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SURFACTANTES

El surfactante es una palabra derivada de la contracción de la expresión "surface active agent", término que significa,
literalmente, agente de actividad superficial. En otras palabras, surfactante es un compuesto caracterizado por la capacidad
de alterar las propiedades superficiales e interfaciales de un líquido1,2. El término interfaz denota el límite entre dos fases
inmiscibles, mientras que el término superficie indica que una de las fases es gaseosa1. Otra propiedad fundamental de los
surfactantes es la tendencia de formar agregados llamados micelas que, generalmente, se forman a bajas concentraciones
en agua. La concentración mínima en la cual se inicia la formación de micelas se llama concentración micelar crítica (CMC),
siendo una importante característica de un surfactante1. Estas propiedades hacen que los surfactantes adecuados para una
amplia gama de aplicaciones industriales que involucren: detergencia, emulsificación, lubricación, capacidad espumante,
capacidad mojante, solubilización y dispersión de fases3.

La producción mundial de surfactantes excede de 3 millones de t / año y su utilización se concentra en las industrias de
petróleo, de cosméticos, de productos de higiene y de limpieza 3, siendo este último el sector que utiliza la mayor parte de
los surfactantes producidos como materia prima para la fabricación de detergentes de uso doméstico. La gran mayoría de
los surfactantes disponibles comercialmente se sintetizan a partir de derivados de petróleo. Sin embargo, el aumento de la
preocupación ambiental entre los consumidores, combinado con nuevas legislaciones de control del medio ambiente, llevó
a la demanda de surfactantes naturales como alternativa a los productos existentes.

Los compuestos de origen microbiano que exhiben actividad superficial se denominan biosurfactantes, consistentes en
subproductos de sus respectivos sistemas metabólicos5. En las últimas décadas, varios microorganismos han sido
reportados como productores de varios tipos de surfactantes. La biodegradabilidad6,7 y baja toxicidad de los
biosurfactantes constituyen ventajas adicionales sobre los ingredientes sintéticos y, consecuentemente, se convierten en
sustitutivos de los emulsificantes convencionales en alimentos y cosméticos6, originando mayor atractivo de mercado por
el hecho de que estos productos sean considerados naturales, además de apropiados para aplicación ambiental7.

Las bacterias, junto con las arqueobacterias, son las mayores responsables de la producción de estos compuestos. Estos
microorganismos han sido aislados del suelo, del agua marina, de los sedimentos del mar y de las zonas contaminadas por
los aceites. Diversas evidencias indican que los biosurfactantes son producidos, en algunos casos, en gran cantidad en estos
ambientes. Una de ellas es la presencia de espuma y emulsiones en áreas de derramamiento de aceites en océanos, así
como su efecto positivo en el aumento de la recuperación terciaria de aceite8.

Los primeros relatos que involucran la utilización de biosurfactantes datan de 1949, cuando Jarvis y Johnson9 detectaron
las actividades antibiótica y hemolítica de un ramnolípido, y de 1968, cuando Arima y colaboradores10 descubrieron la
existencia de un nuevo compuesto biológicamente activo producido por Bacillus subtilis9, el cual fue denominado surfactina
debido a su gran actividad superficial, teniendo posteriormente su estructura elucidada11. Más tarde, se registró la
producción de biosurfactante en medios hidrofóbicos, lo que llevó a estudios de su aplicación en tratamiento de residuos
de petróleo12, recuperación de petróleo13,14, biorremediación y dispersión en el derramamiento de aceites14.

La surfactina es un lipopéptido ácido cíclico producido por B. subtilis que es uno de los biosurantes más eficaces conocidos
hasta ahora. Contiene siete residuos amino y está cerrado por la formación de lactonas. Se sabe que la surfactina es capaz
de disminuir la tensión superficial de 72 a 27.9 mN / m en una concentración de 0.005% (p / v). Una característica
importante de este componente es su capacidad para lisar glóbulos rojos y puede actuar como un antibiótico, antiviral y
agente hemolítico (Carillo et al 2003) .1 La biosíntesis de surfactina por B. subtilis ha sido ampliamente estudiada, la cual
se activa. por la surfactina que sintetiza la enzima graminina S sintetasa que participa en la formación de adenilato de
aminoacilo y tioéster (Kluge et al. 1988) .2
Abu-Ruwaida et al (1991) 3 propusieron que una gran variedad de biosurfactantes están influenciados por la naturaleza de
la fuente de carbono, la concentración de nitrógeno, fósforo, magnesio, hierro y iones de manganeso en el medio y las
condiciones de cultivo. Incluyendo pH, temperatura, agitación y velocidad de dilución. Los biosurfactantes que producen
bacterias reaccionan a los cambios en su entorno modificando su composición y estructura de la superficie.

