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07-09-2012

Herramientas metodológicas para el estudio del genoma y la expresión génica Dr (C). Alejandro Vera
Herramientas metodológicas para el
estudio del genoma y la expresión
génica
Dr (C). Alejandro Vera Sánchez
Universidad Metropolitana
de Ciencias de la Educación
ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE 2012

ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE 2012

TEMARIO

Extrayendo información de genes y genomas

Aproximaciones metodológicas para el estudio de la expresión génica

Estudios de la expresión desde simples genes a genomas completos

Genómica funcional y transcriptómica

07-09-2012

“Genética Molecular”

Sólo en el sentido:

Uso de secuencias de nucleótidos y su variabilidad

ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE 2012
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Secuencias de nucleótidos

Desarrollo de metodologías de

Laboratorio y Poder computacional

PCR ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE 2012
PCR
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Desarrollo de metodologías de Laboratorio y Poder computacional PCR ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE 2012
Desarrollo de metodologías de Laboratorio y Poder computacional PCR ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE 2012

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METODOS

 
METODOS    
METODOS    
 

A.- OBTENCIÓN DE DATOS MOLECULARES

Extracción DNA total

A.- OBTENCIÓN DE DATOS MOLECULARES Extracción DNA total MODELTEST
A.- OBTENCIÓN DE DATOS MOLECULARES Extracción DNA total MODELTEST

MODELTEST

 

Amplificación PCR

B.- Inferencias Filogenéticas
B.- Inferencias Filogenéticas
B.- Inferencias Filogenéticas
B.- Inferencias Filogenéticas
B.- Inferencias Filogenéticas
B.- Inferencias Filogenéticas
B.- Inferencias Filogenéticas
B.- Inferencias Filogenéticas

B.- Inferencias

Filogenéticas

B.- Inferencias Filogenéticas

Máxima Verosimilitud (ML)

Máxima Parsimonia (MP)

Máxima Verosimilitud (ML) Máxima Parsimonia (MP) Métodos Bayesianos .

Métodos Bayesianos.

B.- Inferencias Filogenéticas Máxima Verosimilitud (ML) Máxima Parsimonia (MP) Métodos Bayesianos .  
 
 
     
     
   
 
 

Secuenciación

 

BayesPh

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Edición

Inferencia de

estados ancestrales

Inferencia de estados ancestrales BayesTr
BayesTr
BayesTr
Inferencia de estados ancestrales BayesTr

Alineamiento

 
 

Estimación de tiempos de divergencia:

Estimación de tiempos de divergencia:
Estimación de tiempos de divergencia:
  Estimación de tiempos de divergencia:

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Marcadores Moleculares

Son marcadores geneticos basados en la secuencia del ADN

Problema: como conseguir suficientes copias de un gen para poder manipularlo y observarlo?

Polymerase Chain Reaction PCR

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1° denaturar 2° alinear primers 3° amplificar Taq pol ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE 2012
1° denaturar
2° alinear primers
3° amplificar Taq pol
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Repetir (1,2 y3) 30 a 50 veces ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE 2012
Repetir (1,2 y3)
30 a 50 veces
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Visualización de los productos de la PCR por medio de electroforesis

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Visualización de los productos de la PCR por medio de electroforesis ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE
Visualización de los productos de la PCR por medio de electroforesis ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE
Visualización de los productos de la PCR por medio de electroforesis ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE
Visualización de los productos de la PCR por medio de electroforesis ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE
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SECUENCIACIÓN DE ADN Método enzimático de terminación de cadena o método didesoxi de Sanger ALEJANDRO
SECUENCIACIÓN DE ADN
Método enzimático de
terminación de cadena o
método didesoxi de
Sanger
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Método automático de secuenciación
Método automático de
secuenciación
ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE 2012 Método automático de secuenciación

Problema:

1.- antiguamente la secuenciación del ADN era costosa

2.- habitualmente se trabaja con un único « gen »

