Dantur, K. I., Enrique, R., Welin, B., & Castagnaro, A. P. (2015).

Aislamiento de bacterias celulolíticas del intestino de larvas de Diatraea saccharalis y

evaluación de su capacidad para degradar la biomasa de la caña de azúcar
La necesidad de reemplazar los combustibles fósiles con alternativas renovables más
amigables con el medio ambiente ha despertado un interés creciente en encontrar recursos
abundantes y baratos para la producción de biocombustibles. Una de las alternativas más
interesantes y prometedoras a corto y mediano plazo, es el bioetanol de segunda generación
(B2G) producido a partir de subproductos lignocelulósico de actividades agrícolas,
forestales e industriales o de residuos urbanos.
El material lignocelulósico de origen natural, especialmente en forma de material de pared
de células vegetales, es una mezcla renovable, abundante y relativamente barata de
materiales orgánicos, que contiene principalmente polisacáridos (~ 75% en peso seco) y
lignina (~ 25% en peso seco). Sin embargo, todavía no existe un sistema de producción
industrial económicamente viable para la producción de bioetanol a escala industrial a
partir de lignocelulosa o la biomasa de caña de azúcar. Una de las principales razones del
alto costo de producción de B2G es la resistencia de la lignocelulosa a la hidrólisis
enzimática, que requiere una etapa de pretratamiento antes de una degradación eficiente a
base de enzimas (Canilha et al., 2012; Cardoso et al., 2012).
Si bien se aplica un pretratamiento de la biomasa vegetal, aún se necesitan grandes
cantidades de enzimas para obtener una degradación rápida y eficiente de la celulosa y las
hemicelulosas, por lo que se necesitan cócteles enzimáticos nuevos y más eficientes para
generar un proceso de degradación más económico para la producción de bioetanol. La
degradación natural de la lignocelulosa, es una parte esencial del ciclo del carbono, se lleva
a cabo por microorganismos altamente especializados que degradan la madera (hongos y
bacterias) y microbios simbióticos encontrados en los intestinos de muchos animales que se
alimentan de plantas. La hidrólisis de la celulosa es un proceso multi-enzimático que
implica al menos tres tipos diferentes de actividades enzimáticas con el fin de liberar la
unidad básica más pequeña, es decir una molécula de glucosa. Entre estas encontramos, las
endo-β-glucanasas rompen la cadena principal de celulosa, reduciendo la longitud de la
cadena, donde las exo-β-glucanasas atacan para liberar oligómeros de glucosa de cadena
corta. Finalmente, las cadenas cortas de glucosa liberadas después de los ataques con
exoglucanasa se hidrolizan a unidades de glucosa simples por una β-glucosidasa.
El barrenador de tallos de la caña de azúcar Diatraea saccharalis es la principal plaga de la
caña de azúcar en Argentina y causa daños considerables a las plantas infestadas, lo que
facilita infecciones secundarias fúngicas y / o bacterianas, lo que resulta en importantes
pérdidas económicas para los productores debido a la alta y rápida capacidad de
alimentación de las larvas de esta especie.
Teniendo en cuenta lo anterior los investigadores se plantearon la siguiente hipótesis de que
las larvas que solo se alimentan de caña de azúcar podrían haber desarrollado una
comunidad consorcial de bacterias simbióticas que poseen un arsenal enzimático que
degrada eficazmente el tejido vegetal de la caña de azúcar.
Para corroborar esta hipótesis se plantearon el objetivo aislar las bacterias celulolíticas de
las larvas que se alimentan de caña de azúcar para explorar su potencial como fuente de
enzimas para la degradación eficiente de la biomasa de caña de azúcar que podría
emplearse en la producción de bioetanol de segunda generación u otros tratamientos de
biomasa.

Materiales y métodos
Aislamiento de bacterias celulolíticas del intestino de Diatraea saccharalis
Se colectaron larvas de quinto estadio de D. saccharalis en campos de caña de azúcar en la
Estación Experimental Agroindustrial Obispo Colombres (EEAOC), Tucumán, Argentina,
y se esterilizaron superficialmente con etanol al 70%, antes de que las vísceras fueran
disectadas asépticamente de réplicas de diez larvas. Los intestinos aislados se cortaron en
trozos pequeños, se homogeneizaron en una solución salina isotónica antes de sembrar en
un medio de agar salino mínimo que contenía 0.5% de glucosa, bagazo de caña de azúcar
finamente molido o restos de cosecha (HT) como única fuente de carbono.

Los cultivos se incubaron durante 3 días a 37 ° C y se aislaron colonias bacterianas capaces

de crecer en celulosa como única fuente de carbono. La capacidad de degradar la celulosa
se confirmó repicando las bacterias en el mismo agar salino mínimo suplementado con
carboximetilcelulosa al 0,5% (CMC). Después de 4 días de incubación a 30 ° C, el medio
se trató con 0,1% (p / v) de rojo congo acuoso, un indicador específico para la hidrólisis de
la celulosa dejando un halo claro donde la CMC se ha degradado.

