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Citogenética

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La citogenética es el campo de la genética


que comprende el estudio de la estructura,
función y comportamiento de los
cromosomas. Incluye análisis de
bandeado G en cromosomas, otras
técnicas de bandeado citogenético, y
también la citogenética molecular del tipo
de hibridación por fluorescencia in situ
(FISH) e hibridación por genómica
comparativa (CGH).

Célula metafásica positiva para el reordenamiento


bcr/abl usando la técnica FISH.
Historia
Primeros años

Los cromosomas fueron observados por


primera vez en células vegetales por Karl
Wilhelm von Nägeli en 1842. Su
comportamiento en células animales (de
salamandra) lo describió Walther
Flemming, el descubridor de la mitosis, en
1882. Otro anatomista alemán, von
Waldeyer, le dio nombre en 1888.

La siguiente etapa tuvo lugar tras el


desarrollo de la genética a principios del
siglo XX, cuando se dedujo que el conjunto
de cromosomas (el cariotipo) era quien
portaba los genes. Levitsky parece que fue
el primero que definió el cariotipo como la
apariencia fenotípica de los cromosomas
somáticos, en contraste con su contenido
genético. La investigación del cariotipo
humano llevó muchos años para
responder a la pregunta más básica:
¿cuántos cromosomas tiene una célula
diploide humana normal? En 1912, Hans
von Winiwarter recopiló 47 cromosomas
en espermatogonias y 48 en oogonias,
concluyendo con un mecanismo de
determinación sexual XX/XO. Painter en
1922 no estaba seguro de que el número
diploide del hombre fuera 46 o 48, a favor
de 46. Cambió su opinión más tarde de 46
a 48, e insistió de manera acertada en que
el hombre tenía un sistema XX/XY.
Considerando sus técnicas, estos
resultados fueron bastante destacables.

Se necesitaban nuevas técnicas para


resolver definitivamente el problema:

Utilizando células en cultivo


Pretratando células en un medio
hipotónico, el cual penetra y dispersa los
cromosomas
Detener la mitosis en metafase con una
solución de colchicina
Aplastando la preparación para forzar a
los cromosomas a ponerse en un
mismo plano
Troceando una fotomicrografía y
organizando el resultado en un
cariograma indiscutible.

Hasta mediados de los años 50 no fue


generalmente aceptado que el cariotipo
del hombre incluía sólo 46 cromosomas. Y
algo muy importante, los grandes primates
tenían 48 cromosomas.

Aplicaciones en biología
Los trabajos de McClintock con
el maíz
Barbara McClintock empezó su carrera
como citogenetista del maíz. En 1931
McClintock y Harriet Creighton
demostraron que la recombinación
citológica de cromosomas marcados tenía
correlación con la recombinación de
rasgos genéticos. McClintock continuó su
carrera con el estudio citogenético de los
mecanismos y la herencia de
cromosomas circulares y fragmentados
del maíz. Durante sus trabajos en
citogenética, McClintock descubrió los
transposones, lo que le condujo a
conseguir su Premio Nobel en 1983.

Poblaciones naturales de
Drosophila

En los años 30 del siglo XX Dobzhansky y


sus colaboradores tomaron Drosophila
pseudoobscura y D. persimilis de
poblaciones salvajes en California y
estados vecinos. Usando la técnica de
Painter estudiaron los cromosomas
politénicos y descubrieron que las
poblaciones salvajes eran polimórficas por
las inversiones cromosómicas. Todas las
moscas se parecían a cualquiera de las
inversiones que portaban: este es un
ejemplo de polimorfismo críptico.

Rápidamente se acumularon pruebas para


demostrar que la selección natural era
responsable. Usando un método ideado
por L'Heretier y Teissier, Dobzhansky crio
poblaciones en jaulas de cría, que permitía
alimentarlas, la reproducción y la toma de
muestras de las mismas al mismo tiempo
que evitaba que se escaparan. Esto tenía
la ventaja de descartar la migración como
respuesta a los resultados. Las
poblaciones que contienen inversiones de
frecuencia inicial conocida se pueden
mantener en condiciones controladas. Se
encontró que los diferentes tipos de
cromosomas no fluctuaban al azar, como
sería de ser idealmente neutros, pero se
ajustaban a algunas frecuencias en las
que se estabilizaban. Cuando Dobzhansky
publicó la tercera edición de su libro en
1951 estaba convencido de que la
morfología de los cromosomas se
mantenía en la población por la ventaja de
selección de los heterocigotos, como en la
mayoría de los polimorfismos.

