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Informe de laboratorio
“MICROSCOPIA Y TINCIÓN DE GRAM; PREPARACIÓN DE
MEDIOS DE CULTIVO, SIEMBRA Y AISLAMIENTO DE
MICROORGANISMOS.”
Docente
Karol Ibeth Meza Acosta
Microbiología
2019 – A
MARCO TEÓRICO
La técnica se basa en aplicar una serie de colorantes a una muestra de cualquier origen
(esputo, orina, pus, etcétera) que supuestamente contenga bacterias no identificadas. Los
colorantes tiñen la pared de las bacterias de color morado y, tras unos minutos, se realiza
un lavado del colorante. Después de eso puede que el colorante permanezca en la pared
bacteriana o que se haya ido. En el primer caso permanecería el color morado, y se trataría
de bacterias Gram positivas y, en el segundo, la pared tendría un color rosado, y serían
Gram negativas.
Colorantes:
En la tinción de gram se utilizan colorantes como la fucsina y el cristal violeta; y reactivos
tales como el lugol y el alcohol acetona
La fucsina ácida es un colorante magenta utilizado en histología, en las tinciones
de Mallory, Van Gieson y de Gram
Fluidos
El cultivo de organismos patógenos necesita de fluidos corporales para que puedan
desarrollarse como lo harían en su ambiente natural. Por esta razón, se añade sangre
completa o desfibrilada. El fluido se extrae de un animal sano y, una vez esterilizado, se
agrega en el medio de cultivo.
Extractos
Son obtenidos de distintas partes animales (como carne o hígado) o vegetales (semillas) y
se procesa para obtener un concentrado sólido en forma de pasta o polvo. Los más
comunes son de levadura, malta y carne.
Peptonas
Estos compuestos orgánicos se obtienen por hidrólisis enzimática o química de tejidos
animales o vegetales. La finalidad es añadir contenido rico en aminoácidos, los cuales son
las unidades fundamentales de las proteínas.
Amortiguadores
Los “buffers” o sistemas amortiguadores evitan los cambios bruscos de pH y ayudan a
mantener el rango óptimo que el organismo tolera.
La mayoría de los organismos pueden desarrollarse adecuadamente a un pH de 7, aunque
algunas bacterias prefieren los medios alcalinos. Sin embargo, existen bacterias que
resisten variaciones de pH entre los valores de 6 y 9.
En especies sensibles al pH, el daño no es producido por la cantidad excesiva de iones
hidrógeno o hidroxilo, sino por el aumento de ácidos o bases débiles que pueden penetrar
en la célula.
Igualmente, se añaden indicadores que pH para poder monitorearlo y evitar desviaciones
ocasionadas por fermentaciones u otros procesos.
Objetivos
El objetivo principal al preparar un medio de cultivo es añadir todos los componentes
necesarios para permitir el desarrollo exitoso del organismo que desea ser aislado. Debe
ser identificada la combinación de componentes y nutrientes más efectivo para lograr el
medio deseado.
Tanto la preparación como el almacenamiento del medio son críticos para garantizar un
crecimiento exitoso, ya que de estos pasos depende la composición del medio y la
disponibilidad de nutrientes.
Hay que tomar en cuenta que el cultivo de microorganismo es una tarea que se ve afectada
por varios factores externos al medio de cultivo, como la intensidad de luz recibida,
temperatura y nivel de acidez o alcalinidad del medio. Por ello, cada uno de estas variables
debe ser tomada en cuenta.
TIPOS DE MEDIOS
Basado en su composición
Basados en su composición existen tres tipos principales de cultivos: naturales o empíricos,
semi-sintéticos y medios definidos sintéticos o químicos.
Medio natural
En los medios naturales la composición exacta es desconocida. Estos incluyen
ingredientes como leche, sangre diluida, zumos vegetales, extractos e infusiones de carnes
y peptonas. Por razones económicas, suelen añadirse componentes de bajo costo como
extracto de soya, suero, melaza, etc.
Medios semi-sintéticos
Se llama medio semi-sintético si se conoce parcialmente la composición del mismo.
Cualquier medio que contenga agar pasa a ser un medio semi-sintético.
Entre ellos tenemos agar papa dextrosa, agar czapek-dox, agar avena, agar peptona de
carne, entre otros ejemplos.
Medios generales
Estos admiten el desarrollo de una amplia variedad de microorganismos. Si algún
organismo necesita de condiciones especiales para su crecimiento no podrá desarrollarse
exitosamente en este tipo de cultivo.
