G0, P5 en
fase S y P6 en fase G2 del ciclo celular. Panel B muestra el porcentaje de células en
G1 y G0 del ciclo celular con los estímulos de 0,1, 0,5 y 1 M de TG entre 8 y 24 h
(promedio ± DE, n=3) **p<0,01 con respecto al control, ANOVA seguido de post-test
de comparación múltiple de Tukey. Como control se utilizó DMSO a una concentración
equivalente a la que se encuentra en 1 M de TG, durante 24 h.

30
6.2. Estudio de la autofagia mediada por chaperonas en células NIH3T3
expuestas a estrés de retículo endoplásmico

Luego de haber estandarizado las condiciones de trabajo, el paso siguiente fue

demostrar la hipótesis de trabajo mediante el estudio de AMC en células NIH3T3
expuestas a ERE. Para esto se utilizaron dos aproximaciones experimentales
principales. En primer lugar se evaluó la localización de los lisosomas mediante
inmunocitoquímica durante el evento de ERE y en segundo lugar se determinaron los
niveles proteicos de marcadores de la AMC, en extracto total y fracción lisosomal
mediante Western blot.

Se ha descrito que un aumento en los niveles de Lamp2A en la membrana y en

los niveles de Hsc 70 en lumen del lisosoma se relacionan directamente con la
actividad de la AMC. Además se ha observado una relocalización de los lisosomas
activos para AMC hacia zonas perinucleares, pero se desconoce su causa (39, 35).

La inmunocitoquímica para Lamp2A de la Figura 7 muestra un aumento en la

expresión del receptor para los tiempos ensayados (4 y 8 h). Es menos evidente la
redistribución hacia zonas perinucleares debido a que en estado basal la mayoría de
las células muestran una tinción fuerte en esa zona. Este aumento en los niveles de
Lamp2A es significativo para el estímulo con TG 1 µM, analizado en western blot de
extracto total (Figura 8). El aumento de Lamp2A se refleja en una mayor presencia en
la fracción lisosomal, en donde es funcional (Figura 9).

En cuanto a la redistribución de Hsc 70 hacia los lisosomas, la Figura 11

muestra que si bien en condiciones basales Hsc 70 se encuentra en regiones similares
con Lamp2A, esta ubicación se acentúa durante el evento de ERE. Además se quiso
tener certeza que el anticuerpo contra Lamp2A estuviese marcando lisosomas, para lo
cual se incubó junto al marcador de este organelo Lamp1 y se observó una alta
colocalización (Figura 10).

Finalmente se estudió la expresión de Hsc70 en extracto total mediante western

blot. No se observaron cambios en los niveles de Hsc70 hasta las 24 h de estímulo. La
Figura 12 muestra un gráfico representativo para las 8 h de estímulo.

31
CONTROL 20µM DMSO 20µM

TG 4 h 20µM 20µM
TG 8 h

20µM

Control anticuerpo
Secundario Alexa488

Figura 7. Tapsigargina aumenta los niveles de Lamp2A en células NIH3T3.

Inmunocitoquímica de células estimuladas con 0,1 µM Tapsigargina (TG) por los
tiempos indicados. Como control se utilizó DMSO a una concentración equivalente a la
que se encuentra en 0,1 µM de TG, durante 8 h. Se incubó con anticuerpo anti-
Lamp2A y secundario Alexa Fluor 488. Los núcleos se tiñeron con Hoechst. La captura
de imágenes se realizó mediante un microscopio confocal Carl-Zeiss. En el inserto se
muestra el control de la especificidad del anticuerpo secundario.