Identificación de aislados bacterianos y análisis de homología de secuencia del gen 16S

rDNA

Se realizó la extracción de ADN con el kit PureLink Genomic DNA (Invitrogen, EE. UU.)
De acuerdo con las instrucciones del fabricante. Se emplearon primers universales
bacterianos fD1 y rP1 para amplificar el gen 16S rDNA a partir de ADN genómico. Se
realizó (PCR) Todos los productos de ADN amplificados se controlaron mediante
electroforesis en gel de agarosa al 1% (p / v) teñidos con GelRed (Biotium, EE. UU.).
Posteriormente Los productos de amplificación de 1,5 Kb se purificaron directamente a
partir de la reacción de PCR utilizando el kit de purificación PureLink Quick PCR
(Invitrogen, Alemania) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Las reacciones purificadas fueron secuenciadas por el Servicio de Secuenciación del

Instituto de Biotecnología, INTA Castelar usando un analizador de ADN capilar Todas las
secuencias se alinearon y comfrontaron con la base de datos NCBI y en la base de datos
RDP 2 utilizando el algoritmo BLAST (Alignment Local Basic and Search Tool) (Altschul
et al., 1997). Las secuencias de ADNr 16S alineadas se analizaron en base a sus
características homólogas y se construyó un árbol filogenético utilizando la versión en línea
de software MAFFT 7 utilizando la opción neighbor-joining con un análisis de arranque de
1.000 replicaciones aleatorias.
Determinación de la actividad celulasa total
Las bacterias se cultivaron durante toda la noche en medio Luria-Bertani (LB) y 20 μl de
una suspensión bacteriana ajustada a una D.O. de 0,2 se aplicó a continuación como una
gota sobre placas de agar sólido que contenía el medio mínimo de solución salina descrito
anteriormente suplementado con 0,5% (p / v) bagazo finamente molido o residuos de
cosecha de caña de azúcar. Las bacterias se cultivaron durante una quincena a 30 ° C y las
placas se tiñeron posteriormente con rojo Congo para determinar la posible degradación de
la celulosa. El diámetro de la zona clara alrededor de la gota bacteriana es indicativo de la
magnitud de la actividad celulolítica.

Ensayo de actividad de CMCasa extracelular

Veinte (20) micro litros de una suspensión de un cultivo bacteriano se ajustaron a un O.D.
de 0.2 y aplicado, como una gota, en un medio mínimo sólido que contiene 0.1% de
glucosa y 0.5% (p / v) de CMC. Después, las placas se incubaron a 30 ° C durante 10 días
antes de fotografiar las placas para controlar el crecimiento bacteriano y posteriormente se
tiñeron con rojo Congo para visualizar la actividad endoglucanasa extracelular. El índice de
actividad enzimática (EIA) se calculó como el diámetro del halo claro más el diámetro de la
colonia / diámetro de la colonia. Una bacteria con una EIA superior a 2.5 se considera
como un productor de enzimas celulolíticas.
Para evaluar la actividad de endoglucanasa extracelular en medio líquido, se inocularon
células bacterianas cultivadas en un medio rico en un medio salino mínimo (descrito
previamente) suplementado con glucosa al 0,2%, triptona al 0,2% y CMC al 0,5% (p / v)
(medio de adaptación) y se incubaron durante 24 horas a 37 ° C. Las células bacterianas
adaptadas se inocularon en medios mínimos con diferentes fuentes de carbono como se
menciona anteriormente y se incubaron durante 14 días en un Shakers a 150 rpm a 30 ° C.
Las muestras se tomaron a diferentes tiempos (5, 10, 14 días después de la inoculación) y se
centrifugaron, primero a 5.000 rpm durante 15 minutos y después a 20 minutos a 13.000
rpm. La concentración de proteína total se cuantificó por el método de Bradford con el kit
de ensayo de proteínas Bio-Rad (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA) usando albúmina
de suero bovino como estándar de proteína (Bradford 1976). Se aplicaron 200 microlitros
(200 μl) que contenían 10 μg de proteína total en pequeños pocillos en placas de agar que
contenían medio mínimo suplementado con 0,5% (p / v) de CMC. Después, las placas se
incubaron durante 10 días a 30 ° C antes de superponerse con rojo Congo. Un halo claro
alrededor de un pozo indica actividad celulolítica extracelular.
La actividad de la enzima endocelulolítica se midió usando el reactivo, ácido 3,5
dinitrosalicílico (DNS) (Miller 1959). La mezcla de reacción consistió en 100 μl de CMC al
2% (p / v) en tampón de acetato de sodio 100 mM (pH 5,0), a lo que se añadieron 100 μl de
los sobrenadantes obtenidos antes de la incubación a 40ºC durante diferentes puntos de
tiempo. Para detener la reacción, se añadieron 200 μl de reactivo DNS y la mezcla de
reacción se calentó a 100 ° C durante 10 min. A continuación, la mezcla se dejó enfriar a
temperatura ambiente, se centrifugó y luego se midió la absorbancia a 540 nm usando un
espectrofotómetro. Una unidad de actividad enzimática se define como la cantidad de
enzima necesaria para liberar 1 μmol de azúcares reductores (medidos como glucosa) por
ml / min durante la reacción.
Microscopía electrónica de barrido