Los biosurfactantes, en general, pueden clasificarse en: glicolípidos, liposacáridos, lipopeptídeos, fosfolípidos y ácidos
grasos / lípidos neutros (como los ácidos usílago y corinomicólico) 15, además de surfactantes poliméricos y surfactantes
particulados16, siendo los lipopeptídeos los biosurfactantes más efectivos15 . Los surfactantes lipoproteicos son quizás los
más conocidos por sus actividades antibióticas, siendo mejor caracterizados aquellos producidos por Bacillus sp, incluyendo
surfactina, iturina, fengicina, liquenisina8, micosubtilisina y bacilomicina17. Este tipo de compuesto se caracteriza por la
presencia de péptidos ligados a ácidos grasos, siendo que la porción proteica de la molécula puede ser neutra o aniónica y
los aminoácidos están frecuentemente dispuestos en una estructura cíclica8.

A pesar de la elucidación de diversas propiedades de la surfactina en la década del 60, sólo en los años 80 llamó la atención
de diversos investigadores como una alternativa atractiva para sustituir a los surfactantes sintéticos, los cuales pueden ser
más dañinos al ambiente8. Los surfactantes producidos por diferentes linajes de Bacillus subtilis, además de ser obtenidos
por procesos menos agresivos desde el punto de vista ambiental, presentaron efectos significativos en la biodegradación
de hidrocarburos alifáticos y aromáticos18-20, remoción de aceite de arena contaminada19,21, formación de emulsiones
estables en aceite21, así como en la degradación del plaguicida endosulfan22 y biorremediación de suelos altamente
contaminados por cinc y cadmio23.

Esta revisión tiene el propósito de levantar datos sobre producción, aplicación y actualidad relacionadas a la surfactina, el
principal surfactante producido por linajes de Bacillus subtilis, que, a pesar de ser un biosurfactante muy efectivo, pocos
estudios se realizaron acerca de sus aplicaciones. Además, sus características químicas y propiedades funcionales permiten
evidenciar el gran potencial de esa sustancia para su aplicación en diversos segmentos industriales.

La surfactina es conocida por tener una excepcional actividad superficial, reduciendo la tensión superficial del agua (20 ° C)
de 72 a 27 mN / m10. ,24-27 en concentraciones menores de 20 μM26, además de reducir la tensión interfacial del sistema
agua / hexadecano de 43 a valores menores que 1 mN / m25,27. Cuando se compara a otros biosurfactantes27,28 ya
algunos surfactantes sintéticos, como dodecilsulfato de sodio (SDS) y bromuro de trimetil amonio (BTA) 29, tiene mayor
capacidad de reducir la tensión superficial e interfacial y presenta menores valores de concentración micelar crítica CMC)
27-29.

La surfactina es producida por varias cepas de Bacillus subtilis10,21,30,31 y su estructura general, demostrada en la Figura
1, es la de un péptido cíclico de siete aminoácidos ligados a una cadena de ácido graso b-hidróxi, siendo que esta cadena
puede variar de 13 a 15 átomos de carbono, permitiendo la existencia de diferentes compuestos homólogos e
isómeros25,31,32. El principal ácido graso conjugado es el ácido 3 hidroxi-13-metil-tetradecanoico31,32 conectado por la
unión de lactona, al igual que los demás26.

La surfactina natural es una mezcla de isoformas que se diferencian ligeramente en sus propiedades físico-químicas debido
a variaciones en el tamaño de la cadena, a la unión de su componente hidroxi ácido graso ya las sustituciones de los
aminoácidos componentes del anillo31. Estas variaciones dependen del linaje31,33 y de las condiciones nutricionales y
ambientales31,34, más que de determinación genética.

La actividad biológica de la surfactina depende tanto de la composición de aminoácidos y de la secuencia del péptido como
de la naturaleza de su parte lipídica31. Las sustituciones de aminoácidos son responsables de los cambios significativos en
sus propiedades causadas por la modificación de la distribución polar / apolar y / o de la accesibilidad de grupos carboxílicos
a cationes. Estas modificaciones acarrean diferencias en la capacidad hemolítica, quelación de metales, CMC y actividad
superficial25,26.

Varios experimentos han demostrado que la surfactina es bastante estable cuando está sometida a diversas condiciones.
Los biosurfactantes producidos por Bacillus sp son estables en concentraciones de NaCl de 2 a 3%, las cuales son suficientes
para inactivar surfactantes convencionales35. El biosurfactante producido por la cepa de Bacillus subtilis C9 presentó un
amplio límite de estabilidad y mantenimiento de propiedades emulsificantes a límites variados de temperaturas (20-100 °
C por 1 h), pH (5,0 a 9,5) y concentraciones salinas de 1.000 de la concentración de NaCl y 10 mM de CaCl229.