32
 A
Lamp2A

β-actina
Niveles de Lamp2A Relativos

3 *

2
B

0
0 0,1 1 M TG

Figura 8. El tratamiento con Tapsigargina aumenta los niveles totales de

Lamp2A. El nivel del receptor lisosomal Lamp2A se estudió mediante western blot de
extracto total. Panel A muestra un western blot representativo de la cantidad de
Lamp2A y de β-actina, frente al estímulo. Panel B muestra el análisis densitométrico
de los niveles proteicos de Lamp2A, normalizado por los niveles de -actina y relativo
al control. Se estimuló con TG 0,1 y 1 µM por 8 h. (Promedio ± DS, n=5) *p<0,05 con
respecto al control 0 µM TG. ANOVA seguido de post-test de comparación múltiple de
Tukey.

33
 A

Lamp2A

Lamp1

L PN L PN

0 0,1 (µM TG)

2
*
Niveles Relativos de Lamp2A

0
0 0,1 M TG

Figura 9. Tapsigargina aumenta la presencia de Lamp2A en la fracción lisosomal

en células estimuladas con TG 0,1 µM por 8 h. Los niveles proteicos del receptor
lisosomal Lamp2A se estudiaron mediante western blot de fracción lisosomal generada
por centrifugación diferencial. Panel A muestra un western blot representativo de los
niveles de Lamp2A y Lamp1, frente al estímulo. L es fracción lisosomal, PN es fracción
post-nuclear. Panel B muestra el análisis densitométrico de Lamp2A, normalizado por
Lamp1 y en relación al control. Los valores representan el promedio ± DS, n=3,
*p<0,05 con respecto al 0 µM de TG t-test.

34
 Lamp1 Lamp2A

20µM 20µM

Colocalización

Control anti-Lamp1 con

ab secundario para
Lamp2A

Control anti-Lamp2A con

ab secundario para
Lamp1

Figura 10. Lamp2A se20µM localiza en los lisosomas. Inmunocitoquímica de células

NIH3T3. Se incubó con anticuerpo anti-Lamp2A y anti-Lamp1, seguido por la
incubación con sus respectivos anticuerpos secundarios. La captura de imágenes se
realizó mediante un microscopio confocal Carl-Zeiss. En el inserto se muestran los
controles de la especificidad de los anticuerpos.

35
 Hsc70 Lamp2A Colocalización

C C C
20µM 20µM 20µM

TG 0,1 µM 20µM TG 0,1 µM 20µM TG 0,1 µM 20µM

TG 1 µM 20µM TG 1 µM 20µM TG 1 µM 20µM

Control anti-Hsc70 con Control anti-Lamp2A

ab secundario para con ab secundario para
Lamp2A Hsc70

Figura 11. El tratamiento con Tapsigargina produce una redistribución de Hsc70

hacia los lisosomas. Inmunocitoquímica de células NIH3T3 estimuladas con TG 0,1 y
1 µM durante 8 h. Como control se utilizó DMSO a una concentración equivalente a la
que se encuentra en 1 µM de TG. Se incubó con anticuerpo anti-Lamp2A y anti-Hsc70
seguidos de sus respectivos anticuerpos secundarios. La captura de imágenes se
realizó mediante un microscopio confocal Carl-Zeiss.

36
 A

Hsc70

β-actina

0 0,1 0,5 1 0,1 0,5 1 0,1 0,5 1 0,1 0,5 1 0,1 0,5 1 0,1 0,5 1 0,1 0,5 1 µM)

C 2 4 6 8 12 18 24 (h)

B
3
Niveles relativos de Hsc70

0
M

M

M

M
0

1
1

5
0,

0,
TG

TG
TG

TG

Figura 12. El tratamiento con Tapsigargina no cambia los niveles totales de

Hsc70. Se evaluó la cantidad de esta chaperona mediante western blot de extracto
total. Panel A muestra un western blot representativo de la expresión de Hsc70 y de β-
actina, frente al estímulo. Panel B muestra el gráfico que representa la densitometria
de la expresión de Hsc70, normalizado por la expresión de β-actina y relativo al control.
Se graficaron los estímulos con TG 0,1, 0,5 y 1 µM durante 8 h (promedio ± DS, n=3).

