Cinética del crecimiento microbiana de Saccharomyces cerevisiae en fermentación

batch sumergida

Danilo Hernández1, Adrián Morales Morales 2, Harold Lozano Olivares 3

1
Estudiantes de Ingeniería de Alimentos, Universidad de Córdoba, Berástegui,
Colombia.

Orientador: PhD. Deivis Lujan Rhenals

RESUMEN

El proceso de fermentación batch sumergida aerobia de la Saccharomyces cerevisiae, se

estudió para evaluar experimentalmente los parámetros cinéticos de la ecuación de monod.
inicialmente se adaptó la cepa microbiana a las condiciones y nutrientes del medio a utilizar
para evitar la fase lag; Desde el comienzo de la fermentación, se utilizó 28°C como
temperatura para el crecimiento de estas levaduras, se pudo obtener parámetros cinéticos,
tales como la velocidad específica de crecimiento (0,0072), la constante de saturación de
Monod (11,745 g/l) y el rendimientos sustrato – biomasa (3,9409 g biomasa/g sustrato),
utilizando el modelo de Eadie-Hofstee con un R2 de 0,9993 permitiendo entender el
crecimiento de la Saccharomyces cerevisiae en el proceso de fermentación aerobia.

Palabras Claves: Proceso, fermentación, Batch , monod , crecimiento.

ABSTRACT

The aerobic submerged batch fermentation process of Saccharomyces cerevisiae was

studied to experimentally evaluate the kinetic parameters of the monod equation. initially the
microbial strain was adapted to the conditions and nutrients of the medium to be used to
avoid the lag phase; From the beginning of the fermentation, 28 ° C was used as
temperature for the growth of these yeasts, it was possible to obtain kinetic parameters,
such as the specific growth rate (0.0072), the saturation constant of Monod (11.745 g / l)
and the substrate - biomass yield (3.9409 g biomass / g substrate), using the Eadie-Hofstee
model with an R2 of 0.9993, allowing us to understand the growth of Saccharomyces
cerevisiae in the aerobic fermentation process.

Key Words: Process, fermentation, batch, monod, growth.

 1. INTRODUCCIÓN

El cultivo discontinuo o cultivo batch es el método de cultivo más simple, consiste en un

recipiente cerrado en el que no existe aporte de nutrientes ni egreso de productos. Cuando
se siembran microorganismos en un medio de cultivo adecuado, la concentración de
biomasa (X g cel.secas/L) aumenta, empleando los nutrientes que le aporta el medio de
cultivo para producir nuevas células. Este proceso continúa hasta que algún nutriente del
medio de cultivo se agota (sustrato limitante), se produce la acumulación de alguna
sustancia inhibidora formada por los propios microorganismos, etc. el crecimiento se
detiene y finaliza el batch. La evolución del cultivo con el tiempo sigue una curva típica
denominada “curva de crecimiento microbiano”.

Fase lag o fase de latencia: El crecimiento del microorganismo no comienza

inmediatamente después de la inoculación del medio de cultivo, necesita un período de
adaptación a las condiciones de cultivo, denominado fase lag o fase de latencia.

Fase de crecimiento exponencial: Finalizada la fase lag, la concentración de biomasa (x)

comienza a aumentar en forma lenta y luego más rápidamente, hasta llegar a una etapa en
la cual las células crecen a una velocidad específica máxima y constante (m).

Fase estacionaria: Luego de la fase exponencial hay un rápido período de desaceleración

causada por el agotamiento de algún nutriente (el sustrato limitante) o por acumulación de
inhibidores y por lo tanto  tiende a 0, se entra en la llamada fase estacionaria.

Fase de declinación o muerte: En esta última etapa, la concentración celular disminuye

como resultado de la escasez de reservas de energía o por autolisis (Martos and Zubreski,
2013).

El conocimiento de la cinética del cultivo permite predecir el desarrollo de la fermentación y

evaluar rendimientos y productividades, datos importantes en el diseño de estrategias de
producción y optimización de procesos. Las células consumen los nutrientes requeridos
para crecimiento y los convierten en nuevas células y productos metabólicos. La velocidad
de estos procesos varía con el desarrollo del cultivo. A medida que las células crecen se
acumulan en el medio los productos finales del metabolismo celular. Frecuentemente, estos
componentes alteran el pH y la reología del medio; factores decisivos sobre la actividad
celular y los mecanismos de transporte. Objetivo de este estudio se determinó
experimentalmente los parámetros cinéticos de la ecuación de Monod (YX/S, µ y µmax) en
la fermentación batch sumergida aeróbica de la Saccharomyces cerevisiae.

