Está en la página 1de 38

2.

Metodología de laboratorio

2.1. Bioóptica

2.1.1. Caracterización bio-óptica del sistema acuático

El campo lumínico se caracteriza por los valores de coeficiente de atenuación de PAR


de la radiación descendente (Kd):

Kd = (Ln(Io) - Ln(Iz)) / z (unidades: m-1)

donde Io es la radiación justo debajo de la superficie del agua e Iz la radiación a la


profundidad z (en metros). Esta ecuación proviene del modelo exponencial de la ley de
Lambert-Beer que predice la radiación que alcanza una profundidad z:

Iz = Io e-Kz (unidades: mol m-2 s-1)

El modelo describe la extinción cuantitativa de la radiación a través de una masa de


agua, pero el proceso tiene también un carácter cualitativo ya que Kd es función de la
longitud de onda. En aguas puras el valor de Kd es mínimo para longitudes de onda de
alrededor de 450 nm (que corresponden al color azul) y máximo para las longitudes de
onda más larga (correspondiente al rojo). La atenuación total es la suma de la
atenuación parcial de cada uno de los componentes de los que depende la atenuación de
la luz en la columna de agua (atenuación del agua, atenuación del material particulado y
la atenuación del material disuelto).

Kd (PAR) = KW + KPH + KG + KTR (unidades: m-1)

donde KW es el coeficiente de atenuación del agua, KPH el coeficiente de atenuación del


material particulado orgánico donde se incluye lo correspondiente al fitoplancton, KG el
coeficiente de atenuación de las sustancias gilvínicas o sustancias amarillas o material
disuelto, KTR el coeficiente de atenuación del material particulado no vivo, lo que se
denomina tripton (Kirk, 1983).
La profundidad a la que llega el 10%, 1% y 0.1% de la radiación incidente se calcula a
partir de la siguiente ecuación:

D10% = Ln(0.1) / Kd (unidades: m)

D1% = Ln(0.01) / Kd (unidades: m)

D0.1% = Ln(0.001) / Kd (unidades: m)

El cálculo del coeficiente de transmisión de la columna de agua se determina a partir de


la siguiente ecuación:

T = (Iz / Io) * 100 (%)

siendo Iz la radiación a la profundidad z (en metros) e Io la radiación a profundidad 0


(justo debajo de la superficie del agua). Se expresa en valores de porcentaje (0-100).
Por otro lado, el cálculo del coeficiente de atenuación del haz de luz, c, (que es un buen
estimador de la concentración de material particulado) se hace a partir de los valores de
transmisión expresados en porcentaje (0-1) y divididos por 0.25 (longitud en metros que
tiene el haz de luz que va desde el emisor hasta el receptor del transmisómetro, equipo
descrito con detalle en la página).

c = ((%T / 100) / 0.25) (unidades: m-1)

Los valores de c se introducen en una tabla donde se corresponden con valores


estimados de concentración de material particulado en unidades de g L-1.

2.1.1.1. Clasificación de Jerlov

Según la clasificación de Jerlov todas las aguas de todos los mares y océanos de la
Tierra se pueden clasificar en dos tipos inicialmente, aguas costeras y aguas oceánicas,
donde el parámetro que las diferencia es el valor del coeficiente de atenuación vertical
de la luz (Kd). Así, las aguas costeras constituyen, a su vez, 9 tipos (costeras tipo 1 al 9)
y las aguas oceánicas cinco (I, IA, IB, II, III) siendo las aguas más transparentes las que
presentan valores más bajos y las más turbias los valores más altos. Para calcular el tipo
de agua se usan varias fórmulas atendiendo a la atenuación de la radiación a 400 nm.

Aguas tipo costeras:

y = 9.963 log ( 400 nm) + 5.133

Aguas tipo oceánicas: (según modificación de Piazena y Häder, 1997)

y = 9.4359 log( 400 nm) + 15.547 para 0.046 m-1

y = 3.4454 log( 400 nm) + 7.6455 para 0.046 m-1

donde = Ln T/ z siendo T = Iz/ Io y z la profundidad en metros.

2.1.1.2. Coeficiente de absorción específico de la clorofila

El objetivo de este análisis es conocer qué capacidad de absorción de luz tiene una
muestra vegetal (fitoplancton o talo de macroalga) e investigar su aclimatación a
diferentes niveles de radiación. Además, el coeficiente de absorción específico de la
clorofila puede ser empleado para la estimación de la producción primaria por modelos
bio-ópticos. En el caso de muestras fitoplanctónicas se toman muestras de 1.5 L a
diferentes profundidades. Este agua se filtra por un equipo de filtración Millipore con
filtros Whatman GF/F de 0.22 m de tamaño de poro y de 25 mm de diámetro. El filtro
es entonces analizado con un espectrofotómetro determinando el espectro de absorción
in vivo del material particulado. Para esto, se pone el filtro en el camino del haz de luz y
se mide directamente junto con el blanco. El blanco se hace con un filtro impregnado en
agua de mar filtrada. Una vez medida cada muestra, se incuba cada filtro en 2.5 mL de
N, N dimetilformamida (DMF) en tubos de ensayo Pyrex en oscuridad y a 4 ºC durante
24 h. Una vez transcurrido este tiempo, se pasan de nuevo por el espectrofotómetro pero
usando, esta vez como blanco, un filtro impregnado en DMF. Con esto, se extraen todos
los pigmentos liposolubles con lo cual, en el filtro queda el detritus o toda aquella
porción del material particulado que no corresponde a pigmentos. La diferencia entre las
dos lecturas (in vivo (ODp( )) y el detritus (ODd( ))) será la densidad óptica de los
pigmentos fitoplanctónicos (ODph( )) recogidos en el filtro (Kishino et al., 1985):

ODph( ) = ODp( ) - ODd( )

El factor de amplificación debido a la concentración de la muestra de agua de mar


natural en suspensión sobre un filtro es corregido usando el algoritmo obtenido
empíricamente por Arbones et al. (1996):

ODphs( ) = 0.38 * ODph( ) + 0.42 ODph( )2

El coeficiente de absorción especifico de la clorofila será calculado como sigue:

a*ph ( ) = 2.3 * ODphs ( ) / X Cl a (unidades: m2 mg-1 Cl a)

donde X (en metros) es la relación entre el volumen del agua de mar filtrada y el área
filtrada sobre el filtro (volumen/área), 2.3 es un factor de conversión de logaritmo
decimal a logaritmo natural, y Cl a es la concentración de la clorofila a en unidades de
mg Cl a m-3.

