Extracción de RNA

1. Homogenizar la muestra
Centrifugar las células para obtener el pellet.
2. Lisar las células
Agregar 350 µL de Buffer RA1 y 3.5 µL de β-mercaptoetanol (si no hay β-ME se
puede utilizar DTT a una concentración de 10-20 mM).
3. Lisado filtrado
Reduce la viscosidad y aclarar el lisado por filtración a través de NucleoSpin Filter
(anillo violeta). Centrifugar 1 minuto a 11,000 rcf.
4. Ajustar las condiciones de unión de RNA
Descartar el filtro NucleoSpin y agregar 350 µL de etanol al 70% homogenizar el
lisado y mezclarlo con la pipeta arriba y abajo 5 veces.
Alternativa transferir a un tubo nuevo de 1.5 mL, agregar el etanol y mezclar en
vortex 10 seg.
5. Enlazar el RNA
Por cada preparación tomar una columna con anillo de color azul, mezclar el lisado
2 o 3 veces con la pipeta y cargar en la columna. Centrifugar por 30 seg. a 11,000
rcf.
6. Membrana de Silica
Agregar 350 µL de MDB y centrifugar 1 min. a 11,000 rcf. para secar la membrana.
7. Digestión DNA
Preparar mezcla de reacción DNasa en un tubo estéril de 1.5 mL. Por cada
extracción , agregar 10 µL rDNasa reconstituido a 90 µL de buffer para rDNasa.
Mezclar por inmersión.
8. Lavar y secar la membrana de silica
1er lavado
Agregar 200 µL de Buffer RA2 a la columna y centrifugar 30 seg a 11,000 rcf.
2º lavado
Agregar 600 µL de Buffer RA3 a la columna y centrifugar 30 seg a 11,000 rcf.
3er lavado
Agregar 250 µL de Buffer RA3 a la columna y centrifugar 2 min a 11,000 rcf para
secar la membrana completamente.
9. Diluir RNA
Diluir el RNA en 60 µL de agua libre de RNasas y centrifugar 1 min a 11,000 rcf.