SEPARACION DE CARBOHIDRATOS POR CROMATOGRAFIA

EN CAPA FINA

CROMATOGRAFIA.- La cromatografía es una técnica de separación

extraordinariamente versátil que presenta distintas variantes. En toda
separación cromatográfica hay dos fases (sólida, líquida o gas) una móvil y
otra estacionaria, que se mueven una con respecto de la otra manteniendo un
contacto íntimo. La muestra se introduce en la fase móvil y los componentes de
la muestra se distribuyen entre la fase estacionaria y la móvil. Los
componentes de la mezcla a separar invierten un tiempo diferente en recorrer
cada una de las fases, con lo que se produce la separación. Si un componente
está la mayor parte del tiempo en la fase móvil el producto se mueve
rápidamente, mientras que si se encuentra la mayor parte en la fase
estacionaria, el producto queda retenido y su salida es mucho más lenta.

CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA

Las capas finas preparadas sobre vidrio se denominan cromatoplacas o placas

simplemente.
Se usan dos tipos de capas: capa compacta que se adhiere a la placa de vidrio por
medio de un agente aglomerante incorporado al adsorbente o por las cualidades
adherentes del propio material, y capa suelta.Estas últimas sólo se emplean en la
determinación de la actividad de los adsorbentes y en uno o dos casos especiales.

REACTIVOS UTILIZADOS PARA REVELAR CARBOHIDRATOS

Reactivos más específicos dan manchas coloreadas con diversos azúcares, entre
ellos el ftalato de anilina (en n-butanol saturado de agua) y naftoresorcinol (en
acetona, agua y ácido fosfórico)
Diversas técnicas han sido empleadas en la detección de los carbohidratos
después de la separación cromatográfica. Aquí se incluyen las revelaciones con
sprays o inmersiones de tiras de papel en paltos de capa fina conteniendo
diversos reactivos de coloración.
Aunque se trata de métodos sensitivos, resulta muy difícil realizar un análisis
cuantitativo.
Dentro de los sprays cromogénicos se mencionan: el ácido tiobarbitúrico para
la determinación de ácidos siálicos; el orcinol-ácido sulfúrico para determinar
galactosa; antrona para hexosas; carbazol para ácidos urónicos; el resorcinol
para residuos de ácidos siálicos unidos, y otros generales y específicos.
CLASES DE SOPORTE QUE SE UTILIZAN
La hidroxiapatita, celulosa microcristalina, sílica y soportes de mezclas de
carbón activado.

MECANISMO DE REACCION ENTRE LOS CARBOHIDRATOS Y EL

REACTIVO DE MOLISCH
La presencia de carbohidratos en una muestra se pone de manifiesto por la
reacción de Molisch, que a cierto punto es la reacción universal para cualquier
carbohidrato.
Se basa en la acción hidrolizante y deshidratante del ácido sulfúrico sobre los
hidratos de carbono. En dicha reacción el ácido sulfúrico cataliza la hidrólisis
de los enlaces glucosídicos de la muestra y la deshidratación a furfural (en las
pentosas) o hidroximetilfurfural (en las hexosas).
Estos furfurales se condensan con el alfa naftol del reactivo de Molisch
(reacción de Molisch) dando un producto coloreado.

