ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA DE BACTERIAS DEL SUELO AISLADOS DE KOCHI, LA INDIA Y SU

IDENTIFICACIÓN MOLECULAR.

RESUMEN:

El presente estudio trata sobre la actividad antibiosis de las bacterias del suelo, aislado de 10
diferentes ubicaciones de rizosfera y cultivo diverso en Kochi, Kerala, India. Las bacterias fueron
aisladas por serie estándar técnicas de placas de dilución. La caracterización morfológica del aislado
se realizó por tinción de Gram y encontró que todos ellos son grampositivos. Las bacterias aisladas
se probaron contra 6 patógenos humanos a saber, Escherichia coli, Enterococcus sp., Pseudomonas
aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus y Acinetobacter sp. La selección primaria
se llevó a cabo mediante rayas perpendiculares y superposición de semillas método. Con base en el
resultado de la detección primaria, se seleccionaron la mayoría de los aislamientos potenciales de
S1A1 y S7A3. para la detección secundaria. Ambos aislamientos mostraron resultados positivos
contra Enterococcus sp. y S. aureus. La actividad antagonista máxima de 20,98 y 27,08 mm de zona
de inhibición se registró en S1A1 contra Enterococcus sp. y S. aureus respectivamente, a una
concentración de 180 ml. Identificación molecular se llevó a cabo mediante secuencia de ARNr 16S.
El 16S rRNA se amplificó a partir de las muestras de ADN mediante el uso de PCR. Los productos de
PCR 16S rRNA amplificados se purificaron y se secuenciaron. Las secuencias fueron sometidas a NCBI
BLAST. Los resultados de los aislamientos S1A1 y S7A3 BLAST mostraron 99% y 95%
respectivamente, similitud con la secuencia de base de datos disponible de Bacillus
amyloliquefaciens. Las secuencias fueron depositadas en Se obtuvieron GenBank y los números de
acceso KY864390 (S1A1) y KY880975 (S7A3). 2018 producción y hosting por Elsevier B.V. en nombre
de la Academia de Investigación Científica y Tecnología.

INTRODUCCION

Hace ocho décadas se descubrieron los antibióticos, han revolucionado el tratamiento de

infecciones, transformando una vez mortal enfermedades en problemas de salud manejables [1].
Disponibilidad de efectivo antibióticos ha revolucionado la salud pública y ha sido responsable de
permitir innumerables avances en la atención médica; habilitados por terapias antibióticas eficaces
han creado a su vez crisis donde muchos antibióticos ya no son efectivos contra las infecciones
simples. Tales infecciones a menudo resultan en un aumento en el número de hospitalizaciones,
más fracasos de tratamiento y la persistencia de farmacorresistente a patógenos [2]. Desde 1980
hasta principios de la década de 2000, hubo una disminución del 90% en la aprobación de nuevos
antibióticos. Muchas compañías se han alejado desde el desarrollo de medicamentos debido a
factores científicos, regulatorios y económicos obstáculos que demostraron que el desarrollo de
antibióticos es menos atractivo en comparación con áreas terapéuticas más rentables [3]. Los
microbios siguen siendo más resistentes, la tubería de antibióticos continúa disminuyendo, y la
mayoría del público permanece inconsciente de esta situación crítica. Esto ha llevado a una situación
actual donde, solo las enfermedades infecciosas matan aproximadamente 13 millones de personas
en todo el mundo, anualmente, un peaje que sigue aumentando, ayudado y asistida por genes de
resistencia. La tasa bruta de mortalidad por enfermedades infecciosas es de 416,75 por 100.000
personas (cálculos basados en datos del Banco Mundial y Global Burden of Disease, 1990) y es el
doble de la tasa que prevalece en los Estados Unidos cuando se introdujeron antibióticos
(aproximadamente 200 por cada 100,000 personas). Cerca de 2 millones de infecciones y 23,000 las
muertes son causadas por patógenos de resistencia a antibióticos por año en Estados Unidos. En
Europa, 25,000 personas mueren cada año debido a antibióticos bacterias resistentes. Cerca de 2.2
millones de muertes en enfermedades diarreicas [4]. La prevalencia de Estreptococos neumonía
resistente a los antibióticos ha aumentado en la última década en los Estados Unidos. La proporción
de neumococos no susceptibles a la penicilina ha alcanzado el 35% en algunas áreas [5].

