SEMINARIO INVESTIGATIVO

(TIPOS DE RESISTENCIAS MICROBIANAS)

EXPONENTE:

JUAN JOSÉ MONTALVO LAMBRAÑO

PRESENTADO A:
MARYORIS SOTO

UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA COLOMBIA

(SEDE BERÁSTEGUI)

FACULTAD DE INGENIERÍAS

PROGRAMA DE INGENIERÍA DE ALIMENTOS

IV SEMESTRE

3/MAYO/2019
 Contenido:

1. Introducción
2. Definiciones
2.1. Resistencia microbiana.
2.2. Antisépticos.
2.3. Antibióticos.
2.4. Desinfectantes.
3. Mecanismos de resistencia microbiana.
3.1.1. Enzimas hidrolíticas.
3.1.2. Modificación del sitio activo.
3.1.3. Disminución de la permeabilidad de la pared celular al ingreso del
a antimicrobiano.
3.1.4. Bombas de eflujo.
3.2.1. Mecanismos de resistencia a antisépticos y desinfectantes.
3.2.2. Mecanismos de resistencia a antibióticos.
4. riesgos de la presencia de antimicrobianos en alimentos.
5. conclusión.
7. Bibliografía
1. INTRODUCCIÓN
En este seminario conoceremos los tipos de resistencias microbianas que
experimenta un microorganismo en presencia de un agente antimicrobiano
(antibióticos, antisépticos y desinfectantes). La resistencia que ejercen las
bacterias a los antibióticos, antisépticos y desinfectantes, es un problema de salud
pública que se creía superado. Desde el descubrimiento de los primeros
antibióticos, los microorganismos han sido capaces de evadir su acción. El uso
indiscriminado de los antibióticos y la presión selectiva ambiental realizada por
antisépticos y desinfectantes ha generado una respuesta de supervivencia en los
microorganismos, que los capacita para evadir con eficiencia la acción bactericida
de algunos agentes

2. DEFINICIONES
2.1. Resistencia microbiana: La resistencia bacteriana es la capacidad que tienen
las bacterias de soportar los efectos de los antibióticos o biocidas destinados a
eliminarlas o controlarlas.

2.2
.
2.3. Métodos convencionales:
Los métodos microbiológicos convencionales, empleados actualmente en
numerosos laboratorios de todo el mundo y establecidos en muchos casos como
métodos estándares de análisis microbiológico de los alimentos, se caracterizan
por ser laboriosos, emplear grandes volúmenes de medios de cultivo y requerir un
tiempo considerable para la obtención y el análisis de los resultados.
2.4. Métodos no convencionales:
Métodos destinado a la detección, el recuento, la caracterización y la
subtipificación de microorganismos (patógenos y del deterioro) mediante el cual se
obtienen resultados de manera sencilla, fiable y en menor tiempo que con los
métodos convencionales. El desarrollo de métodos rápidos y automatizados
constituye un área de la microbiología aplicada muy dinámica y en continua
evolución.
3. Métodos convencionales de Identificación y diagnóstico microbiano.
3.1. Métodos convencionales de identificación microbiano:
Se pueden utilizar en diferentes áreas:
  Área clínica: es aquí donde se conoce cuál es el agente causal de la
Infección que presenta un paciente.
 Industria farmacéutica, cosmética y de alimentos: donde las normas de
control de calidad exigen la ausencia de ciertos microorganismos.
 Investigación de nuevos microorganismos: se aísla un determinado
microorganismo que debe identificarse para comprobar si se trata de un
microorganismo conocido o de uno nuevo para poder clasificarlo.
3.1.1. Clasificación de Métodos convencionales de identificación microbiano.
• Métodos basados en pruebas bioquímicas: Algunas pruebas bioquímicas
se denominan pruebas rápidas porque evalúan la presencia de enzimas
preformadas y se realizan de forman inmediata:
CATALASA-CITOCROMO C- OXIDASA-COAGULASA-SOLUBILIDAD EN
BILIS, entre otras.

• Métodos basados en biología celular: este se da a través de procedimientos

y reactivos, donde se pueden detectar determinadas secuencias de ADN
que son propias de un determinado agente microbiano.

• Métodos basados en pruebas serológicas: análisis que mide el número de

anticuerpos que se producen ante la presencia de un virus o bacteria en el
suero o un reactivo.

