FOTOCOLORIMETRIA

carlos alvarez betin

DOCENTE:
 RESUMEN
La fotocolorimetría es la medida de la luz absorbida por una solución
mediante un aparato que es un fotocolorímetro. El equipo consta de una fuente
de luz artificial, un monocromador que separa exclusivamente luz de una sola
longitud de onda (la que sea preferente para la medida), un recipiente o tubo
de vidrio (que alberga la solución a medir), una célula fotoeléctrica que
transforma la luz trasmitida en corriente eléctrica y una unidad de medida de
la corriente eléctrica o galvanómetro.
La colorimetría y fotocolorimetría no son en realidad técnicas distintas y la
diferencia estriba en el tipo de instrumental empleado, de forma que se
denomina colorímetro a aquellos aparatos en los que la longitud de onda con
la que vamos a trabajar se selecciona por medio de filtros ópticos; en los
fotocolorímetros o espectrofotómetros la longitud de onda se selecciona
mediante dispositivos monocromadores

PALABRAS CLAVES: Proteína, Aminoácidos, absorción. Radiación,

longitud de onda

SUMMARY
The photocolorimetry is the measure of light absorbed by a solution with a
device which is a Photocolorimeters. The equipment consists of an artificial
light source, a monochromator light separating only one wavelength (which is
preferred for the measurement), a glass container or tube (which holds the
solution to measure), a photocell that transforms light into electrical current
transmitted and a unit of measure of electric current or galvanometer.
Photocolorimetry colorimetry and techniques are not really different and the
difference is the type of equipment used, so called colorimeter to those devices
in which the wavelength with which we work is selected by means of optical
filters ; Photocolorimeters or spectrophotometers in the wavelength devices is
selected by monochromators

KEY WORDS: Protein, amino acids, absorption. Radiation wave length

 INTRODUCION

Las técnicas colorimétricas se basan en la medida de la absorción de radiación en la zona

visible por sustancias coloreadas. En algunas ocasiones, la muestra que deseamos
determinar no posee color por sí misma; en tal caso, es preciso llevar a cabo un desarrollo
de color empleando reactivos que den lugar a sustancias coloreadas con la muestra que
interesa estudiar.
La colorimetría y fotocolorimetría no son en realidad técnicas distintas y la diferencia
estriba en el tipo de instrumental empleado, de forma que se denomina colorímetro a
aquellos aparatos en los que la longitud de onda con la que vamos a trabajar se selecciona
por medio de filtros ópticos; en los fotocolorímetros o espectrofotómetros la longitud de
onda se selecciona mediante dispositivos mono-cromadores.
Puede definirse la espectrofotometría de absorción, como la medida de la atenuación que el
material a estudiar (muestra) efectúa sobre una radiación incidente sobre el mismo con un
espectro definido. En general, las medidas se realizan dentro del espectro comprendido
entre 220 y 800 nm, y este espectro, a su vez, puede dividirse en dos amplias zonas: la zona
de la radiación visible, situada por encima de 380 nm, y la zona de la radiación
Ultravioleta situada por debajo de estos 380 nm. La región del infrarrojo se sitúa por
encima de los 800 nm.
Así es como cada sustancia coloreada absorberá luz a determinada longitud de onda, y la
intensidad de la luz debe variar de acuerdo a la concentración de la sustancia en la solución,
el color que se observa, como luz invisible es el producto o resultado de la luz transmitida.
Las transmisiones electrónicas que se producen en la zona de radiación visible y de
radiación ultravioleta se deben a ña absorción de radiación o de luz por determinados
grupos ópticos, enlaces y grupos funcionales en el interior de la molécula, la longitud de
onda de la absorción y la intensidad dependerán de muchos grupos.
La longitud de onda es una medida de la energía que se necesita, para la transmisión, su
intensidad dependerá, de la probabilidad de que la transición se produzca, cuando
interaccione el sistema electrónico y la radiación, y también del estado excitado.
-Los electrones de una molécula pueden clasificarse en cuatro tipos diferentes:

 Electrones de capa cerrada, que no participan en el enlace, tienen energía de

excitación muy elevada y no contribuyen a la absorción en las zonas de radiación visible o
la radiación UV.