Anomalías numéricas
humanas
Con la aparición de procedimientos que
permitían enumerar los cromosomas de
forma sencilla, inmediatamente se
hicieron descubrimientos en relación a
anomalías que derivan de los casos de no
disyunción los cuales provocan la
aparición de aneuploidías (adiciones o
deleciones de cromosomas enteros). En
1959, Lejeune[14] encontró que los
pacientes con síndrome de Down tenían
una copia extra del cromosoma 21. El
síndrome de Down es conocido también
como trisomía del 21. En 1960, Nowell[15]
descubrió un pequeño cromosoma,
denominado el cromosoma Filadelfia, el
cual se demostró que era la causa de la
Leucemia mieloide crónica. 13 años más
tarde Janet Rowley probó que se trataba
de una translocación de los cromosomas
9 y 22.
Otras anomalías cromosómicas
descubiertas incluyen anomalías en
cromosomas sexuales. Un individuo que
sólo posea un cromosoma sexual (el X)
padece el síndrome de Turner, un
cromosoma X de más en un varón, con 47
cromosomas en total, padece el Síndrome
de Klinefelter. Muchas más
combinaciones pueden aparecer sin ser
letales como XXX, XYY, y XXXX. La
capacidad de los mamíferos para tolerar
aneuploidías en cromosomas sexuales
deriva de la capacidad de inactivarlos, que
se necesita en hembras normales para
compensar el tener dos copias del X. No
todos los genes del cromosoma X se
inactivan, lo que responde a por qué se
observa una diferencia fenotípica en
individuos con un cromosoma X de más o
de menos.

La trisomía del 13 se relaciona con el


Síndrome de Patau y la del 18 con el
Síndrome de Edward.

Aparición de las técnicas de


bandeo
Cariotipo humano de varón.

Al final de los 1960 Caspersson desarrolló


técnicas de bandeo que teñían los
cromosomas de forma diferencial. Esto
permite diferenciar a los cromosomas de
otras cosas de tamaño similar así como
dilucidar las interrupciones y los
cromosomas constituyentes que
intervengan en translocaciones
cromosómicas. Las deleciones en un
cromosoma ahora también podrían ser
llamadas más específicamente y
entendidas mejor. Los síndromes por
deleción como el DiGeorge, el Prader-Willi
y otros fueron asociados a deleciones del
material cromosómico.

Los diagramas de identificación de


cromosomas basados en datos de
bandeo, se conocen como mapas
citogenéticos. Estos mapas se
convirtieron en la base de campos
oncológicos o prenatales y en seguida se
incluyeron citogenéticos en laboratorios
clínicos donde los cariotipos permitían la
observación de las alteraciones
cromosómicas por parte de los científicos.
Las técnicas se extendieron para el cultivo
de amniocitos libres obtenidos del líquido
amni��tico, y se ampliaron a todo tipo
de cultivos que permitieran mayor
resolución de bandeo.

Comienzos de la citogenética
molecular

En la década de 1980 se hicieron avances


en citogenética molecular. Mientras los
marcajes con radioisótopos se habían
hibridado con ADN desde 1969, la
innovación estaba ahora en las pruebas de
marcajes fluorescentes. Hibridándolos
con preparados de cromosomas
realizados con las técnicas existentes se
pasó a llamar hibridación por
fluorescencia in situ (FISH). Este cambio
aumentó significativamente el uso de
técnicas de marcaje fluorescente como
las técnicas habituales de marcaje por ser
más seguras y poderse utilizar
indefinidamente. Otro avances en
micromanipulación y examen de
cromosomas condujo a las técnicas de
microdisección de cromosomas a que las
aberraciones estructurales de
cromosomas podían aislarse, clonarse y
ser estudiadas con mucho más detalle.

Usos en medicina
translocación 9;11 asociada a AML.

En algunos tipos de cáncer,


concretamente en noeplasias
hematológicas, los citogenéticos pueden
determinar qué translocaciones
cromosómicas están presentes en las
células malignas, facilitando el
diagnóstico y la susceptibilidad al
tratamiento (por ejemplo el mesilato de
imatinib en casos del cromosoma
Filadelfia).

En desórdenes congénitos, como el


síndrome de Down, los citogenéticos
pueden determinar la naturaleza del
defecto cromosómico - una "simple"
trisomía, un mosaico, translocación
"balanceada" o equilibrada, una deleción, o
una inserción en uno - o ambos – de los
parentales, o en el feto. Gracias a la
aparición de procedimientos de
recolección que permitían una
enumeración de cromosomas más fácil,
se hicieron descubrimientos muy
rápidamente en el incremento de
anomalías por casos de no disyunción que
causaban aneusomías (adiciones o
deleciones de cromosomas enteros). En
1959 Lejeune[2] descubrió en los
pacientes de síndrome de Down la
existencia de una copia extra del
cromosoma 21. En 1960 Nowell[3]
descubrió el denominado cromosoma
Filadelfia, causante de la Leucemia
mieloide crónica. 13 años después, Janet
Rowley probó que se trataba de una
translocación de los cromosomas 9 y 22.