Medios de enriquecimiento
Los medios de enriquecimiento favorecen el crecimiento de cierto tipo de microorganismo,
pero no se ha añadido ninguna sustancia para evitar que otra clase de microbios crezcan
en él.
Medios selectivos
Buscan el crecimiento específico de un microorganismo, llámese hongos, bacterias,
protozoarios, entre otros. Para ello, inhiben del desarrollo de los demás.
Para lograr este objetivo se pueden añadir compuestos químicos mortales para un amplio
grupo de microorganismos e inocuo para el organismo de interés o añadiendo fuentes de
energía que sólo sean asimilables por el microbio buscado.
Los medios selectivos son utilizados cuando se toman muestras médicas con el fin de
cultivar algún microorganismo patógeno. Acá es necesario favorecer el crecimiento del
patógeno e inhibir el desarrollo de la flora microbiana normal proveniente del paciente.
El agar sulfito de bismuto, por ejemplo, no permite el crecimiento de bacterias gram
positivas y una gran cantidad de bacterias encontradas en la cavidad gastrointestinal. Por
ello, es usado para cultivas la bacteria gram negativa causante de la fiebre tifoidea,
Salmonella typhi en muestras fecales.
Medios diferenciales
Este tipo utiliza alguna característica diagnóstica del organismo de interés (peculiaridades
en su metabolismo, por ejemplo) para poder identificarlas frente a otra especie que crece
en el mismo medio.
Tanto los medios diferenciales como los medios selectivos son de gran utilidad en el área
de la microbiología clínica y de la salud pública, ya que estas disciplinas necesitan detectar
la presencia de microorganismos específicos relacionados con patologías o condiciones
pobre de higiene.
Se pueden añadir sustancias indicadoras en el cultivo que otorguen una característica
distintiva a la colonia buscada. Por ejemplo, a los medio agar-eosina-azul de metileno
(abreviado EMB) y el agar-MacConkey se les añade lactosa y un indicador de pH.
Así, cuando se desarrolla una colonia en estos medios con la capacidad de fermentar la
lactosa y de producir aldehídos, pueden observarse de un color especial.
Un cultivo axénico consiste en una sola especie microbiana, proveniente de una sola célula.
Los cultivos axénicos son muy raros en la naturaleza. En los medios naturales -por ejemplo,
en el suelo, agua, o en el cuerpo humano- existen cultivos mixtos. En un cultivo mixto, viven
muchas y diferentes especies de forma conjunta. Un cultivo axénico se obtiene
artificialmente en el laboratorio. A la hora de obtener un cultivo axénico se han de tomar
precauciones especiales, ya que los microorganismos están por todas partes, en la
naturaleza, en el laboratorio y en los instrumentos y recipientes usados en los
experimentos. Estos microorganismos no deseados o contaminantes deben ser eliminados
de un cultivo para que éste pueda ser axénico. El segundo paso para obtener un cultivo
axénico es inocular o introducir, una sola célula de un microorganismo en un medio sólido
o liquido, esterilizado previamente. De esta manera, aislamos un solo microorganismo del
resto y se podrá multiplicar en condiciones favorables. Un clon está constituido por una
población de células descendientes de un solo microorganismo. Una colonia es un clon lo
suficientemente grande como para ser visible sobre la superficie de un medio sólido.
Un cultivo microbiano que ha estado creciendo por cierto tiempo en el mismo tubo o matraz,
debe ser transferido a un medio de cultivo nuevo, de otra manera el crecimiento y
sobrevivencia no pueden continuar. En esta transferencia se deben considerar dos
aspectos básicos referentes a: no introducir microorganismos indeseables (contaminantes)
y concentración o carga microbiana de la muestra (inóculo) a sembrar.
Con relación a la concentración del inóculo, un error frecuente del principiante consiste en
tomar muestras grandes, lo que es innecesario. Una colonia de bacterias del tamaño de la
cabeza de un alfiler contiene varios millones de microorganismos, es obvio que con una
cantidad pequeñísima (casi invisible) que se adhiera al asa, será más que suficiente para
efectuar una transferencia exitosa.
Dispositivos empleados en la transferencia de muestras microbianas: hisopo, pipeta (para
uso microbiológico son terminales y la parte superior o boquilla debe estar protegida con
filtro de algodón), pipeta pasteur, cable de Kolle o portasa con alambre de platino dispuesto
en forma de: aguja, asa, espátula y/o gancho.
