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ACTIVIDAD 2 “ACTIVIDAD ENTREGABLE”

UNIVERSIDAD ABIERTA Y A DISTANCIA DE MÉXICO

ASIGNATURA

BIOLOGÍA MOLECULAR II

UNIDAD 3

ACTIVIDAD 2 “ACTIVIDAD ENTREGABLE”

ALUMNO

JUAN JESÚS LÓPEZ ROSAS

DOCENTE EN LÍNEA

JAIME GARC SIMBRÓN

FECHA DE ELABORACIÓN DEL TRABAJO

20 DE AGOSTO DEL 2018

CARRERA

INGENIERO EN BIOTECNOLOGÍA
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ACTIVIDAD 2 “ACTIVIDAD ENTREGABLE”

INSTRUCCIONES: Realiza un ensayo a mano (con puño y letra) escanéalo y súbelo al


portal del artículo científico compartido en el bloque de material de apoyo “Rubisco
mutagenesis provides new insight into limitations on photosynthesis and growth in
Synechocystis PCC6803”.

Desarrolla tu actividad a mano escanéalo y súbelo al portal en la sección indicada. Mínimo


tres cuartillas máximo 6.

Anexar conclusión a tu actividad y referencias bibliográficas. Simbrón Jaime (2018).

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Figura 1: Diagrama de interacciones RuBP en los sitios de unión 1P y 5P. En el estado


cerrado de Rubisco, el fosfato forma enlaces de hidrógeno con Gly381, Gly403, Gly404 y
Thr65 en el sitio de unión a 1P (líneas discontinuas), mientras que en el estado abierto de
la enzima la interacción con Trp66 reemplaza la interacción con Thr65 (no mostrado). El
fosfato también forma enlaces de hidrógeno con Arg295 e His327 en el sitio de unión a 5P
en el estado cerrado de la enzima (líneas discontinuas). En el estado abierto de la
enzima, la interacción de fosfato con His327 se reemplaza por interacción con His298 (no
se muestra). El diagrama se basa en la estructura cristalina de la espinaca no activada
Rubisco en complejo con RuBP (código PDB 1RCX), se produjo utilizando el software
RasMol. Los átomos de carbono, nitrógeno, oxígeno y fosfato están coloreados en gris,
azul, rojo y naranja, respectivamente.

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Figura 2: Tabla 1 sobre las propiedades cinéticas de los mutantes de Rubisco. La enzima
se activó durante 30 minutos con 280 μM de CO2 y 10 mM de MgCl2 a 30°C. Se añadieron
alícuotas de 10 μl (Rubisco activado de 1,25 - 1,5 μM) a 290 μl de la mezcla de reacción
que contenía diversas concentraciones de CO2 y RuBP 0,5 mM o diversas
concentraciones de RuBP y Pi y 660 μM de CO2 (4 Bq nmol-1), Ditiotreitol 5 mM, MgCl {2}
10 mM y 7,5 unidades de anhidrasa carbónica de Wilbur - Anderson en HEPES 50 mM,
pH 8,0. La reacción se terminó después de 2 min mediante la adición de 200 μl de ácido
acético 6 N y el material estable en ácido se contó después de 48 h. La concentración del
sitio catalítico se determinó mediante unión a [14C] CPBP cada ensayo se realizó por
triplicado. Los datos se analizaron de acuerdo con Hanes - Woolf o Dixon (Segel, 1975) y
las líneas que mejor se ajustaban se calcularon usando el método de mínimos cuadrados.
Los coeficientes de correlación para las líneas de regresión fueron > 0,95.

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Figura 3: Efecto de la concentración de Pi en la activación de Rubisco. Los mutantes de


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tipo salvaje y Rubisco G404A, T65A y T65S se activaron durante 30 minutos a 30°C con
ditiotreitol 1 mM, CO2 70 M, MgCl2 5 mM y se añadieron diversas concentraciones de
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fosfato de potasio después de un intervalo de 5 minutos. Se añadieron alícuotas de


enzima activada a una mezcla de reacción en presencia de RuBP 0,5 mM, 14CO2 70 μM
(11,3 Bq nmol-1). El pliegue de activación se definió como la proporción de actividad de
Rubisco activada en presencia o ausencia de Pi, respectivamente. La actividad de
Rubisco en ausencia de Pi fue de 40, 5.5, 2.56 y 22.5 min-1 para los mutantes Rubisco
tipo salvaje y G404A, T65A y T65S, respectivamente.

Figura 4: Tasas de intercambio de O2 de Synechocystis wild type y G404A, T65A y T65S


Rubisco mutantes. Se tomaron medidas a diversas irradiancias y Ci 2 mM (A) y a diversas
concentraciones de Ci por debajo de 400 μmol de fotones m-2 s-1 (B) en tampón HEPES
25 mM, pH 7,0, usando un electrodo de O2 de tipo Clark (Rank Brothers, REINO UNIDO).
Cada ensayo se realizó por triplicado. Las desviaciones estándar fueron < 10%.