El mayor impulso de resistencia se debe a los usos continuos de antibióticos. Es predecible en

cualquier ambiente donde los antibióticos son liberados. Las bacterias adquieren resistencia a los
antibióticos, debido a la amplia disponibilidad de antibióticos y su uso y eliminación inadecuados.
En 2010, India fue el mayor consumidor mundial de antibióticos para la salud humana en 12.9? 109
unidades (10.7 unidades por persona). ¿El siguiente consumidor más grande fue China con 10?0?
109 unidades (7.5 unidades por persona) seguido por los Estados Unidos a 6.8? 109 unidades (22.0
unidades por persona). Setenta y seis por ciento del aumento general en global consumo de
antibióticos entre los años 2000 y 2010, debido a Países BRICS, (Brasil, Rusia, India, China y
Sudáfrica). En los países BRICS, el 23% del aumento en el antibiótico minorista ventas en India, y
hasta el 57% del aumento en el sector hospitalario en China. Los medicamentos antimicrobianos
utilizados para profiláctico o terapéutico para fines humanos, veterinarios y agrícolas también
favorece la supervivencia y la propagación de organismos resistentes [7]. El uso agrícola representa
al menos la mitad de los antibióticos producidos en los Estados Unidos.

La eliminación inadecuada de los desechos animales y su aplicación excesiva como fertilizantes

también conduce a la propagación de la resistencia en el suelo bacterias (potencialmente por
transferencia lateral de genes), que luego sirven como reservorio persistente de resistencia a los
antibióticos. Además, aves de corral, ganado, y los cerdos criados con antibióticos albergan
poblaciones significativas de bacterias resistentes a los antibióticos, que se transmiten a humanos
a través del contacto directo con los animales y a través de su carne, huevos y leche.

Creciente resistencia a los antimicrobianos y una disminución de los antibióticos gasoducto han
dado lugar a una era emergente post-antibiótico, como los pacientes ahora están muriendo de
infecciones bacterianas que alguna vez fueron tratable Ahora es importante investigar
deliberadamente para el desarrollo de antibióticos nuevos, seguros y efectivos para combatir la
amenaza de MDR concomitante (patógenos multirresistentes [10]. Como los productos naturales
tienen una estructura novedosa, siguen siendo la principal fuente prometedora de metabolitos
secundarios [11] y también sirvió como actividad antibacteriana contra bacterias patógenas [12].
Los productos naturales obtenidos a partir de microorganismos aún aparecen como la fuente más
auspiciosa de futuros antibióticos

Entre los diferentes hábitats inexplorados, el suelo se considera como uno de los entornos más
adecuados para el crecimiento microbiano [14], los microorganismos que han sido aislados del suelo
son líder en la fuente del descubrimiento de antibióticos. Suelo y asociado a planta los entornos
albergan numerosas bacterias que producen antibióticos metabolitos con actividades específicas o
de amplio espectro contra coexistencia de microorganismos en función del pH, disponibilidad de
nutrientes y contenido de humus. La actividad y diversidad de los organismos del suelo están
regulados por una jerarquía de factores abióticos y bióticos. Los principales factores abióticos son
el clima, incluida la temperatura, la humedad textura del suelo, estructura del suelo, salinidad y pH.
Las condiciones climáticas también influyen en la fisiología de los organismos del suelo, ya que
difiere en el globo y también, en los mismos lugares, entre las estaciones. Incluso aunque el suelo
es naturalmente rico en microbios capaces de antibióticos síntesis, la frecuencia con la que se
produce la síntesis ecológicamente niveles significativos ha sido mucho menos claro. Aunque
tradicional enfoque de selección al azar que se ha hecho para los últimos 50 años para producir
nuevos antibióticos que están a favor seres humanos. Teniendo en cuenta esto, en el presente
estudio fue destinado a aislar y caracterizar bacterias productoras de antibióticos del suelo de la
rizosfera de diferentes lugares.

