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UNIVERSIDAD DE LA SABANA

Caracterización proteica
de dos especies de
microalgas:
haematococcus pluvialis
y scenedesmus
obliquuos
Seminario de proyecto de grado I

Cindy Johana Lara Acosta y Nelcy Lorena Montes Vanegas

10/04/2012
CARACTERIZACIÓN PROTÉICA DE DOS ESPECIES DE MICROALGAS HAEMATOCOCCUS PLUVIALIS Y
SCENEDESMUS OBLIQUUOS

Contenido

1. CONTEXTO ------------------------------------------------------------------------------------------------------------2
2. PROBLEMÁTICA------------------------------------------------------------------------------------------------------2
3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ------------------------------------------------------------------------------2
4. OBJETIVO--------------------------------------------------------------------------------------------------------------2
4.1 OBJETIVO GENERAL ------------------------------------------------------------------------------------------2
4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ------------------------------------------------------------------------------------3
5. JUSTIFICACIÓN -------------------------------------------------------------------------------------------------------3
6. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA -----------------------------------------------------------------------------------------3
6.1 Microalgas------------------------------------------------------------------------------------------------------3
6.2 Haematococus pluvialis -------------------------------------------------------------------------------------4
6.3 Scenedesmus obliquus --------------------------------------------------------------------------------------4
6.4 Medio de cultivo ----------------------------------------------------------------------------------------------5
6.5 Métodos de extracción y reconocimiento de proteína --------------------------------------------5
7. PLAN DE TRABAJO --------------------------------------------------------------------------------------------------6
7.1 RECURSOS E IMPEDIMENTOS -----------------------------------------------------------------------------6
8. CRONOGRAMA ------------------------------------------------------------------------------------------------------7
9. RECURSOS ECONÓMICOS Y MATERIALES ---------------------------------------------------------------------8
10. DISEÑO EXPERIMENTAL ----------------------------------------------------------------------------------------9
10.1 Cultivo de micro- algas -----------------------------------------------------------------------------------9
10.2 Extracción de proteína--------------------------------------------------------------------------------------9
10.3 Electroforesis SDS PAGE --------------------------------------------------------------------------------- 10
11. BIBLIOGRAFÍA --------------------------------------------------------------------------------------------------- 11

1
1. CONTEXTO

A partir de dos especies de microalgas, Haematococcus pluvialis y Scenedesmus obliquuos, se


realizará el reconocimiento proteico de estas especies; donde se tendrá que tener en cuenta la
realización del cultivo de las microalgas, la recolección de la biomasa, la recolección de la proteína,
por ultimo la identificación y caracterización de todas las proteínas presentes.

2. PROBLEMÁTICA

Los suplementos proteicos actualmente provienen en su gran mayoría de los animales o de forma
sintética, lo que es en cierta manera costoso y en algunos países no se cuenta con el acceso a
estos. Por lo que el uso de las micro-algas podría ser la solución a este problemática, gracias a su
gran contenido de proteínas, fácil acceso en todo el mundo y bajo precio.

3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA

Realizar una caracterización de las proteínas presentes en dos tipos de micro-algas como lo son
la Haematococcus pluvialis y Scenedesmus obliquuos, de una manera practica y eficiente.

4. OBJETIVO

4.1 OBJETIVO GENERAL

2
Caracterizar las proteínas de las microalgas Haematococcus pluvialis y Scenedesmus obliquuos,
para analizar la posibilidad de uso como suplemento proteico en lugares donde el acceso a estos
sea nulo o costoso.

4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Buscar el medio de cultivo óptimo para cada una de las especies de micro-algas.
• Implementar métodos mecánicos y químicos para el rompimiento de la pared celular y
así obtener la biomasa apropiada.
• Utilizar varios métodos de análisis para el reconocimiento de las proteínas de las
especies utilizadas.

5. JUSTIFICACIÓN

Las microalgas son actualmente una de las especies mas utilizadas para distintos procedimientos,
abarcando desde suplemento nutricional hasta componente de combustibles; dadas las diferentes
características que estas presentan en sus estructuras, defieren de una especie de otra, por otro
lado se ha querido generar mayor productividad en los cultivos y así obtener más facilidades de
manejo en el laboratorio.

De esta misma manera encontrar suplementos proteicos cuyos costos sean muy bajos se ha
convertido en una prioridad para el mundo, más específicamente en países emergentes cuyos
índices nutricionales son muy bajos.

En la realización de este proyecto se espera identificar proteínas con un alto valor nutricional, pues
se ha encontrado en datos bibliográficos, que algunas especies ya están siendo empleadas,
inicialmente estas investigaciones son realizadas de manera práctica, pues al generar una muestra
de la especie se puede realizar todo el análisis químico.

