UNIVERSIDAD INDUSTRIAL DE SANTANDER

Facultad de Salud
Escuela de Microbiología y Bioanálisis
Laboratorio de Bioquímica I
Semestre II-2017

Práctica No 3. Análisis Cuantitativo de Carbohidratos.

Paula Fernanda Caicedo Rincón 2161030 Grupo de Laboratorio: 02 – J01
Dennis Lorena Cárdenas Leal 2161029 Fecha de elaboración de la práctica: 2017-09-12
Pablo Elías Prado Guevara 2161058 Fecha de presentación del informe: 2017-09-19

● Objetivos

Cuantificar la cantidad de glucosa en muestras biológicas mediante los métodos de antrona y el sistema
glucosa oxidasa/ peroxidasa, para así, comparar los resultados obtenidos y evaluar cada método según el
fundamento empleado.

● Resultados y discusión
Cuantificación de carbohidratos por el método de Antrona: Se depositó un volumen determinado de
glucosa 0,01% en cuatro tubos iniciales (1, 2, 3, 4) y se aforaron hasta 5 ml con agua destilada. Luego, se
tomó 1 ml de cada uno y se les agregaron 4 ml de antrona (1’, 2’, 3’, 4’, y el 5 sin diluir en agua). Se siguió el
procedimiento indicado (baño de hielo, baño de agua hirviendo y nuevamente baño de hielo). Finalmente, se
midió la absorbancia de los patrones y de la muestra problema. Los resultados obtenidos se muestran a
continuación:
Tabla 1. Concentración y Absorbancia de los patrones. Método Antrona.

Concentración 1’ 2’ 3’ 4’ 5 Muestr
(mg/dL) a
0,2 0,4 0,8 1,2 2
mg/dL mg/dL mg/dL mg/dL mg/dL

Absorbancia 0,178 0,287 0,625 0,920 1,589 0,086

Figura 1. Patrones de glucosa preparados. Figura 2. Curva de calibración. Método Antrona.

Ejemplo de los cálculos presentados en la tabla 1:

Tubo 1: 0,5 ml glucosa 0,01% (10 mg/dL) + 4,5 ml agua destilada
mg
10 ∗ 0,5 ml
dL
C tubo 1 = = 𝟏 𝐦𝐠/𝐝𝐋
5 ml
mg
1 ∗1 ml
dL
C tubo 1′ = = 𝟎, 𝟐 𝐦𝐠/𝐝𝐋
5 ml
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A partir de la ecuación obtenida mediante la curva de calibración (figura 2), se calculó la concentración de
glucosa en la muestra: A= 0,7917X - 0,008

0,086 + 0,0085
X= = 0,1194 mg/dL ∗ 250 = 𝟐𝟗, 𝟖𝟓 𝐦𝐠/𝐝𝐥
0,7917

La concentración de azucares totales en muestras biológicas puede ser determinada por métodos
espectrofotométricos. Se basa en las reacciones de color entre el carbohidrato y la antrona, la cual se disuelve
en ácido sulfúrico. En medio ácido, los enlaces glicosídicos de los disacáridos y polisacáridos son
hidrolizados y se produce la deshidratación de las pentosas y hexosas, permitiendo la generación de derivados
de furfural, como el 5- hidroxi metil furfural; este último, reacciona con la antrona produciendo un color
verde azulado. El color se observó en los patrones de glucosa preparados (figura 1).

En la elaboración de la curva de calibración, se incluyeron todos los patrones. La concentración y absorbancia

del patrón 5 (1 ml de glucosa 0,1% y 4 ml de antrona) se encontraban aparentemente alejadas de los demás
datos; sin embargo, se puede observar que entre los patrones 1’- 2’ y 2’ - 4’, la concentración se duplica,
mientras que con los demás se presentó una diferencia menor entre sus concentraciones. Es recomendable
incluir 5 o 6 patrones para que la variabilidad sea mínima y el intervalo lineal sea suficiente. Entre mayor
cantidad de patrones hayan, mayor fiabilidad en la recta de calibrado. El coeficiente de correlación obtenido
(R= 0,999) indica que existe una relación directamente proporcional entre la concentración y a absorbancia
medida en la práctica.
La glucosa es la principal fuente de energía del ser humano, le permite llevar a cabo funciones vitales como el
latido cardiaco, los movimientos digestivos y la respiración. Cuando la glucosa falta, se genera sudoración,
debilidad, palidez, sensaciones de hambre bruscas, entre otros síntomas. En cuanto a la muestra analizada, se
encontraron 𝟐𝟗, 𝟖𝟓 𝐦𝐠 𝐝𝐞 𝐠𝐥𝐮𝐜𝐨𝐬𝐚 /𝐝𝐥, lo cual es una cantidad bastante baja, si tenemos en cuenta que los
rangos normales se encuentran entre 70 y 100 mg/dl.