2.1.1.3. Pigmentos fotosintéticos

La determinación del contenido en clorofilas se evalúa según la metodología de Inskeep


y Bloom (1985). La extracción de la clorofila se realiza con DMF. Una vez filtradas las
muestras, los filtros se incuban en 2.5 mL de DMF durante 24 h a 4 ºC y en oscuridad.
Una vez transcurrido este tiempo se mide densidad óptica a diferentes longitudes de
onda y se usan las siguientes fórmulas:
Cl a = 12.70 * (A664.5 nm – A750 nm) - 2.79 * (A647 nm – A750 nm) (unidades: mg L-1)

Cl b = 20.70 * (A647 nm – A750 nm) - 4.62 * (A664.5nm – A750 nm) (unidades: mg L-1)

donde A es la absorbancia del extracto a nm. La turbidez de las muestras se


determina a 750 nm. Las unidades en las que se expresa la concentración de clorofila
son en mg L-1. Si se divide esta concentración por el peso fresco de la muestra y a su
vez se multiplica por el volumen de extracción (en nuestro caso 2.5 mL) el contenido en
clorofilas queda expresado como mg clorofila g-1 peso fresco.
Si se multiplica por la proporción peso fresco/peso seco quedará expresado como mg
clorofila g-1 peso seco.

2.1.2. Equipos de medida de radiación

2.1.2.1. Radiación terrestre, acuática y artificial

La instrumentación utilizada para medir la radiación tanto solar como artificial fue la
siguiente:

Li-1000 (Data logger) (Fig. 1) es un radiómetro al que se le pueden conectar varios


sensores:
- sensor cuántico subacuático Li-192 (Licor, USA) con sensor plano (2 )
- sensor cuántico esférico acuático Zemoko (Holland), con un diámetro de 2 cm.
- sensor cuántico esférico subacuático Li-193 SB.
Todos miden sólo radiación fotosintéticamente activa desde 400 hasta 700 nm. La
irradiancia se expresa en unidades fotónicas ( moles fotones m-2 s-1).
Sensor cuántico
Zemoko

LI-1000

DataLogger
Sensor cuántico subacuático
Li 193 SB esférico

Li 192 Sensor
cuántico subacuático

Fig. 1. Esquema del radiómetro LI-1000 con los sensores empleados.

Radiómetro cuántico LI-189 (Licor, USA) al cual va unido el sensor cuántico


plano (2 ) Li-190 SA para medidas terrestres (Fig. 2). Sólo mide radiación
fotosintéticamente activa desde 400 hasta 700 nm. La irradiancia se expresa en unidades
fotónicas ( moles fotones m-2 s-1).

Li 190 SA
Sensor cuántico

LI-COR
Radiómetro cuántico

Modelo LI-189

Fig. 2. Esquema del radiómetro LI-189 unido al sensor plano Li-190 SA.
Sensores Gröbel, radiómetros terrestres con sensores planos (2 ) que miden radiación
tanto en la banda del UVB (280-320 nm) como en la banda de la UVA (320-400 nm).
La irradiancia se expresa en unidades energéticas (W m-2). Debido a que los sensores no
emplean la banda de UVA y UVB definida por el sistema internacional de medida (CIE)
los valores de irradiancia eran corregidos con algoritmos obtenidos a partir de la
intercalibración con el radiómetro ELDONET (radiómetro descrito más adelante).

UVB (ELDONET) = UVB (Gröbel) * 0.16

UVA (ELDONET) = UVA (Gröbel) * 2.00

PAR (ELDONET) = PAR (Li-1000) * 1.11

LI-1800 UW (Li-Cor Radiation Sensors Inc., Lincoln, EE.UU.) es un


espectrorradiómetro tanto acuático como terrestre (Fig. 3) provisto de un sensor plano
(2 ) que mide la distribución espectral de la radiación dispersándola mediante un
monocromador provisto de una rejilla de difracción. Cuenta con un detector de silicio
determinándose la irradiancia desde 300 hasta 850 nm con una precisión de ± 1.5 nm y
una dispersión lineal de 8 nm mm-1. El espectrorradiómetro va unido a un cable de 100
m de longitud que se conecta a un ordenador portátil con el que se controlan las
medidas. Con este equipo se pueden determinar los espectros de emisión de las
lámparas usadas en los experimentos bajo radiación artificial así como la radiación solar
instantánea. De esta forma se puede calcular la radiación biológica efectiva usando
diferentes espectros de acción que provocan daño en el material biológico (esto se
explica con más detalle en un apartado posterior). También permite calcular el
coeficiente de atenuación vertical de la luz espectral. Las unidades pueden ser tanto en
W m-2 como en moles m-2 s-1. La calibración del espectrorradiómetro se realiza
semestralmente.
Fig. 3. Esquema del espectrorradiómetro Li-1800 UW. Va conectado mediante un
cable a un ordenador o terminal desde el que se maneja el aparato. Su rango de medida
va desde 300 hasta 850 nm aunque su óptimo está a 450 nm.