 Electrones covalentes, de enlaces simples (ê sigmas). Estos también poseen

energía de excitación, demasiadas elevadas para contribuir a la absorción visible o UV.

 Electrones apareados de capa externa que no participan en el enlace, como los

de N,O,S y los alógenos, además se encuentran unidos con menos fuerzas que los enlaces
sigma y puede excitarse con radiación visible o ultravioleta.

 Electrones en los orbitales ∏ (pi), en los enlaces dobles y triples. Estos se excitan
con gran facilidad, y a ellos se debe la mayoria de espectros electrónicos de la zona de
radiación visible y UV.
Estos electrones en orbitales que la molécula posee y que pueden ser vacios u orbitales en
anti enlaces; corresponde a niveles de energía de estado excitado ∏ o σ, por tanto al
absolverse la radiación, se produce una transmisión electrónica a un orbital de anti enlace.

Las mediciones espectrofotométricas se basan en la ley de LAMBERT, la cual permite

cuantificar la concentración de una muestra, relacionándola con la cantidad de luz
absorbida por la misma.
Establece que la concentración de una sustancia es directamente proporcional a la cantidad
de la luz absorbida inversamente, proporcional al logaritmo de la luz transmitida.

A= ECL

Donde:
A= Absorción
E= Coeficiente de extinción molar
C= Concentración de la solución
L=Diámetro del tubo o celda.

LEYES DE LA ABSORCIÓN

Cuando la luz atraviesa una muestra, sólo una fracción de ella es transmitida. La
proporción de luz transmitida se denomina Transmitancia (T) y se calcula de la siguiente
manera:

T = I / I0

Donde:
I = la intensidad de luz transmitida por la muestra
I0 = la intensidad de luz incidente

La transmitancia toma valores entre 0 – 1. También se expresa como porcentaje si se

multiplica por 100 y sus valores están en el rango de 0-100%:

%T = (I / I0) x 100

La relación (I / I0), también puede ser expresada como luz absorbida en lugar de luz
transmitida. En ese caso nos referimos a la Absorbancia (A) de una muestra.

La Absorbancia es adimensional, varía en el rango de 0 - ¥ y se define como:

A = log 1/T = log10 (I0 / I)

Por sustitución se comprueba que la Absorbancia y el porcentaje de transmitancia están
relacionados mediante la siguiente expresión:

A = log (100 / %T)

A = 2 - log( % T)

LEY DE LAMBERT:

“La fracción de luz absorbida por un medio transparente es independiente de la intensidad

de luz incidente, y cada capa sucesiva del medio, absorbe una fracción igual de la luz que
pasa a través de él¨. Esto lleva a un decaimiento exponencial de la intensidad de luz a lo
largo del paso óptico en la muestra, que puede ser expresado matemáticamente como sigue:

Log10 (I0/I) = A = K b

Donde :
b = la longitud del paso óptico de la cubeta de espectrofotometría y
K es una constante del medio, que fue descifrada por Beer.

LEY DE BEER:

¨La cantidad de luz absorbida es proporcional al número de moléculas de cromóforo que la

luz atraviesa¨. La constante K, es proporcional a la concentración de cromóforo (c) : K = a
c, donde a es la absortividad o coeficiente de absorción, una propiedad del cromóforo en sí
misma. La absortividad a es una constante que depende de:

La longitud de onda de la luz incidente,

La identidad de la sustancia analizada y
·Del medio en que ésta se encuentre (pH, solvente e interacción con otras sustancias) La
constante a representa la probabilidad de absorción a una longitud de onda determinada