La microscopía electrónica de barrido (SEM) se utilizó siguiendo el protocolo descrito por

Karnovsky (1965). Brevemente, se recogieron cultivos bacterianos durante 7 días a partir
de medios mínimos con 0,5% de bagazo o HT y se fijaron durante la noche a 4ºC en
paraformaldehído al 8%, tampón de fosfato de sodio 0,1 M a pH 7,4 y glutaraldehído al
25%. La suspensión se lavó en tampón de fosfato de sodio 3 veces durante 10 minutos cada
vez y se fijó después en una solución de tetróxido de osmio al 2% en tampón de fosfato de
sodio. Después de la fijación, las muestras se deshidrataron gradualmente con 30%, 50%,
70%, 80%, 90% y 100% de concentraciones de etanol, seguido de un tratamiento final
usando 100% de acetona. Para preservar la estructura de la superficie de la muestra y evitar
el daño debido a la tensión superficial durante la observación microscópica, se utilizó el
procedimiento de punto crítico. La muestra se montó luego en un soporte de muestra de
aluminio y se cubrió con una capa de oro y se observó bajo alto vacío en un microscopio
electrónico de barrido Zeiss Supra 55 VP (Carl Zeiss, Oberkochen, Alemania) en el CIME
(Centro Integral de Microscopía Electrónica, INSIBIO , Tucumán, Argentina).

Resultados
Aislamiento de bacterias celulolíticas del intestino de Diatraea saccharalis
Con el fin de aislar simbiontes bacterianos del intestino de D. saccharalis alimentado con
caña de azúcar, se recolectaron larvas de quinto estadio en campos de producción de caña
de azúcar en la provincia de Tucumán en el noroeste de Argentina. Los intestinos de las
larvas se diseccionaron inmediatamente y se plaquearon en placas de agar que contenían un
medio de crecimiento bacteriano mínimo suplementado con glucosa o biomasa de caña de
azúcar en forma de bagazo o restos de cosecha (HT), como única fuente de carbono. A
partir de estas placas iniciales se aislaron 118 colonias bacterianas que mostraron actividad
preliminar de degradación de celulosa deducida de la formación de halo alrededor de la
colonia bacteriana cuando se trató con rojo Congo (Figura 1A), ochenta a partir de placas
de glucosa (1,2 × 108 unidades formadoras de colonias.ml-1) y treinta y ocho de las dos
placas de sustrato de lignocelulosa (2,0 x 105 unidades formadoras de colonias.ml-1).
Después de una ronda de purificación de colonias, todas las colonias bacterianas indicadas
para poseer actividad de celulasa se volvieron a analizar para la capacidad de degradación
de la celulosa utilizando un medio de crecimiento mínimo complementado con CMC.
Treinta y ocho de las 118 colonias bacterianas originalmente aisladas, diecinueve de placas
de glucosa y diecinueve de placas de biomasa de caña de azúcar, mostraron zonas de
aclaramiento variable alrededor de la colonia bacteriana después de la incubación con rojo
Congo (Figura 1B) y fueron seleccionadas para estudios posteriores.