• Métodos basados en tinción diferencial: se usan para diferenciar de manera

más explícita los microorganismos. Estas tinciones utilizan los colorantes
diferenciales, que se componen de más de una sustancia tintórea.
Entre estas podemos destacar las más utilizadas en microbiología:

Tinción de Gram.
Tinción ácido-resistente.
Estas tinciones se utilizan para identificar los siguientes microorganismos:
*Microorganismos ácido alcohol resistentes (especies de Mycobacterium)
*Microorganismos moderadamente ácido alcohol resistentes
(principalmente, especies de Nocardia).
*Rhodococcus y géneros relacionados.
*Ovocistos de algunos parásitos (ej., Cryptosporidium, Cystoisospora
[Isospora] belli)
Tinción de Auramina.
En esta encontramos microorganismos patógenos como:
*Cryptosporidium Hematoxilina férrica
*Tricómina
* Wright-Guiemsa).
 • Métodos basados en tipificación con fagos: el uso de fagos específicos
permite identificar y subclasificar bacterias dentro de una misma especie.

• Métodos basados en detección molecular: PCR, aplicado para identificación

de organismos que no pueden ser cultivados por métodos convencionales.
BACTERIAS: Helicobacter pylori – Vibrio Cholerae .
PROTOZOARIOS: Tripanosoma cruzi – Toxoplasma gondii.

1.1.2. Crecimiento en cultivos de identificación.

Proceso por el que se induce el crecimiento de agentes patógenos y no
patógenos.
Medios de cultivos sólidos utilizados:
Medios selectivos: es un medio de cultivo en el que solo puede crecer un tipo de
microorganismo, dentro de estos tenemos; Agar macConkey, Agar CLED, Agar
XLD, Agar VCAT.

Medios no selectivos: contienen suficientes nutrientes como para soportar el

crecimiento de gran variedad de microorganismos, dentro de estos encontramos;
Agar sangre y Agar chocolate.

3.2. Métodos Convencionales de diagnóstico microbiano.

Dentro de estos existen solo dos métodos los directos y los indirectos.
Directos: implican la demostración del agente patógeno, sus metabolitos o alguno
de sus componentes antigénicos en los fluidos orgánicos del paciente.
Algunos de estos son:
Tradicionales: observación microscópica, cultivo e identificación.
Moleculares: hibridizacion y P.C.R.
Detección de antígenos: Inmunofluorescencia directo y Elisa directo.
Indirectos : implican la demostración de la huella que el agente patógeno ha
dejado en su contacto con el sistema inmunocompetente del paciente.
Algunos de estos son: Inmunofluorescencia y Elisa.
3.3. Ventajas y Desventajas de los métodos convencionales.
Ventajas:
 Bajos costos
 Fácil manejo.
Desventajas:
 Tiempo de duración de la incubación.
 Interferencia de organismos antagónicos.
 Necesidad de subcultivos adicionales para la confirmación de los
resultados.
 Laboriosidad.

2. Métodos no convencionales de identificación y diagnostico microbiano.

4.1. Origen de los métodos no convencionales.

Desde la década del 70, el desarrollo y la implementación de los métodos no
convencionales para la identificación de microorganismos evolucionaron en
paralelo con los adelantos en otras áreas de la investigación científica, en
particular con la generalización del uso de galerías de pruebas bioquímicas
miniaturizadas. A partir de la década del 80, el avance en la producción de
anticuerpos monoclonales hizo posible el desarrollo de pruebas inmunológicas de
identificación, como el ELISA o la inmunocromatografía. En 1990, con el
advenimiento de las técnicas de biología molecular comenzaron a utilizarse
técnicas como la PCR, tanto para tamizaje como para la identificación de
microorganismos y sus factores de virulencia. A partir del año 2000, comenzó el
desarrollo de biosensores y en menor medida de biochips y microarrays. El
crecimiento exponencial de los métodos no convencionales aplicados a la
microbiología de los alimentos puede evidenciarse en la gran cantidad de equipos
comerciales que se ofrecen en la actualidad con el objetivo de tener resultados
rápidos, en tiempo real, exactos y de bajo costo. Por ejemplo, como consecuencia
de la automatización, el estudio de genotipos bacterianos pasó de ser un proceso
tedioso y lento a un método práctico que se puede aplicar en los ensayos
microbiológicos cotidianos.
Los factores que justifican la utilización de métodos no convencionales e impulsan
su desarrollo son numerosos, entre ellos se pueden mencionar las presiones
regulatorias, las modernas prácticas de producción y la complejidad analítica.
4.2. Métodos no convencionales de identificación microbiano.
Dentro de estos podemos encontrar los métodos rápidos utilizados en
microbiología de los alimentos los cuales pueden dividirse en cinco grandes
grupos, incluyendo los empleados para el recuento de células viables, para la
medición de la biomasa, los sistemas miniaturizados y kits de diagnóstico, los
inmunológicos y los genéticos.
4.2.1. Clasificación de métodos no convencionales de identificación microbiano.
 Recuento de células viables: este método facilita de diversas maneras la
realización del recuento microbiano y/o disminuyen el tiempo necesario
para la obtención de resultados. Sin embargo, necesitan un tiempo de
 incubación variable para que los microorganismos crezcan y puedan ser
detectados y enumerados.
El recuento de células viables, tanto de los alimentos como de las
superficies en contacto con los mismos y del aire de las industrias
alimentarias, es uno de los parámetros más importantes a la hora de
determinar la calidad y seguridad de los alimentos. Tradicionalmente, el
recuento de células viables se ha realizado mediante el método estándar de
recuento en placa, que, aunque sencillo, es laborioso, requiere un volumen
considerable de tubos de ensayo y medio de dilución, y espacio para el
almacenamiento y la incubación de las placas de cultivo. En lo que se
refiere a la preparación de placas de cultivo, destacan las siguientes
mejoras: autómatas para la preparación y distribución de medios de cultivo
(Masterclave, AES Chemunex); sistemas que incluyen pectina como agente
gelificante en lugar de agar, evitando así la necesidad de calentar el medio
para fundirlo (Redigel, 3M); y medios liofilizados que utilizan como soporte
una película plástica de tamaño y grosor similar al de una tarjeta de crédito
que contiene geles solubles en agua fría que se rehidratan al depositar la
muestra en su superficie y que requieren un espacio mínimo para su
almacenamiento e incubación (Petrifilm, 3M), existiendo asimismo
instrumentos para la lectura rápida y automática de los resultados (Lector
de placas 3M Petrifilm, 3M).