MATERIALES Y METODOS

2.1. Área de estudio

Las muestras fueron recolectadas de Kochi, distrito de Ernakulum en el estado de Kerala. ¿Se
encuentra en la costa suroeste de la India en 9? 580N 76? 130E. En esta área, el suelo consiste en
sedimentos como aluvión, lateritas, arenas marrones, etc. Los suelos salinos hidromorfos son
también se encuentra en las áreas y predominantemente, tipos de rocas del suelo.

2.2. Colección de muestras de suelo

Las muestras de suelo de la rizosfera se recolectaron de 10 diferentes ubicaciones en el campo de

cultivos diferentes en Kochi, Kerala, India. Los escombros de muestras de suelo se eliminaron antes
de la recolección. El sitio era excavado en 5-15 cm y aproximadamente 10 g de la rizosfera el suelo
se recogió en un tubo estéril y se transportó al laboratorio y almacenado a 4 ° C.

2.3. Aislamiento y mantenimiento de bacterias del suelo

Las bacterias del suelo se aislaron mediante la placa de dilución serial estándar técnica. A 1 g de
cada muestra de suelo se pesó y empapó 10 ml de solución salina fisiológica estéril. Las muestras
fueron entonces en serie diluido. De las 4 diluciones, 100 ml de cada dilución (10? 1, 10? 2, 10? 3 y
10? 4) de cada muestra se utilizaron para preparar nutrientes placas de agar agar. Las placas se
incubaron hasta 7 días para encontrar colonia bacteriana antagónica. Las colonias que mostraron
antagonismo fueron recogidos y veteados en placa de agar nutriente por separado para obtener
colonias aisladas puras. Cultura pura fue almacenado a 4 ° C para estudios posteriores.

2.4. Caracterización morfológica de bacterias aisladas

Caracterizaciones morfológicas del antagonista aislado las bacterias se llevaron a cabo utilizando el
método de tinción de Gram. Veinte Se usaron cultivos de caldo de nutrientes de cuatro horas de
cada aislamiento para la tinción de Gram.

2.5. Examen primario

La detección primaria de las bacterias antagónicas se realizó in vitro contra 6 bacterias patógenas
humanas. La proyección fue hecha por ambas rayas perpendiculares y método de superposición de
semillas. La prueba los patógenos incluyen Escherichia coli, Enterococcus sp., Pseudomonas
aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Staphylococcus aureus y Acinetobacter sp.
2.6. Rayado perpendicular

La bacteria antagonista fue aislada de la muestra por rayado como una sola línea recta a través del
centro del nutriente placa de agar. Después de 48 h de incubación de los 6 patógenos probados
fueron veteados perpendicularmente a las bacterias antagonistas. Inmediatamente después de
rayar, la longitud de la raya se marcó en placa con rotulador. Las observaciones se realizaron
después de 24 h. Después de la incubación, cualquier sustancia producida por las bacterias del suelo
se esperaba que lisar / inhibir el patógeno humano probado [15].

2.7. Método de superposición de semillas

Las bacterias antagonistas aisladas de la muestra fueron manchas inoculado en una placa de agar
nutriente usando una púa de diente estéril. Después de 48 h de incubación, se agregaron 2 ml de
cloroformo en la tapa; la placa se mantuvo invertida y sellada, de modo que los humos del
cloroformo matarían las bacterias inoculadas al prevenir su crecimiento. Esto asegura que solo los
metabolitos secundarios del inóculo difundido en los medios de agar nutriente permanecen activos.
Después de 1 h, las placas se abrieron y los humos se les permitió evaporar por 20 min. Entonces,
100 ml de cada patógeno humano de prueba el cultivo se mezcló con 5 ml de nutriente estéril y
enfriado (40? C) caldo con 0,6% de agar. Después de una mezcla completa, el medio era
superpuestos a la placa de agar nutriente y se incubaron durante 24 h. La actividad antagonista se
midió determinando la zona de inhibición.