37
6.3. Estudio de la participación del ERE en la activación de la autofagia mediada
por chaperona mediante la intervención de elementos de estos sistemas.

Existen indicios claros que las vías de degradación de proteínas se mantienen

interconectadas, ya que si alguna no está operativa, las otras se activan para mantener
a la célula libre de proteínas dañadas y agregadas. Se ha observado esta
intercomunicación entre la AMC y macroautofagia durante eventos de estrés nutricional
(42, 43), pero no se ha estudiado si ocurre durante el ERE.

Se ha reportado que una disminución en los niveles de Lamp2A produce a su

vez una disminución en la actividad de AMC, tanto cuando existe una transfección con
el siRNA (42), así como en células que tienen una disminución permanente del
receptor (43). Para estudiar este fenómeno durante un evento de ERE, se utilizaron
células deficientes en Lamp2A. La Figura 13A muestra que el 85% de las células
expresan GFP, incluso 6 meses después de producida la transducción. La GFP está
codificada en el plasmidio de expresión que contiene el iRNA para Lamp2A. Este
aumento del número de células fluorescentes se refleja en la disminución en un 81%
de la presencia de Lamp2A en la fracción lisosomal (Figura 13B).

En seguida se investigó si la ausencia de AMC desencadenaba mayor ERE,

para lo cual se analizó la expresión de Chop por western blot en células carentes de
Lamp2A. La Figura 14A muestra que contrariamente a lo esperado, las células control
tratadas con TG muestran mayor cantidad de Chop que las células que no expresan
Lamp2A. Este resultado podrían deberse a que el aumento en la actividad de la
macroautofagia hace que las células Lamp2A resuelvan de mejor manera el ERE que
las células control. Para evaluar esta hipótesis estudiamos la conversión de LC3 I a
LC3 II, lo que habitualmente es usado como un marcador de macroautofagia (62). Los
resultados muestran que la disminución de la AMC causa un aumento en la actividad
de macroautofagia a niveles basales (Figura 14B). También en esta última figura se
observa que el tratamiento con TG produjo una mayor activación de la macroautofagia
en las células que no expresan Lamp2A en comparación con las que si lo expresan.

38
 Las células m5-7 son fibroblastos embrionarios (MEF) generados a partir de
ratones “knock out” para ATG5, que regulan la expresión de ATG5 mediante un
sistema Tet-off/on. La molécula ATG5 es clave en la generación de autofagosoma por
lo que su ausencia (células tratadas con doxiciclina) lleva a la inactivación de la
macroautofagia. En cambio, las células controles (células no tratadas con este
antibiótico) poseen ATG5 y responden normalmente a los estímulos autofágicos (63)
(Figura 15A). La Figura 15 B muestra la expresión del complejo ATG5/ATG12 como
control del tratamiento de las células m5-7. Las células tratadas con doxiciclina no
muestran expresión del complejo ATG5, mientras que la eliminación del antibiótico por
24 h fue suficiente para restaurar su expresión.

La Figura 16 muestra los niveles totales de Lamp2A en las células m5-7

sometidas a ERE. Se observa que las células que expresan ATG5 responden de
manera equivalente a las células NIH3T3 frente al estresor TG (Figura 16A). Las
células m5-7 tratadas con doxiciclina, es decir carentes de ATG5, muestran un
aumento significativo en los niveles totales de Lamp2A comparado con células
controles que expresan el ATG5 (Figura 16A). Estos resultados sugieren que podría
estar produciéndose un aumento compensatorio de la AMC cuando la macroautofagia
está inactiva. Un resultado sorprendente se observó cuando las células m5-7 carentes
de ATG5 se trataron con TG, en donde se observó una importante disminución de los
niveles de Lamp2A (Figura 1 B).