Se utilizó otro linaje, se produjo surfactante con estabilidad a variaciones de temperatura (100 ° C por 2 h, 121 ° C por 0,5
hy 135 ° C por 1 h), de pH 6 a 12, en concentración salina (15 (% NaCl) y en presencia de enzimas proteolíticas (bromelina,
ficina, papaína y tripsina) además de buenas propiedades emulsificantes de aceites vegetales e hidrocarburos21.

La acidificación de la solución para pH igual a 2 eleva la tensión superficial a 62 mN / m, volviendo a 27 mN / m con la


neutralización, pH 6, mostrando la dependencia de las propiedades surfactantes de la surfactina en relación al pH27. Esto
se debe al hecho de que en medio ácido la surfactina precipita sin, sin embargo, tener su estructura alterada21,27. Esta
característica constituye en una ventaja adicional pues, aun sometida a condiciones más extremas de pH, hay
mantenimiento de la estructura química original.

PROPIEDADES FUNCIONALES Y TOXICOLÓGICAS

Un número creciente de investigaciones relativas a las propiedades funcionales de los biosurfactantes nos sitúan como
productos de origen biotecnológico de real importancia en cuanto a las variadas aplicaciones. Se proponen tres funciones
principales para estos compuestos: aumentar el área superficial de sustratos hidrofóbicos insolubles en agua, aumentar la
biodisponibilidad de sustratos hidrofóbicos por el aumento de su solubilidad aparente e influir en la adhesión de
microorganismos a superficies. Estas funciones tienen una fuerte influencia en la supervivencia de los microorganismos
productores de estos surfactantes en su hábitat natural (suelo y rizosfera) 5.

Así como los demás biosurfactantes, los lipopeptídeos son capaces de alterar las propiedades físicas y / o químicas de las
interfaces. Estos compuestos pueden actuar como antibióticos, agentes antivirales y antitumorales, inmunomoduladores o
inhibidores de enzimas y toxinas. El modo de acción de muchos de estos compuestos no fue aclarado en detalle hasta el
momento, a pesar de saber que sus actividades de superficies y de membrana desempeñan un papel importante en diversos
sistemas. Muchos surfactantes lipopeptídicos poseen potentes actividades antibióticas y fueron sometidos a diversos
estudios en el descubrimiento de nuevos antibióticos5. Entre los lipopeptídeos, la surfactina es el representante más
investigado36, pues presenta baja CMC, alto poder de reducción de la tensión superficial10,21,27,29,37, además de
presentar diversas funciones biológicas, como se muestra en la Tabla 1.

las mismas características caracterizan la surfactina como molécula biológicamente activa. Aunque los mecanismos de
acción de la surfactina no están completamente dilucidados, se presume que estas características son una consecuencia
directa de la interacción membranal de la surfactina y la alteración de las propiedades de bicapa. Más específicamente,
parece claro que estas propiedades de la surfactina están principalmente relacionadas a su capacidad de alterar la
integridad membranal, como consecuencia del establecimiento de fuertes interacciones con los constituyentes
fosfolipídicos de la membrana celular45. Los estudios sobre los mecanismos moleculares de permeabilización de membrana
a través de la incorporación de la surfactina demostraron haber pérdida del contenido vesicular a través de la
desestabilización lipídica o formación de poros intra membranales38,47. Recientemente, se ha demostrado que ciertos
tipos de péptidos cíclicos son capaces de inactivar bacterias gram-positivas y gram-negativas, a través de la autoformación
de sistemas tubulares en membranas lipídicas38.

Las propiedades de la surfactina también son base para la explicación de su acción anticarcinogénica. Se propuso que la
surfactina tiene la capacidad de, al alcanzar el interior de la célula, promover ruptura de la membrana plasmática28. Se
mostró actividad antitumoral contra células con carcinoma de Ehrlich39; la actividad antiproliferativa en experimentos con
células de los cánceres de ovario, renal, de próstata, de colon, de pulmón, de mama, de mama residente y melanoma;
actividad citostática y citotóxica a todos los carcinomas investigados21.

La surfactina también es capaz de inhibir la formación de biopelículas de otras bacterias, incluso de la patógena Salmonella
enterica. Las acciones antimicrobianas y antifúngicas de lipopeptídeos fueron ventajosas para las células de B. subtilis al
eliminar competidores del mismo hábitat.