LEY DE LAMBERT-BEER

La ley explica que hay una relación exponencial entre la transmisión de luz a través de una
sustancia y la concentración de la sustancia, así como también entre la transmisión y la
longitud del cuerpo que la luz atraviesa. Si conocemos l y α, la concentración de la sustancia
puede ser deducida a partir de la cantidad de luz transmitida.
Las unidades de c y α dependen del modo en que se exprese la concentración de la sustancia
absorbente. Si la sustancia es líquida, se suele expresar como una fracción molar. Las
unidades de α son la inversa de la longitud (por ejemplo cm-1). En el caso de los gases, c
puede ser expresada como densidad (la longitud al cubo, por ejemplo cm-3), en cuyo caso α
es una sección representativa de la absorción y tiene las unidades en longitud al cuadrado
(cm2, por ejemplo). Si la concentración de c está expresada en moles por volumen, α es la
absorbencia molar normalmente dada en mol cm-2.
El valor del coeficiente de absorción α varía según los materiales absorbentes y con la
longitud de onda para cada material en particular. Se suele determinar experimentalmente.
La ley tiende a no ser válida para concentraciones muy elevadas, especialmente si el
material dispersa mucho la luz. La relación de la ley entre concentración y absorción de luz
está basada en el uso de espectroscopía para identificar sustancias.

Dónde:

A es la Absorbancia (o absorbencia)
I0 es la intensidad de la luz incidente
I1 es la intensidad de la luz una vez ha atravesado el medio
L es la distancia que la luz atraviesa por el cuerpo
c es la concentración de sustancia absorbente en el medio
α es el coeficiente de absorción o la absorbancia molar de la sustancia
λ es la longitud de onda del haz de luz
k es el coeficiente de extinción

OBJETIVOS
 Analizar los principios de la técnica fotocolorimetrica.

 Manejar adecuadamente el fotocolorímetro.

 Determinar el espectro de absorción de un compuesto y seleccionar su longitud de

onda óptima o de máxima absorción.

MATERIALES
 Fotocolorímetro

 Solución de albumina

 Reactivo del biuret.

PROCEDIMIENTO

Preparar Preparar una

una Sln Sln problema
Blanco con con 0.5 ml de
2ml de Sln albumina
salina + +1.5 ml de
4ml de R. Sln salina +
Biuret 4ml de R.
Biuret
Determinar la
Absorbancia con el
fotocolorímetro a
diferentes
longitudes de onda

Registrar los datos de la Absorbancia,

para ambas soluciones Vs longitud de
onda en una grafica
 RESULTADOS

Tabla de DATOS 1

TUBOS ALBUMINA SLN R.

SALINA BIURET

Blanco -- 2ml 4ml

Sln o.5 ml 1.5 ml 4ml

problema

Tabla de DATOS 2

Long Abs de
de Abs del sln. Dife de
onda Blanca Proble Abs (Δ)
(λ) ma
340 0.265 1,035 0.77
410 0.134 0.289 0.155
445 0.069 o.183 0.144
500 0.160 0.299 0.139
525 0.193 0.387 0.194
550 0.231 0.422 0.191
565 0.225 0.412 0.187
605 0.250 0.375 0.125
620 0.269 0.366 0.097
665 0.240 0.224 -0.016
690 0.277 0.259 -0.018
820 0.108 0.162 0.054
λ Max
0.231 0.422 0.191
550

Grafica Nº1
Al realizar la grafica de Absorbancia Vs longitud de onda.

La curva obtenida corresponde al espectro para las estructuras de los complejos el espectro
proteico formado con el reactivo Biuret. La longitud de onda máxima de Absorbancia
obtenida fue de 550 nm.

ANÁLISIS DE RESULTADOS

La fotocolorimetría es un método optico de análisis, que mide la cantidad de luz absorbida

por una sustancia coloreada. Como cualquier otro método espectroscópico, se basa en la
medida de la intensidad, y la longitud de onda de la radiación electromagnética que ha
atravesado la materia o que esta emite.

Es importante decir que un espectro de Absorbancia, se absorben diferentes longitudes de

onda en distintos grados, es decir, la absortividad varía según la longitud de onda.
La solución de albumina absorbió luz a determinadas longitudes de ondas, esto se puede
observar en la grafica, obteniendo un espectro característico, en el que se evidencio una
longitud de onda máxima de 550 nm. Lo que corresponde a un máximo bastante amplio
en el espectro con una Absorbancia de 0.191.