39
 A

GFP

B
Lamp2A

Ponceau

Lamp2A (+) Lamp2A (-)

Figura 13. Generación de células Knock down para Lamp2A. Células NIH3T3 se
transducieron con vectores lentivirales, producidos por cotranfección en células
HEK293T. Además del iRNA para Lamp2A, el plasmidio de expresión codifica la
proteína fluorescente verde (GFP). Como control se generó una línea que expresa un
iRNA para luciferasa. Panel A Se siguió el éxito de la infección lentiviral mediante
citometria de flujo. Se observa que un 85% de las células Lamp2A (-) expresan GFP.
Panel B Se muestra un western blot de Lamp2A en la fracción lisosomal generada por
centrifugación diferencial. Se observa una reducción de un 81% de Lam2A en las
células infectadas con el iRNA para Lamp2A. Como control de carga se muestra la
membrana teñida con rojo Ponceau.

40
 A

Chop

β-actina

LC3 I
LC3 II

β-actina

Lamp2A(+) Lamp2A(-)

0 0,1 0 0,1 (µM TG)

Figura 14. Efecto de la Tapsigargina sobre los niveles de Chop y LC3 I/II en
células carentes de Lamp2A. Células NIH3T3 se transducieron con un lentivirus que
expresa un iRNA para luciferasa (Luc -) como control o para Lamp2A (Lamp2A -).
Luego ambos tipos celulares se trataron con TG 0,1 µM por 8 h, se prepararon lisados
de extractos proteicos y se determinaron por western blot los niveles de Chop (panel
A), de LC3 I/II (panel B) y de -actina como control de carga. Los western blot
mostrados son representativos de n=3-4, en los cuales se observaron similares
resultados.

41
A

Atg5/Atg12
55 KDa

-actina

ATG (-/-) ATG (+/+)

Figura 15. Efecto de la doxiciclina en la expresión de ATG5 en células MEF m5-7.

Panel A Para eliminar la expresión de ATG5 en células m5-7 se agregó diariamente
durante una semana doxiciclina 100 ηg/mL. Luego, las células se separaron en dos
placas, unas continuaron su tratamiento con doxiciclina, mientras que las otras se
cultivaron en medio sin doxiciclina por 24 h. Panel B La figura muestra un western blot
donde las muestras se cargaron por duplicado. El anticuerpo usado identifica el
complejo ATG5/ATG8 y se muestra -actina como control de carga. Además se
observa que el complejo está presente en las células NIH3T3. Los resultados muestran
que las placas tratadas con Doxiciclina no expresan ATG5.

42
A Lamp2A

Ponceau

3
Niveles Relativos de Lamp2A
**

2
*

0
0 0,1 0 M TG

ATG5 (+/+) ATG5 (-/-)

B Lamp2A

Ponceau
Niveles Relativos de Lamp2A

2
*

0
0 0,1 M TG

ATG5 (-/-)

43
Figura 16. Efecto de la TG en los niveles de Lamp2A en células carente de
ATG5. Células MEF m5-7 se trataron como se explica en la Figura 15. Panel A
Muestra un western blot representativo y el gráfico donde se compara los
niveles de Lamp2A para células Atg5 (-/-) en relación a las células Atg5 (+/+).
Panel B Muestra un western blot representativo y el gráfico donde se compara
los niveles de Lamp2A para células Atg5 (-/-) al ser estimuladas con TG 0,1 µM
por 8 h. Como control de carga se muestran la membrana teñida con rojo
Ponceau. Los valores mostrados corresponden al promedio ± DS (n=3).
*p<0,05 con respecto al control. ANOVA seguido de post-test de comparación
múltiple de Tukey.

44
7. DISCUSION

7.1. Estandarización de un modelo in vitro de ERE

Mediante el primer objetivo se confirmó que la Tapsigargina produce ERE en

las células NIH3T3, evidenciado por el aumento en los niveles de Chop, el cual no
se expresa basalmente en este tipo celular. Además se observa la desaparición de
Chop a las 24 h post-estímulo, indicando que la célula sobrellevó el evento de
estrés de retículo y que probablemente existe un mecanismo degradativo que
controla los niveles de Chop.