Taxonomía bacteriana y el análisis de secuenciación del gen 16S rDNA

Se usó una secuencia de una cepa Chlamydia pneumoniae CHT16SR (L06108) para
enraizar el árbol. Las secuencias del gen 16S rDNA resultantes para los aislamientos
Klebsiella oxytoca Kd70 TUC-EEAOC, K. pneumoniae KdB5 TUCEEAOC, K. variicola
KdB1 TUC-EEAOC, Stenotrophomonas maltophilia Kd3 TUC-EEAOC, S. rhizophila
Kd46 TUC-EEAOC, Bacillus pumilus Kd109 TUC- EEAOC, Enterococcus casseliflavus
Kd7 TUC-EEAOC, Microbacterium hominis KdL49 TUC-EEAOC, M. schleiferi KdL45
TUC-EEAOC se enviaron a GenBank con los números de acceso de KM096608,
KM096599, KM096598, KM096600, KM096602, KM096605, KM096606, KM096603,
KM096601 respectivamente. .
Klebsiella oxytoca Kd70 TUC-EEAOC, Bacillus pumilus Kd109 TUC-EEAOC,
Stenotrophomonas maltophilia Kd3 TUC-EEAOC, Enterococcus casseliflavus Kd7
TUCEEAOC se han depositado en la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos
Celulares (DSMZ, http: // www. Dsmz.de) como accesión DSM 27019, DSM 27021, DSM
27017 y DSM 27018 respectivamente.
La amplificación de ADN in vitro mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
de la secuencia del gen 16S rDNA completo se realizó usando como molde ADN genómico
aislado de las 38 cepas bacterianas que muestran actividad celulolítica. Los fragmentos de
ADN amplificados de tamaño correcto se secuenciaron y se compararon con las secuencias
de ADNr 16S conocidas en la base de datos de ADN GenBank y el Proyecto de base de
datos Ribosomal. La alineación de secuencias nos permitió identificar aislamientos a nivel
de género y, en algunos casos, a nivel de especie (Tabla 1).
El correspondiente análisis filogenético basado en las secuencias del gen 16S rDNA
obtenidas se presenta en la Figura 2, donde el árbol de homología muestra dos grupos
principales, bacterias Gram-negativas y Gram-positivas. El primer grupo contenía aislados
pertenecientes al phylum Proteobacteria, que incluía especies de los géneros
Stenotrophomonas (5,2%) y Klebsiella (47,4%). El grupo Gram-positive incluyó bacterias
pertenecientes a la phyla Actinobacteria, representadas por especies del género
Microbacterium (13.2%), y Firmicutes representadas por especies de los dos géneros,
Enterococcus (23.7%) y Bacillus (10.5%). Las secuencias del gen 16S rDNA de las cepas
aisladas mostraron una homología de nucleótidos que oscilaba entre 97.0 y 99.8% con
cepas bacterianas publicadas en la base de datos. La bacteria Gram-negativa Klebsiella
oxytoca Kd70 TUC-EEAOC aislado fue filogenéticamente la más estrechamente
relacionada con la cepa K. oxytoca KCTC1686 (99.0% de homología de secuencia). El
aislado de Klebsiella pneumoniae KdB1 TUC-EEAOC mostró una similitud de secuencia
del 99,0% con la cepa K. pneumoniae MGH78578, mientras que Klebsiella variicola KdB5
TUC-EEAOC estaba muy relacionado con la cepa K. variicola At-22 (99,7% de similitud
de secuencia). El aislado Stenotrophomonas maltophilia Kd3 TUC-EEAOC compartió una
identidad de secuencia del 98,3% con la cepa S. maltophilia R551-3 y S. rhizophila Kd46
TUC-EEAOC mostró una homología del 99,0% con la cepa S. rhizophila ep-10.
En el caso de los aislados Gram-positivos, el aislado Kd109 TUC-EEAOC identificado
como Bacillus pumilus mostró un 99.5% de homología de secuencia de rDNA 16S con la