En la transferencia de microorganismos se emplean agujas, asas de inoculación, hisopos,
pipetas o pipetas pasteur que deberán esterilizarse previamente. La utilización de estos
dispositivos, así como de los diferentes medios de cultivo tienen aplicaciones específicas.
Por ejemplo: los medios líquidos se preparan en tubos o matraces que se cubren con
tapones de algodón o tapones especiales. Un cultivo líquido puede ser transferido mediante
un asa microbiológica, un hisopo, pipeta o pipeta pasteur; el inóculo se deposita dentro del
caldo o medio líquido. En este tipo de cultivos los microorganismos presentan un desarrollo
particular que se manifiesta en la superficie o a través de todo el líquido. Una de las
ventajas que presenta este tipo de cultivo se refiere a la posibilidad de agitarlos acelerando
la velocidad de microorganismos anaerobios, por otra parte, en este tipo de cultivos, las
poblaciones se encuentran suspendidas y e fácil homogenizarlas, lo que permite
estandarizar la concentración del inóculo. La desventaja que presentan, e que en ellos e
difícil detectar contaminación a simple vista.
Los medios semisólidos e preparan en tubos, se inoculan con aguja de siembra (asa recta)
o pipeta pasteur; en este último caso es necesario calentar el medio y cuando se encuentra
en estado líquido y a una temperatura de aproximadamente 42ºC se agrega el inóculo, se
homogeniza y se deja solidificar. Estos medios se emplean para estudiar la movilidad de
los microorganismos y para favorecer la separación de microorganismos con diferentes
requerimientos de oxígeno.
Los medios sólidos e preparan en tubos o matraces dependiendo de la cantidad o de las
necesidades, después de esterilizarlos, estos se inclinan o vierten en cajas de petri. La
siembra se realiza con el asa, inoculando la superficie del agar con mucha suavidad; en
estos medios, los microorganismos al multiplicarse forman agregados que se hacen
visibles a simple vista; a estos agregados se les denominan colonias, las que presentan
características que varían con el tipo de microorganismo cultivado y el medio de cultivo
empleado.
En cualquier medio de cultivo es de primordial importancia ajustar el pH, ya que aún cuando
la mayoría de los microorganismos crecen mejor en pH neutro, algunos requieren de pH
alcalino o ácido, por lo que al proporcionar un pH adecuado se favorecerá el crecimiento
del microorganismo de interés y la obtención del cultivo. Con este mismo propósito durante
la incubación se deben proporcionar las condiciones adecuadas para el microorganismo
en estudio. El crecimiento óptimo de los microorganismos se presenta a temperaturas que
la mayoría de las veces están relacionadas con la de su hábitat natural.
Algunos microorganismos crecen por debajo de 15ºC, otros requieren temperaturas más
elevadas (30 a 45ºC) y algunos hasta 80ºC. Para alcanzar y mantener estas temperaturas
se puede usar una incubadora microbiológica o un baño de agua a temperatura constante,
en tanto que para lo microorganismos que presentan su crecimiento óptimo a temperaturas
entre 20 y 25ºC se pueden incubar en la gaveta o cajón del laboratorio, a temperatura
ambiente.
En general las incubadoras microbiológicas satisfacen las necesidades en cuanto a los
rangos de temperatura requeridas por los microorganismos. La desventaja que tienen es
que estos aparatos funcionan con aíre seco, lo que determina la deshidratación de los
medios de cultivo. Por lo tanto, el crecimiento de cualquier cultivo
experimental que se realice en incubadora no debe prolongare por más de nueve días. Con
relación a las necesidades gaseosas, no todos los microorganismo crecen en presencia de
oxígeno atmosférico; los que sólo crecen en presencia de aíre se llaman aerobios
obligados; los que sólo crecen en ausencia de oxígeno se denominan anaerobios obligados
o estrictos, un tercer grupo se adapta a las dos condiciones y se le conoce como
facultativos. Existe una cuarta categoría que comprende bacterias que requieren oxígeno,
pero sólo lo utilizan cuando éste existe en concentraciones reducidas; a estos se les llama
microaerofílicos. El desarrollo de estos diferentes grupos e favorece mediante la agitación
de los cultivos o mediante la exclusión de oxígeno para lo que se emplean sustancias
reductoras o equipos especiales.