Radiómetro acuático de Biospherical Instrument, Inc, (San Diego,

California) modelo PUV500 para calcular el coeficiente de atenuación vertical de la


luz en la columna de agua y radiómetro terrestre, modelo PUV510 para medir la
radiación instantánea e integrada a lo largo del día en aire (Fig.4). Ambos equipos
determinan la radiación descendente en cuatro bandas diferentes: 305±1 nm (ancho de
filtro de 7±1 nm), 320±2 nm (ancho de filtro de 11±1nm), 340±2 nm (ancho de filtro de
10±1 nm) y 380±2 nm (ancho de filtro de 10±1 nm) y radiación PAR por un sensor de
banda ancha desde 400 hasta 700 nm. Sus unidades de medida son W cm-2 para la
banda del UV y nmoles cm-2 s-1. El radiómetro PUV500 está equipado con un sensor de
presión que determina la profundidad y un sensor de temperatura.
El sistema tiene acoplado un transmisómetro SeaTech (longitud del haz de luz de 25
cm) empleado para determinar el porcentaje de transmisión del agua a cada
profundidad. El transmisómetro está provisto de una fuente de luz roja LED FFE-3100
con un máximo de longitud de onda a 660 nm y un ancho de línea espectral de 40 nm
mediante la cual se puede calcular el coeficiente de atenuación de la luz expresado en
m-1 que es un buen estimador de la concentración de material particulado (c). Tanto el
radiómetro PUV500 como el transmisómetro van unidos por un cable de conexión y
fijados a una estructura metálica con la que se sumergen. El radiómetro va conectado
mediante un cable de 100 m de longitud a un pequeño ordenador portátil desde donde se
controlan las medidas. La calibración del equipo se realiza cada dos años por la
compañía Biospherical (San Diego, California, EE.UU.).
Fig. 4. radiómetros PUV500 y PUV510 utilizados para las medidas de radiación tanto
en agua como en aire.

Otra utilidad que presenta el radiómetro acuático es la de estimar la producción primaria


instantánea y la concentración de clorofila a partir de la fluorescencia natural. Usando
modelos bio-ópticos ya descritos (Kiefer et al., 1989) y utilizando valores constantes de
rendimiento y coeficiente de absorción específico de la clorofila se consiguen valores de
producción en la columna de agua. La producción instantánea es subestimada por estos
modelos.
Los valores de radiación UV (305, 320, 340 y 380 nm) medidos con el radiómetro
PUV500-510 pueden ser utilizados para calcular los valores de radiación UVB y UVA
totales mediante las fórmulas obtenidas por Orce y Helbling (1997) obtenidas utilizando
el mismo radiómetro (PUV500-510).

UVB = 59.5 * E305 nm + 4.1 * E320 nm (unidades: W m-2)

UVA = 87.4 * E340 nm – 2.4 * E380 nm (unidades: W m-2)


ELDONET (Real Time Computer, Alemania) es un radiómetro terrestre y acuático
(Fig. 5) que mide en tres canales siguiendo el rango internacional de la C.I.E. (Comisión
Internacional de Iluminación): UVB (280-315 nm) UVA (315-400 nm) y PAR (400-700
nm). Este instrumento usa una esfera integradora (Ulbricht) de 10 cm para recoger tanto
radiación directa como indirecta. Está instalado en el tejado del edificio de los Servicios
Centrales de Investigación de la Universidad de Málaga.

Fig. 5. Equipo de medida de radiación ELDONET. Este radiómetro va conectado a un


ordenador donde se almacenan todos los datos. Además, posee un sensor de temperatura
y el modelo acuático tiene también un sensor de presión.

Sus unidades de medida son W m-2. Está conectado a un ordenador que registra todas
las medidas realizadas cada minuto y los datos se envían directamente al servidor
central de la Red Europea de medida de radiación de UV ELDONET en la que está
integrado (pagina Web: www.ib.pi.cnr.it/eldonet/).
Nuestro grupo de trabajo forma parte de la red europea de medida de radiación UV y
PAR, ELDONET, dentro de un proyecto financiado por la Unión Europea (CT96 UE
ENV4 0191). Además, estos instrumentos se están instalando en diversos puntos de
Andalucía constituyendo la red de medida de radiación solar UV y fotoprotección en
Andalucía (UVIFAN, financiado por los fondos FEDER (1FD 97-0824).
Igualmente, nuestro grupo de trabajo realiza aproximadamente cada mes
intercomparaciones de estos equipos, con lo que se dispone de factores de corrección
entre cada uno de ellos. Así, cualquier medida con uno de estos equipos puede ser
transformada a valores calculados con otro equipo.
La nomenclatura utilizada para las medidas de radiación es la que aparece publicada en
el libro " Underwater light and algal photobiology" (Björn et al. 1996). La radiación
fotosintéticamente activa es expresada en el sistema fotónico, es decir, en unidades
cuánticas (µmol fotones m-2 s-1) y la radiación ultravioleta en el sistema de energía, por
tanto, en unidades no cuánticas (W m-2). La dosis es expresada o bien en mol m-2 o bien
en kJ m-2.

2.1.3. Factor de conversión de unidades de energía y unidades cuánticas

La energía (E) asociada a un fotón de longitud  se calcula a partir de la ecuación:

E = hc / (1)

donde h es la constante de Planck (6.6*10-34 W s2 ), c la velocidad de la luz (3*1017 nm


s-1) y la longitud de onda en nm.
Si se parte de que E es igual a un mol de fotones que, a su vez, equivalen a un número
de Avogadro de fotones y se sustituyen todos los valores en la ecuación (1) se llega a la
expresión final:

1 µmol fotones m-2 s-1 =119.7 / (W m-2)

Para la radiación PAR el factor usado es 1 µmol fotones m-2 s-1 = 0.217 W m-2 o lo que
es lo mismo 1 W m-2 = 4.60 µmol fotones m-2 s-1. La longitud de onda usada es 550 nm
que es el valor medio de la banda de PAR.