APLICACIONES DE LA CROMATOGRAFIA DE CAPA FINA

Las separaciones sobre capa fina se parecen en muchos aspectos a la del papel, pero es
posible la elección de muchos más medios, ya que con esta técnica pueden realizarse
separaciones por reparto, filtración sobre gel, adsorción e intercambio iónico. Las
propiedades particulares de la cromatografía en capa fina permiten desarrollar el
fraccionamiento en un periodo de tiempo mucho menor. Por ejemplo, es frecuente
conseguir magníficas separaciones sobre capas entre veinte y cuarenta minutos. Incluso
empleando como adsorbente celulosa, el desarrollo de la placa es mucho más rápido que
el papel. Una razón de esto es el tamaño tan fino de las partículas que constituyen los
medios empleados en cromatografía en capa fina, por lo que se consiguen mejores
resoluciones y manchas más compactas.
La gran rapidez y versatilidad de la cromatografía en capa fina la hace ideal para la
enseñanza.
FUNDAMENTO.- Las propiedades particulares de la cromatografía en capa fina
permiten desarrollar el fraccionamiento en un periodo de tiempo mucho menor. Por
ejemplo, es frecuente conseguir magníficas separaciones sobre capas entre veinte y
cuarenta minutos.

OBJETIVOS.-
- Aplicar la cromatografía en la detección de carbohidratos.
- Realizar los cálculos del RF.

MATERIALES Y SUSTANCIAS
- Placa de vidrio con sílica gel
- Cámara cromatográfica
- Pipetas
- Pera para pipetear
- Regla
- Estufa
- Solvente de desarrollo (50 ml Butanol, 30 ml propanol, 20 ml Ac Bórico
0,5%)
- Muestra (CHO #1; CHO#2)
- Carbohidratos patrón (xilosa, lactosa, sacarosa, glucosa, galactosa,
ribosa, fructosa).

PROCEDIMIENTO:
En la placa de vidrio trazar una línea a 1.5 cm de la base, que servirá como punto de origen
para la aplicación de las muestras, luego aplicar las muestras y los carbohidratos patrones con
un capilar, mas o menos con separaciones de unos 0,5 cm, calentar en la estufa a unos 120 ºC
por unos 2 minutos, luego agregar 50 ml del solvente de desarrollo en la cámara
cromatográfica.

Poner la placa en la cámara cromatográfica y esperar hasta que ascienda el solvente de

desarrollo por la placa de vidrio hasta unos 7 cm de la base. Una vez ascendido el solvente
sacar la placa y tirar una ralla con cuidado hasta donde llegó el solvente, calentar en la estufa
por unos minutos.

Luego sacamos la placa de la estufa y con una brocha con cuidado pasamos el reactivo de
Molisch para el revelado, una vez hecho esto secamos en la estufa a 120 o 140 ºC de 1 a 5
minutos, tener cuidado de que las manchas no se vayan a dañar, observar de rato en rato hasta
que aparezcan las manchas coloreadas.

Medir la distancia desde el punto de origen hasta la mitad de la mancha, y luego desde el
punto de origen hasta el frente del solvente y calcular el RF.
RESULTADOS:

CARBOHIDRATOS P. O. – C. M.(cm) P. O. – F. S .(cm) RF

XILOSA 2.5 5.7 0,439
LACTOSA 0.9 5.7 0,158
SACAROSA 1.5 5.7 0,263
GLUCOSA 1.8 5.7 0,316
GALACTOSA 1.6 5.7 0,281
RIBOSA 2.3 5.7 0,404
FRUCTOSA 1.4 5.7 0,246
CHO #1 1.8 5.7 0,316
CHO #2 2.3 5.7 0,404

RF = distancia del punto origen (O) al centro de la muestra (CM)

Distancia del punto de origen (O)al frente del solvente (FS)

En el revelado se forman derivados del furfural, las hexosas van a formar

hidroxi metil furfural y las pentosas forman furfural y estas son incoloras, pero
como el reactivo de Molisch tiene α naftol van a formar complejos coloreados
de violeta púrpura rosado.
 UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS QUIMICAS

ESCUELA DE QUIMICA Y FARMACIA

LABORATORIO
DE
BIOQUIMICA

TEMA:
SEPARACION DE CARBOHIDRATOS
POR CROMATOGRAFIA
EN CAPA FINA

GRUPO #1

INTEGRANTES:
NAHUM MALDONADO
LUIS TOALA
 GERARDO GUERREO
JAIME CAMINO VALDEZ
JAVIER MURILLO MERO