TÉCNICAS DE SIEMBRA:
El método de siembra por estría en placa
Es el método más fácil y el más usado para obtener cultivos axénicos. Para ello, con un
asa de siembra se toma una muestra de la población mixta y a continuación se hacen
estrías sobre la superficie de un medio sólido preparado en una placa Petri (a las placas
Petri también se les denomina simplemente placas). Conforme se van haciendo estrías en
zigzag con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio menos
microorganismos. A continuación, se flamea el asa, se toca en la región donde se han
realizado las últimas estrías y se continúa la siembra con la misma técnica, en la superficie
de medio sin sembrar aún. Repitiendo este proceso varias veces se logra separar células
individuales. A continuación, las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que
las células aisladas experimenten un número suficiente de divisiones para formar colonias
visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon derivado de una sola célula,
no podemos asegurarlo. Quizás, dos células quedaron depositadas tan juntas que han
originado una única colonia mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un
cultivo axénico, conviene repetir el procedimiento a partir de una colonia bien aislada en la
primera placa. Las colonias que se desarrollen la segunda vez, serán, casi con toda
seguridad, cultivos axénicos.
Observación macroscópica: El tamaño de las bacterias impide verlas a simple vista. Sin
embargo, las colonias que forman sobre medios sólidos sí son visibles, y en ellas se puede
estudiar una serie de características que nos ayudan a su identificación. A nivel
morfológico, podemos estudiar la forma de las colonias, su tamaño, aspecto del borde (liso,
rugoso, ondulado, ramificado, etc.), presencia de brillo, color, etc. Incluso sobre medio
líquido las bacterias producen modificaciones de interés para su clasificación y que tienen
que ver esencialmente con las características de su metabolismo. Así se observa si la
turbidez es uniforme, si crecen en el fondo, si lo hacen en la zona superficial, si producen
pigmentos, etc.
Observación microscópica: Puesto que la inmensa mayoría de las bacterias son
incoloras, la única forma de observarlas bien en el microscopio óptico consiste en
incrementar su contraste con respecto al medio. Esto se consigue mediante su teñido
con colorantes o mediante la disposición de una óptica especial de contraste,
generalmente de fases, en el microscopio.
Para observar las bacterias teñidas, hay que proceder previamente a su fijación.
Inicialmente se prepara un frotis a partir de medio líquido o dispersando en una gota de
agua una porción de células crecidas en sólido. Posteriormente se deshidrata el frotis
por calentamiento suave utilizando el reverso de la mano como control de temperatura
tras pasar repetidamente el portaobjetos sobre la llama del mechero. Tras la fijación por
calor se procede a la tinción.
GÉNERO Y ESPECIE MACROSCÓPICAS MICROSCÓPICAS TINTORIALES
MICROSCOPÍA
Y TINCION DE GRAM
Fue necesario hacer un aislamiento por diluciones decimales a Aislamiento por estría
la muestra de lixiviados con el fin de no obtener una
sobrepoblación de microorganismos en los resultados
impidiendo así su cuantificación y su clara identificación
Se Destapo el tubo que contenía el cultivo de
microorganismos y se tomó el inóculo con el
asa estéril, depositando el inóculo sobre la
superficie de la placa de agar EMB, y se
prosiguió a deslizar el asa con el inóculo sobre
el medio de cultivo y hacer una serie de
estrías para lograr un aislamiento exitoso
Extensión Vaciado en
con varilla placa
Se mezcló inmediatamente en la
caja la muestra de lixiviados con el
medio de acuerdo a los
movimientos establecidos en la
guía; se realizaron 4 veces
Se lleva a la incubadora
RESULTADOS
TINCIÓN DE GRAM
Durante la observación de la muestra problema tomada del tubo que contenía el cultivo
de microorganismos cada integrante se familiarizo con ésta mediante la utilización del
microscopio y visualización de la misma por medio de este, cada vez que se fue
cambiando de objetivo.
Se realizó una tinción de gram durante la práctica ya que se utilizaron varios colorantes
de tinción como lo fue la fucsina y el cristal violeta.
Objetivo de 4x
Visibilidad totalmente nula de los posibles microorganismos presentes en la
muestra problema; esto debido a distancia y enfoque de este lente y también al
micro tamaño de los organismos posiblemente presentes
Objetivo de 10x
Se perciben manchas tipo colonias pero es difícilmente confirmar si realmente lo
son o por lo contrario solo son residuo o manchas de colorantes, sin embargo en
otras zonas del porta objeto se divisan pequeños puntos que al parecer son
cocos
Objetivo de 40x
Los puntos efectivamente son coco, y además se pueden notar diplococos,
estreptococos
ail
Fotografías de los medios de cultivo después de haber sembrado en ellos y de haber pasado por su
respectiva incubación
Siembra por vaciado en placa Siembra extensión con varilla Siembra aislamiento por estría
Medio de Cultivo mal preparado; Medio de cultivo exitoso; siembra Medio de cultivo exitoso, siembra
siembra por vaciado en placa de por extensión con varilla de vidrio de aislamiento por estría a partir de
microorganismos a partir de la microorganismos a partir de la agua contaminada sembrada.
dilución 10^-6 de lixiviados. dilución 10^-6 de lixiviados.