2.1.4. Uso de espectros de acción. Dosis biológica efectiva

Un efecto biológico o químico puede ser expresado en función de la exposición a la


energía radiante bajo condiciones de diferentes irradiancias espectrales. Estos efectos
son fuertemente dependientes de la longitud de onda de la radiación. El expresar tales
efectos en función de la radiación significa aplicar una función de corrección (Cullen y
Neale, 1997). Se han creado los llamados espectros de acción para varias respuestas
biológicas determinadas. Un espectro de acción no es más que una función que refleja el
efecto de una determinada longitud de onda sobre una variable biológica, por ejemplo,
la formación de dímeros de pirimidina en moléculas de ADN. Las funciones ponderadas
espectrales (BWF, Biological weighting functions) deben ser aplicadas para relacionar
estos efectos con la exposición a radiación UV (Rundel, 1983). Estas funciones
ponderadas se multiplican por la radiación espectral de cada fuente de luz y se obtiene
la radiación (principalmente la radiación UV) biológicamente efectiva. Estas
operaciones son útiles para predecir el daño biológico provocado por cualquier fuente
de radiación ya sea artificial o natural. De esta manera, se puede hallar la dosis
biológicamente efectiva que cabría esperar ante una reducción de la capa de ozono. Otra
ventaja que tiene el utilizar dosis biológicas efectivas en vez de dosis no efectivas, o
absolutas, es que, de esta forma pueden estandarizarse todas las medidas de radiación,
ya provengan de una lámpara u otra fuente de radiación, o se mida en diferentes zonas
geográficas.
Los espectros de acción más utilizados son:

- Daño de la radiación en el material genético (ADN), sobre todo en la banda del UVB.
Este espectro de acción se realizó sobre ADN de Escherichia coli (Setlow, 1974) (Fig.
6).
- Daño generalizado en plantas (sobre crecimiento y fotosíntesis) (Caldwell, 1971) (Fig.
6).
Fig. 6. Espectro de acción de daño en ADN (Setlow, 1974) y daño generalizado en
plantas (Caldwell, 1971).

Fig. 7. Espectro de acción de fotoinhibición de la evolución de oxígeno de cloroplastos


aislados de espinaca (Jones y Kok, 1966) que ha sido utilizado para calcular la dosis
biológica efectiva producida por la radiación.

- Fotoinhibición de la evolución de oxígeno de cloroplastos aislados de espinaca (Jones


y Kok, 1966) (Fig. 7).
- Inhibición de la fotosíntesis en fitoplancton por radiación UV (Phaeodactylum,
Gymnodinium y Prorocentrum) (Cullen et al, 1992) (Fig. 8).

Todos los espectros de acción están normalizados a 1 en el valor de 300 nm.


Fig.8. Espectros de acción de inhibición de la fotosíntesis en fitoplancton por radiación
UV (Phaeodactylum, Gymnodinium y Prorocentrum) (Cullen et al, 1992).

El espectro de inhibición de la fotosíntesis en fitoplancton por radiación UV (Cullen et


al., 1992) es, en realidad, un espectro biológico efectivo que se realiza con luz
policromática y filtros que cortan de manera selectiva determinadas longitudes de onda.
Así, a pesar de que se nombrará como espectro de acción, igual que los otros, hay que
hacer esta puntualización.
Fig. . Espectro de emisión de la lámpara halógena del proyector de diapositivas
utilizado como fuente de radiación para la medida de producción de oxígeno.
Fig. . Espectro de emisión de la lámpara LED usada como luz de incubación por el
fluorímetro PAM-2000.

2.1.5. Uso de filtros

Se utilizaron filtros de acetato de celulosa que cortan la radiación a diferentes longitudes


de onda. Así, el filtro Ultraphan 295 (Digefra GmbH, Munich, Alemania) corta toda la
radiación por debajo de 295 nm, el filtro Folex 320 (Folex GmbH, Dreieich, Alemania)
corta toda la radiación por debajo de 320 nm y el filtro Ultraphan 395 (Digefra GmbH,
Munich, Alemania) corta toda la radiación por debajo de 395 nm. Igualmente, todos los
filtros absorben un 10% de radiación. Estos filtros fueron utilizados en experimentos a
exposiciones que excluyen parte de la radiación. Para los tratamientos de radiación
UVB+UVA+PAR (PAB) se emplearon los filtros de 295, para tratamientos de radiación
UVA +PAR (PA) los filtros de 320 y para los tratamientos de radiación PAR (P) los
filtros 395.
100

80

60

40

20 295
320
395
0
300 400 500 600 700 800

Longitud de onda (nm)

Fig. . Porcentaje de transmisión de los filtros. El filtro 295 corta la radiación por encima
de 295 nm, dejando pasar una mínima parte de UVB, toda la UVA y toda la PAR
(tratamientos PAB), el filtro 320, corta por encima de 320 nm dejando pasar toda la
UVA y toda la PAR (tratamientos PA) y el filtro 395 deja pasar sólo aquella radiación
por encima de 395 nm, es decir, solamente radiación PAR (tratamientos P).

Además, en todos los experimentos donde se usaron lámparas con emisión en UVC
(Philips TL-12) se emplearon filtros 295 para cortar la radiación por debajo de esta
longitud de onda.
Los filtros se sumergen en el agua para evitar que gotas de agua puedan producir un
“efecto lupa” alterando de esta forma la homogeneidad del campo lumínico.
Superficie del agua

Ultraphan (395 nm)


Folex (320 nm) P
Ultraphan (295 nm)
Caja de PA 40 cm
PAB 40 cm
PVC

45 cm

Barras de acero
inoxidable

Fig. . Ilustración esquemática que muestra la disposición de los filtros utilizados para
los experimentos de campo (Tomada de Gómez et al., 1998)

2.1.6. Fuentes artificiales de luz. Lámparas

Lámparas fluorescentes Truelite de 40 W cuyo espectro de emisión se acerca mucho


más al espectro solar que otras lámparas (Fig. ). Tiene una temperatura de color de 5500
K (luz natural= 5500 K) y un índice de rendimiento de color (CRI) del 91% (Luz
natural= 100%).
Lámparas fluorescentes QP-340 de 40 W que tienen un espectro de emisión enriquecido
en el UV con un máximo a 340 nm, y QP-351 con un máximo a 351 nm (Q-Panel,
USA) (Fig. ).
Lámparas fluorescentes Philips TL12 de 40 W con espectro de emisión en la región del
UVB (Fig. 51a). Esta lámpara tiene parte de emisión en la región de la radiación UVC.
Dicha emisión en UVC se elimina con el uso de los filtros 295.
Estas lámparas han sido incluidas en todos los experimentos llevados a cabo por el
grupo europeo de UV pertenecientes al proyecto “Effects of ultraviolet radiation on
marine macroalgae and seagrasses (UV/marine macrophytes)” (CT96UE ENV4-0188)
ya que, la comparación de estas lámparas con el espectro solar presenta una mayor
similitud en cuanto a proporciones espectrales que otras lámparas más convencionales
(Fig. y).
Lámpara Optimarc (Duro-Test), que tiene una potencia de 250 W con la que se
realizaron experimentos de alta radiación PAR (Fig.). Su espectro de emisión es más
parecido al solar que el de otras lámparas.