Se plantea que el trabajo experimental y la realización de esta caracterización de proteínas se


realicen en un tiempo apropiado, pues se emplearan diversas técnicas para corroborar y
reconocerlas correctamente. Como se mencionaba anteriormente son técnicas de análisis
químico, de tal manera se podrá trabajar en el laboratorio de la Universidad de la Sabana.

6. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA

6.1 Microalgas

3
Las microalgas son organismos pertenecientes al reino vegetal, que comprenden un grupo de
diversos organismos foto sintetizadores.

Se clasifican como talofitas o plantas inferiores por presentar una estructura simple no vascular
izada con ausencia de raíz, tallo hojas. Se asemejan a las algas superiores porque contiene
carbohidratos, proteínas y pigmentos fotosintéticos

Las microalgas se encuentran principalmente en el medio marino, sin embargo tienen una amplia
distribución geográfica ( se encuentran en todas las condiciones ambientales de la tierra ) 1

Las microalgas son consideradas alimentos funcionales, capaces no sólo de elevar el contenido
nutricional de los alimentos tradicionales, sino también de afectar positivamente la salud de
animales y humanos, debido a que contienen cantidades apreciables de proteínas, vitaminas y
ácidos grasos polinsaturados. Algunas microalgas incluso tienen un contenido aminoacidito
superior al presentado por alimentos convencionales.2

6.2 Haematococus pluvialis

Haematococcus pluvialis es una microalga unicelular, verde que tiene la capacidad de realizar
fotosíntesis. La hematococcus pluvialis se utiliza comúnmente en aplicaciones comerciales para
producir astaxantina (3,3 '-dihidroxi-β, β'-caroteno-4, 4'-diona), que se sabe que tienen efectos
inmuno reguladoras y anticancerosos, así como efectos antioxidantes. Esta microalga esta
compuesta con un porcentaje de 23,62% de proteínas.3

6.3 Scenedesmus obliquus

Esta microalga pertenece a la división Chlorophyta, Clase Chlorophyceae, Orden Chlorococcales,


familia Scenedesmaceae y puede encontrarse solitaria o en parejas formando cenobios. La

1
MARTINEZ SILVA, Alicia soledad. Evaluación del crecimiento celular y de los pigmentos obtenidos
de la micro-alga Haemactococcus Pluvialis cultivada en diferentes medios. Trabajo de grado en
doctorado en tecnología avanzada. México Distrito Federal. Instituto politécnico nacional de
México. centro de investigación en ciencia aplicada y tecnología avanzada. Enero, 2010. 91 p.
2
QUEVEDO Catalina, P. MORALES Sonia ACOSTA Alejandro. Crecimiento de scenedesmus sp en
diferentes medios de cultivo para la produccion de proteína microalgal. Marzo, 2008. En: VITAE,
revista de la facultad de química farmacéutica de la Universidad de Antioquia, Medellín,
Colombia. Vol 15, no 1.p 25-35
3
WANG, H.-C.; CHO, M.-G. y RIZNICHENKO G. Rubin. Investigation of the maximum quantum yield
of PS II in Haematococcus pluvialis cell cultures during growth: Effects of chemical or high-intensity
light treatment. En: Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. Septiembre,2011. Vol
104, no 3. P 394-398
4
Scenedesmus tiene la capacidad de soportar elevadas concentraciones de nutrientes contenidos
en las aguas residuales, poseer actividad metabólica elevada y capacidad de resistir variaciones
ambientales lo que la hacen sobrevivir y ser un género común de aguasresiduales 4

6.4 Medio de cultivo

Las micro-algas pueden ser cultivadas en diferentes medios de cultivo y con cualquier volumen sin
embargo los sistemas de producción son poco sofisticados por lo que se han desarrollado cultivo
en foto-bioreactores para aumentar la productividad5. Para cada una de las Microalgas se utilizan
diferentes medios como están a continuación:

• Haematococus medio Mes Volvox (Medio de uso general para las cepas de agua
dulce)
• Scenedesmus medio bristol

6.5 Métodos de extracción y reconocimiento de proteína

Para la extracción de la proteína de de las Microalgas se puede utilizar


una disrupción sónica de las células durante 3 ciclos de 1 min. A 70W en hielo, en
presencia de 1% (w / v) de SDS. El método de extracción es el factor factor más

4
Charity E. Andrade R.1, et al .Biomass production of microalga Scenedesmus sp.with wastewater
from fishery. Venezuela.Trabajo de grado Facultad Experimental de Ciencias. Universidad del Zulia
venezuela. Enero,2009. 32 p.
5
MARTINEZ SILVA, Alicia soledad. Evaluación del crecimiento celular y de los pigmentos obtenidos
de la micro-alga Haemactococcus Pluvialis cultivada en diferentes medios. Trabajo de grado en
doctorado en tecnología avanzada. México Distrito Federal. Instituto politécnico nacional de
México. centro de investigación en ciencia aplicada y tecnología avanzada. Enero, 2010. 91 p.