En este instancia de la práctica
las diluciones realizadas no fueron
Debido a la mala preparación del no se logró cumplir con el objetivo
suficientes para reducir la carga de
medio no se pudo cumplir con el microorganismos para la muestra a
el cual era el aislamiento de
objetivo de la siembra fracasando trabajar, pues la reproducción de microorganismo mediante la
de este modo en la cuantificación microorganismos fue excesiva técnica menciona, tal vez porque
e identificación de los posibles complicando así la cuantificación de no se realizó correctamente la
organismos presentes en la los mismos y las posibles colinas técnica o simplemente por haber
siembra mediante esta técnica presentes en el medio de cultivo, por tomado mucha muestra y al
lo tanto se debió utilizar una dilución momento de hacer las estrías se
de 10^-8 o 10^-9 de la muestra con arrastraba todo
el fin de obtener mejores resultados;
sin embargo se logró identificar 7 Sin embargo se identificaron
colonias de las cuales 6 tenían colonias de bacterias circulares e
morfología circular y bornes irregulares con una tonalidad lila
regulares y 1 contaba con con una textura lisa
morfología irregular. Todas 7 con
textura corrugosa
DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS
TINCIÓN DE GRAM
Durante la práctica se afianzaron conocimientos fundamentales de la asignatura,
logrando así un óptimo entendimiento del funcionamiento del microscopio y manejo de
muestras al igual que el procedimiento para realizar la tinción de gram.
Conforme a los resultados obtenidos y los microorganismos identificados se denota el
funcionamiento de los reactivos y colorantes al interior de las células bacterianas
utilizando como soporte para ello la literatura disponible en internet y libros a cerca del
tema; siendo así los cocos y diplococos identificados y los cuales estaban teñidos de
color rosado son bacterias gram negativas las cuales constan de una pared celular que
está formada por dos membranas lipídicas, una interna (citoplasmática) y otra externa,
con un espacio entre ellas denominado espacio periplasmático en el que se dispone una
capa de una sustancia llamada peptidoglicano; debido a su delgada capa de este último
se les clasifico como gram negativas pues por esta característica este tipo de bacterias
no pueden retener los colorantes quedando teñidas de color rosado
Por otra parte los estreptococos que se encontraron se clasifican como gram positvos
por su tinción color violeta, Esta característica química está íntimamente ligada a la
estructura de la envoltura celular, pues esta consta de una pared celular con un alto
contenido de peptidoglicano lo que les permite teñirse de este color.
Se puede concluir que el ser humano esta expuestos a diversos patógenos que
pueden hacernos daño en caso de no tener un sistema inmunológico en óptimas
condiciones
a) Medios naturales
Son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal
como ser extractos de tejidos o infusiones y cuya composición química no se
conoce exactamente.
b) Medios sintéticos
Son los medios que contienen una composición química definida cualitativamente
y cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles.
c) Medios definidos
Se conoce la cantidad exacta de cada uno de los compuestos que hay en el medio.
d) Medios complejos
Se realizan a partir de extractos naturales (extracto de levadura, sangre, etc.); no
se conoce exactamente cuál es la composición del medio; sin embargo, presenta
la ventaja de que ya están presentes todos o casi todos los elementos que una
célula puede requerir.
e) Medios selectivos
Son utilizados para favoreces el crecimiento de ciertas bacterias contenidas en
una población polimicrobiana. El fundamento de estos medios consiste en facilitar
nutricionalmente el crecimiento de una población polimicrobiana específica. Un
ejemplo de estos medios es el Caldo Selenito
f) Medios diferenciales:
Se utilizan para poner en evidencia características bioquímicas que ayuden a
diferenciar géneros o especies. Algunos ejemplos de este tipo de medios de
cultivo son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa), el agar sangre (tipo de hemólisis), el SS
(que es doblemente diferencial), entre otros.
g) Medios de enriquecimiento
Contiene los nutrientes necesarios para apoyar el crecimiento de una amplia
variedad de microorganismos, se utiliza para la cosecha de diferentes tipos de
microorganismos en un mismo medio.
BIBLIOGRAFÍA