Fig.. Comparación de la lámpara Truelite con el espectro solar según proporciones


espectrales.
Fig.. Comparación de las lámparas fluorescentes “Daylight” (OSRAM) convencionales
con el espectro solar según proporciones espectrales
Fig.. Espectro de emisión de las lámparas Truelite utilizadas para experimentos bajo
radiación artificial comparadas al espectro de la radiación solar.

a
b

Fig. . Espectro de emisión de las lámparas QP-340 (a) y QP-351 (b) usadas en los
experimentos bajo radiación artificial UV comparadas con el espectro solar.

b
1.2
Philips TL12
1
Unidades relativas

0.8

0.6

0.4

0.2 a
0
300 400 500 600 700 800

Longitud de onda (nm)

Fig. Espectro de emisión de las lámparas PhilipsTL12 (a) y Optimarc (b) utilizadas en
experimentos bajo radiación artificial comparadas con el espectro solar. Estas lámparas
se usan para conseguir altos valores de radiación UVB y PAR. respectivamente.

2.1.7. Uso de dosímetros

Los dosímetros estiman la dosis mínima eritemática (DME) provocada por la radiación
solar o cualquier otra fuente de luz. El eritema es una lesión leve en la piel
(enrojecimiento) que aparece tras una prolongada exposición solar. Los dosímetros
consisten en una película biológica que contiene esporas de una cepa silvestre y una
cepa mutante de la bacteria Bacillus subtilis inmovilizadas en láminas transparentes de
poliéster. Los mutantes son incapaces de reparar el daño en el material genético debido
a la radiación UV. Su análisis da idea de la DME (Fig. ). El espectro de acción utilizado
en los dosímetros viene representado en la figura. Es interesante para determinar el daño
potencial de la radiación incidente y capacidad de fotoprotección frente a la radiación
UV de diversas sustancias naturales que absorben UV
Después de la irradiación se envían a la empresa Biosense (Alemania) que realiza el
ensayo biológico. Las esporas son incubadas en un medio de cultivo, las proteínas
sintetizadas después de varias divisiones celulares son teñidas y determinadas por
fotometría dando una medida de actividad biológica. La dosis efectiva biológica se
calcula a partir de una curva de calibración. La respuesta es independiente de la
temperatura en el rango de –20 ºC a 70 ºC, se pueden conservar alrededor de un año a
humedad relativa < 70% sin influencia en la viabilidad de las esporas.
La curva de sensibilidad de la película de esporas presenta una alta similitud con el
espectro de acción de eritema inducido por UV en piel de humanos (Quintern et
al.,1992).

Radiación UV
Piel
Viospor ®

Sistema filtro
Capas más óptico
Membranas externas de la
Envoltura de
celulares piel
la espora
Proteínas Lípidos
Citosol Proteínas
ADN ADN

Respuesta
Eritema, ... Daño en ADN película

Fig. . Esquema donde se representa el daño provocado por la radiación UV tanto en la


piel humana como en el dosímetro. Lo que se produce es un daño en el ADN
provocando eritema solar que es estimado por el daño producido en la película de
esporas que hay en el dosímetro.
Fig.. Espectros de acción utilizados por los dosímetros Viospor para calcular la dosis
mínima eritemática provocada por la radiación solar incidente.

Se utilizaron dos tipos de dosímetros los cuales se diferencian en el número de DME


(Dosis mínima eritemática) que son capaces de recibir. Así, los dosímetros tipo I pueden
exponerse entre 0.1 y 9 DME y los dosímetros tipo II entre 0.25 y 21 DME. 1 DME
equivale a una exposición radiante efectiva eritemática de 250 J m-2 (dosis efectiva entre
280-400 nm).
Una vez expuestos a la radiación necesaria para provocar daño se conservaban en
oscuridad antes del envío para su análisis.

2.1.9. Absorción y dispersión de la luz in vivo

2.1.9.1. Introducción

La luz incidente al llegar a un material pigmentado sigue varios caminos, parte es


absorbida por el material, otra parte es transmitida y otra parte es dispersada (reflejada
y refractada). El espectro de la luz transmitida y reflejada presenta unas características
diferentes al de la luz incidente que vienen determinadas por la absorción y dispersión
de partes específicas del espectro dependiendo de la composición pigmentaria,
morfología y tamaño celular y estructuras físicas externas (cristales, pelos, etc.).
Cuando estas partículas están disueltas en un medio acuoso (por ejemplo, agua de mar)
contribuyen en gran medida a alterar el coeficiente de absorción y dispersión de ese
medio.
Las propiedades ópticas del agua de mar difieren de las del agua pura por la presencia
en cantidades variables de diversos materiales disueltos y particulados como:
fitoplancton vivo, material detrítico particulado derivado de los organismos
planctónicos (tripton), material particulado de origen terrestre y sustancias disueltas de
origen terrígeno (sustancias gilvínicas). Estudiar la influencia de este material en las
propiedades ópticas del agua implica conocer las llamadas propiedades ópticas
inherentes como son el coeficiente de absorción (a) y el de dispersión (b) de la luz (la
suma de ambos dará el coeficiente de atenuación (c).

c = a + b (m-1)

Estas propiedades inherentes son independientes del ángulo y pueden ser determinadas
a través de propiedades aparentes que sí son dependientes del ángulo de incidencia de
la luz. Una de estas propiedades aparentes de un medio acuoso es el coeficiente de
atenuación vertical (Kd) que viene definido por la expresión:
Kd = Ln Io - Ln Iz / z

siendo Io la irradiancia incidente y Iz la irradiancia a una distancia Z, la dimensión es así


de L-1 (m-1). Esta expresión se obtiene al despejar K de la función exponencial de la
atenuación vertical de la luz,