Además las células NIH3T3 mostraron ser muy resistentes al estímulo pro-
apoptótico Tapsigargina. Aunque se mantuvo la expresión de Chop, un factor
transcripcional apoptótico durante 18 h de estímulo, las células no presentaban
muerte celular aunque en evidente estado de arrresto de su ciclo celular en la
etapa G1. Este efecto ha sido observado con anterioridad y se debe a un bloqueo
en la expresión de la ciclina D1 (61).

Entre los experimentos que profundizan en este objetivo está la evaluación del
ciclo celular luego de retirar el estresor, para poder confirmar que efectivamente la
célula se recuperó y que pudo reactivar su ciclo replicativo. Por otro lado, como se
menciona en los resultados, la evaluación de BIP mediante western blot si bien
mostró una tendencia a aumentar sus niveles en respuesta a ERE, éstos no fueron
significativos, por lo que se debe evaluar su mRNA mediante RT-PCR.

7.2. Estudio de AMC en células NIH3T3 expuestas a ERE

Los datos de la tesis establecen las primeras señales de una posible activación
de la AMC seguido a un evento de ERE. Esta activación tendría por objeto ayudar
en la eliminación de las proteínas mal plegadas que se están generando en el RE.
Para esto la maquinaria del ERAD, en la cual intervienen varias chaperonas, luego
de retrotranslocar sus sustratos al citosol, los pondría en manos de las chaperonas
de la AMC. Naturalmente las proteínas blanco de la vía, deben cumplir con el
requisito de exponer la secuencia de reconocimiento KFERQ.

45
 El resultado más importante que se obtuvo en la tesis, fue que el tratamiento
con Tapsigargina lleva a un aumento en el nivel total de Lamp2A. Este aumento podría
estar dado por un aumento en la expresión total de Lamp2, y por ende de todas sus
isoformas, Lamp2A, Lam2B y Lamp2C, por igual. La otra posibilidad que existe, es que
se esté favoreciendo el splicing de Lamp2A. Para resolver esta pregunta, es necesario
observar si las otras isoformas de Lamp2, aumentan su expresión. No hay reportes que
describan los mecanismos que controlan la expresión de Lamp2, ni bajo que
condiciones se favorece el splicing de alguna de las isoformas. Una muy interesante
posibilidad sería que se esté produciendo un mecanismo similar al que ocupa IRE1
para producir el splicing de XBP1. El sensor IRE1, tiene un dominio endoribonucleasa
en su porción citosólica, que genera el corte del mRNA de XBP1 en dos posiciones,
produciendo la eliminación de un intrón. Los exones resultantes son unidos por una
RNA ligasa (12, 13).

Otra posibilidad es que el aumento en la expresión del receptor pueda deberse

a la alteración en el calcio citosólico, que provoca la Tapsigargina. Con relación a este
punto, un experimento clave será quelar el calcio citosólico en conjunto al estímulo con
Tapsigargina, para poder estudiar el eventual papel del calcio en este proceso. Sin
embargo, una de las principales características del ERE es que se reduce al mínimo la
traducción general (8). Si el aumento en los niveles de Lamp2A es debido a una mayor
expresión del gen Lamp2, deben estar implicados factores que eviten el bloqueo de
traducción producido por la acción de eIF2α durante el ERE. De esta manera se podría
descartar una posible intervención de los mecanismos normales de control de la
expresión génica, que pudiesen depender de calcio.