Cuantificación de carbohidratos utilizando el kit glucosa oxidasa/ peroxidasa:

Absorbancia del patrón: 0,420
Absorbancia de la muestra (plasma): 0,232
Concentración de glucosa en la muestra:
0,232 mg
C= ∗ 100 = 𝟓𝟓, 𝟐𝟒 𝐦𝐠/𝐝𝐋
0,420 dL

La utilización del Kit glucosa oxidasa/ peroxidasa es un método utilizado actualmente en clínica e
investigación para valorar glucosa en el suero o plasma sanguíneo. Al igual que el método antrona, permite la
cuantificación de este carbohidrato utilizando métodos espectrofotométricos, pero se basa en reacciones
químicas. La enzima glucosa oxidasa (GOD) reconoce específicamente a una de las formas anoméricas de la
D- glucosa (β- glucopiranosa) catalizando su oxidación a ácido D- glucónico y peróxido de hidrogeno. Este
último es el sustrato de la enzima peroxidasa (POD), que en presencia del fenol y una amina aromática (4-
aminoantipirina) de lugar a una quinonaimina de color rosa y agua.
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La concentración de azúcar en la muestra de plasma a fue de 55,24 mg/dl, el cual se calculó con una relación
directa, pues este sistema está estandarizado y presenta una alta precisión.

Al observar los resultados obtenidos de la concentración de glucosa en la muestra por distintos métodos, se
identificó que los valores difieren en gran medida, pero ambos se encuentran por debajo del rango normal (70
y 100 mg/dl). Para calcular el porcentaje de error de los dos métodos, se tomó como valor establecido 55
mg/dl, el cual indica los niveles bajos de glucosa en sangre (hipoglicemia). El porcentaje de error para el
método antrona fue de un 45,7% y para el método del Kit glucosa OD/ POD de 0,4%. Se debe tener en
cuenta, que todo proceso está ligado a errores aleatorios y sistemáticos. En el método de la antrona, los
operadores se involucran mucho más en la manipulación de la muestra, reactivos y equipos; por ejemplo,
durante la práctica, tres personas diferentes realizaron el proceso de medición y toma de volúmenes; incluso,
es muy posible que los volúmenes agregados no hayan sido los indicados en el procedimiento. También hay
que tener en cuenta que la muestra pudo contener sustancias interferentes, como bilirrubina o medicamentos
que disminuyeran la concentración de glucosa. Para comparar la concentración de glucosa en la muestra
obtenida por ambos métodos, era preferible haber utilizado el mismo volumen, ya que para antrona se
tomaron 100 uL y para el kit 10 uL. El kit brinda la oportunidad de variar proporcionalmente la muestra y el
reactivo; Así, se pudo haber tomado una mayor cantidad de muestra, pero no se realizó porque el reactivo no
era suficiente para todos los ensayos. Sin embargo, el porcentaje de error del kit fue muy bajo, debido a la
gran sensibilidad del método, comprendiendo así la facilidad que brinda y el costo que posee; En este método
se presentó una mayor absorbancia y por ende una mayor concentración, pues son directamente
proporcionales.
 Conclusiones
Es de vital importancia tener en cuenta las condiciones previas a la toma de muestras, pues esto garantiza la
validez del resultado. La cuantificación de glucosa, puede ser realizada de muchas formas. El método
enzimático de glucosa oxidasa peroxidasa presenta mayor exactitud, debido a la sensibilidad y especificidad
de los reactivos empleados y a su estandarización previa. Por otra parte, los métodos furfurálicos también son
útiles, pero se debe tener un cuidado especial en su realización, pues es más probable que se presenten gran
cantidad de errores de tipo aleatorio y sistemático. En cuanto a la muestra analizada, se afirma que el paciente
es hipoglucémico, pero se recomienda la realización de exámenes confirmatorios.

● Bibliografía
1 Departamento de Ciencias Básicas. Laboratorio de Bioquímica. Universidad de Bogotá Jorge Tadeo Lozano. GUÍA No 1.3 VALORACIÓN
DE GLUCOSA EN SUERO O PLASMA POR EL MÉTODO GOD / POD. Disponible en:
http://avalon.utadeo.edu.co/comunidades/estudiantes/ciencias_basicas/bioquimica/guia_1_3.pdf
2 Pérez, M.; Brambila, E.; (2005). Preparación y evaluación de un equipo de reactivos para la determinación de glucosa (glucosa
oxidasa/peroxidasa) . (2005). Disponible en: http://www.medigraphic.com/pdfs/bioquimia/bq-2005/bq054c.pdf
3 Dosal N.A.; Villanueva, M.; Introducción a la Metología Química, Curvas de calibración en los métodos analíticos. (2008). Disponible
en: http://depa.fquim.unam.mx/amyd/archivero/CURVASDECALIBRACION_23498.pdf
4 American Diabetes Asssoacition. Disponible en: http://www.diabetes.org/es/vivir-con-diabetes/tratamiento-y-cuidado/el-control-de-
la-glucosa-en-la-sangre/hipoglucemia.html?referrer=https://www.google.com.co/
5 Fundación para la diabetes. Disponible en: http://www.fundaciondiabetes.org/general/82/conozcamosla-mejor