Iz=Io e(-Kd*Z)

Kd se relaciona con a y b a través de la expresión siguiente (Kirk, 1983):

Kd = a + b / cos ,

siendo  el llamado ángulo Zenith, estos es 90º-I (ángulo de la luz incidente respecto a
la una superficie normal).
La atenuación vertical (KT) total sería la suma de la atenuación vertical de la radiación
descendente (Kd) como se definió antes y de la atenuación vertical de la radiación
ascendente (Ku) es decir la luz que se refleja o dispersa hacia la superficie

KT = Kd + Ku

La radiación dominante es la descendente pero en ciertos tipos de aguas con una gran
concentración de partículas el componente ascendente adquiere una importancia
relativa mayor.

2.1.9.2. Coeficiente de absorción y coeficiente de absorción específico

El coeficiente espectral de absorción in vivo a() y el coeficiente espectral de


absorción específico a*() son parámetros claves en fotofisiología pues nos informan
de la capacidad de absorción de luz y por lo tanto de la capacidad fotosintética y de
fotoaclimatación a variaciones lumínicas.
Estos coeficientes serán determinados in vivo en partículas fitoplantónicas y en
macroalgas y en estas partículas al extraer el material pigmentado; esto permite
determinar la contribución de estructuras no fotosintéticas al espectro de absorción in
vivo total.

2.1.9.2.1. Fitoplancton

Determinar el coeficiente de absorción de una suspensión fitoplactónica directamente


en el medio acuoso es muy complejo debido a la enorme dispersión de la luz que se
produce lo que requiere equipos especiales para medir la cantidad de luz dispersa. Sin
embargo la densidad óptica o Absorbancia (DO) de una suspensión celular (DOsusp) se
puede determinar a partir de la DO de esas partículas retenidas en filtros de fibra de
vidrio (DOfiltro). Estos filtros actúan de placa difusora limitando la dispersión de la luz
fuera de la ventana del detector del espectrofotómetro.

MÉTODOS:

Filtrar a través de un filtro GF/F (0.7 µm de tamaño de poro) una solución del alga
verde Dunaliella salina, tomar el filtro y colocarlo entre dos portaobjetos. A
continuación de coloca lo más cerca posible del detector de un espectrofotómetro
(Beckman DU-7) y se determina DO del filtro entre 400-750 nm (barrido espectral). Se
utiliza como blanco un filtro humedecido con el medio de cultivo sin algas.

Se opera de la manera siguiente:

DOsusp= Log10 Io / It (adimensional)

siendo DOsusp, la densidad óptica de la suspensión celular (adimensional), Io irradiancia


de la luz incidente e It irradiancia de la luz transmitida.
El coeficiente de absorción es el cociente entre la densidad óptica y la distancia del
recorrido de la luz a través de la partícula. Tiene dimensión de L-1 (m-1).
El coeficiente de absorción por longitud de onda de la partícula fitoplanctónica, ap( ),
se puede calcular de dos maneras:

(a) Bricaud & Starmski (1990)

ap( )= 2.3 [DOfiltro( ) - DOfiltro(750 nm)] / (V/A)

Dimensión: L-1 (m-1)

2.3, conversión de log base 10 a log base e (ln)


V = volumen de agua filtrada (m3)
A = arrea del filtro ocupada por células fitoplantónicas (m2)
DO = densidad óptica del filtro
= factor de amplificación del recorrido de la luz. Al colocar el filtro de fibra de vidrio
con las células muy cerca del detector del espectrofotómetro se debe aplicar un factor
de corrección por el incremento en el recorrido efectivo de la luz causado por la
dispersión de la luz dentro del filtro de fibra de vidrio. Este factor aplicado es , es la
proporción entre la longitud de recorrido óptico y la geométrica. Es un factor que
corrige la diferencia óptica entre la absorción de luz en la suspensión celular (en una
cubeta espectrofotométrica) y en la suspensión filtrada y retenida en un filtro. Este
parámetro varía significativamente para valores de DOfiltro bajos(< 0.2). En muestras
con DO entre 0.2 y 2, al menos dentro de las bandas de máxima absorción (Chl a =680
nm y Chl b=647 nm), el valor de se mantiene alrededor de 2.0 (Bricaud & Stramski,
1990). b es así función de la DO del filtro y es dependiente de la longitud de onda ( )
de acuerdo a la expresión = 1.63 * DOfiltro( ) - 0.22.

(b) Mitchell (1990) y Cleveland & Weidemann (1993)


En vez de analizar ) en función de la DOfiltro( ), se analiza la DOsus( ) como función
de la DOfiltro( ) (Mitchell, 1990).

DOsusp( ) = 0.378 [DOfiltro( ) + 0.523 [DOfiltro( )2]


sólo es válido para DOfiltro(680 nm) entre 0 y 0.4

Una vez calculado DOsusp se calcula el coeficiente de absorción de las partículas

ap( ) = 2.3 [ODsusp( )-ODsusp(750)] / (V/A) Dimensión: L-1 (m-1)

El coeficiente de absorción específico por longitud de onda de partículas


fitoplanctónicas ap*( ) se calcula de acuerdo a la expresión

ap*( ) = ap( )/[Chl a] (m-1/mg m-3 = m2/mg) Dimensiones: L2/P

Se calcula la concentración de clorofila de acuerdo a Inskeep & Bloom (1985).


Se introduce el filtro en 2 mL de N,N Dimetilformamida (DMF), se mantiene a en
oscuridad a 4 oC de 3-6h, se toma una alícuota y se determina la absorbancia a 664.5,
647 y 750 nm en cubetas de 1 cm de recorrido. Si el extracto está turbio (Absorbancia a
750 nm mayor de 0.02) se debe realizar previamente una centrifugación (10.000 rpm)
durante 15 min. y se toma el sobrenadante.

