I.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL:

1. Limpiar el lugar donde se va a trabajar, esterilizándolo

con lejía, así como también los instrumentos a utilizar.
2. Lavar y secar bien, esterilizar dos laminas porta objetos.
3. Colocar el asa de siembra al fuego del mechero por un
intervalo de 2 min, para de esta manera esterilizarlo.
4. Coger una pizca de muestra (colonia bacteriana)
con el asa de siembra, y colocarla en la lámina
porta objetos, disolviéndolo con una gota de agua.
5. Esparcir la muestra por toda la lámina porta
objetos, para darle una pasada por la llama del
mechero y así fijar la colonia.
6. Adicionar una gota del colorante cristal violeta, se deja reposar por 1 min,
para luego enjuagar ligeramente con agua destilada.
7. Se agrega una solución de lugol, que sirve para estabilizar el cristal
violeta.

8. Seguidamente añadimos acetona, para decolorar algunas bacterias.

9. Por ultimo añadimos safranina a nuestra lámina porta objetos, y se
enjuaga ligeramente con agua destilada.
10. Luego tomamos la otra lamina porta
objetos, y cogemos una pizca de otra
muestra (colonia bacteriana), con el asa
de siembra previamente esterilizado.
11. Y repetimos cada uno de los pasos desde la 5 hasta la 9.
12. Colocamos ambas láminas trabajadas en una hoja en blanco y dejamos
secar para su observación.
II. RESULTADOS:

Al realizar las pruebas para ambos porta objetos, se determinó que eran
bacterias Gram negativas porque su color no se tiño de azul oscuro o de
violeta, sino lo hicieron de rojo - rosado, esto se debe a que posee una pared
celular fina y una segunda membrana lipídica, esta hace que no se retenga el
colorante violeta dejándolas rosa por la safranina.
CUESTIONARIO:
PREGUNTA 2:
Investigue a qué se debe la afinidad de los colorantes básicos por las
bacterias, y a qué la de los ácidos
Un microorganismo gram positivo debe presentar una pared celular sana. El
mismo microorganismo, si sufre daño de la pared por una u otra causa, se vuelve
gram negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retención o el
escape del colorante. Una posible teoría del mecanismo de tinción es la
siguiente:

El colorante básico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca
insoluble en agua. El alcohol o la acetona empleados para aclarar, deshidrata
las paredes de los microorganismos gram positivos, tratados con mordiente, y
forma una barrera que la laca no puede atravesar. En las células gram negativas,
los lípidos de la pared (más abundantes que en las células gram positivas) se
disuelven por este tratamiento, lo que permite el escape del complejo de cristal
violeta con yodo. Algunos autores objetan esta teoría, pero es indudable la
importancia general de la pared celular.

Varias son las teorías emitidas para explicar el mecanismo de la tinción de Gram.
Stearn (1923) basó la suya en una combinación química entre el colorante y las
proteínas de las bacterias, las proteínas y aminoácidos son cuerpos anfóteros,
esto es, tienen la facultad de reaccionar con ácidos y con bases, gracias a sus
grupos amino y carboxilo; en soluciones ácidas, reaccionan con los ácidos, y en
soluciones alcalinas lo hacen con las bases. De igual manera, comprobaron que
la reacción de tinción de las bacterias obedece en gran parte a su contenido
proteínico; estos microorganismos se conducen como cuerpos anfóteros, al
combinarse con colorantes ácidos en soluciones ácidas y con los básicos en
medio alcalinos. La combinación con ambos tipos de colorante no se produce en
el «punto isoeléctrico». Como los microorganismos contienen más de una
proteína, ese punto no tiene un valor preciso y definido, sino que constituye más
bien una gama o escala que comprende dos o tres unidades de pH. Según Stern,
los microorganismos gram positivos tienen una escala isoeléctrica de pH inferior
a la de los microorganismos gram negativos; y, a base de sus datos
experimentales, deducen las siguientes conclusiones:

 Los microorganismos gram positivos pueden hacerse gram negativos al

aumentar la acidez.
 Los microorganismos gram negativos pueden hacerse gram positivos al
aumentar la alcalinidad.
 Los microorganismos de reacción positiva a los colorantes ácidos pueden
hacerse gram negativos por aumentar la alcalinidad.
 Los microorganismos de reacción positiva a los colorantes básicos pueden
hacerse gram negativos por aumentar la acidez.
 En la zona isoeléctrica característica de cada especie es muy escasa la
tendencia a retener cualquier colorante.
 Parece estar bien demostrado que las proteínas de las bacterias no son
simples, sino más bien una débil combinación de sustancias proteínicas con
otras lipoideas o grasas.
 La materia grasa extraída de los microorganismos gram positivos difiere de
la obtenida de los microorganismos gram negativos, en que la primera
contiene una proporción mucho mayor de ácidos no saturados que muestren
gran afinidad por los agentes oxidantes. Todos los mordientes (como el yodo)
empleados en la coloración gram son oxidantes; su efecto, en general,
consiste en dar a la sustancia oxidada un carácter más ácido. Esto aumenta
la afinidad de un microorganismo por los colorantes básicos.
 El cambio de respuesta a la coloración de Gram con el tiempo es propio,
sobre todo, de los microorganismos débilmente gram positivos cultivados en
los medios que contengan sustancias capaces de fermentar, y cuya reacción se
vuelve ácida en el curso del desarrollo.

BIBLIOGRAFIA USADA:
1- Gram, C. (1884). “La tinción diferencial de esquizomicetos en secciones
de tejido y en preparaciones secas”.Fortschritte der Medizin. Disponible
en http://www.asmusa.org/ccLibraryFiles/FILENAME/000000235/1884p2
15.pdf. Consultado el 13 de abril del 2019.