 Medida de la biomasa microbiana: este método (por ejemplo, el sistema

Promicol) puede emplearse para la detección específica de ATP microbiano
en productos líquidos tales como leche UHT, zumos, postres lácteos, etc.,
en los que es necesario determinar la presencia/ausencia de
microorganismos. No obstante, la principal aplicación de este principio en la
industria alimentaria se encuentra en la monitorización de la higiene de
superficies. En este caso, la presencia de altos niveles de ATP de cualquier
origen (microbiano o no) es indicativa de una limpieza deficiente. En la
actualidad, existen numerosos sistemas que utilizan dispositivos del tipo
escobillón o hisopo para la toma de muestra y luminómetros portátiles,
robustos, sensibles y fáciles de utilizar que ofrecen lecturas rápidas (en
menos de 1 min) del nivel de ATP (Ultrasnap y systemSURE Plus, Hygiena;
Accupoint, Neogen; Lightning MVP, Biocontrol; CleanTrace y Uni-Lite, 3M)
lo que permite aplicar las acciones correctoras establecidas en el plan de
Análisis de Peligros y Puntos de Control Crítico (APPCC) antes de que se
contamine el producto.

 SISTEMAS MINIATURIZADOS: los sistemas miniaturizados surgen a partir

del concepto de la placa microtituladora (96 pocillos, formato 8x12), que
permite reducir el volumen de
reactivos y medio a emplear en los ensayos, así como estudiar en un
formato manejable el efecto de un compuesto sobre un gran número de
aislados o el de una serie de compuestos sobre un aislado determinado.
Esta línea de investigación ha permitido desarrollar algunos de los medios
de cultivo selectivos que se encuentran en el mercado actualmente. Entre
 los sistemas miniaturizados de identificación microbiana disponibles en la
actualidad, basados en el metabolismo de sustratos específicos por parte
de los microorganismos y su detección mediante diversos sistemas
indicadores, destacan los siguientes: tarjetas desechables para la
identificación sencilla de colonias sospechosas mediante pruebas
bioquímicas rápidas (O.B.I.S., Oxoid); galerías que permiten la
identificación de más de 800 especies de bacterias y levaduras (API,
bioMérieux); tubos de plástico con compartimentos que contienen agar con
distintos sustratos y con una aguja en su interior que posibilita la
inoculación del tubo de forma rápida y sencilla a partir de una única colonia.
 SISTEMA API: los sistemas miniaturizados API son métodos rápidos que
permiten la identificación de microorganismos a través de la realización de
diferentes pruebas bioquímicas. A demás permite identificación de cepas
gram positivas, gram negativas y levaduras.

Dentro de este sistema podemos encontrar:

 API 20E
 API 20A
 API 20 NE
 API STAPH.

 BBL Enterotube II: es un sistema de identificación listo para usar que se

emplea en la identificación de Enterobacteriaceae y otros bacilos gram
negativos con resultado negativo a la oxidasa.