3.- actualmente se requiere de evidencia independiente multiples genes”

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Utilizando pocos genes para reconstruir una filogenia

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Problema: la secuenciacion del ADN es costosa

Otras maneras de caracterizar distintos alelos

1)

Microarray

2)

SSCP

3)

RFLP

4)

RAPD

5)

Isoenzymas

(entre otros)

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Single Strand Conformational Polymorphism (SSCP)

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Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

Los individuos están caracterizados por una serie de

bandas (perfil de bandas) que representan la presencia

o ausencia de un sitio de restricción

Las bandas son distintos fragmentos de un mismo sector del ADN (locus)

Equivale a una secuenciación parcial del ADN genómico

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Restriction Fragment Length Polymorphism

(RFLP)

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Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD)

Porciones de ADN son amplificadas azarosamente en cualquier parte del genoma (nuclear y citoplasmático)

PCR Espécimen 1 RAPDs Espécimen 2 RAPDs + m ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE 2012
PCR
Espécimen
1
RAPDs
Espécimen
2
RAPDs + m
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6 perfiles = 6 fenotipos

La variabilidad (presencia o ausencia de una banda) esta debida a mutaciones en los sitios de fijacion de los partidores

Cada banda es un fenotipo « Presente » o « Ausente »

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Problemas con los RAPDs

La ausencia de una banda puede ser el

resultado de numerosas mutaciones distintas en los sitios de partidores

Dos bandas de un mismo tamaño

pueden ser de secuencia totalmente

distinta

Las bandas son fenotipos de un

carácter dominante (no se puede determinar si es homocigoto o heterocigoto)

Son muy sensibles a las condiciones de PCR

Son muy sensibles a la contaminación por otros organismos

Homoplasia

Dominancia

Falta de reproducibilidad

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Ventagas de los RAPDs

Son fenotipos de caracteres heredables

Marcan el genoma completo

Son muchos loci independientes (no ligados físicamente) => la recombinación es el principal responsable de la variabilidad genotípica

=> permite pruebas independientes de las hypotesis

Su variabilidad es generalmente neutra frente a la selección

Es relativamente económica y fácil de desarrollar

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Introducción

Los pro y contra de utilizar AFLPs:

Ventajas:

- Tiempos cortos y moderados costos de operación, permitiendo el estudio de numerosos loci (>1000).

Desventajas:

- El tipo de información genética obtenida por locus es relativamente pobre:

“La presencia o ausencia de un fragmento de DNA puede ser detectada en un locus dado, pero en la mayoría de los estudios es imposible separar entre genotipos dominantes homocigotos (1/1) y heterocigotos (1/0)”.

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Generación e interpretación de datos

ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE 2012 Generación e interpretación de datos Alelo presente = 1 Alelo
ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE 2012 Generación e interpretación de datos Alelo presente = 1 Alelo
ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE 2012 Generación e interpretación de datos Alelo presente = 1 Alelo
ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE 2012 Generación e interpretación de datos Alelo presente = 1 Alelo

Alelo presente = 1

Alelo ausente = 0

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Lectura automatizada de AFLPs (electrophenograma)

ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE 2012 Lectura automatizada de AFLPs (electrophenograma)

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Generación e interpretación de datos

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Análisis Genético ?

Antes de comenzar un proyecto, tener en cuenta dos importantes criterios (Mariette et al., 2002):

1) Marcadores numerosos pero menos informativos distribuidos azarosamente dentro del genoma = AFLP.

2) Unos pocos marcadores altamente informativos = microsatélites, secuenciación de DNA o SNPs.

ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE 2012 1 = pobre → 5 = excelente
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1 = pobre → 5 = excelente

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El estudio de la expresión génica ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE 2012
El estudio de la expresión génica
ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE 2012
El estudio de la expresión génica En un mamífero una célula cualquiera puede expresar unas
El estudio de la expresión génica
En un mamífero una célula cualquiera puede expresar unas
5000 proteínas diferentes a partir de ~35000 genes.
La mayor parte de estas proteínas son necesarias para
cualquier tipo celular y normalmente se expresan en forma
constitutiva (housekeeping proteins housekeepingen).
Otras solo se encuentran presentes en algunos tipos celulares.
Como se regula este proceso?
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TRANSCRIPCION:

SINTESIS ENZIMATICA DE RNA (RNA POLIMERASA) UTILIZANDO UNA MOLECULA DE DNA COMO TEMPLADO.

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3 RNA Polimerasas

RNA polymerase I transcribes most rRNA genes RNA polymerase II transcribes all protein-coding genes RNA polymerase III transcribes tRNA genes and 5S rRNA genes

3 tipos de RNA

rRNAs FORMAN PARTE ESTRUCTURAL DE LOS RIBOSOMAS mRNAs CODIFAN PARA PROTEINAS tRNAs TRANSPORTAN AMINOACIDOS AL RIBOSOMA

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DONDE SE INICIA Y TERMINA LA TRANSCRIPCION

SEPTIEMBRE 2012 DONDE SE INICIA Y TERMINA LA TRANSCRIPCION Promotor: secuencia río arriba del inicio de

Promotor: secuencia río arriba del inicio de la transcripción donde se une el complejo de transcripción incluyendo la RNA polimerasa. Factor de transcripción: proteínas que regulan la expresión génica, se unen a secuencias del DNA río arriba del sitio de inicio de la transcripción o al complejo de transcripción, estimulando o reprimiendo la actividad del complejo.

DONDE SE INICIA Y TERMINA LA TRANSCRIPCION

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Dominio CTD ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE 2012
Dominio CTD
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Factores generales de transcripción

TFIID: 2 subunidades (TBP y 1complejo de 10 TAFs) TFIIB: (1 proteína) media la interacción entre TFIID y la Polimerasa TFIIF: (4 proteínas) estabiliza el complejo DNA-TBP-TFIIB. TFIIE: (4 proteinas) regula TFIIH y en conjunto promueven la formación la adición del primer nucleotido del RNA. TFIIH: es el complejo de mayor tamaño (9 subunidades) actividad helicasa y de reparación de DNA.

La RNA polimerasa (12 subunidades) requiere de estos factores para Posicionar correctamente la enzima regular su actividad

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Existen complejos de proteínas que integran señales de regulación tanto de otros factores de transcripción como de señales provenientes de la célula

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Activación de la transcripción vía “mediator” •Se unen a la RNA polimerasa •Pueden regular la
Activación de la transcripción vía “mediator”
•Se unen a la RNA polimerasa
•Pueden regular la actividad de TFIIH
CTD kinasa
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Dominio CTD

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1.- EXTRACCIÓN DEL ARNm ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE 2012
1.-
EXTRACCIÓN
DEL ARNm
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2.- SINTESIS DEL cDNA ALEJANDRO VERA SÁNCHES, UMCE, SEPTIEMBRE 2012
2.-
SINTESIS DEL
cDNA
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Microarray para detectar Single Nucleotide Polymorphism (SNP)

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AGRADECIMIENTOS

A Luis Pastenes, U de Chile por su ayuda con la bibliografía

BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA

1.- Hoy., Marjorie. 2003. Insect Molecular Genetics , 2° edición, Academic Press, USA

2.- Moody, D.E., 2001. Genomics techniques: An overview of methods for the study of gene expression. J Anim Sci 79:E128-E135.

3.-Stapley, Jessica, Reger, Julia , Feulner, Philine G.D. , Smadja, Carole ,Galindo, Juan , Ekblom, Robert, Bennison, Clair, Ball, Alexander D.,Beckerman, Andrew P. y Slate, Jon. 2010. Adaptation genomics: the next generation. Trends in Ecology and Evolution Vol.25

No.12

4.- Caruz, Antonio. Clases del curso Genética Molecular”Universidad de Jaén.