2.8. Evaluación secundaria

La bacteria que mostró resultados positivos en la detección primaria, seleccionado para selección
secundaria por método de difusión de pozo En este método, inicialmente se limpiaron los 6
patógenos de prueba por separado en 6 diferentes placas Mulgar Hinton Agar usando esteril
bastoncillo de algodón. Inmediatamente después del hisopado, se encontraron dos (10 mm) pozos
hecho en cada plato con la ayuda de taladro de corcho estéril. Los pozos fueron cargados con 90 ml
y 180 ml de sobrenadante de cultivo de antagonista bacteria. El antibiótico disco amoxyclav
(Enterococcus sp.) y estreptomicina (para otro patógeno humano de prueba) se utilizó como control
positivo. Después de 24 h de incubación, se verificaron las placas para la presencia de la zona de
inhibición. La longitud de las zonas producidas tanto por las bacterias antagónicas y el disco de
antibióticos se midieron usando con precisión una pinza de Vernier.

2.9. Aislamiento de ADN genómico de bacterias

En 1,5 ml de aislados bacterianos cultivados durante la noche mantenidos en caldo de nutrientes

fueron transferidos a 2 ml de tubo de microcentrífuga y se centrifugó a 10.000 \ mu g durante 2
minutos y se recogió el sedimento. Lo mismo se repitió para otro 1.5 ml de cultivo para cosechar
suficiente cantidad de células (100 mg). El pellet se lavó con 0,9% de solución salina y suspendido
en 1 ml de tampón de digestión y se incubó a 50 ° C con sacudidas ocasionales en microcentrífuga
herméticamente cerrada tubos durante 60 min. La muestra fue luego extraída con igual volumen de
fenol-cloroformo-alcohol isoamílico (25: 24: 1) y centrifugado durante 10 minutos a 10.000 g. La
capa acuosa superior fue transferida a un nuevo tubo. A 0,5 ml de acetato de amonio 7,5 M se se
mezcló suavemente y se añadieron 2 ml de etanol 100% enfriado en hielo. Eso se centrifugó durante
5 minutos a 5000 \ mu g. El pellet de ADN fue lavado con 70% de etanol El pellet se secó al aire y se
suspendió en 25 ll de tampón TE (pH 8,0) y se almacena a 4 ° C. El ADN genómico aislado se cuantificó
mediante un espectrofotómetro a longitudes de onda de 260 y 280 nm. La pureza de genómica El
ADN se comprobó mediante análisis en gel de agarosa al 0,8%. Después de correr, el gel se tiñó con
bromuro de etidio y se fotografió con GELSTAN sistema de documentación en gel.

2.10. Identificación molecular de bacterias mediante amplificación 16S rRNA y secuenciación

Los cebadores universales (cebador directo 50- AGAGTTTGATCCTGGCTCAG -30 y cebador inverso
50- GGTTACCTT GTTACGACT-30) para la amplificación del ARNr 16S fragmento de gen. Las
condiciones de ciclado de PCR fueron las siguientes: una inicial desnaturalización durante 5 min a
94 ° C, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 94ºC durante 1 minuto, recocido a 55ºC durante
1 minuto y extensión a 72 ° C durante 2 minutos y luego una extensión final durante 5 minutos a 72
° C. La mezcla de reacción de amplificación de ARNr (30 ml) consiste en 2X Amplicon Red master
mixes (amplicon?) Con 10 ng de genoma total de cada aislado, 10 pmol de cada cebador directo e
inverso. Los productos amplificados de PCR se sometieron a electroforesis en agarosa al 1% gel. El
gel se tiñó con bromuro de etidio y se fotografió con el sistema de documentación de gel GELSTAN.

2.11. Secuenciación y análisis de 16S rRNA

El fragmento del gen 16S rRNA amplificado se purificó y secuenciado utilizando servicios de
secuenciación de ADN (Eurofins Scientific, Bangalore) empleando el mismo cebador utilizado para
la amplificación por PCR. 16S Secuencias de genes rRNA se exportaron a '' Alineación local básica
Search Tool "(BLAST) disponible en el sitio web del Centro Nacional para Información de
Biotecnología (NCBI-http: //www.ncbi.nlm.nih.- gov) para identificar coincidencias con referencia
caracterizada existente secuencias.

RESULTADOS

3.1. Recolección de muestras de suelo

Las muestras de suelo fueron recolectadas de diferentes rizosferas cultivos como papaya, jengibre,
coco, plátano, nuez moscada, Brinjal y Tapioca (Tabla 1).