 BBL Crystal: el sistema BBL Crystal para la identificación (ID) de bacterias

gram-positivas (GP) es un método de identificación en miniatura que utiliza
substratos convencionales, fluorogénicos y cromogénicos modificados. Se ha
diseñado para la identificación de bacterias aerobias gram-positivas aisladas
frecuentemente de muestras clínicas.

 RapID ™ System: son una línea completa de paneles de identificación

manual rentables para un amplio espectro de microorganismos, se pueden
identificar microorganismos anaerobios, bacilos gram-positivos, corineformes,
entéricos, no fermentadores, estreptococos y levaduras todo en 4 horas.

 SISTEMAS AUTOMATIZADOS: ofrecen la posibilidad de lectura e

interpretación de resultados de manera automática.

 FENOTIFICAS: Resultados a partir de 4 horas, Combinan reacciones

enzimáticas y bioquímicas.
 • VITEK: Uno de los sistemas miniaturizados y automatizados más
conocidos y sofisticados es el sistema VITEK (bioMérieux) que,
basándose en cambios de color de los sustratos o en la producción
de gas de los cultivos inoculados en los pocillos de una tarjeta
plástica que contiene los sustratos bioquímicos en forma
deshidratada, puede identificar un cultivo típico de Escherichia coli
en 2-4 h.

• BIOLOG: (AES Chemunex) que detecta la capacidad de los

microorganismos para oxidar 95 fuentes de carbono además
permite la prueba e identificación de bacterias aerobias Gram-
negativas y Gram-positivas en el mismo panel de prueba.

• PHOENIX: identificación de bacterias gram-positivas y gram-

negativas, unos de los más completos

 GENOTIPICAS: Secuenciación del ARN.

MicroSEQ: es el componente de secuenciación del sistema de identificación

bacteriano MicroSEQ 500 16S rDNA, que proporciona un método fácil de
usar basado en secuencias de ADN para identificar la mayoría de las
bacterias.

 Métodos inmunológicos: los métodos inmunológicos se basan en la

reacción específica entre un antígeno y un anticuerpo policlonal o
monoclonal. En microbiología de los alimentos, el método inmunológico
más empleado para la detección de microorganismos o sus toxinas es el
ensayo ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) tipo sándwich. En
los últimos años, se han desarrollado sistemas que permiten realizar el
ensayo ELISA de manera automatizada, dirigidos fundamentalmente a la
detección de Salmonella, E. coli O157:H7, Listeria monocytogenes,
Campylobacter spp. y toxinas estafilocócicas.

 Métodos genéticos: a diferencia de los métodos citados en las secciones

anteriores, que detectan características fenotípicas sujetas de manera
natural a variación, los métodos genéticos se dirigen a la detección de
características celulares mucho más estables contenidas en los ácidos
nucleicos. Una técnica para detectar dichas características en ausencia de
instrumentación especializada es la hibridación de ácidos nucleicos. Los
ensayos comerciales actuales emplean sondas genéticas
(oligonucleótidos sintéticos) marcadas enzimáticamente que, tras hibridar
con regiones específicas del ARN ribosómico (una célula bacteriana
puede contener hasta 10.000 copias de ARN ribosómico frente a una
única copia de ADN cromosómico), catalizan una reacción que da lugar a
un producto coloreado a partir de un sustrato cromogénico, lo que es
 indicativo de la presencia del microorganismo en el alimento
(GeneQuence, Neogen). En los últimos años es cada vez más frecuente
en los laboratorios de microbiología de los alimentos el empleo de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar el ADN de los
microorganismos diana y disponer así de una cantidad suficiente que
permita su detección.
La técnica de PCR cuantitativo en tiempo real es una de las opciones más
prometedoras en los laboratorios de control de calidad de los alimentos,
no solo para la identificación y cuantificación de microorganismos, sino
también para la determinación de la presencia de organismos modificados
genéticamente en materias primas y productos terminados y para la
autentificación de productos en los que pueda producirse un fraude por
sustitución de especies por otras de menor valor comercial.

4.3. Métodos no convencionales de diagnóstico microbiano:

 TÉCNICA ELISA:
ELISA se basa en el uso de antígenos o anticuerpos marcados con una
enzima, de forma que los conjugados resultantes tengan actividad tanto
inmunológica como enzimática. Al estar uno de los componentes (antígeno o
anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte
(inmunoadsorbente) la reacción antígeno-anticuerpo quedará inmovilizada y,
por tanto, será fácilmente revelada mediante la adición de un substrato
especifico que al actuar la enzima producirá un color observable a simple
vista o cuantificable mediante el uso de un espectrofotómetro o un
colorímetro.