Luego de observar que se producía un aumento en los niveles totales de

Lamp2A, se buscó en el promotor de este gen elementos de respuesta a alguno de los
factores de transducción clásicos que son inducidos durante ERE. Mediante el uso del
programa TESS, Transcription Element Search System (http://www.cbil.upenn.edu/cgi-
bin/tess/tess), observamos que existen varios sitios de consenso para los factores
transcripcionales que pertenecen a la familia AP1 y NF-kB. Existen reportes que
indican la activación de estos factores durante el ERE (64, 65, 66, 67, 68). Un ejemplo
es la expresión de manganeso superóxido dismutasa, una enzima antioxidante que se

46
ubica en la mitocondria, y que aumenta su expresión en respuesta a la activación de
AP1 y NF-kB, inducidos por ERE. La activación de estos factores es dependiente de la
vía de IRE1 (64).

AP1 es una familia de factores transcripcionales que controlan principalmente la

proliferación, diferenciación y apoptosis. La familia de factores transcripcionales AP1,
está integrada de las subfamilias Jun y Fos. La activación de AP1 requiere de la
fosforilación de JNK y p38 MAPK (69). JNK es clásicamente activado por la vía de
IRE1 durante el ERE, y media la muerte por apoptosis (22). La utilización de
inhibidores de p38 MAPK reduce en un 40% la actividad de la AMC frente a la
privación de nutrientes (70). Recientemente se va visto que la fosforilación mediada por
JNK1 de Bcl2, activa la macroautofagia inducida por privación de nutrientes (71). Sería
importante evaluar inhibidores de JNK para observar si también tiene un rol en la
regulación de la AMC.

NF-kB es un factor transcripcional compuesto de dos subunidades p50 y p65,

que regula principalmente el sistema inmune e inflamatorio (72). La retención citosólica
de NF-kB requiere la acción de inhibidor IkB (72). Se ha reportado que durante un
evento de estrés nutricional, este inhibidor es sustrato de la AMC, degradación que es
revertida por antioxidantes (73).

Se ha descrito un aumento en los niveles de Lamp2A total solo con estímulos

que producen estrés oxidativo (40), pero no se ha indagado en el mecanismo que
produce este aumento en la transcripción. Los factores AP1 y NF-κB, han mostrado
actividad durante el estrés oxidativo (68)

La Tapsigargina es un inductor de ERE que en general muestra un poco

reproducibilidad en sus resultados. Una explicación para que 0,1 µM de TG no sea
significativo (Figura 8), es que esta concentración no sea suficiente para inducir ERE
suficiente en todas las repeticiones. Sin embargo la tendencia siempre fue a mostrar un
aumento en el total de Lamp2A, lo que se hace estadísticamente concreto para la
concentración de 1µM.

Por otro lado es importante mostrar que el aumento total de Lamp2A se

produce con otros inductores de ERE. Sin embargo, existen varias limitantes para la

47
elección de alguno de los inductores clásicos de ERE. La tunicamicina un inhibidor de
la glicosilación en el RE, fue descartada debido a que Lamp2A es una proteína muy
glicosilada, lo cual da cuenta de más de la mitad de la masa de Lamp2A. Lamp2A de
humano tiene 16 N-glicosidaciones y otras tantas O-glicosilaciones (34). Por este
mismo motivo se descarta la brefeldina A, que inhibe el tráfico desde el RE y el aparato
de Golgi, en donde se producen la O-glicosidación de proteínas. Una posibilidad a
estudiar, es el uso de ditiotreitol, el cual genera un estrés reductivo, en el RE que
impide la formación de enlaces bisulfuro.

Las inmunofluorescencias corroboran lo observado mediante western blot, en

cuanto al aumento de total de Lamp2A. Sin embargo no es tan evidente la
relocalización de los lisosomas hacia zonas perinucleares que se ha observado con
otros estímulos de AMC (29, 35, 40). Esto puede ser una característica particular de la
respuesta frente a ERE. Es importante indagar en el acercamiento entre los lisosomas
y el RE, para establecer si el aumento de volumen durante del RE durante el ERE
desencadena una mayor interacción entre ambos organelos, que pudiese ser
importante en la activación de AMC.