3.2. Aislamiento y mantenimiento de aislamientos microbianos

Las unidades formadoras de colonias (UFC) de cada muestra de suelo fueron diversas. La dilución
adecuada se seleccionó en base a la placa que tiene un contaje cantidad de colonias El número
máximo de CFU se registró en muestra de suelo (S6) y número mínimo de CFU se observó en el suelo
muestra (S2). De 10 muestras de suelo seleccionadas 5 muestras de suelo (S1, S2, S4, S7 y S10)
mostraron propiedades antagonistas en las diluciones, ¿ya sea 10? 2 o 10? 3. S7 poseía tres colonias
con actividad antagonista. Seguido por S1, que tenía dos colonias. El resto de las tres muestras, es
decir, muestra S2, S4 y S10 tenían colonias individuales que exhiben antagonismo (Tabla 2). Por lo
tanto, estos 8 (S1A1, S1A2, S2A2, S4A1, S7A1, S7A2, S7A3, S10A1) bacterias antagonistas se
seleccionaron para mayor evaluación.

3.3. Caracterización morfológica

La caracterización morfológica de los aislamientos microbianos fue hecho por tinción de Grams que
reveló los 8 aislamientos microbianos fueron grampositivos Entre ellos, las diferentes bacterias gram
positivas como bacilos, se observaron bacilos de cadena larga y cocos.
3.4. Examen primario

En la detección primaria, se seleccionaron 8 aislamientos bacterianos para verificar su actividad

antibacteriana contra los patógenos humanos S. aureus, K. pneumoniae, Enterococcus sp., P.
aeruginosa, E. coli, Acinetobacter sp. Entre 8 aislamientos diferentes, 4 de ellos mostraron
antagonismo actividad en el método de vetas perpendiculares. Ambos aislamientos S1A1 y S7A3
revelaron producción de antibióticos capacidad al mostrar la zona de inhibición contra E. coli,
Enterococcus sp., S. aureus y K. pneumoniae, mientras que los aislamientos S7A1 mostraron zonas
inhibidoras contra E. coli, Enterococcus sp. y S. aureus. Los aislar S1A2 produjo zona de inhibición
contra K. pneumonia y Enterococcus sp. y S. aureus. El aislante restante S2A2, S4A1, S7A2 y S10A1
no produjeron zona de inhibición (Tabla 4). En el método de superposición de semillas, ambos
aislamientos S1A1 y S7A3 produjeron zona de inhibición contra S. aureus, K. pneumoniae y
Enterococcus sp. mientras que los aislamientos S1A2 produjeron zona de inhibición contra
Enterococcus sp. y S. aureus. Por otro lado, S7A1 produjo zona de inhibición contra solo un patógeno
de prueba, es decir, contra S. aureus (Tabla 5).

3.5. Evaluación secundaria

Después del método de superposición perpendicular y superposición de semillas, la mayoría de los

aislamientos potenciales S1A1 y S7A3 tienen un antagonista significativo actividad contra 4
patógenos humanos de prueba a saber, Enterococcus sp., S. aureus, K. pneumonia y P. aeruginosa
(Tabla 6). Ambos los aislamientos mostraron resultados positivos para Enterococcus sp. y S. aureus.

En 90 ml y 180 ml del aislado S1A1 mostraron 20,68 mm y 20.98 mm de zona de inhibición

respectivamente contra Enterococcus sp. La zona de inhibición del disco antibiótico AMC 30
(Amoxyclav) fue 22.98 mm contra Enterococcus sp. De manera similar, se produjeron zonas de
inhibición de 18.93 mm y 20.66 mm por 90 y 180 ml de aislante S7A3 respectivamente contra
Enterococcus sp. mientras que el disco estándar producía la zona de inhibición 24.58 mm. Durante
la selección contra S. aureus, ambos aislamientos S1A1 y S7A3 produjeron zonas de inhibición
aumentadas que la zona producida por estreptomicina de disco estándar. La zona de la inhibición
producida por el aislado fue mayor contra S. aureus cuando se compara con Enterococcus sp.