cepa B. pumilus SAFR-032. El aislado KdL49 TUC-EEAOC (Microbacterium hominis)
está muy estrechamente relacionado con la cepa M. hominis DSM-12509 con una
homología de secuencia del 99,8%, mientras que KdL45 TUC-EEAOC (M. schleiferi) es
filogenéticamente más estrechamente relacionado con la cepa M. schleiferi DSM-20489
(97.0% de identidad). Finalmente, el aislado Kd7 TUC-EEAOC (Enterococcus
casseliflavus) mostró una homología del 99,0% con la cepa E. casseliflavus EC-20.

Ensayo de actividad total de celulasa

Se analizó la actividad exo y endoglucanasa de los treinta y ocho (38) aislamientos
bacterianos seleccionados utilizando placas de agar que contenían bagazo, HT o CMC
como fuentes de carbono. Entre los aislamientos probados, solo las cepas pertenecientes a
las especies de los géneros Klebsiella y Bacillus demostraron claras actividades totales de
celulasa y endoglucanasa (Figura 3A, 3B, 3C y Tabla 1). Las bacterias pertenecientes a las
especies de los géneros Enterococcus y Stenotrophomonas mostraron una actividad
endoglucanasa marcada en las placas de CMC (Figuras 3C y 4A) pero a pesar de que
pudieron crecer en sustratos de lignocelulosa no mostraron ninguna zona clara de hidrólisis
en los sustratos de biomasa de caña de azúcar (Figuras 3A, 3B y 4A). Las cepas bacterianas
de especies que pertenecen al género Microbacterium mostraron una actividad celulolítica
muy baja cuando se cultivaron en placas de CMC y no pudieron crecer en ninguno de los
dos sustratos de lignocelulosa de caña de azúcar ensayados (Figura 3A y Figura 3B).
Como se muestra en la Figura 3C y la Tabla 1, los aislados bacterianos de Klebsiella,
Bacillus, Enterococcus, Stenotrophomonas y Microbacterium produjeron zonas claras de
tamaño variable en placas de CMC. Después de 4 días de incubación, la cepa de B. pumilus
generó el mayor halo que indica la mayor actividad de celulasa de todas las cepas aisladas
analizadas. La cepa B. pumilus produjo un halo con un diámetro de 7 cm, mientras que las
cepas pertenecientes al género Klebsiella produjeron halos de 5.5 y 5.0 cm de diámetro.
Finalmente, las cepas pertenecientes a especies de los géneros Enterococcus,
Stenotrophomonas y Microbacterium mostraron áreas mucho más pequeñas de
decoloración con diámetros que varían de 2.5 a 1.5 cm (Tabla 1).
Para investigar si los aislamientos de Klebsiella oxytoca, K. pneumoniae, K. variicola y
Bacillus pumilus, que mostraron la mayor actividad celulolítica, estaban constituidos por
diferentes genotipos, la técnica de elementos extrangénicos palindrómicos repetidos - PCR
huella genomica (rep-PCR) se realizó basándose en análisis de clúster que combina los
marcadores ERIC, BOX y REP. Los estudios de diversidad genética de los dieciocho (18)
aislamientos de Klebsiella revelaron 3 conglomerados que separan las tres especies
mencionadas, pero en solo una de las especies, Klebsiella oxytoca, se detectaron diferencias
genéticas entre las cepas donde se encontró que la cepa Kd-70 TUCEEAOC era
genéticamente distinta a los otros aislamientos (datos no mostrados). Se encontró que los
cuatro aislados de Bacillus pumilus consistían en dos genotipos diferentes que se agrupaban
en dos grupos, cada uno formado por dos miembros (datos no mostrados).