A pesar de que los biossurfactantes lipopeptídicos actúan en la membrana celular de microorganismos de manera similar
a los surfactantes sintéticos5, la actividad biológica de la surfactina de un linaje de B. subtilis cultivada en manipule se
mostró más elevada que la surfactina comercial, en ensayos con diversos linajes de microorganismos entre ellos
Staphylococcus aureus y Salmonella choterasius) 39. Además, hay fuertes evidencias de que las propiedades de barreras
de la membrana pueden ser dañadas en áreas donde los oligómeros de la surfactina interactúan con fosfolípidos. Esto causa
fluctuaciones estructurales que pueden ser el principio de acción de los antibióticos y otros efectos biológicos importantes
de ese lipopeptídeo. Estos tipos de péptidos actúan rápidamente sobre la integridad membranal, así como en otros
procesos vitales y pueden, quizás, constituir la próxima generación de antibióticos37.

El potencial de los surfactantes peptídicos puede ser evidenciado a través de la demostración de propiedades de las
proteínas surfactantes humanas A y D, al proteger ratones contra hipersensitividad pulmonar inducida por A. fumigatus y
productos alergénicos. Las proteínas surfactantes pueden interactuar con los antígenos glicosilados y alergénicos de A.
fumigatus, inhibiendo la unión específica de la IgE con el alergénico y ser capaces de bloquear la liberación de histamina
sintetizada de basófilos42.

Otra aplicación propuesta es la facilitación de la absorción de fármacos utilizando el pulmón como sitio de entrada. En la
mayoría de los casos, la mayoría de las personas que sufren de la enfermedad de Chagas, en el momento de la vacunación,
corta distancia a paso aire-sangre45. Se examinaron los efectos de la surfactina en la absorción de insulina en el pulmón de
ratas. La biodisponibilidad del péptido administrado por la ruta intratraqueal como solución conteniendo 1 ó 10 mM de
surfactina fue 15,1 y 80,0%, respectivamente. Los datos relativos a la toxicidad no se presentan en el informe46.

La actividad antiviral de la surfactina se determinó para una amplia gama de virus. Experimentos in vitro mostraron que la
surfactina inactivó eficazmente el virus causante del herpes, así como el retrovirus y otros virus de ARN y ADN compactados.
Sorprendentemente, no fue inactivado el virus Semliki Forest, un virus envelopado utilizado como modelo para virus de la
hepatitis C. Concentraciones mayores que 80 mM llevaron a una reducción en las concentraciones de los virus41.

La ruptura total de las membranas lipídicas virales y parcial de los capsídeos sugiere que la acción antiviral sea debida a la
interacción físico-química del surfactante con la membrana viral lipídica. La surfactina puede ser útil en aplicaciones
relacionadas con el aumento de la seguridad de productos biotecnológicos y farmacéuticos, tales como derivados de sangre
y productos obtenidos de cultivos de células, que tienen riesgo de transmitir enfermedades como el virus de la hepatitis B,
el VIH o el herpes simple . Sin embargo, el potencial de la surfactina parece ser dependiente del ambiente, pues la actividad
de la surfactina contra virus decrece con un incremento de la relación proteína / lípido en el medio de reacción. De esta
forma, no debe ser útil para mejorar la seguridad contra virus en productos con alta concentración proteica41.

Los estudios de toxicidad in vivo en ratas demostraron que la LC50 de la surfactina es 200 mg / kg en aplicaciones
intramusculares y mayor que 4 g / kg en aplicaciones orales30. Debido a esta baja toxicidad in vivo, es posible que no sea
necesario que la surfactina sea completamente removida de los productos. Por otro lado, la surfactina tiene efecto
hemolítico e inhibe la formación de coágulo fibrinoso, por lo tanto, debe ser removida cuando se utiliza durante el proceso
productivo de ciertos productos41.

Sin embargo, se sabe que los biosurfactantes, en general, poseen baja toxicidad, pudiendo ser aplicados en alimentos,
cosméticos y productos farmacéuticos. Bacillus amyloliquefaciens y otros miembros del grupo del Bacillus subtilis se
consideran seguros. Algunos productos celulares de linajes de Bacillus poseen el status 'GRAS' ("Generally Recognized as
Safe"). En algunos casos se puede citar, como la preparación enzimática de pectato-liase de Bacillus subtilis (GRAS nº 114),
la amilasa derivada de Bacillus licheniformis (GRAS nº 79) y la pululanasa de Bacillus licheniformis (GRAS nº 72) 48. A pesar
de ello, B. subtilis y B. licheniformis parecen estar implicados en algunos casos de envenenamientos fatales por alimentos49.

BIOSSURFACTANTES EN LA INDUSTRIA DE ALIMENTOS: ASPECTOS TECNOLÓGICOS

Los biosurfactantes son de gran interés por sus propiedades físico-químicas y biológicas que pueden ser explotadas en las
industrias farmacéutica, de aceites minerales24 y de alimentos51. La propiedad de formación y estabilización de emulsiones
es la principal característica a ser influenciada por la adición de biosurfactantes en alimentos4,6,21,38,39,52. En general, la
función de los emulsificantes en alimentos es promover la estabilidad de la emulsión, controlando la aglomeración de
glóbulos de grasa y estabilizando sistemas aerados53,54.

