ENZIMAS: Catalizadores biológicos que hacen posible el funcionamiento de la
célula en condiciones ambientales moderadas.
Las enzimas son proteínas y están clasificadas dependiendo del tipo de reacción que catalizan en oxireductasas, transferasas, hidrolasas, etc. FACTORES DECISIVOS EN LA SELECCIÓN DEL MICROORGANISMO
• Capaz de dar una alta producción de enzima al menor tiempo posible
1 de fermentación.
• Que sean extracelulares.
2
• Las cepas no deben producir sustancias toxicas.
3
• Debe generar la menor cantidad de subproductos interferentes.
4 CONDICIONES OPTIMAS PARA LA CEPA SELECCIONADA
Debe ser determinada experimentalmente. En la cual la
temperatura, la composición de la solución de nutrientes y la suplementación de sustrato optimas para los cultivos pueden ser determinados.
Tienen como desventaja que no se puede controlar los valores de
pH y la concentración de oxigeno disuelto. Para la selección del biorreactor se deben tener en cuenta los siguientes requerimientos:
FUNCIONALES ECONOMICOS
Debe existir una alta transferencia de masa
Fácil de operar bajo condiciones asépticas. liquido-gas.
Es necesaria la formación de interfaces Flexibilidad razonable con respecto a los
liquido-gas. requerimientos de varios procesos.
Debe haber una adecuada relación de las
Bajo poder especifico de consumo. fases dispersadas (gaseosa, liquida, solida) MATERIALES Y MÉTODOS BIOREACTORES: SE REALIZARON SEIS EXPERIMENTOS PARA LOS QUE SE DISEÑARON 3 TIPOS DE BIORREACTORES BIORREACTORES: el biorreactor es sin duda uno de los equipos fundamentales de la microbiología industrial. Es el recipiente donde se realiza el cultivo, y su diseño debe ser tal que asegure un ambiente uniforme y adecuado para los microorganismos. El biorreactor de tanque agitado es de uso muy definido. La agitación se realiza mecánicamente mediante un eje provisto de turbinas ocasionada por un motor.
Biorreactor de Columna de Burbujeo.Este tipo de
bioreactor carece de un sistema de transmisión mecánica para mezclar el caldo de cultivo, es básicamente un contenedor cilíndrico con un eyector de gas en el fondo. Este gas es expulsado en forma de burbujas ya sea hacia una fase liquida o hacia una suspensión solida liquida. Esterilización de los biorreactores
Microorganismo y condiciones de cultivo
Composición del medio
de expresión enzimática ESTERILIZACIÓN DE LOS BIORREACTORES
Antes del bioproceso, los bioreactores
se trataron con una solución de hipoclorito de sodio al 0.25 % por 48 horas; luego se trataron con una solución de fenol al 3% por 15 minutos, posteriormente con una de etanol al 70 % por 15 minutos y finalmente fueron enjuagados con 500 ml de agua estéril. Los aditamentos para la entrada de aire y el control de espuma se esterilizaron de manera similar Microorganismo y condiciones de cultivo: se utilizó la cepa Phanerochaetechrysosporium BKM-F-1767 (ATCC24725) replicada en medio YMPG, el cual contiene por cada 100 mililitros; extracto de levadura 1g, extracto de malta 1g, peptona bacteriológico 0.2g, glucosa 1g, asparagina 0.1g 0.2g 0.1g; tiamina clorhidrato 1mg y agar 2g. Se esterilizó y se colocó en cajas de Petri estériles; la cepa se replicó sobre este medio e incubo a 37 °C por 5 días y se mantuvo a 4°C. Composición del medio de expresión enzimática
se preparó el fluido de expresión enzimático
que contenía por cada 100 mililitro:
• Glucosa 1g g; tartrato de amonio 0.02g; 0.2g 0.05g;
0.01g; Tween 800.05g; tiamina HCl 0.1.mg; alcohol veratrilico 2,5 Mm y solución de elementos traza 7ml
Ácido nitrilo acético 1,5g; 3g; NaCl 1g;
0.1g; 0.1g; 0.1g; 0.01g; 0.01g; 0.01g; 0,01g; 0.1g PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE ESPORAS : Al biorreactor estéril se le adicionaron 1000 ml de fluido de expresión esterilizado por filtración a través de filtros de 0.45 mm, y una suspensión de esporas de la cepa recién replicada en tween 80 al 0.1% hasta una concentración final entre 15x104 y 20x104 esporas/ml .