El aumento total en los niveles de Lamp2A se ve reflejado en una mayor

presencia de este receptor en la fracción lisosomal generada por centrifugación
diferencial. Estos resultados muestran que el aumento en la expresión de Lamp2A, no
altera los mecanismos que destinan al receptor hacia los compartimientos lisosomales
en donde es funcional. La ubicación de Lamp2A puede ser en el interior del lisosoma,
formando parte de la fracción inactiva o en la membrana del lisosoma, donde a su vez
puede estar multimerizado o secuestrado en los dominios lipídicos en donde es
inactivo (38, 37, 25). La manera de averiguar la localización del receptor es obteniendo
lisosomas puros mediante separación en gradiente de densidad, ya que la
centrifugación diferencial entrega una fracción contaminada con mitocondrias.

Otro de los resultados fue la ausencia de cambios en la expresión total del otro
marcador y actor clave de la AMC, Hsc70. Como existe una gran cantidad de esta
chaperona en la célula, posibles cambios en la expresión total podrían estar siendo
enmascarados, por lo que es importante indagar a nivel de mRNA.

48
 Si bien las aproximaciones utilizadas en esta tesis para evaluar AMC, solo
involucran el estudio en la expresión de los marcadores, el aumento de Lamp2A y su
localización en los lisosomas, es un fuerte indicio que la actividad de AMC aumenta. La
actividad de la AMC se puede determinar evaluando la degradación de proteínas
marcadas, en presencia de un inhibidor de la macroautofagia. Otra manera de medir la
actividad es mediante ensayos de transporte de sustratos de la vía, al interior de
lisosomas aislados (44). Este tipo de ensayos entregan la certeza que la vía esta
activa, pero son difíciles de implementar, por lo que durante a tesis se optó por la
estrategia ya descrita.

7.3. Estudio de la participación del ERE en la activación de AMC mediante la

intervención de elementos de estos sistemas

El bloqueo de la AMC nos permitió observar los eventos compensatorios que se

activan, cuando esta vía degradativa selectiva no esta operando normalmente. Se ha
descrito que se produce la activación de la macroautofagia a niveles basales en células
que expresan iRNA de Lamp2A (43). Esto lo pudimos comprobar al observar un
aumento en los niveles de procesamiento de LC3 a su forma lipidada LC3 II, en células
Lamp2A(-) comparadas con las células control Luc(-). Además el evento de ERE en las
células luc(-) provocó un aumento en el procesamiento de LC3, de acuerdo con lo que
ha sido descrito (51), pero el mismo tratamiento en las células Lamp2A(-) produce un
aumento de LC3 II aún mayor. Esta sobreactivación de la Macroautofagia para las
células carentes de AMC, indica que la AMC se encarga de un porcentaje importante
de toda la carga degradativa celular durante este evento de estrés. Además este
ensayo demostró la comunicación entre estas dos vías degradativas durante el ERE,
que se suma a los estresores ya descritos (42).

Por otro lado durante este objetivo obtuvimos que al contrario de lo esperado,
hay una mayor expresión de Chop en las células Luc(-) que en las Lamp2A(-) para las
8 h de estímulo. Como se mencionó en los resultados previos, ésto podría tener
relación con el aumento en la actividad de la macroautofagia, que podría estar
regulando los niveles proteicos de Chop. Es necesario seguir la cinética de expresión
de Chop para observar si la carencia de AMC altera del patrón mostrado en la Figura 6.

49
 Para la segunda parte de este objetivo, se trabajó con las células MEF m5-7
ATG5 (+/+), las cuales mostraron similar comportamiento que las células NIH3T3, para
la inducción de la expresión de Lamp2A (Figura 16A), esto aboga a favor de que la
activación de la AMC en respuesta a ERE sea un mecanismo conservado.