Ensayo de actividad de CMCasa extracelular

La actividad total de endoglucanasa producida por las cepas aisladas se ensayó en medio
sólido y líquido, mientras que la actividad endoglucanasa extracelular se evaluó usando
placas de agar que contenían CMC, donde alícuotas de 200 μL de sobrenadantes libres de
células y fibras obtenidas de cultivos bacterianos complementados con CMC o biomasa de
caña de azúcar se aplicaron. Después de la incubación a 30 ° C durante 10 días y la
posterior tinción con rojo Congo, la formación de halo alrededor de los pozos inoculados
mostró actividad de celulasa extracelular. Es interesante observar que el diámetro de halo
más grande, que indica una actividad más alta (relación> 5,0), se observó para las especies
de Klebsiella y Bacillus cuando los cultivos se incubaron en presencia de sustratos
celulósicos insolubles o solubles (Figura 4A), corroborando nuestros resultados de las
mediciones de actividad de celulasa total (Figura 3A, 3B y 3C).
Por el contrario, las especies pertenecientes a los géneros Stenotrophomonas y
Enterococcus solo mostraron una actividad extracelular moderada cuando se incubaron en
medio suplementado con CMC y no mostraron actividad mensurable cuando se cultivaron
en sustratos celulósicos insolubles (Figura 4A). Estos resultados son consistentes con los
perfiles de crecimiento y halo obtenidos en las placas de biomasa de CMC y caña de azúcar
en las Figuras 3A, 3B y 3C. No se encontró actividad de celulasa extracelular detectable
para especies que pertenecen a Microbacterium cultivadas en medio que contiene CMC o
biomasa de caña de azúcar (datos no mostrados).
Al analizar la concentración de proteína total en el medio extracelular durante el
crecimiento en CMC, se encontró la mayor acumulación de proteína para Klebsiella
oxytoca Kd70 TUC-EEAOC (46.6 μg / ml) y Bacillus pumilus Kd109 TUC-EEAOC (28.3
μg / ml) seguido de Stenotrophomonas maltophilia Kd3 TUC-EEAOC y Enterococcus
casseliflavus Kd7 TUC-EEAOC con 5,5 μg / ml y 7,8 μg / ml, respectivamente (Tabla 2).
Cuando el cultivo se realizó en medios suplementados con bagazo de caña de azúcar, se
observó la misma tendencia que con la CMC. En este caso, cantidades similares de proteína
extracelular fueron secretadas por K. oxytoca (21.08 μg / ml) y B. pumilus (17.47 μg / ml)
mientras que en el caso de E. casseliflavus y S. maltophilia se detectó muy poca o ninguna
proteína en el sobrenadante (Tabla 2).
Al cuantificar la actividad CMCasa, se observaron las actividades enzimáticas más altas
para B. pumilus (0,32 U / ml) y K. oxytoca (0,22 U / ml), mientras que se obtuvieron
actividades mucho más bajas para las cepas pertenecientes a E. casseliflavus y S.
maltophilia. Se observó el mismo patrón de actividad enzimática para las cepas cultivadas
en biomasa de caña de azúcar con los valores más altos para B. pumilus (0.23 U / ml) y K.
oxytoca (0.13 U / ml), mientras que E. casseliflavus y S. maltophilia mostraron valores
mucho más bajos o actividad CMCasa no detecta (Tabla 2). Se obtuvieron valores similares
a los determinados para K. oxytoca y S. maltophilia cuando se analizaron las otras especies
de Klebsiella y S. rhizophila (datos no mostrados).
Adherencia de células bacterianas a material celulósico insolubleUn paso importante para
la hidrólisis bacteriana eficiente de la celulosa y la hemicelulosa es la adhesión de las
bacterias a la fibra del sustrato. Para verificar que los aislamientos bacterianos del intestino
de D. saccharalis puedan unirse al material de biomasa de la caña de azúcar, se realizaron
estudios de microscopía electrónica de barrido en bagazo y HT incubados con una bacteria
Gram positiva (Enterococcus) y una bacteria Gram negativa (Klebsiella), respectivamente.
Como se puede ver en la Figura 5, ambas cepas se adhieren firmemente tanto al bagazo de
caña de azúcar (izquierda) como a las fibras HT (derecha). La cepa de Klebsiella oxytoca
Kd70 TUC-EEAOC se unen como células bacterianas individuales en forma de barra,
mientras que la cepa de Enterococcus casseliflavus Kd7 TUC-EEAOC se encuentra
característicamente unida en pares de células.
Figura 3 Ensayo celulolítico cualitativo de aislados bacterianos. Placas sólidas de agar
que contienen un medio salino mínimo suplementado con (A) bagazo, (B) residuos de
cosecha (HT) y (C) carboximetil celulosa (CMC) como únicas fuentes de carbono. Las
bacterias se dejaron crecer durante 15 días a 30 ° C antes del tratamiento con rojo Congo.
Los halos alrededor de las colonias bacterianas son indicativos de la degradación de la
celulosa. Abreviaciones de las bacterias: E = Enterococcus casseliflavus cepa Kd7 TUC-
EEAOC, K = Klebsiella oxytoca cepa Kd70 TUC-EEAOC y B = Bacillus pumilus cepa
Kd109 TUC-EEAOC, S = Stenotrophomonas maltophilia Kd3 TUC-EEAOC, M =
Microbacterium hominis KdL49 TUC-EEAOC y Ec = Escherichia coli DH5α como control
negativo.
Figura 4 Medida de la actividad endoglucanasa extracelular. A) Actividad enzimática
probada mediante hidrólisis de CMC por sobrenadantes de bacterias cultivadas en CMC y
bagazo. Los sobrenadantes exentos de células y fibras se incubaron durante 10 días a 30 ° C
antes de teñir con rojo Congo. Los halos alrededor de los pozos indican actividad de
endoglucanasa extracelular. B) Concentración de proteína extracelular total medida por el
método de Bradford de cultivos bacterianos incubados en medio que contiene residuos de
caña de azúcar o CMC. C) Actividad de CMCasa en sobrenadantes de cepa bacteriana
seleccionada para alta actividad celulolítica cultivada en CMC y bagazo expresado en
unidades.ml-1. Abreviaciones bacterianas: E = Enterococcus casseliflavus Kd7 TUC-
EEAOC, K = Klebsiella oxytoca Kd70 TUC-EEAOC y B = Bacillus pumilus Kd109 TUC-
EEAOC, S = Stenotrophomonas maltophilia Kd3 TUC-EEAOC.