Actividad enzimática y seguimiento del bioproceso:
Durante los seis ensayos se tomaron muestras dos veces por día, las cuales fueron filtrados por 0.45 mm. Se realizaron los siguientes análisis: Pruebas específicas para cada ensayo:
Para los ensayos 1 y 2 Para los ensayos 3 y 4
• se tomaron 10.0 ml de • Para los ensayos 3 y 4: se
muestra del biorreactor dos tomaron 5.0 ml de muestra veces al día durante 15 del biorreactor dos veces al días para el ensayo 1 y 27 día, durante 11 días para el días para el ensayo 2. Las ensayo 3 y durante 23 días muestras se filtraron por para el ensayo 4; se les membrana de 0.45 µm determino la turbidez por prepesadas y se determinó UV-VI el peso seco del micelio secando los filtros prepesados a 40°C en estufa de vacío hasta peso constante. Para los ensayos 5 y 6 Tiempo de duración
• cada ensayo se determinó de
• Para los ensayos 5 y 6 se acuerdo a los cambios que se tomaron 5.0ml de muestra dos iban presentando en el veces al día, durante 13 días biorreactor (apariencia y olor para el ensayo 5 y durante 35 del fluido de expresión, etc.) días para el ensayo 6. con los cuales se concluyó la viabilidad de cada ensayo. • Alícuotas del ensayo 6 fueron precipitadas con metanol grado reactivo, pasada por filtros especiales para solventes orgánicos de 0.45 µm previamente pesados. Al residuo se les realizo un espectro IRTF en un Spectrum RXI FT-IR SystemPerkin Elmer, con el fin de observar los cambios en la estructura del PVOH RESULTADOS Y DISCUSIÓN Para los ensayos 1 y 2
• Hongo creció en forma de pellets.
• Biomasa no homogénea por ello las gráficas
de crecimiento dan puntos muy variables.
• El tamaño del hongo depende en gran parte
de la agitación.
• Los pellets del primero fueron mas
pequeños susceptibles a desintegrarse. (150 Biorreactor rpm)
• Máxima actividad enzimática se observó el
día 16. (18.00 U/I)
• Día 23 para el segundo ensayo (24.96 U/I)
Agitador orbital Forma pellets Phanerochaete chrysosporium máx.
máx. Para los ensayos 3 y 4 • No se utilizó agitación orbital.
• El suministro de aire es suficiente tanto
para la oxigenación como para una agitación homogénea.
• Crecimiento sin pelletes.
• El polipropileno del biorreactor y
accesorios(ejes, tuercas, tornillos) interactuaron con el medio.
• Cambios en sus características olor, color,
morfología.
• La máxima actividad enzimática noveno
dia 6.36 U/l y 9.46 U.I Biorreactor Columna de burbujeo (polipropileno) Forma filamentosa Phanerochaete chrysosporium Para los ensayos 5 y 6 • Reactor mas inerte.
• Aumento del volumen de aire de
300mL/min a 750mL/min.
• Crecimiento aglomerado filamentoso
• La máxima actividad al cuarto día (10.79
U/I) para el ensayo 5 y al día 30 (43.22 U/I) para el ensayo 6.
• Actividad mas estable y aumento gradual.
• En el ensayo 6 por medio de scan se
observo formación de compuestos fenólicos que resultaron a partir de la biodegradacion del PVOH. Biorreactor Columna de burbujeo (vidrio) CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES Los resultados obtenidos hasta ahora, permiten concluir que el escalamiento del proceso exige un cuidadoso diseño del biorreactor. Por la factilidad económica que tiene el biorreactor utilizado en los ensayos 5 y 6 y por la estabilidad en la producción de la LiP observada en el ensayo 6, se puede concluir que de los tres sistemas diseñados, este es el mas adecuado para continuar estandarizando las variables y optimizando el proceso para mejorar la obtención de la LiP. EN LA PRODUCCION DE LiP es necesario buscar acelerar el metabolismo del hongo con el fin de aumentar su tasa de crecimiento para que su producción enzimática se inicie en el menor tiempo posible
podría agregársele al medio aserrín
de pino porque en trabajos anteriores no publicados, se comprobó que la presencia de éste, estabiliza el sistema y aumenta la cantidad de enzima producida Recomendaciones y conclusiones Para mantener estables los niveles de enzima se podría realizar la fermentación como un proceso discontinuo hasta que el microorganismo se encuentre en su metabolismo secundario, para luego convertirlo en un proceso continuo agregándole diariamente pequeñas cantidades de fluido de expresión, garantizándole al hongo un tiempo de vida mayor. FIN