En la zona de radiación visible del fotocolorímetro, la intensidad de luz y absorción de la

misma están determinadas por los grupos funcionales y enlaces de la molécula de la
proteína, (albumina); enlaces peptidicos, puentes disulfuros. Se puede decir entonces que
al estar formada la albumina por elementos químicos como el nitrógeno, oxigeno y azufre,
presenta electrones apareados de capa externa que no participan en el enlace y que por lo
tanto pueden excitarse con radiación visible reflejada, como el color físicamente
observado.
Las proteínas globulares presentan una gran solubilidad en soluciones salinas, diluidas
debido a la fuerza iónica y a la valencia de los iones presentes, en la solución es por ello
que se agrego una solución salina de NaCl a la proteína y además, el reactivo de biuret que
formo un producto coloreado, permitiendo que la solución proteica absorbiera una
determinada cantidad de luz en el fotocolorímetro a diferentes longitudes.

En el análisis espectrofotométrico, fue necesario conocer el espectro de absorción de la

muestra problema, midiendo la Absorbancia a distintas longitudes de onda para establecer
la frecuencia de máxima absorción de la especie a determinar, con el propósito de obtener
una mejor sensibilidad en su cuantificación. El espectro de absorción resultante es la
representación gráfica de la probabilidad de absorción en función de la longitud de onda.
La albumina es una sustancia incolora por tanto para hacer posible la medida de la
Absorbancia fue necesario combinar a esta con el reactivo de biuret, para a si permitir la
formación del complejo biuret-albumina y a si poder calcular la Absorbancia para la
albumina. El cálculo de Absorbancia obtenido para la albumina fue posible gracias a la
medida de la Absorbancia que se le realizo inicialmente al biuret que fue tomado como tubo
de control, esta Absorbancia se tomo a las mismas longitudes de onda medidas para el
complejo biuret-albumina, luego se le resto la Absorbancia del tubo control al complejo
para obtener a si los resultados de Absorbancia para la albumina a diferentes longitudes de
onda.
El reactivo del Biuret lleva sulfato de Cobre (II) y sosa, y el Cu, en un medio fuertemente
alcalino, se coordina con los enlaces peptídicos de la albumina formando un complejo de
color violeta (Biuret) cuya intensidad de color depende de la concentración de proteínas, lo
que facilita y da lecturas más precisas de concentración. En cuanto a la longitud de onda se
utiliza en un intervalo de 410-690nm (luz visible) porque en esa es en la que mayor espectro
de absorción tiene y da lecturas más precisas el fotocolorímetro y la grafica, es para
determinar un rango lineal dentro del cual se puede mirar a que longitud de onda optima
se puede medir la muestra.

CONCLUSIONES
 Las sustancias incoloras se deben combinar con otras sustancias que le permita
colorearse para que así puedan ser determinadas su Absorbancia por fotocolorimetría.

 La fotocolorimetría es una técnica que se basa en medir la cantidad de luz absorbida

o transmitida por un compuesto en una solución.

 La fotocolorimetría es una técnica que permite medir la absorción de radiación

electromagnética, ultravioleta y visible de numerosas especies químicas inorgánicas y
orgánicas, para su análisis cualitativo y cuantitativo.

 La absorción de luz y la intensidad de la misma, están determinadas por los grupos

funcionales y los enlaces que presentan la molecula proteica, (albumina).

 En la solución de albumina la mayor cantidad de luz se absorbe a una longitud de

onda de 550 nm.

BIBLIOGRAFIA

 BOHINSKI, R. 1991. Bioquímica. Editorial Addison Wesley. Iberoamericana S.A.

México.

 LAGUNA, J. & PIÑA, E. 1979. Bioquímica. 3a. Edición. México.

 PEÑA, A, A., ARROYO, A., GOMEZ & R., TAPIZ. 2002. Bioquímica. Editorial Limusa.
México.