También se han encontrado anomalías


cromosómicas en cromosomas sexuales,
pudiendo aparecer individuos con un solo
cromosoma sexual (el X) como es el caso
del síndrome Turner, o varones con un
cromosoma X de más (Síndrome de
Klinefelter). Hay constancia de muchas
otras combinaciones no letales como los
casos de XXX, XYY, o incluso XXXX. En
mamíferos hay una gran tolerancia a este
tipo de anomalías dado que también se
tiene la capacidad de inactivar total o
parcialmente algún cromosoma. Éste es el
caso de las hembras en las que se inactiva
la copia extra de su cromosoma X para
compensar el exceso de genes con
respecto a los varones.
La trisomía del 13 se relaciona con el
Síndrome de Patau y la trisomía del 18 con
el Síndrome de Edward. Además de esto,
actualmente esta ciencia se está volcando
en el uso de sus técnicas, y especialmente
la citogenética molecular, para el
pronóstico y el diagnóstico de diversos
tipos de cáncer. En cuanto a otras
enfermedades podemos destacar las
neoplasias y las hematopatías como diana
de las técnicas de citogenética más
destacadas.

Aplicaciones en Diagnostico
molecular
Dependiendo del tipo de muestra que se
tome, se podrá dar un diagnostico sobre
uno o varios casos concretos:

TIPO DE MUESTRA APLICACIONES

Evaluar a una pareja con antecedentes de infertilidad o abortos


Sangre/células mucosa
Evaluar una apariencia anormal del cuerpo que sugiere una
bucal
anomalía genética

Células médula ósea Análisis casos de leucemia y linfomas

Células fetales en líquido Diagnóstico prenatal para evaluar anomalías cromosómicas en un


amniótico feto en desarrollo

Diagnóstico genético preimplantatorio en técnicas de


Células embrionarias
reproducción asistida

Técnicas
Análisis rutinarios
Tipos de bandeo

Los análisis de cromosomas rutinarios


hace referencia a los análisis de
cromosomas metafásicos que se han
teñido usando tripsina seguida de Giemsa,
Leishmanns, o una mezcla de ambas. Esto
origina patrones de bandas únicos en los
cromosomas. El mecanismo molecular y
el motivo de estos patrones se desconoce,
aunque podría estar relacionado con la
replicación y el empaquetamiento.

En los laboratorios citogenéticos se


utilizan diversas técnicas de bandeo de
cromosomas. El bandeo por Quinacrina
(bandeo-Q) fue la primera tinción utilizada
para la obtención de patrones de bandas
específicos. Este método requiere un
microscopio de fluorescencia y ya no es
usado tan ampliamente como el bandeo
con Giemsa (bandeo-G). El bandeo de
inversión (bandeo-R) necesita tratamiento
por calor e invierte las bandas blancas y
negras habituales de los bandeos G y Q.
Este método es muy útil si se quieren teñir
los extremos distales de los cromosomas.
Otras técnicas de tinción incluyen bandeo-
C y tinción de la zona del organizador
nucleolar (tinción NOR). Estas últimas
técnicas tiñen porciones específicas del
cromosoma. El bandeo-C tiñe la
heterocromatina estructural, que se
encuentra normalmente cerca del
centrómero, y la tinción NOR resalta los
satélites y los brazos de los cromosomas
acrocéntricos. El bandeo a mayor
resolución incluye la tinción de
cromosomas en profase o metafase
temprana (prometafase), antes de
alcanzar la máxima condensación. Porque
los cromosomas profásicos y
prometafásicos están menos
condensados que los cromosomas de la
metafase, el número de bandas
observables para todos los cromosomas
aumenta en 300 a 450 y hasta 800. Esto
permite detectar anomalías menos obvias
que normalmente no se verían con los
bandeos convencionales.

Preparación de muestras

Las células de la médula ósea, la sangre,


el líquido amniótico, la sangre del cordón
umbilical, los tumores, y tejidos
(incluyendo piel, cordón umbilical, hígado,
y muchos otros órganos) se pueden
cultivar usando técnicas de cultivo celular
estándar con el fin de incrementar su
número. Un inhibidor mitótico (colchicina,
colcemida) se añade al cultivo para
detener la división celular en la mitosis, lo
cual nos dará una mayor producción de
células mitóticas para los análisis.
Después, las células se centrifugan, y el
medio y el inhibidor mitótico se eliminan y
se sustituyen por una solución hipotónica.
Esto provoca que las células se hinchen
por lo que los cromosomas se dispersarán
cuando se añadan a la muestra. Tras
poner a las células en un medio
hipotónico, se añade fijador Carnoy (etanol
y ácido acético glacial 3:1). Esto matará a
las células, lisará los eritrocitos, y
endurecerá los núcleos de los glóbulos
blancos que queden. Las células se fijan
rápido por regla general para eliminar los
restos de los eritrocitos sobrantes. La
suspensión de células entonces cesa en
las muestras de los especímenes. Tras el
paso de las muestras por un horno o
esperando unos días, están listas para el
bandeo y el análisis.