Se ha reportado que células carentes de ATG5 y que por lo tanto no producen

macroautofagia presentan una activación constitutiva de la AMC (44).Para nuestro
estudio contamos con las células MEF m5-7 que poseen un sistema tet-off para la
expresión de ATG5 (63), lo que permite tener a partir de una mismo tipo celular una
población que es capaz de producir macroautofagia y otra que no. Gracias a esta
herramienta corroboramos lo observado por Kaushik y cols (44), en cuanto a que se
produce un aumento en los niveles proteicos basales de Lamp2A, en células incapaces
de activar la macroautofagia, lo que se traduce en una mayor actividad de la AMC. Lo
paradójico se observa cuando las células ATG5 (-/-) son sometidas a ERE, ya que el
tratamiento revierte los niveles basales de Lamp2A de las células ATG5 (-/-) sin
estimular, mientras que lo esperado era ver un aumento en sus niveles totales. Esto
puede deberse a que alguno de los mecanismos de degradación de Lamp2A se está
activando. Otra posibilidad es que la activación del proteasoma, descrito en eventos de
ERE, degrade a algún factor transcripcional implicado en la regulación positiva de
Lamp2A. Si esto es cierto, la inhibición del proteasoma debiera al menos llevar los
niveles del receptor en las células ATG5 (-/-) estimuladas a los de las células ATG5
(-/-) sin estimular. Además podría suceder que se esté dando una disminución de los
lisosomas, lo cual llevaría a una disminución de Lamp2A, lo que se puede evaluar
observando la masa total de lisosomas con lisotracker.

50
8. CONCLUSIONES

 TG detiene el ciclo en células NIH3T3 en la etapa G1.

 TG aumenta la expresión de Lamp2A y en la colocalización de Lamp2A con

Hsc70. Esto indica que la actividad de la AMC podría estar aumentada.

 El aumento en los niveles totales de Lamp2A se refleja en un aumento de su

localización en los lisosomas, lo cual indica que el mecanismo de destinación

de Lamp2A no se ha alterado.

 TG produce que el aumento en la actividad de Macroautofagia sea mayor en las

células deficientes en AMC que en las células control. Lo cual indica que la

ausencia de AMC es compensada con la activación de MA, durante un evento

de ERE.

 TG provoca que células deficientes en AMC tengan niveles menores de Chop

que el control estimulado. Esto muestra que las células que tienen la

macroautofagia sobreactivada generan menos, o pueden resolver antes el ERE.

 En células Knock out para ATG5, TG revierte el aumento basal de Lamp2A.

51
Figura 17. Modelo propuesto. Se ha descrito que durante un evento de Estrés de
Retículo se activan las vías proteolíticas del proteasoma y macroautofagia. También se
ha observado que se detiene el ciclo celular, lo que se corroboró en nuestro análisis. El
principal hallazgo de la tesis fue que la TG provoca un aumento en los niveles de
Lamp2A y una redistribución de Hsc70 a los lisosomas, lo cual es el primer indicio de
un aumento en la actividad de la Autofagia Mediada por Chaperonas. Además existen
antecedentes que muestran la activación de factores de la familia AP1 y NF-kappaB
durante el Estrés de Retículo, para los cuales existen sitios en el promotor de Lamp2A.
El bloqueo de la Macroautofagia provoca un aumento constitutivo de Lamp2A y en
consecuencia de la Autofagia Mediada por Chaperonas. Este aumento en Lamp2A es
revertido por la TG, lo cual podría deberse a una sobreactivación del proteasoma que
pudiese estar degradando algún factor que promueva la expresión de Lamp2A. El
bloqueo de la Autofagia Mediada por Chaperonas produce una sobreactivación basal
de la Macroautofagia y una disminución en los niveles de Chop, lo que podría indicar
que Chop es degradado por la Macroautofagia.

52
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10. FINANCIAMIENTO

Este trabajo fue financiado por el Fondo Nacional de Investigacion en Áreas Prioritarias

(FONDAP), Centro de Estudios Moleculares de la Célula (15010006).

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