Los diferentes tipos de ELISA son los que se enumeran a continuación:

 Anticuerpos marcados:
 ELISA Directo
 ELISA Indirecto
 ELISA sándwich

 Antígeno marcado
 ELISA competitivo

 BIOLUMINISCENCIA
Mide niveles de ATP lo relaciona con niveles de contaminación, la
bioluminiscencia es una tecnología basada en la detección del ATP
(adenosintrifosfato), molécula energética de todos los organismos vivos, este
sistema indica el nivel de limpieza en toda la extensión de la superficie por medida
del ATP de orígenes diversos

 SEPARACIÓN INMUNOMAGNÉTICA
Estas técnicas se basan en el uso de anticuerpos unidos a la superficie de unas
esferas formadas por un material supe paramagnético (es decir, que sólo son
magnéticas en presencia de un campo magnético) recubierto de un polímero. Los
anticuerpos se unen de manera específica a un antígeno presente en la superficie
de un tipo celular concreto y, mediante un simple imán, se pueden separar las
células que se han unido a los anticuerpos de las demás, existen en el mercado
dos sistemas de separación de células basados en el uso de esferas supe
paramagnéticas unidas a anticuerpos

 TÉCNICA ELFA (ENZYME LINKED FLUORESCENT ASSAY)

Unida a técnicas de inmuno-detección, inmunoconcentración y a captura
específica mediante fagos La interacción entre virus bacteriano (fago) y su célula
la bacteria sensible es sumamente específica, ya que el proceso de absorción se
encuentra mediado por receptores específicos tanto en el virus como en la célula
bacteriana, se le añade una alícuota de un fago especifico, este puede ocasionar
la lisis de las bacterias. El uso de fagos específicos permite identificar y
subclasificar bacterias dentro de una misma especie.

4.4. Ventajas y desventajas de los métodos no convencionales.

Ventajas:

 procesar elevado número de muestras / tiempo

 facilidad de uso
 Rapidez
 límites de detección bajos

 precisión (sensibilidad y especificidad).

Desventajas:
 alto costo de los equipos.

 necesidad de confirmación.

 difícil traducción cuantitativa de resultados.

5. Métodos no convencionales de conservación de alimentos.

Los avances científicos están permitiendo encontrar diferentes procesos
no térmicos que consiguen, sin elevación de las temperaturas de los alimentos, la
eliminación de gérmenes patógenos para mejorar la conservación. Las nuevas
tecnologías en la conservación de alimentos van desde la aplicación de
altas
presiones, irradiación, ultrasonidos o la aplicación de campos el
e l é c t r i c o s pulsados, entre otros.
La técnica de alta presión hidrostática (HHP) se basa en el t ratamiento
de un producto por encima de 100 MPa, una elevada presión, que consigue
afectar, especialmente, a las membranas celulares y a la
estructura de algunas proteínas sensibles. La consecuencia es
que se puede limitar el desarrollo microbiano y eliminar una parte
significativa de las bacterias presentes en el producto .El efecto de la alta
presión hidrostática, a diferencia de lo que ocurre en los procesos
térmicos y otras tecnologías de conservación, es casi instantáneo y
uniforme en todo el alimento. Por ende, el diseño del proceso es independiente
de la geometría y tamaño del producto, así como del equipo de tratamiento, por lo
que el escalado a nivel comercial de los efectos observados en unidades del
laboratorio y planta piloto es extremadamente simple y seguro.

6. Innovación:

NEW TECHNOLOGIES IN MICROBIOLOGY: AUTOMATIZATION AND

SOME APPLICATIONS IN MICROBIAL IDENTIFICATION AND
SUSCEPTIBILITY TEST.
(NUEVAS TECNOLOGÍAS DE DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO:
AUTOMATIZACIÓN Y ALGUNAS APLICACIONES EN IDENTIFICACIÓN
MICROBIANA Y ESTUDIO DE SUSCEPTIBILIDAD).

3. Vocabulario:

 Métodos - Method
 Convencional - Conventional
 Identificar - Identify
 Diagnóstico - Diagnosis
  Origen - Origin
 Técnica - Technique
 Diseminación - Dissemination
 Microbiología - Microbiology
 Tecnología - Technology
 Clasificación - Classification

7. Bibliografía
https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0718-48162009000200014

http://www.scielo.org.co/pdf/cm/v38n2/v38n2a07.pdf

http://www.fao.org/3/y5468s/y5468s0d.htm

https://www.greenfacts.org/es/glosario/pqrs/resistencia-bacteriana.htm