5
crítico para la determinación de proteínas en las micro-algas y debe ser optimizado
para cada especie de alga6

Se puede utilizar el método de precipitación por ácido tricloro-acético (TCA)/acetona

Se pueden reconocer las proteínas por medio de la electroforesis SDS-PAGE que parece ser
muy útil y mantiene la metodología más económica y más práctica que la biología
molecular para un control rápido de algas utilizadas por la industria alimentaria7; Tambien
se pueden reconocer por el método de Lowry (método colorimétrico) el cual hace una
valoración cuantitativa de las proteínas. A la muestra se añade un reactivo que forma un complejo
coloreado con las proteínas, siendo la intensidad de color proporcional a la concentración de
proteínas, según la ley de Lambert-Beer A= ε.l.vc

7. PLAN DE TRABAJO

Teniendo en cuenta que el plan de trabajo es una herramienta de gestión y planificación de un


proyecto, y que sirve como guía para realizar un trabajo durante el tiempo planificado.

7.1 RECURSOS E IMPEDIMENTOS

Se ha observado que la extracción de proteínas como suplemento alimenticio en micro-algas en


los últimos años ha sido muy experimentada, gracias a los resultados obtenidos y su aplicación.

Se desea tener un medio de cultivo apropiado para cada una de las especies de micro algas, pues
dado que exista el mínimo cambio en las condiciones, puede ocurrir que estas no se reproduzcan
además establecer cantidades mínimas apropiadas de cultivo que permitan una recolección de
biomasa necesaria, para los distintos procedimientos a realizar.

6
E.A,Meijer y R.H,Wijffels. Development of fast reproducible and effective method for the
extraction and quantification of proteins of micro-algae. En : Biotechnology techniques. Diciembre
, 1998. Vol.12, no 5, P. 353-358.
7
ROUXEL CATHERINE, Andre Daniel; JEROME M Etienne M y Fleurence J. Species identification by
SDS-PAGE of red algae used as seafood or a food ingredient. En: Food chemistry. Agosto , 2001.
Volume 74, no 3, p. 349-353

6
En el proyecto a realizar se debe tener en cuenta que surgirán inconvenientes respecto a varios
aspectos, inicialmente pueden ocurrir cambios en los medios de cultivo, que no permite que se
desarrolle las micro-algas, es decir, si se exceden o se limitan las cantidades oportunas de dióxido
de carbono, agua, o alguna sal, o los cambios de la temperatura se podrá perder toda la
recolección de la micro-alga, respecto a esto se propone inicialmente realizar un cultivo a escala
que nos permita generar un tipo de relación para el medio de cultivo.

Por otro lado se tendrá como inconveniente el rompimiento de la pared celular de las micro-algas
para la recolección de la biomasa, para superar esto se mejoraran los métodos mecánicos y
químicos. De igual manera se deberán implementar nuevas tecnologías para la caracterización de
las proteínas y hallar excelentes bases de datos.

8. CRONOGRAMA

7
Abril Mayo Junio Julio Agosto Septiembre Octubre Noviembre Diciembre
ACTIVIDADES DEL PROYECTO 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
1
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9. RECURSOS ECONÓMICOS Y MATERIALES

Gracias a las diferentes investigaciones que adelanta la universidad con investigaciones de cultivos
de microalgas, se cuenta con una cantidad considerable de equipos, materiales y reactivos para
disponer en este proyecto.

Utensilios de Laboratorio
Erlenmeyer 6
Vasos de precipitado 7
probeta 3
Tubos de ensayo 12
Capsulas de Porcelana 6
Cajas de petri 12
Embudo 2
Matraz 2
Agitadores 2
Pipeta 2
Termometro 2
Buretas 2

Equipos
Centrifuga
Bioreactor

8
Ultrasonido
Espectofotometro
Sistema de Electroforesis

Reactivos
Sales de Cultivo medio Mes Volvox
Sales de Cultivo medio Bristol
Dioxido de Carbono
Agua
Ácido Tricloroacético
Acetona
Dithiothreitol

10. DISEÑO EXPERIMENTAL

10.1 Cultivo de micro- algas

1. Se utilizaron diferentes medios de cultivos que requieren diferentes sales para las
distintas micro-algas :
 Haematococus medio Mes Volvox
 Chlorella y scenedesmus medio Bristol
 Spirulina Za Roud

2. Se esterilizaron los medios de cultivos


3. Se mantuvieron los diferentes cultivos a condiciones con presencia de agua y
dióxido de carbono apropiados para su crecimiento.