2. MATERIALES Y METODOLOGÍA

1) Preparación del pre-inoculo:

Se preparó un pre-inoculo un día previo a la realización el experimento con el fin de

evitar la fase de latencia de los microorganismos.

FIGURA 1. FERMENTADOR BATCH SUMERGIDO AEROBIO

2) Inoculación y Fermentación:

 Se inocular el fermentador con 80 mL de pre-inóculo (10% del volumen final).

 Se instalaron los accesorios del fermentador aerobio; (ver figura 1).

 Se realizó la fermentación a 28 ºC, 300 rpm, y 1,5 vvm (Volumen de aire por
volumen de medio por minuto).

 Se determinó cada 1 horas durante 7 horas: densidad óptica celular (X) y

Concentración de Glucosa (S), Recuento en placa.
 3. RESULTADOS y ANÀLISIS

A partir de curvas patrones, DNS y peso seco, se hallaron las concentraciones (g/L) de
sustrato y biomasa, respectivamente, como se muestra en la tabla 1.

Tiempo (h) Densidad opt. DNS X(g cel/L) S (g/L)

0 0,57 8,1 0 13,5405
1 0,606 10,75 3,955102 17,9571667
2 0,654 8,625 4,471918 14,4155
3 0,708 7,625 5,053336 12,7488333
4 0,738 7,4 5,376346 12,3738333
5 0,822 7,325 6,280774 12,2488333
6 0,87 7,05 6,79759 11,7905
Tabla 1. datos de perfil de crecimiento del microorganismo

Ahora, para determinar los parámetros cinéticos (µm, Ks) se utilizó el análisis diferencial,
como se muestra a continuación:

Tiempo (h) X(g/L) S(g/L) dx/dt µ (h^-1)

0 0 13,5405 6,1595 0
1 3,955102 17,9571667 0,02672515 0,00675713
2 4,471918 14,4155 0,19629558 0,04389517
3 5,053336 12,7488333 0,57862222 0,11450302
4 5,376346 12,3738333 0,87866769 0,16343213
5 6,280774 12,2488333 2,05183381 0,32668487
6 6,79759 11,7905 2,94257094 0,43288444
Así mismo, en la figura 1. Se muestra el comportamiento típico del crecimiento microbiano,
donde se e un crecimiento exponencial.

8
7
6
Biomasa g/L

5
4
y = 0.0991x3 - 1.0796x2 + 4.0351x + 0.2487
3 R² = 0.9695
2
1
0
0 1 2 3 4 5 6 7
tiempo (h)

Grafica 1. perfil de crecimiento del M.O.

𝑑𝑠 1 𝑑𝑥
Los parámetros µ en cada punto se halló usando la formula general = asi:
𝑑𝑡 𝑥 𝑑𝑡

Tiempo (h) X(g/L) S(g/L) dx/dt µ(h^-1)

0 0 13,5405 6,1595 0
1 3,955102 17,9571667 0,02672515 0,00675713
2 4,471918 14,4155 0,19629558 0,04389517
3 5,053336 12,7488333 0,57862222 0,11450302
4 5,376346 12,3738333 0,87866769 0,16343213
5 6,280774 12,2488333 2,05183381 0,32668487
6 6,79759 11,7905 2,94257094 0,43288444

Se emplearon los modelos de Lineweaver-Burk, Langmuir y Eadie-Hofstee para encontrar

los parámetros cinéticos ya mencionados.
  Modelo Lineweaver-Burk

Este método explica que al graficar 1/µ Vs 1/S se obtiene una recta donde Ks/µm es la
pendiente de la recta y 1/µm es el intercepto

1/µ 1/S

147,991765 0,055688073
22,7815522 0,069369776
8,73339432 0,07843855
6,11874778 0,0808157
3,06105395 0,081640428
2,31008534 0,084814045

160
140
120 y = -4913.7x + 400.99
R² = 0.8659
100
80
1/µ

60
40
20
0
-20 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.09
-40
1/S

Gráfico 2. Relación 1/S vs 1/µ

Así el valor de cada parámetro es: µm 0,00249383

Ks -12,2539215
  Modelo Langmuir

S s/µ

17,9571667 2657,5128
14,4155 328,407466
12,7488333 111,340589
12,3738333 75,7123653
12,2488333 37,4943397
11,7905 27,2370612

Este modelo se explica mediante la teoría que dice que existe una relación lineal al
graficar S Vs S/µ, donde la pendiente representa µm y el intercepto Ks/µm.