Ecuaciones dictromáticas: determinación de la concentración de Chl, mg/L

Chl a = 12.70 (A664.5-A750) - 2.79 (A647-A750)

Chl b = 20.70 (A647 - A750) - 4.62 (A664.5- A750)

Chl total = 17.90 (A647 - A750) + 8.8 (A664.5 - A750)

2.1.9.2.2. Macroalgas

Se utilizará un alga roja Porphyra sp. (con Chl a y Biliproteínas) y un alga verde Ulva
rigida con Chl a y Chl b. Son algas planas, Porphyra presenta una sola capa de células
mientras Ulva tiene dos capas. Se seguirá el método descrito por Mercado et al. (1996).
MÉTODO

Colocar un trozo de talo de alga humedecida en agua de mar entre dos portaobjetos y
colocar un cristal de ópalo que actúa de placa difusora entre los portaobjetos y el
detector del espectrofotómetro con la parte blanca opaca en dirección al haz de luz del
aparato. Se realiza un barrido espectral entre 400-750 nm y se opera de la siguiente
manera,

am( ) = DOm( )/grosor, Dimensión: L-1

siendo am() el coeficiente espectral de la macroalga, DOm() la densidad óptica o


Absorbancia de la macroalga . En el denominador se incluye el grosor o anchura del
talo. Se expresará am en los máximos de absorción in vivo de cada pigmento: Chl a
(680 nm), Chl b (647 nm), Ficoeritrina (566 nm) y Ficocianina (624 nm).

2.1.9.2.3. Coeficiente de absor

ción de particulas no pigmentadas

Para conocer la contribución a la absorción de luz total de las estructuras no


pigmentadas (asemejable a partículas detríticas o tripton). Se extrae la clorofila de los
filtros en los que está retenida Dunaliella o de los talos de Porphyra y Ulva
manteniendo la estructura de la partícula intacta. Para ello se introduce el filtro o las
macroalgas en un solvente orgánico N, N Dimetilformamida (DMF), 2 mL durante una
noche a temperatura ambiente. Se realizan las medidas de DO como se indicó
anteriormente, denominando el coeficiente de absorción tras la extracción como ae().
Este coeficiente es una estimación de la absorción de luz por parte de estructuras no
fotosintéticas. En general se toma el coeficiente a 440 nm (Kirk, 1983).
Se calcula también la contribución de los pigmentos extraídos por DMF a la absorción
total (ap o am) expresándolo como porcentaje (% pigmentos extraídos por DMF).

2.1.9.3. Absortancia y reflectancia


2.1.9.3.1. Cáculo a partir de la densidad óptica

DOsusp es igual también a lo siguiente DOsusp = log10 (1-A) ó A = 1-10-OD siendo A la


absortancia o fracción de luz absorbida (Ia) de la luz incidente (Io) (A = Ia/Io).

2.1.9.3.1.1. Dunaliella y Ulva:

Para calcular la absortancia debido a Chl a y Chl b se opera de la manera siguiente:

- de Chl a

Achl a = 1 - 10-DOchla

siendo
DOchl a = DO680 - DO750

-de Chl b

Achl b = 1 - 10-DOchl b

siendo
DOchl b = DO647 - DO750

2.1.9.3.1.2. Porphyra

- Chl a:

Achl a = 1 - 10-DOchl a

siendo
DOchl a = DO680 - DO750
- Ficoeritrina (PE):

APE = 1 - 10-DOPE

siendo
DOPE = DO566 - DO750

- Ficocianina (PC)

APC = 1-10-DOPC
siendo
DOPC = DO624 - DO750

2.1.9.3.2. Esfera de integración

Se puede medir la absortancia de los filtros fitoplanctónicos empleando un esfera de


integración conectada a un espectroradiómetro (Licor 1800-UW) en vez de emplear un
espectrofotómetro (ver apéndice 1).
De acuerdo a lo indicado en el apéndice 1

A=1-T-R

la absortancia (A) se determina a partir de la fracción de luz transmitida transmitancia


(T) y de la fracción de luz reflejada Reflectancia (R).

2.1.9.3.2.1. Reflectancia

Es la comparación del campo lumínico resultante de un haz de luz reflejado de una


muestra (filtro con algas o talo de macroalga) de la reflejada de un material de
referencia.

R = I s - I d / Ir - I d
donde Is es la medida de la luz que sale de la esfera cuando se ilumina la muestra, Ir es
la medida cuando se ilumina el material de referencia (placa de Sulfato de bario) e Id es
la iluminación debida a la radiación de fondo (“extraviada o stray”). Se mide cuando se
ilumina el puerto donde se coloca la muestra pero sin ésta (la radiación externa a la
esfera que puede salirse a través del puerto no cubierto de la muestra). La mayor parte
de la radiación que procede del iluminador pasará a través del puerto de la muestra. La
única radiación que ilumina la pared será la “stray” o “extraviada”.

2.1.9.3.2.2. Transmitancia

Es la comparación del campo lumínico resultante en la esfera producido por un haz de


luz transmitido por la muestra de aquel que no pasa a través de ésta

It = Is / Ir

En ambos casos se considera que la reflectancia del material de referencia

es 1 (100%).

2.1.9.4. Efecto empaquetamiento

El espectro de absorción in vivo (suspensión celular o talo de macroalga) difiere del


espectro de fragmentos tilacoidales o del espectro in vitro (extracto pigmentario). El
espectro de las células intactas tiene picos menos pronunciados que el de células
ultrasonicadas (fragmentos tilacoidales) o el de extractos pigmentarios. Estas
diferencias se deben al llamado efecto empaquetamiento, es una consecuencia del
hecho de que los pigmentos en vez de estar uniformemente distribuidos en la célula,
están contenidos en paquetes discretos (cloroplastos, ficobilisomas). El hecho de que
los pigmentos estén distribuidos de forma heterogénea en las células hace que haya una
discrepancia entre la densidad óptica de una solución pigmentaria extraída de una
suspensión celular. El efecto empaquetamiento se define como la relación que hay entre
la densidad óptica de la suspensión celular y la densidad óptica de la disolución
pigmentaria.