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Figura 5: Actividad, contenido y rotación catalítica de Rubisco en Synechocystis de tipo


salvaje y mutantes. Las células, crecidas en medio BG - 11 a CO2 ambiente bajo
iluminación continua (20 μmol m-2 s-1), se centrifugaron y resuspendieron en tampón
HEPES 50 mM, pH 8,0, que contenía 285 μM de CO2, MgCl2 10 mM, 1 ditiotreitol mM y un
cóctel inhibidor de proteasa (P2714, Sigma). Las celdas se rompieron por debajo de
24000 lb pulgada-2 usando una prensa francesa. El extracto crudo se centrifugó y el
sobrenadante que contenía la enzima se activó por incubación durante 30 minutos a
30°C. El contenido de sitios catalíticos de Rubisco se determinó mediante la incubación
de 200 μl de enzima activada con 15 μM [14C] CPBP (185 Bq nmol-1). La enzima unida a
CPBP se separó del ligando libre usando una columna Sephadex - G100 de 10 cm. La
actividad de Rubisco se determinó como se describe en la tabla 1 en presencia de RuBP
1 mM y 14CO2 640 μM (1.3 Bq nmol-1) en la mezcla de reacción. Cada ensayo se realizó
por triplicado. Las desviaciones estándar fueron < 10%.

Figura 6: Micrografías electrónicas de transmisión de células Synechocystis. Los


mutantes de tipo silvestre (A) y Rubisco T65A, T65S y G404A (B - D, respectivamente).
Los carboxisomas, designados por flechas blancas, se distinguen por su composición
granulosa y forma poliédrica.

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Figura 7: Relaciones entre Km (RuBP) y Kcat de Rubisco (A) y entre la tasa de


fotosíntesis bajo irradiancia saturante y las concentraciones de Ci (Pmax) y Km (RuBP)
(B) y Kcat (C) de los derivados de Synechocystis Rubisco en el tipo silvestre y mutantes
C172A, C172A - C192A, R134A, K305E, C399A, G404A, H298A, H327Q, T65A y T65S
Rubisco. La Pmax se determinó usando un electrodo de O2 a 400 μmol m-2 s-1 y NaHCO3
2 mM y las propiedades cinéticas de Rubisco se determinaron como se describe en la
tabla 1.
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Figura 8: Relaciones entre la actividad de Rubisco por clorofila y la tasa de fotosíntesis en


las hojas de Nuphar lutea y en la cianobacteria Synechocystis PCC6803. La actividad de
Rubisco y la tasa relativa saturada de luz de la fotosíntesis bruta se determinaron durante
el día en hojas aéreas de Nuphar. La tasa relativa de fotosíntesis bruta se determinó a
una concentración de CO2 ambiente bajo 2000 μmol de fotones m-2 s-1 usando un
fluorómetro PAM. La tasa de fotosíntesis ligera y saturada en Ci de células Synechocystis
(tipo salvaje y mutante C172A, C172A - C192A, R134A, K305E, H298A, H327Q, T65A y
T65S Rubisco) se determinó usando un electrodo de O2 a 400 μmol m-2 s-1 y NaHCO3 2
mM. La actividad de Rubisco se determinó a saturar las concentraciones de RuBP y CO2.
Los valores máximos de cada parámetro para Nuphar y para Synechocystis de tipo
salvaje se definieron como 100%.

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Figura 9: Concentraciones y relaciones de concentración de los metabolitos del ciclo de


Calvin RuBP, PGA, GA3P y DHAP en Synechocystis de tipo salvaje y Rubisco mutantes
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H327Q y G404A. Las células se incubaron a 30ºC bajo la irradiación indicada en


presencia de NaHCO3 3,75 mM hasta que la tasa de fotosíntesis fue estable. Se
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succionaron rápidamente alícuotas (30 - 50 μg de clorofila ml-1) en ácido perclórico 0,35


M. Después de la neutralización del ácido con K2CO3, se determinó la concentración de
metabolitos. RuBP se convirtió a PGA y PGA, GA3P y DHAP se redujeron por reacciones
dependientes de NADH a glicerol – 3 - fosfato.

FUENTES CONSULTADAS DE ACUERDO AL FORMATO APA:

De acuerdo a la plataforma. (2018) instrucciones para realizar la actividad 2 actividad


entregable de la unidad 3

https://unadmexico.blackboard.com/bbcswebdav/internal/courses/BI-BBM2-1802-B1-
001/announcements/_254403_1/PLANEACION%20DOCENTE%20UNIDAD%203%20Biol
ogia%20Molecular.pdf

De acuerdo a la plataforma. (2018) unidad 3. Introducción a la ingeniería genética

https://unadmexico.blackboard.com/bbcswebdav/institution/DCSBA/Bloque%201/BT/06/B
BM2/U3/Unidad3.Introduccionalaingenieriagenetica_131216.pdf

De acuerdo a Yehouda Marcus, Gueta Hagit, Wolff Yael y Gurevitz Michael. (2011) rubisco
mutagenesis provides new insight into limitations on photosynthesis and growth in
synechocystis PCC6803

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3153676/

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