ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE

CHIMBORAZO

FACULTAD DE CIENCIAS

ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA

SEMESTRE: Primero B
NOMBRE: Tatiana Guashpa Caiza
CODIGO: 3811
FECHA: Marzo del 2019

MONTAJE DE PREPARACIONES FRESCAS,TEMPORALES Y PERMANENTES

MICROSCOPIA
Los microorganismos son demasiado pequeños para ser detectados por el ojo humano, por
ello, es esencial la observación microscópica para determinar la forma, el tamaño,
agrupamiento y características de coloración de los mismos. Generalmente, éstos son los
primeros datos que se obtienen cuando se desea saber que tipo de bacteria u hongo es.
Con el microscopio óptico se consigue un amplio margen de aumento que puede alcanzar
desde 10 a 1000 diámetros.
Existen varios tipos de microscopios y se han desarrollado numerosos métodos que
permiten examinar con gran detalle las muestras que contienen microorganismos. Cada
tipo de microscopio y cada técnica de preparación de las muestras ofrece determinadas
ventajas para la demostración de ciertos caracteres morfológicos. Fundamentalmente
existen dos clases de microscopio, según el principio en que se funda la amplificación de la
imagen:

Preparación del material microbiológico para microscopía

La observación microscópica constituye la primera etapa del estudio de los
microorganismos y también del diagnóstico microbiológico ya que permite conocer algunas
características de los microorganismos, como ser: forma, disposición o agrupación,
presencia o ausencia de estructuras (cápsulas, esporas, flagelos), movilidad, etc.
El estudio "en fresco" se desarrolló cuando todavía no se habían inventado la fijación y la
tinción. Actualmente se siguen utilizando, sobre todo gracias al desarrollo de las técnicas
de contraste de fases y contraste interferencial. Un estudio “en fresco" es aquel que no
precisa un tratamiento en el que se maten las células, como es la fijación o la inclusión. No
presenta dificultades añadidas a las de cualquier técnica microscópica, pero sí que requiere
la máxima limpieza. Las bacterias no teñidas muestran pocos detalles morfológicos, el
diagnóstico bacteriológico generalmente se basa en las diferentes afinidades tintoriales de
las bacterias para identificarlos más adecuadamente, Sin embargo, también resultan útiles
las preparaciones no teñidas en la determinación de la movilidad. Las preparaciones fijas y
teñidas son de uso casi universal, tanto a partir de especímenes recibidos como de colonias
cultivadas.
En general una muestra del espécimen original puede ser colocada directamente sobre el
portaobjetos o bien ser recogida con un asa, recordando siempre tener una preparación
delgada y homogénea.
Una colonia puede ser examinada haciendo con ella una suspensión tenue en una gota de
solución salina, y luego extendiéndola con un asa sobre un portaobjetos. Las películas
secadas al aire son fijadas con calor suave sobre la flama de un mechero y luego pasadas
a través de ella. Debe tenerse cuidado para evitar el calor excesivo, que puede alterar la
forma bacteriana. El calor deseable es aquel en el que el portaobjetos sea apenas caliente
para ser colocado sobre el dorso de la mano.
Observación microscópica
Para observar una muestra al microscopio óptico podemos recurrirá a:

Preparación húmeda.

Cubreobjeto
Fig.9. Preparación de un preparado fresco

Se realiza colocando una gota de la suspensión de microorganismos entre un porta y un

cubreobjetos. Se observa directamente.

- Preparación fijada. Se coloca una suspensión homogénea de microorganismos en una

gota de agua sobre el portaobjetos y se fija (mediante calor o agentes químicos) y
después se tiñen mediante diferentes técnicas. Estas preparaciones se observan sin
cubreobjetos y, habitualmente, con objetivos de inmersión.

Preparación preparado fijo para tinciones:

La extensión del material sobre el portaobjetos se hará de diferentes formas, en función de

la procedencia del producto a examinar.
Si el producto es líquido, se depositará una pequeña cantidad de material en el centro del
porta, extendiéndolo con el asa hasta conseguir una capa fina y homogénea.
Si la extensión debe hacerse a partir de un cultivo en medio sólido, la colonia que vayamos
a estudiar se mezclará con una gotita de agua destilada estéril colocada en el centro del
porta.
Secado:
Una vez realizado el frotis, debemos dejar secar al aire la preparación, cuando está seca la
superficie pasa de ser brillante a mate; para acelerar el secado se puede calentar
ligeramente la parte inferior del portaobjetos (sin quemar). Fijado:
La fijación es el último paso antes de proceder a la tinción, y tiene como objetivo no permitir
que la muestra de estudio se pierda (o se barra) en el proceso de tinción.