 STRYTER, Luber. 1995. Bioquímica. Toma I. Editorial Reverte S.A. Barcelona,

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B/GUIA%20TP%20ORGANICA-BIOLOGICA.pdf

 http://webdelprofesor.ula.ve/farmacia/gmendez/manuales%20PDF/EXPERIMENT
O%206%20CITOCROMO%20C%2006-04.pdf

 http://mail.efn.uncor.edu/departamentos/quimica/Guia-2008-OK.pdf

 http://www.fq.uh.cu/dpto/qf/docencia/pregrado/estruc_2/uv/descargas/uv_3.pdf

 http://biologia.laguia2000.com/bioquimica/funciones-y-clasificacin-de-las-
protenas

 http://www2.uah.es/sancho/farmacia/practicas/guiones/1er%20cuatrimestre/Guio
nes/Lowry.pdf

CUESTIONARIO

1. ¿PORQUE LA REGIÓN VISIBLE EMITE RADIACIONES OBSERVADAS

POR EL OJO HUMANO?

R/

De todo el espectro, la porción que el ser humano es capaz de ver es muy pequeña en
comparación con las otras regiones espectrales. Esta región, denominada espectro visible,
comprende longitudes de onda desde los 380 nm hasta los 780 nm. La luz de cada una de
estas longitudes de onda es percibida por el ojo humano como un color diferente, por eso, en
la descomposición de la luz blanca en todas sus longitudes de onda, por prismas o por la
lluvia en el arco iris, el ojo ve todos los colores.

Porque la radiación comprendida entre 290nm y 100 nm (U-VC)es absorbida por la capa de
ozono de la estratosfera, el resto de la radiación entre los 290 nm y los 400 nm (U- VB y U-
VA). Llega a la superficie terrestre, con muchas posibilidades de ocasionar perjuicios a las
personas.

2. ¿CUAL ES EL FUNDAMENTO FISICOQUÍMICO DE LA TRANSICIÓN DE

LOS E-S QUE SE LOCALIZAN EN UN ORBITAL DETERMINADO?
R/
La absorción de energía y liberación de la misma, lo que va a permitir que un electrón
hacienda o descienda a diferentes niveles en los orbitales atómicos.
El principio físico-químico, la absorción de radiación ultravioleta-visible por una molécula,
causando la promoción de un electrón de un estado basal a un estado excitado, liberándose
el exceso de energía en forma de calor. La longitud de onda (λ) comprende entre 190 y 800
nm . la luz visible o UV es absorbida por los electrones de valencia, estos son promovidos a
estados excitados, (de energía mayor). Al absorber radiación electromagnética de una
frecuencia, correcta, ocurre una transición desde uno de estos orbitales a un orbital vacio.
Las diferencias entre energías varían entre, los diversos orbitales. Algunos enlaces como los
dobles, provocan coloración en las moléculas, ya que absorben energía en el visible, así
como el UV. Como es el caso de β-caroteno. Cuando un haz de radiación ultravioleta.
Atraviesa una disolución conteniendo, un analito, absorbente, la intensidad incidente del
haz (Io) es atenuada hasta 1 , esta fracción de radiación que no ha logrado traspasar la
muestra es denominada transmitancia, (T) (T= 1/10). Por aspectos prácticos, se utilizara la
Absorbancia, (A=-Log T), por estar relacionada linealmente con la concentración de la
especie absorvente. Según la ley de BEER-LAMBERT: A=E ./. CE. Coeficiente de
absortividad molar, l=camino optico, C: concentración de la especie absorvente.

3. ¿POR QUE RAZÓN UN COMPUESTO QUÍMICO ABSORBE O EMITE

ENERGÍA?

R/

Lo que pasa es que en los átomos del elemento, cuando absorben energía calorífica, se
produce una excitación en sus electrones los cuales "saltan" de un orbital a otro dentro del
mismo átomo, desde los niveles inferiores a los niveles superiores; pero cuando los
electrones regresan a su estado original liberan toda esa la energía la cual se manifiesta en
energía luminosa (fotón). Los fotones son creados o destruidos cuando interactúan con los
átomos, pero algo importante de notar es que las transiciones entre niveles iguales de
energía siempre producen el mismo color de fotón. Cada vez que el electrón salta hacia
abajo un nivel de energía produce un fotón y el mismo salto produce los mismos colores que
son distintos para cada elemento. Esto se llama espectro atómico. Con esta propiedad se
pueden hacer análisis cualitativos, es decir, se puede identificar los diferentes elementos
presentes en un compuesto.