Por definición, una emulsión es un sistema heterogéneo, consistente en al menos un líquido inmiscible (fase interna
discontinua) dispersado en otro (fase externa continua) en forma de pequeñas gotas, con el diámetro que, en general,
excede de 0,1μm54. Estos sistemas poseen una estabilidad mínima, la cual puede ser aumentada por aditivos surfactantes,
sólidos finamente divididos, etc52,53, que actúan reduciendo la tensión interfacial, disminuyendo la energía en la superficie
entre las dos fases y previniendo la coalescencia de las partículas a través de la formación de barreras estéreo y
electrostático53. Ejemplos de emulsiones naturales son la leche y la yema de huevo. Los ejemplos de alimentos procesados,
que son emulsiones, son crema de leche, mantequilla, margarina, mayonesa, salsas para ensalada, salchichas, salchichas,
helados, pasteles, chocolate, rellenos52 y productos instantáneos54.

Otras aplicaciones para los emulsificantes se describen, entre ellas: mejorar la textura y vida de estante de productos
contento almidón, por la formación de complejos con los componentes de éstos; modificar las propiedades reológicas de
la harina de trigo, por la interacción con el gluten; mejorar la consistencia y textura de productos a base de grasas, por el
control de polimorfismo y la estructura cristalina de las grasas3,54 además de promover la solubilización de aromas6.

Algunas ventajas de la aplicación de biosurfactantes en alimentos pueden ser citadas: estos compuestos pueden ser
producidos bajo la aplicación de procedimientos relativamente simples y baratos; los nuevos tipos de surfactantes, que no
son fácilmente sintetizados por proceso químico, pueden ser obtenidos; tienen un aspecto ecológicamente correcto,
debido a su completa biodegradabilidad; para aplicaciones específicas, se pueden utilizar diferentes propiedades del mismo
compuesto (como la combinación del efecto emulsificante con antibiótico) 28, así como su potencial para su uso como
ingrediente con propiedades funcionales29.

A pesar de la aplicación potencial, la industria de alimentos no utiliza todavía los biosurfactantes como aditivos a gran
escala. Muchas propiedades de los biosurfactantes, así como su regulación en relación a la aprobación como nuevo
ingrediente para alimentos, tienen que ser resueltas. La elaboración de pruebas y la evaluación de cualquier nuevo
ingrediente se requiere de acuerdo con los reglamentos de la U. S. Food and Drug Administration y este proceso puede ser
largo. Los factores a ser considerados en esta evaluación se relacionan con cuestiones nutricionales, funcionales,
sensoriales, biológicas y toxicológicas del nuevo ingrediente, además de otros factores deben ser considerados, tales como
factores económicos, cuando comparados a los surfactantes sintéticos para el mismo uso, aceptación por el consumidor ,
regulación legal y hábitos alimentarios de los consumidores52.

A pesar de las restricciones citadas, la utilización de biosurfactantes en alimentos se muestra prometedora cuando se
consideran algunas aplicaciones ya descritas en la literatura. En Japón, donde las restricciones legales relativas al uso de
nuevos componentes naturalmente producidos en procesos biotecnológicos en la industria de alimentos no son tan rígidos,
los soforolípidos se han patentado como aditivos para harina de trigo55, pared celular de Saccharomyces uvarum
hidrolizada y liofilizada aplicada en margarinas56, así como ramnolipidos de Pseudomonas aeruginosa para aplicaciones
cosméticas y alimenticias57-59. Además, otro relato apuntó posibles aplicaciones de biosurfactantes en alimentos: Emulsan
y Paraemulsan de Acinetobacter calcoaceticus combinados con emulsionantes sintéticos60.

La manoproteína producida por Saccharomyces cerevisiae puede estabilizar emulsiones agua / aceite para la producción
de mayonesa, galletas, pasteles, productos cárnicos (salchichas), helados, entre otros. Se produce a través de un proceso
biotecnológico simple, de gran escala y bajo costo. Además de ser estable en una amplia gama de pH (3-11), su subproducto
puede ser utilizado para alimentación animal o producción de medios de cultivo61.

Los Ramnolípidos producidos por Pseudomonas aeruginosa en procesos de fermentación discontinuos y semi-continuos
han demostrado alta productividad, haciendo este método viable para la producción de L-ramnose a escala comercial. La
ramnosa tiene aplicación industrial como materia prima en la producción de algunos compuestos orgánicos58.