3000

2500 y = 429.8x - 5301

R² = 0.9155
2000

1500
S/µ

1000

500

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
-500
S

Gráfico 3. Relación S vs S/µ

Así el valor de cada parámetro es: µm 0,00232666

Ks -12,3336436
  Modelo Eadie-Hofstee

Este modelo se explica mediante la teoría que dice que existe una relación lineal al
graficar µ Vs µ/s donde la pendiente representa Ks y el intercepto µm.

0.5
0.45 y = 11.745x + 0.0072
0.4 R² = 0.9993
0.35
0.3
0.25
µ

0.2
0.15
0.1
0.05
0
0 0.005 0.01 0.015 0.02 0.025 0.03 0.035 0.04
µ/S

Gráfico 3. Relación S/µ vs µ

Ks 11,745
µm 0,00722

Comparando los coeficientes de regresión R2, podemos decir que el modelo que mas se
ajusta al comportamiento de los datos es el modelo de Eadie-Hofstee con R2=0,9993. Los
parámetros obtenidos de este modelo son: Ks (11,745 g/L) y µm (0,00722 h^-1)

x-xo so-s
0 0
5,053336 0,79166667
5,376346 1,16666667
6,280774 1,29166667
Ahora el rendimiento biomasa sustrato esta dado por: 6,79759 1,75

La pendiente de la recta representa el rendimiento biomasa/sustrato

9
8 y = 3.9409x + 0.7607
7 R² = 0.9027
6
5
x-xo

4
3
2
1
0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2
so-s

Gráfico 4. Relación So -S vs X-XO

En resumen, así quedan los parámetros cinéticos

Ks µm Yx/s
11,745 0,0072 3,9409

De todo esto se observa que la constante de saturación Ks es relativamente alta, lo cual

quiere decir que el microorganismo tuvo poca afinidad hacia el sustrato, y se ve reflejado
en una baja velocidad máxima de crecimiento, todo esto provoca un bajo rendimiento
biomasa sustrato

¿Qué es el crecimiento diauxico?

Crecimiento diáuxico

Supongamos que inoculamos una bacteria en un medio líquido provisto de dos fuentes de
carbono (p. ej., glucosa y lactosa), de las cuales una (en este ejemplo, la glucosa) es usada
preferencialmente. Si representamos la cinética del crecimiento poblacional según hemos
aprendido en el apartado anterior, obtenemos una curva como la de la figura siguiente:
Obsérvese que se dan dos fases de crecimiento exponencial separadas por una breve fase
intermedia estacionaria. Esta modalidad de crecimiento con dos fases exponenciales se
conoce con el nombre de crecimiento diáuxico.

Bases del crecimiento diáuxico:

La bacteria usa en primer lugar sólo la fuente preferencial de C (en este caso, la glucosa,
que suele ser la fuente preferencial en muchos heterotrofos), sin "tocar" la otra fuente. Una
vez que agota la primera fuente, se dispone a usar la segunda (ej.: lactosa), perotarda un
tiempo hasta que sintetiza los enzimas catabólicos necesarios para degradar esa segunda
fuente. Cuando las bacterias han logrado niveles de esos enzimas adecuados, se
restablece el crecimiento exponencial, aunque, como se puede constatar en el gráfico, con
una pendiente menor (lo que significa que esta fuente alternativa permite una tasa menor
que la preferencial (Enrique Iáñez 1998).

CONCLUSIÓN
Se determino el perfil de crecimiento del microorganismo, así mismo de determinaron los
parámetros cinéticos Ks, µm y Yx/s, se concluye que el microorganismo tiene baja afinidad
hacia el sustrato.

BIBLIOGRAFIA

Martos, M. and Zubreski, E. (2013). CINÉTICA DE CRECIMIENTO MICROBIANO –

CULTIVO BATCH. [online] Aulavirtual-exactas.dyndns.org. Available at:
http://www.aulavirtualexactas.dyndns.org/claroline/backends/download.php?url=L1BSwUN
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M [Accessed 15 Nov. 2018].
Curso de Microbiología General de Enrique Iáñez. CRECIMIENTO A NIVEL DE
POBLACIONES. http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/micro-ianez/14_micro.htm
actualizado el 17 de agosto de 1998. ENRIQUE IAÑEZ PAREJA.