4. ¿CUALES SON LAS POSIBLES TRANSICIONES ELECTRÓNICAS QUE

PUEDE SUCEDER EN UN COMPUESTO QUÍMICO Y ORDÉNELAS EN
FORMA CRECIENTE DE λ ?
R/
Las bandas de absorción en las regiones Ultravioleta y Visible que presentan los
compuestos orgánicos se asocian con transiciones electrónicas en la capa de valencia. Los
electrones involucrados en dichas transiciones corresponden a aquellos mas débilmente
atraídos por el conjunto de núcleos atómicos que componen la molécula y cuyos estados
pueden ser descritos a través de orbitales moleculares que se expresan como combinaciones
lineales de orbitales atómicos de la capa de valencia. Las transiciones electrónicas a
orbitales moleculares más externos dan lugar a las denominadas transiciones Rydberg
presentes en el Ultravioleta de Vacío. Por otra parte las transiciones electrónicas que
involucran a los electrones de las capas internas son muy energéticas y se presentan en la
región de los rayos X del espectro electromagnético. A estos efectos resulta conveniente
recordar la clasificación convencional de los orbitales moleculares en la capa de valencia de
los compuestos orgánicos.
Orbitales σ y σ*. Son orbitales moleculares localizados a lo largo del eje de unión de los
átomos. Los orbitales σ generan una densidad electrónica elevada en la región internuclear
teniendo un carácter fuertemente enlazante. Los orbitales σ*, como todos los orbitales
antienlazantes, presentan un plano nodal perpendicular al eje del enlace en la región
internuclear y tienen un acentuado carácter antienlazante. Orbitales π y π*. Estos orbitales
se emplean en la descripción de los enlaces múltiples. Las regiones de mayor densidad
electrónica correspondiente a los mismos son aquellas colaterales al eje del enlace. El
carácter enlazante o antienlazante de estos orbitales es menos acentuado que el de los
orbitales σ. Orbitales n. Estos orbitales moleculares tienen un acentuado carácter local y
describen pares electrónicos libres asociados con heteroátomos (O, S, N, HaI).
Energéticamente tienen carácter no-enlazante.

Según el esquema anterior las transiciones

electrónicas posibles dentro de la capa de
valencia son:
 Transiciones οο*. Se presentan en
todos los compuestos orgánicos. Son en
general de gran energía (UV de vacío)
e intensidad.
 Transiciones οπ* y πο*. Son posibles
solo en compuestos insaturados. Son
transiciones de baja intensidad
(regiones de definición de los orbitales
involucrados diferentes)en el UV
lejano. Carecen de interés práctico.
 Transiciones nο*. Se presentan en
compuestos con heteroátomos (O, N, S,
Hal), generalmente en la región
cercana a los 200 nm. La intensidad es
variable dependiendo de la naturaleza
del orbital n.
 Transiciones ππ*. Presentes solo en compuestos insaturados. En ausencia de
conjugación estas transiciones se presentan en UV de vacío. Dan lugar a bandas
intensas que `pueden aparecer en UV cercano si está presente insaturación
conjugada.
 Transiciones nπ*. Presentes en compuestos insaturados con heteroátomos (grupos
carbonilo, nitro, azo, tiocarbonilo). Dan lugar a bandas débiles usualmente en la
región UV-cercana (baja energía de transición).

5. ¿QUE REACTIVO QUÍMICO SE UTILIZAN PARA PREPARAR EL

REACTIVO DE BIURET Y PORQUE?

R/
El reactivo de biuret esta hecho de hidróxido potásico (KOH) y sulfato cúprico
(CuSO4), junto con tartrato de sodio y potasio (KNaC6O6-4H2O). El reactivo de
color, azul cambia a violeta en presencia de proteínas y vira a rosa cuando se
combina con polipéptido de cadena corta, el hidróxido de potasio no participa en la
reacción, pero proporciona el medio alcalino necesario, para que tenga lugar.
Se usa normalmente en el ensayo de biuret un método colorimétrico que permite
determinar la concentración de proteínas de una muestra mediante espectroscopia
UV visible a una longitud de onda de 540 nm (para detectar un ion de Cu+2).