La alga roja Porphiridium cruentum y las bacterias Klebsiella sp y Acinetobacter calcoaceticus fueron identificadas como
buenos productores de bioemulsificantes extracelulares, con mejor actividad estabilizante que la goma arábiga y la
carboximetilcelulosa. El biosurfactante producido por Candida utilis, aplicado como emulsificante en salsas para ensalada,
se mostró prometedor para ser investigado como nuevo ingrediente para la industria alimentaria62.

En detrimento de las propiedades de la surfactina, los informes de su aplicación en la industria de alimentos son escasos.
Sin embargo, se relata que un surfactante producido por linaje de B. sutil, utilizando una solución de 1,0 mg / ml de producto
bruto en agua, demostró capacidad para formar emulsiones estables de aceites comestibles, por ejemplo, aceites de buriti
(Mauria (Guepardo), la palma de la mano, la cebolla, la albahaca, la albahaca, la albahaca, Helianthus annus), canola
(Brassica napus) y oliva (Olea europaca) 21.

CONCLUSIONES

A pesar de que, hasta el momento, existen pocos estudios sobre aplicaciones industriales de surfactina, sus propiedades
químicas, tecnológicas y funcionales indican fuertes posibilidades de uso en este sector.

Desde el punto de vista químico, propiedades como detergencia, emulsificación, capacidad espumante, solubilización y
dispersión de fases de la surfactina generan posibilidades para innumerables aplicaciones en diversos productos
alimenticios, tales como productos de panificación, aromas, lácteos, etc.
Asociadas a ello, algunas de sus ventajas tecnológicas como estabilidad a diversas condiciones de procesamiento, así como
en la formación de emulsiones estables, hacen de la surfactina un potencial ingrediente industrial.

Adicionalmente, teniendo en cuenta las actuales preocupaciones de los consumidores con relación a la alimentación y la
salud, la aplicación de la surfactina en alimentos se muestra favorable a esta tendencia, ya que evidencias demuestran
posibles actividades funcionales de ese biosurfactante como agente preventivo a algunos tipos enfermedad. Los estudios
toxicológicos indican baja toxicidad in vivo.

A pesar de muchos elementos favorables a su aplicación, la industria de alimentos no hace uso de biosurfactantes debido,
principalmente, a los costos involucrados en su proceso productivo. Recientemente, algunas posibilidades han surgido para
reducir los costos de producción de los biosurfactantes en general. La utilización de residuos industriales como medio de
cultivo para microorganismos productores de biosurfactantes parece ser una alternativa posible.

Teniendo en cuenta las numerosas características y propiedades presentadas por la surfactina, la reducción de los costos
de su producción haría posible la aplicación industrial de estos compuestos en un futuro próximo.

BACILLUS SUBTILLIS
Las bacterias de Bacillus subtilis es una especie de Gram-positivo es un saprofito común del
suelo y agua . Esporulados Office, no patógena , gracias a su termofilia se utiliza en la vigilancia y los ciclos de
validación de la esterilización por óxido de calor seco y de etileno , realizado en invernaderos o autoclaves de
esterilización y hornos para el gas óxido de etileno, respectivamente.

ARTÍCULO

a surfactina es un lipopéptido ácido cíclico producido por B. subtilis que es uno de los biosurantes más eficaces conocidos
hasta ahora. Contiene siete residuos amino y está cerrado por la formación de lactonas. Se sabe que la surfactina es capaz
de disminuir la tensión superficial de 72 a 27.9 mN / m en una concentración de 0.005% (p / v). Una característica
importante de este componente es su capacidad para lisar glóbulos rojos y puede actuar como un antibiótico, antiviral y
agente hemolítico (Carillo et al 2003) .1 La biosíntesis de surfactina por B. subtilis ha sido ampliamente estudiada, la cual
se activa. por la surfactina que sintetiza la enzima graminina S sintetasa que participa en la formación de adenilato de
aminoacilo y tioéster (Kluge et al. 1988) .2
Abu-Ruwaida et al (1991) 3 propusieron que una gran variedad de biosurfactantes están influenciados por la naturaleza de
la fuente de carbono, la concentración de nitrógeno, fósforo, magnesio, hierro y iones de manganeso en el medio y las
condiciones de cultivo. Incluyendo pH, temperatura, agitación y velocidad de dilución. Los biosurfactantes que producen
bacterias reaccionan a los cambios en su entorno modificando su composición y estructura de la superficie.