10.2 Extracción de proteína

9
Para la extracción de proteína de las micro-algas se utilizo el método de precipitación por
ácido tricloroacético (TCA)/acetona como se describe a continuación:

1. Para la extracción de proteína se utilizaron 0,2 gramos de biomasa de cada


especie de micro-algas .
2. Se agregaron 10 ml de acetona y 1 gramos de TCA a la biomasa de las micro-
algas.
3. Se lisaron las diferentes biomasas mediante ultrasonidos durante 15 minutos.
4. se sometieron las diferentes muestras a centrifugación con 9000 revoluciones por
minuto (rpm) durante 20 minutos y a una temperatura de 40C.
5. se filtro y el sedimento se lavo una vez con una solución de 4 ml de acetona y 1
ml de agua
6. se sometió el sedimento y se lavó tres veces con una solución de 0,228 gramos
de dithiothreitol (DTT) y 10 ml de acetona.
7. se recolecto el sedimento y se colocó a una solución buffer fosfato a un pH 7 para
realizar con el producto obtenido la Electroforesis SDS PAGE.

Para las especies de chlorella y scenedesmus se observo una mejor extracción de


proteínas con urea en vez de DTT.

10.3 Electroforesis SDS PAGE

Para la realización de electroforesis se realizó el siguiente método.

1. Ensamblar los vidrios

2. Preparar el gel de corrida

3. Adicionar la solución de acrilamida

4. Acomodar el gel de corrida

5. Sembrar las muestras de proteínas previamente obtenidas

6. Esperar la polimerización del gel

10
11. BIBLIOGRAFÍA

 E.A,Meijer y R.H,Wijffels. Development of fast reproducible and effective method for the
extraction and quantification of proteins of micro-algae. En : Biotechnology techniques.
Diciembre , 1998. Vol.12, no 5, P. 353-358.
 ROUXEL CATHERINE, Andre Daniel; JEROME M Etienne M y Fleurence J. Species
identification by SDS-PAGE of red algae used as seafood or a food ingredient. En: Food
chemistry. Agosto , 2001. Volume 74, no 3, p. 349-353
 DA-ZHI ,Wang Lin Lin; LEO,Lai Chan y HUA-SHENG,Hong. Comparative studies of four
protein preparation methods for proteomic study of the dinoflagellate Alexandrium sp.
using two-dimensional electrophoresis. En: Harmful Algae. Junio, 2009.Vo 8, no 5, p. 685–
691
 Charity E. Andrade R.1, et al .Biomass production of microalga Scenedesmus sp.with
wastewater from fishery. Venezuela.Trabajo de grado Facultad Experimental de Ciencias.
Universidad del Zulia venezuela. Enero,2009. 32 p.
 MARTINEZ SILVA, Alicia soledad. Evaluación del crecimiento celular y de los pigmentos
obtenidos de la micro-alga Haemactococcus Pluvialis cultivada en diferentes medios.
Trabajo de grado en doctorado en tecnología avanzada. México Distrito Federal. Instituto
politécnico nacional de México. centro de investigación en ciencia aplicada y tecnología
avanzada. Enero, 2010. 91 p.
 ABUZER,Çelekli, y MEHMET, Yavuzatmaca. Predictive modeling of biomass production
by Spirulina platensisas function of nitrate and NaCl concentrations. en: Bioresource
Technology . Marzo2009 .Vo 100, no 5. p 1847–1851
 MORENO RAMIREZ, Liliana y OLVERA RAMIREX, roxana. Uso tradicional y actual de
spirulina. En: interciencia . Septiembre, 2006. Vol 3, no 009. p 657-663
 TIANFENG, Chen, et al . Mixotrophic culture of high selenium-enriched scenedesmus
oblicuos acetate and the enhanced production of photosynthetic pigmentsEn: Enzyme and
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 E. Bittersmann, A.R. Holzwarth. Synchronous cultures of the green alga Scenedesmus
obliquus: Comparison of picosecond decay associated emission spectra and fluorescence
induction kinetics. En:Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. Diciembre,
1987. Vol 1, no 2. p 247–260
 ABUZER,Çeleklia, et al .Modelling of Scenedesmus obliquus; function of nutrients with
modified Gompertz model. En: Bioresource Technology. Diciembre 2008. Vol 99, no 18. p
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 QUEVEDO Catalina, P. MORALES Sonia ACOSTA Alejandro. Crecimiento de scenedesmus sp
en diferentes medios de cultivo para la produccion de proteína microalgal. Marzo, 2008.
En: VITAE, revista de la facultad de química farmacéutica de la Universidad de Antioquia,
Medellín, Colombia. Vol 15, no 1.p 25-35.

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