Discusión
De un total de 118 aislamientos bacterianos cultivables obtenidos de intestinos de D.
saccharalis alimentados con caña de azúcar, se descubrió que un tercio (38) posee actividad
celulolítica determinada por la degradación de la CMC. Los estudios de homología de
secuencia de 16S rDNA de las 38 muestras revelaron que todas las cepas celulolíticas
pertenecían a las 3 phyla γ-Proteobacteria, Actinobacteria y Firmicutes, que estaban
representadas por especies pertenecientes a cinco géneros diferentes: Klebsiella,
Stenotrophomonas, Microbacterium, Bacillus y Enterococcus.
Los miembros de estos géneros son de amplia distribución en la naturaleza y todos ellos
han sido aislados previamente de las entrañas de los insectos (Cardoso et al., 2012; Huang
et al., 2012; Shao et al., 2014), que poseen actividad celulolítica (Teather y Wood 1982;
Ohkuma y otros 1995; Charrier et al., 1998; Dillon y Dillon 2004; Prem Anand y Sripathi
2004; Ariffin y otros, 2006; Charrier et al., 2006; Mohamed y Huang, 2007; Anand, et al.,
2010; Suen et al. al. 2010; Okeke y Lu 2011; Ko et al., 2011; Huang et al., 2012) y todas
las especies excepto el género Enterococcus han sido reportadas como endofitos de plantas
(Zinniel et al., 2002; Asis y Adachi 2004; Dillon y Dillon 2004; Velazquez et al., 2008;
Malfanova et al., 2011; Huang et al., 2012; Mingyue et al., 2013; Murugappan et al., 2013;
Ren, et al., 2013; Chun-Yan et al., 2014; Soni, et al. . 2014). Tomando en cuenta la extensa
información sobre literatura, parece plausible concluir que la mayoría de las bacterias
celulolíticas aisladas en este estudio existen en la planta y están colonizando el intestino al
alimentar las larvas con tejido vegetal.
El único género de bacterias aislado del intestino de D. saccharalis que no se ha informado
en las plantas es Enterococcus, lo que sugeriría una colonización del intestino larvario del
insecto adulto a través del huevo, como se ha demostrado para Enterococci en otras larvas
de Lepidoptera ( Brinkmann et al. 2008).
Es interesante observar que muchos estudios de microbiota intestinal de insectos herbívoros
están dominados por miembros de los phyla Actinobacterias, γ-Proteobacteria y Firmicutes,
en los cuales la principal función simbiótica sugerida es la fijación de nitrógeno, la
desnitrificación, la degradación de carbohidratos, la desintoxicación y diversos roles de
defensa contra los patógenos (Schloss et al., 2006; Pittman et al., 2008; Hernández et al.,
2013; Shao, et al., 2014). Una función similar, predominantemente nutritiva y de defensa
para las bacterias aisladas del intestino de D. saccharalis es muy probable ya que los tallos
inmaduros de la caña de azúcar, de donde se recolectaron las larvas, tienen un valor
nutricional muy bajo que contiene bajas cantidades de nitrógeno, proteínas, vitaminas,
azúcares y minerales
Para estudiar y caracterizar aún más la actividad celulolítica de las cepas degradantes de
CMC aisladas del intestino de D. saccharalis, se realizaron experimentos utilizando
residuos agrícolas de caña no pretratados como sustrato para reproducir la alimentación
natural de las larvas. Estos estudios revelaron que de todas las especies de los cinco géneros
bacterianos aislados; solo las especies de Bacillus y Klebsiella poseen una capacidad
celulolítica relativamente alta cuando se cultivan en biomasa de plantas de caña de azúcar,
lo que indica que estos géneros son capaces de metabolizar de manera eficiente tanto la
celulosa soluble como insoluble, un requisito previo para la digestión completa de la
biomasa lignocelulósica.
Otra observación interesante de los estudios celulolíticos de cepas pertenecientes a especies
de estos dos géneros fue que la biomasa de la caña pareció inducir una mayor actividad
enzimática extracelular, como se deduce de los halos más grandes observados en las placas
de bagazo y HT de caña de azúcar teñidas con rojo Congo (cph), en comparacion con la
CMC y otras fuentes de carbono. Esta observación indica que podría haber una mayor
especificidad y / o eficiencia en la degradación de la biomasa de la caña de azúcar para
estas bacterias, lo que apoyaría nuestra hipótesis inicial. El apoyo a esta observación son
estudios que muestran una clara correlación entre los cambios en los simbiontes intestinales
bacterianos con diferentes biomasa de alimentación. Como ejemplo, las larvas de
Lepidoptera Spodoptera littoralis alimentadas con alimento artificial, frijol lima y cebada
mostraron una composición muy diferente de las especies intestinales bacterianas en un
estudio metagenómico (Tang et al., 2012).
Curiosamente, numerosas bacterias pertenecientes a los géneros Klebsiella se encontraron
cuando las larvas se alimentaban de cebada pero estaban ausentes en larvas de la
alimentación artificial o solo se encontraban en muy baja representación en insectos
alimentados con frijol lima, lo que podría indicar un papel importante para las especies de
este género en larvas que se alimentan de especies de gramíneas, como se vio en nuestro
estudio sobre la caña de azúcar. Sin embargo, se necesitan más estudios para dilucidar si
estas bacterias son más eficientes en la degradación de celulosa de una biomasa específica
clonando genes de celulasa individuales y realizar estudios in vitro sobre la capacidad de
degradación enzimática de proteínas individuales utilizando diferentes sustratos de
carbohidratos, antes de sacar cualquier conclusión directa. Sin embargo, estos resultados
son alentadores y ameritan una mayor investigación de la eficacia y actividad celulolítica
de celulasas y hemicelulasas de cepas pertenecientes a especies de Klebsiella y Bacillus
aisladas en este estudio para evaluar su eficacia y posible aplicación en la degradación de
biomasa de caña de azúcar para producción de bioetanol de segunda generación u otras
aplicaciones.
Figura 5 Adherencia bacteriana a residuos de cosecha de caña de azúcar. Imágenes de
microscopía electrónica de barrido (SEM) que muestran la adherencia bacteriana a fibras de
plantas procedentes de HT de la caña de azúcar. Imagen izquierda, cepa Klebsiella oxytoca
en forma de barra Kd70 TUC-EEAOC. Imagen derecha, diplococos de la cepa Kd7 TUC-