La surfactina es un compuesto lipopeptídico útil y tiene aplicaciones potenciales en los campos médico y biotecnológico. La
propiedad más importante de su lipopéptido es su aceptabilidad ambiental, ya que son fácilmente biodegradables y tienen
menor toxicidad que los antibióticos sintéticos (Lang y Wanger, 1993) .4 Los compuestos lipopeptídicos tienen muchas
actividades farmacológicas y la surfactina tiene efectos antibacterianos, antifúngicos y antivíricos efectivos. y
antimicoplasma, inhibición de la formación de coágulos de fibrina y propiedades hemolíticas (Cameotra et al. 2004) .5
La surfactina tiene una importante propiedad antibacteriana porque es capaz de penetrar en las membranas celulares de
todos los tipos de bacterias (Bergey et al. 1994) .6 Esta penetración es un factor esencial que contribuye a la actividad
similar al detergente de la surfactina. para crear un ambiente permeable para la bicapa lipídica y causar una ruptura que
solubiliza la membrana (Heerklotz et al. 2001) .7
Anteriormente, se han realizado varios estudios para la producción de lipopéptidos con B. subtilis. En nuestro estudio,
diferentes componentes ambientales y de sal están optimizados para la producción de estos importantes compuestos
médicos.

MATERIAL Y MÉTODOS
Producción de lipopéptidos:
Cepa de Bacillus subtilis para la producción de surfactina. Una cepa de B. subtilis - IMBB fue proporcionada por el Instituto
de Biología Molecular y Biotecnología (IMBB), Universidad de Lahore, Lahore.
Identificación y confirmación de B. subtilis Caracterización bacteriana: la morfología de las colonias de Bacillus subtilis fue
circular, lisa, de 2 a 4 mm blanca, blanquecina, serrada y opaca en agar nutriente y muestra actividad hemolítica en agar
sangre. La morfología celular de esta fue varillas Gram positivas, presentes en grupos y móviles. La tinción de esporas y
cápsulas fue positiva.
Caracterización bioquímica: Las pruebas bioquímicas incluidas para identificar la cepa bacteriana fueron catalasa, ureasa,
indol, reducción de nitrato y oxidasa.

Inoculación de B. subtilis en medios de sal mineral (MSM) para la producción de surfactina

Preparación del inóculo: Se transfirió un bucle lleno de crecimiento fresco de Bacillus subtilis-IMBB a 100 ml de caldo
nutritivo esterilizado. El matraz se incubó a 37ºC durante 48 horas. Después de la incubación, se midió la turbidez del caldo
de cultivo utilizando un especofotómetro Unicam que fue de 1.201.

Producción de surfactina: el experimento se realizó en tres lotes para la producción de surfactina mediante tecnología de
fermentación. En el primer lote se usaron concentraciones bajas y altas de P, K y N para optimizar los minerales. En el
segundo lote, la fuente de carbono se optimizó con diferentes concentraciones y en el tercer lote, el pH se optimizó en un
rango de 6.0 a 8.0. Para la producción de surfactina, se inoculó 1 ml de suspensión de crecimiento en MSM con diferentes
concentraciones y composición de minerales. Los matraces de fermentación se incubaron en un agitador orbital a 37 ° C
durante 24 horas. Después de 24 horas, se tomaron 10 ml de medio y se centrifugaron a 10.000 rpm durante 20 minutos y
se midió la densidad óptica (OD) del sobrenadante a 620 nm para la detección y cuantificación de surfactina. El
procedimiento se realizó durante hasta 120 horas de incubación del cultivo.

Optimización de componentes de medios (N, K, P)


MSM con una concentración de 1.5 y 3.0 g / 100 ml para nitrógeno, 1.5 y 4.0 g / 100 ml para fosfato y 1.0 y 2.0 g / dl para
potasio fue optimizado para la producción de surfactina. El crecimiento de B. subtilis se controló como OD a 620 nm
mediante un espectrofotómetro.

Optimización de pH y fuente de carbono del medio.


El pH del medio es uno de los factores físicos importantes que afectan el crecimiento bacteriano y para la producción de
lipopéptidos. Para estudiar el efecto del pH, se inoculó inoculo de 100 µl de la suspensión de crecimiento en MSM con pH
diferente de 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 y 8.0. El carbono también es una fuente de producción de lipopéptidos y el manitol se optimizó
con concentraciones diferentes de 0.5 a 3.0 g / dl en MSM. Se inoculó un volumen de 100 µl de suspensión de crecimiento
en MSM. El crecimiento y la producción de surfactina se compararon mediante OD a 620 nm.