Dsusp / Dsol = A / C (Adimensional)

donde  es el área proyectada de las partículas en dirección a la fuente de luz (cm2), A


es la absortancia, C es la concentración de pigmentos (mg/L),  es el volumen medio
de la partícula (cm3) y  es el coeficiente de absorción específico del pigmento en una
concentración de 1 mg /mL (cm2 mg-1).
Esta fracción es siempre menor que 1. Cuanto más cerca de 1 menor es el efecto
empaquetamiento, por lo tanto mayor es la eficiencia de absorción de luz ya que la
densidad óptica de la suspensión se aproxima a la de la solución. Células con volumen
celular pequeño o con forma alargada (altos valores de a) tendrán en general un efecto
empaquetamiento pequeño y por lo tanto una alta eficiencia de captación de luz.

MÉTODO
Se determinará la densidad óptica de la solución de algas a partir de la DOfiltro de
acuerdo a la ecuación de Mitchell (1990) indicada arriba. Se realiza la extracción de
pigmentos con DMF y se determina la DO de la solución (los valores máximos en el
espectro.
Un estimador de la eficiencia de absorción de luz y más fácil de determinar que por el
procedimiento de Kirk (1983) es el cociente entre la absortancia in vivo a la longitud de
onda máxima de absorción de un determinado pigmento y la concentración de ese
pigmento.

1. Chl a y Chl b

A680 / [Chl a], A648 / [Chl b]

La clorofila se determina de acuerdo a Inskeep & Bloom (1985).


2. Biliproteinas

-PE: A566 / [PE]

-PC: A624 / [PC]

Las biliproteínas se extraen en tampón fosfato 0.1M pH 6.8 usando para la extracción
un mortero de extracción. El extracto se centrifuga a 10.000 g durante 20 min.
determinando la absorbancia en diversas longitudes de onda (abajo indicadas) y de
acuerdo a las siguientes expresiones (Beer & Eshel, 1985).

PE = ([A564 - A592) - (A455 - A592) * 0.20] * 0.12 (mg mL-1)

PC = ([A618 - A645) - (A592 - A645) * 0.51] *0.15 (mg mL-1)

multiplicando por el volumen de extracción (mL) y dividiendo por el peso húmedo (g)
se expresarán la concentración de pigmentos en mg por peso de alga.

2.1.9.5. Determinación del coeficiente de atenuación de la luz en cultivos

celulares

2.1.9.5.1. Fitoplancton

Se determinará el coeficiente de atenuación de la luz (K) en cultivos de Dunaliella


bardawil a distinta densidad celular y concentraciones pigmentarias. Para ello se
determinará la cantidad de luz dentro del cultivo (integración entre 400-700 nm =
radiación activa fotosintética) variando la distancia a la fuente de luz. Se emplearán dos
tipos de sensores de radiación activa fotosintética: (a) sensor plano (Li192 SB) y (b)
sensor esférico. El primero integra toda la radiación que llega en un ángulo de 180o
mientras que el segundo la integra en 360º. Se compara el valor de K, obtenido de
acuerdo a la expresión indicada en la Introducción. Se usará también un microsensor
esférico conectado al espectrorradiómetro Li-1800 UW, lo que permitirá conocer la
calidad de luz dentro de los cultivos.
Por otro lado se determinara la reflectancia del cultivo (Rcultivo). Es la relación entre la
cantidad de luz reflejada (Iu, radiación que sube) de la cantidad de luz incidente (Id,
radiación que baja).

Rcultivo = Iu / Id

Se compara el coeficiente de atenuación del cultivo con la reflectancia de éste.

2.1.9.5.2. Macroalgas

Se determinará el coeficiente de atenuación colocando sobre la ventana del detector del


espectroradiómetro distintas capas de algas. Se calculará la cantidad de luz transmitida
en cada capa de alga, determinando el coeficiente de atenuación integrado (radiación
activa fotosintética). El hecho de emplear el espectrorradiómetro Li-1880 UW permite
contar con el espectro de transmitancia en vez de únicamente de la integración entre
400-700 nm. De esta manera se analizará el coeficiente de atenuación espectral K(),
es decir se analizará la atenuación en bandas específicas dónde absorben los pigmentos
fotosintéticos.

BIBLIOGRAFÍA

Beer, S. & Eshel, A. (1985). Determining phycoerythrin and phycocyanin


concentrations in aqueous extracts of red algae. Aust. J. Mar. Freshw. Res. 36: 785-
792.
Berner, T., Dubinsky, Z. , Wyman, K. and Falkowski, P. G. (1989). Photoadaptation
and the “pacakage effect” in Dunaliella tertiolecta (Chlorophycea). J. Phycol. 25:
70-78.
Bode, A., Figueroa, F. L. & Tuiz, J. (1994). Estimating the photosynthetic and detritical
fractions of seston: a comparaison of methods. Working group 5 Report. Scientia
Marina 58: 59-65.
Cleveland, J. S. and Weidemann, A. D. (1993). Quantifying absorption by aquatic
particles: a multiple scattering correction for glass-fiber filters. Limnol. Oceanogr.
38(6): 1321-1327.
Figueroa, F. L., Aguilera, J. & Niell, F. X. (1995). Red and blue light regulation of
growth and photosynthetic metabolism in Porphyra umbilicalis (Bangiales,
Rhodophyta). Europ. J. Phycol. 30: 11-18
Innskeep, W. P. and Bloom, P. R. (1985). Extintion coefficients of chlrophyll a and b in
N,N-Dimethylformamide and 80% Acetone. Plant Physiol. 77: 483-485.
Kirk, J. T. O. (1983). Light and photosynthesis in aquatic ecosystems (J. T. O. Kirk
editor), Cambridge University Press, 401 pp.
Mercado, J. Jiménez, C., Niell, F. X. and Figueroa, F. L. (1996)Comparison of methods
for measuring light absorption by algae and their application to tthe estimation of
the package effect. Scientia Marina 60; 39-45.