EEAOC de Enterococcus casseliflavus. Las barras blancas que se muestran en las esquinas
inferiores izquierdas de ambas figuras indican 2 μm.
La baja actividad celulolítica encontrada para especies bacterianas que pertenecen a
especies de los generos Microbacterium, Stenotrophomonas y Enterococcus sugiere papeles
primarios distintos a la degradación de carbohidratos en el intestino larvario. Como se
mencionó anteriormente, la importancia de Enterococcus como colonizador importante del
intestino de insectos está indicada por la colonización temprana y que Enterococcus está
categorizado como una bacteria ácido láctica (LAB), que son organismos beneficiosos
conocidos de la microbiota intestinal de animales, incluyendo insectos (Vasquez et al.,
2012; Shao et al., 2014). Si el Enterococcus ya existe en el huevo de D. saccharalis es
probable que este género desempeñe un papel simbiótico muy importante similar al
propuesto en el estudio metagenómico del intestino del gusano de la hoja de algodón,
donde se encontró que Enterococcus era la bacterias activas más predominante y
metabólica a lo largo de todo el ciclo de vida larval que indican la importancia de este
género como colonizadores intestinales de larvas de miembros de Lepidoptera (Shao et al.,
2014). Como una de las posibles especies fundadoras de la microbiota intestinal, es
interesante especular sobre un posible papel de control para los miembros de este género en
el establecimiento de otras bacterias en el intestino. Es bien sabido que varios miembros de
Enterococci se unen a la capa de moco del epitelio intestinal para formar una estructura de
tipo biofilm (Mohamed y Huang 2007), que podría proteger y evitar que el intestino
larvario sea colonizado por microbios patógenos. Como los miembros de Enterococcus
también son conocidos por producir bacteriocinas, es posible que una acción combinada de
formación de biopelículas y producción de compuestos antimicrobianos ayude a prevenir el
ingreso y establecimiento de microorganismos dañinos en el intestino larvario (Ennahar et
al., 1998; Ruiz-Rodriguez et al. 2012).
Los miembros del género Microbacterium se han aislado del aire, el suelo, el agua, los seres
humanos y las plantas (Zinniel et al., 2002; Velazquez et al., 2008; Soni et al., 2014). Cepas
de M. testaceum, aislado de la superficie de la hoja de las plantas de patata demostraron
producir enzimas degradantes de lactona N-acylhomoserine (AHL) (Morohoshi et al.
2011), lo que indica un papel protector contra patógenos de las plantas, que con frecuencia
utiliza estrategias de detección de quórum al colonizar el tejido vegetal. Otra característica
interesante reportada para Microbacterium spp. es la desintoxicación del cromo de las
plantas mediante la reducción de la biodisponibilidad del cromo tóxico IV del suelo regado
con efluente de la curtiduría (Soni et al., 2014). Otro miembro, M. arborescens, que se
encuentra en los intestinos de orugas herbívoros produce una potente dps de unión a hierro
(protección de ADN durante la inanición) proteína con actividad de peroxidasa, que se ha
sugerido para evitar la formación de radicales de oxígeno que dañan las células (Pesek y col
. 2011). Además, la misma proteína Dps puede sintetizar e hidrolizar conjugados de ácido
amino (N-acil-glutaminas), que se ha demostrado para desencadenar la defensa de las
plantas contra insectos herbívoros (Alborn 1997; Baldwin et al 2001). Esta última
característica podría ayudar a la larva a escapar de las acciones de defensa de la planta
evadiendo la señalización de detección.
El género Stenotrophomonas ocurre de forma ubicua en la naturaleza y especies como S.
maltophilia y S. rhizophila se encuentran a menudo en la rizosfera y dentro de muchas
especies de plantas diferentes donde se han asociado con interacciones beneficiosas con las
plantas. En contraste con los géneros filogenéticamente muy estrechamente relacionados
Xanthomonas y Xylella, no se conocen especies de Stenotrophomonas que sean
fitopatógenas, lo que hace que Stenotrophomonas spp., excelentes candidatos para
aplicaciones biotecnológicas en la agricultura.
Además, las especies del género Stenotrophomonas jugan un importante papel ecológico en
los ciclos de nitrógeno y azufre y varias especies de este género tienen una alta capacidad
para metabolizar una amplia gama de compuestos orgánicos que los hacen candidatos
ideales para la biotecnología y la fitorremediación. Otra característica importante que
podría ser beneficiosa para la larva es la actividad antifúngica descrita para S. rhizophila
(Wolf et al., 2002).
De acuerdo con muchos estudios recientes (Watanabe y Tokuda, 2010; Cardoso et al.,
2012; Gupta et al., 2012; He et al., 2013; Brune, 2014), nuestros resultados indican una
interacción muy compleja entre bacterias e insectos, donde la colonización bacteriana del
intestino de los insectos parece ayudar a la larva en la degradación de los carbohidratos, el
acceso y la absorción nutricional, la protección contra los patógenos, la evasión de la
defensa de las plantas y la posible desintoxicación de los compuestos químicos. Nuestra
comprensión de estas interacciones apenas comienza a desarrollarse y se necesitan muchos
más estudios sobre especies individuales junto con manipulaciones genéticas y químicas
del insecto y las bacterias para avanzar en nuestro conocimiento sobre el papel de la
microbiota intestinal larval en insectos herbívoros. Es importante no olvidar el impacto de
la planta ya que la mayoría de las bacterias aisladas de la larva en este estudio parecen
originarse a partir de endófitos de plantas. Si este es el caso, estas bacterias muestran una
ecología de vida interesante y altamente adoptiva que cambia una interacción beneficiosa
mutua con su huésped a un rol antagonista directo que protege y ayuda a un organismo
invasivo. La comprensión adicional de esta interacción tri-trófica planta-insecto-bacteria
debería proporcionar información y descubrimientos valiosos que podrían emplearse en
soluciones biotecnológicas novedosas y más eficientes para la degradación de
carbohidratos, el manejo de plagas y enfermedades por ejemplo, fito y biorremediación.