La Tabla 1 muestra la mayor producción de lipopétidos utilizando manitol como fuente de carbono en el momento máximo
de incubación. La tabla 1 ilustra que el manitol mostró un efecto positivo, es decir, a mayor concentración de manitol,
mayor será la producción de surfactina. La DO de B. subtilis es 2.110 a 3.0 g / 100 ml de manitol. La Tabla 2 demuestra el
efecto del pH y a un pH de 7.0, la producción de lipopéptidos es máxima con OD 0.865 después de 120 horas de incubación.
El efecto del nitrógeno para la producción de surfactina se muestra en la Fig. 1 y la Fig. 2. Los efectos de las sales de potasio
y fosfato en la producción de lipopetida tienen una actividad inversa y la densidad óptica fue mayor a una baja
concentración de potasio y fosfato representada en las figuras del n. 3 a no. 6

La figura 1 y 2 muestran que el crecimiento se detuvo cerca de las 72 horas debido a la falta de disponibilidad de fuente de
nitrógeno en los medios. La OD fue 1.815 después del tiempo máximo de incubación (120 horas). A una mayor
concentración de nitrógeno (3.0 g / 100 ml), la DO de bacilo subtilis fue de 2.375 después de 120 horas de incubación. En
las figuras 3 y 4, la producción de lipopéptidos fue inversamente proporcional a la concentración de sal de fosfato. A
concentraciones de 4.0 y de 1.5 g / 100 ml, la DO fue de 0.885 y 1.975 respectivamente. La producción de superfluos fue
alta con un período de tiempo en aumento y la OD máxima fue de 3 (Fig. 5).
concentraciones de 1.0 y de 2.0 g / 100 ml, la DO fue de 3.37 y 1.915 respectivamente.

DISCUSIÓN
El género Bacillus subtilis se ha utilizado ampliamente en la industria de la fermentación para la producción de lipopéptidos
y enzimas que tienen una estructura química y actividades biológicas diversas (Stachelhaus et al 1995) .8 Los lipopétidos
producidos por Bacillus subtilis tienen actividad hemolítica que está directamente relacionada a la producción de surfactina
(Moran et al 2002) .9
En las figuras 5 y 6, la producción de lipopéptidos es inversamente proporcional a la concentración de sal de potasio. En
este estudio, se utilizaron varios componentes en el medio para la optimización del medio que se requería para verificar la
eficacia de estos componentes en la producción de surfactina por B. subtilis. La hemolisis producida por B. subtilis en el
agar de sangre se debe a la producción de surfactina.9 El manitol se utilizó como fuente de carbono a una concentración
de 3 g / 100 ml en el medio, lo que aumenta la producción de surfactina con un valor de 2.110 OD. A partir de los resultados
obtenidos basados en la producción de biomasa en presencia de manitol, fue posible sugerir que la utilización de manitol
en este cultivo fue muy eficiente para la producción de surfactina. Los resultados están de acuerdo con lo anterior, también
se observó que cuando la concentración de manitol aumentaba gradualmente, había un aumento eficiente en el
crecimiento de surfactinas que producían Bacillus subtillus.

El carbono y el nitrógeno tienen un papel importante en la producción de surfactinas y lipopéptidos. Se ha informado que
la relación C / N afecta los rendimientos de surfactina; una relación C / N baja es más efectiva en el aumento de la
producción de surfactina (Manresa et al 1991) .12 Los resultados de nuestro estudio son comparables y sugieren una
tendencia similar, ya que un aumento en la concentración de nitrógeno implica una relación C / N baja (Davis et al 1999 ).

En contraste, la producción de lipopéptidos se redujo con alto contenido de fosfato (4 g / 100 ml), ya que OD fue de 0.8885
a 620ºC mientras que a bajo fosfato (1.5 g / 100 ml) se obtuvo un alto OD (1.97). Una explicación para la reducción de la
biosíntesis de surfactina a altas concentraciones de fosfato es que la represión de fosfato podría desempeñar un papel en
la regulación de la producción de surfactina, que es consistente con el efecto negativo de la fuente de fosfato de fácil uso
en la biosíntesis de antibióticos y otros metabolitos secundarios a nivel de transcripción (Liras et al.,

El aislamiento de bacterias del gé nero Bacillus se llevó a cabo por medio de la resuspensió n asé ptica de 1 g de tierra
en 100 mL de agua destilada esté ril, con agita- ció n vigorosa por 30 s, despué s de realizarles diluciones seriadas hasta
103 y someterlas a un tratamiento té r- mico de 85oC durante 10 min en bañ o de agua; se tomó 0,1 mL de la dilució n
tratada que se sembró con espá - tula de Drigalsky en placas con medio de agar nutriente e incubadas durante 72 h a
28oC para despué s realizar- les el conteo de las colonias de distinta apariencia. Se tomó una muestra representativa
de cada colonia para realizarle una tinció n simple con violeta cristal y ob- servar al microscopio (Motic), con un
aumento de 1000X. Aquellas colonias que mostraron presencia de endospora bacteriana pasaron a una subcultivació n
en agar nutriente durante 24 h a 28oC para efectuar la prueba de la catalasa a fin de ubicarlas en el gé nero Bacillus.
Los aislamientos que resultaron positivos a la catalasa se conservaron en frascos de agar nutriente a 4oC hasta su
posterior uso.