Análisis

El análisis de cromosomas bandeados se


hace al microscopio por un laboratorio
clínico especializado en citogenética
(CLSp(CG)). En general se analizan unas
20 células, que es suficiente para
descartar el mosaicismo a un buen nivel.
Se hace un sumario de los resultados que
son estudiados por un citogenetista y se
remiten al médico para poder escribir una
interpretación teniendo en cuenta la
historia clínica previa de los pacientes y
otros datos clínicos. Se informan los
resultados según el Sistema Internacional
de Nomenclatura de Citogenética Humana
2005 (International System for Human
Cytogenetic Nomenclature 2005, ISCN
2005).

Hibridación por fluorescencia


in situ

Células de interfase positivas para una reordenación


de t(9;22).

Hibridación por fluorescencia in situ


significa utilizar sondas marcadas por
fluorescencia para hibridar preparaciones
citogenéticas de células.

Además de en las preparaciones estándar,


la técnica FISH también se puede utilizar
en:

frotis de médula ósea


frotis de sangre
preparaciones de tejido incluidas en
parafina
muestras de tejido disociadas
enzimáticamente
médula ósea sin cultivar
amniocitos sin cultivar
preparaciones de células centrifugadas

Preparación de muestras

La muestra se trata con una solución de


sal que normalmente consiste en 2X SSC
(sal, citrato de sodio). Después las
muestras se deshidratan en etanol, y se
añade la mezcla de sondas. La muestra de
ADN y la sonda de ADN se
codesnaturalizan por calor y dejando un
plazo de al menos 4 horas para la
reasociación. Tras esto, las muestras se
lavan para eliminar el exceso de sondas
que no se hayan unido, y se contratiñe con
4',6-Diamidino-2-fenylindol (DAPI) o
propidio yodado.

Análisis

El análisis de especímenes de FISH se


hace con microscopios de fluorescencia y
los realizan laboratorios clínicos
especializados en citogenética
(CLSp(CG)). Para oncología en general se
apuntan un gran número de células
interfásicas en orden para descartar bajos
niveles de enfermedades residuales,
normalmente entre 200 y 1000 células se
contabilizan y apuntan. Para problemas
congénitos, se emplean habitualmente
unas 20 células metafásicas.

Otras técnicas

Ya hemos mencionado técnicas de uso


habitual en análisis citogenético, pero
haciendo un resumen de todas ellas y
dividiéndolas en grupos según los campos
a los que pertenecen, tenemos:

Análisis citogenético: aquí podemos


incluir técnicas como bandeado G, FISH,
CGH (hibridación genómica comparada)o
el cariotipo multicolor (SKY-FISH y M-
FISH). Estas últimas del cariotipo
multicolor son muy recientes y consisten
en marcar el material genético de cada
cromosoma con uno o varios
fluorocromos, haciéndolos así
diferenciables. El espectro de emisión de
cada uno es único y así obtenemos
cromosomas de diversos colores.
Análisis molecular: la técnica más
destacable en este caso es la PCR
(reacción en cadena de la polimerasa).
Esta técnica se caracteriza por su gran
aplicabilidad dado que amplifica
secuencias específicas de ADN o ARN, y
multiplica por más de 100 el número de
copias que se puedan obtener de un
fragmento de ADN en concreto, algo muy
ventajoso para cualquier estudio que se
realice.

Citogenética molecular
Consiste en la combinación de biología
molecular y citogenética. Por lo general,
esto incluye la utilización de una serie de
técnicas del estilo de hibridación por
fluorescencia in situ (FISH), en la cual las
muestras de ADN están marcadas con
diferentes colorantes que emiten
fluorescencia para así poder visualizar
mejor las regiones específicas del genoma
que se quiera. La FISH también puede
emplearse para observar directamente los
cromosomas metafásicos o los núcleos
interfásicos. A parte, se puede tomar un
método indirecto en el que el genoma
completo es evaluado en cuanto a
cambios en el número de copias utilizando
un cariotipo virtual. Los cariotipos
virtuales se generan a partir de matrices
compuestas de miles de millones de
muestras, y se usan herramientas
computacionales con el fin de hacer una
“simulación por ordenador” del genoma.

Futuro de la citogenética
Los avances actualmente se centran en la
citogenética molecular, incluyendo
técnicas como las matrices de hibridación
de genómica comparativa, CGH, matriz-
SNP basada en cariotipos y sistemas
automatizados para contabilizar los
resultados de preparaciones estándar de
FISH.
Véase también
Cariotipo
Citogenética humana
Citogenética vegetal

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Conceptos de Genética (8ª edición).
(2008).

Enlaces externos
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and Karyotypes
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