En frotis hematológicos no se requiere de fijación debido a que existe una coagulación

rápida de las albúminas citoplasmáticas; o si el material a teñir posee abundante material
celular, se recomienda fijar con alcohol metílico después de secar la preparación.
Los frotis de origen microbiológicos se deben de fijar con calor suave, pasando el
portaobjetos sobre una llama, tras la fijación es muy importante esperar que se enfríe antes
de proceder a realizar cualquier procedimiento de tinción.

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Figura 10.. Preparación de un preparado para tinción 1 realización del extendido 2. Secado
del extendido 3. Fijado a la llama.

Preparación de muestras para microscopía óptica y electrónica

Técnica

Preparación muestras para MO:

 Fijación química de muestras e inclusión en parafina.

 Obtención de cortes finos utilitzando microtom o criotom
 Tinción

Preparación muestras para TEM:

 Muestras Biológicas:
o Fijació química de muestras (cacodilato, tetróxido de osmio...) y inclusión en
resinas.
o Obtención de cortes semifinos (1µm) y ultrafinos (50-70 nm)
o Contraste de rejillas: positivo (con acetato de uranilo y citrato de plomo) y
negativo (ácido fosfotungsténico o acetato de uranilo)
 Muestras Inorgánicas (metálicas o no):
o Adelgazamiento iónico

Preparación muestras para SEM:

 Muestras Biológicas:
o Fijació y preparación de muestras.
o Sombreado de muestras con oro o carbono
 Muestras Inorgánicas (metálicas o no): Si es necesario se hace un recubrimiento
con oro para obtener imágenes de alta resolución

 Hay diversas técnicas para la observación vital:

 Examen en fresco. - Preparaciones húmedas:
para observar organismos acuáticos microscópicos (algas, larvas, etc.). Se pone una
gota del líquido que los contiene sobre el portaobjetos y se pone el cubreobjetos con
cuidado para que no aparezcan burbujas de aire.

Gota pendiente: se utilizan portaobjetos excavados sobre los que se pone el

cubreobjetos, que lleva adherido la gota del líquido que ha de ser observado. Así
podemos observar el movimiento de los microorganismos en el medio líquido, sin que
estén sometidos a la presión entre portaobjetos y cubreobjetos
Esta técnica presenta varios problemas que hay que tener en cuenta: 1. La gota
constituye una lente trémula que desvía los rayos de luz e interfiere con la iluminación,
esto resulta muy molesto cuando se emplea microscopio de contraste de fases. 2. Los
portaobjetos excavados actúan como una lente divergente que puede modificar la
realidad de lo que se está observando.

Montaje:
Hay varios tipos de montaje:
 Gota pendiente: ya explicado anteriormente
Se untan los bordes del cubreobjetos con vaselina para conseguir adherencia y que no
se seque la muestra, si se va a observar durante más de una hora.
-Extensión o frotis: se extiende la gota sobre el portaobjetos con ayuda de otro
portaobjetos, muy rápidamente para que no se dé coagulación. El líquido extendido se
fija, colorea y monta de manera normal. Se suele utilizar en el estudio de sangre y de
bacterias.

 Aplastamiento:
es la técnica más común. Los cortes se depositan en el portaobjetos. Si no se quiere
conservar la preparación, no añadiremos medio de montaje, sólo pondremos el
cubreobjetos, pero la preparación no durará más de una hora, ya que su contenido
líquido se evaporará por el calor emitido por el foco luminoso. Si la preparación se quiere
conservar, utilizaremos un buen medio de montaje que debe cumplir una serie de
propiedades como tener un buen índice de refracción, un pH neutro, y un secado rápido.
Tradicionalmente se ha venido utilizando el bálsamo de Canadá, que actualmente ha
sido sustituido por resinas sintéticas, como el Eukitt. Gracias al medio de montaje, la
preparación se conservará durante mucho tiempo. Una vez añadida la gota de medio
de montaje, se cubre con el cubreobjetos y se espera a su secado. 6.
Etiquetaje: Las preparaciones deben etiquetarse, si es que se quieren conservar o se
van a utilizar posteriormente. En la etiqueta se pone el nombre del material, la especie,
la técnica utilizada y la fecha de realización.

Citas bibliográficas
 -GARCÍA DEL MORAL, R.: Laboratorio de anatomía patológica, McGraw-Hill -
Interamericana de España, Madrid, 1993
 DIAZ, R.; GAMAZO, C.; LOPEZ GOÑI, Y.; Manual práctico de Microbiología,
Editorial Mason.