A una concentración de 90 ml, S1A1 mostró la zona máxima de 23.82 mm contra Staphylococcus,
mientras que la concentración de180 ml inhiben 27.08 mm. La zona producida por disco estándar
la estreptomicina fue de 18.79 mm. Del mismo modo, 90 ml de S7A3 producido 21.58 mm y 180 ml
de la misma produjeron 26.68 mm contra Estafilococo. El disco estándar mostró una zona de 18.25
mm. 3.6. Aislamiento de ADN genómico de bacterias. La extracción de ADN genómico se llevó a cabo
como se describió anteriormente en la sección de metodología, con el fin de obtener alta molecular
peso y calidad del ADN genómico de los dos antagonistas no identificados bacterias (S1A1 y S7A3).
ADN genómico fue aislado con éxito de dos culturas bacterianas antagónicas no identificadas. El
método de extracción de ADN genómico implica la descomposición de la pared celular,
centrifugación para eliminar los fragmentos celulares y la suciedad, precipitación de ácido nucleico
de las células sedimentadas y purificación. El 16S rRNA se amplificó a partir de muestras de ADN de
aislado bacterias antagónicas mediante el uso de PCR. El producto amplificado fue verificado en gel
de agarosa al 1.2% que mostraba un solo fragmento de 1.5 kb en tamaño.
3.7. Identificación molecular de bacterias por 16s r amplificación de ARN y secuenciación

Los productos amplificados de PCR rs 16s de dos bacterias antagónicas fueron purificados y
secuenciados (Tabla 7). La secuencia de bacterias los aislamientos S1A1 y S7A3 se sometieron a
explosión de NCBI. Los los aislamientos S1A1 y S7A3 BLAST arrojaron resultados de 99% y 95%
respectivamente, similitud con la secuencia de base de datos disponible de Bacillus
amyloliquefaciens. Las secuencias fueron depositadas en GenBank y los números de acceso
KY864390 (S1A1) y KY880975 (S7A3) se obtuvieron.

DISCUSION

El objetivo del estudio fue aislar la producción de antibióticos microorganismos de las regiones de
la rizosfera de variedad de cultivos en Kochi. El suelo de la rizosfera ha sido seleccionado para
muestreo desde comunidad microbiana excede en el suelo que cualquier otro entorno. Los
microbios de la rizosfera exhiben un alto nivel de actividad antagonista [dieciséis]. Muchos
científicos han elegido el suelo para el aislamiento de la novela antibióticos ya que es una fuente de
muchas bacterias productoras de antibióticos incluyendo Actinomycetes [13,15,17-19], Constancias
et al. [20] también revela que la heterogeneidad de los resultados del suelo en una amplia variedad
de nichos ecológicos y una gran diversidad de microorganismos del suelo. Esta resultado
correlacionado con nuestra metodología de recolección de muestras implementado donde las
muestras recogidas de diferentes lugares y diversos cultivos. Muestreo aleatorio descrito por
Williams y Vickers [21] era un método convencional de recolección de muestras; este método fue
compatible con en este estudio presente. La caracterización morfológica se realizó mediante tinción
de Grams método, que es un método convencional de caracterización seguido por muchos
científicos [19,22,23]. La tinción de Gram indica que todos los aislamientos bacterianos son
grampositivos. Estos resultados están en confirmatorio con los de Wadetwar y Patil [18] que
obtuvieron la mayoría de los aislados del suelo como gram positivos. Los aislamientos se cribaron
para la producción de antibióticos a través de la detección primaria (rayas perpendiculares y semillas

método de superposición) seguido de un cribado secundario (difusión de pozos de agar) método).

Este es un acuerdo con algunas literaturas anteriores que utilizó los mismos métodos para la
detección de aislados [15,17- 19,24]. El filtrado del cultivo bacteriano se usó en difusión de pozos
de agar método para el cribado secundario. Este mismo método se ha seguido por muchos
científicos [25,26].

El cribado secundario de los aislados S1A1 y S7A3 fue hecho contra los siguientes patógenos
humanos, E. coli, Enterococcus sp., K. pneumoniae, S. aureus, P. aeruginosa y Acinetobacter sp. y la
zona máxima de inhibición fue mostrada por ambos aislamientos S1A1 y S7A3 contra S. aureus.
Estos resultados corroborados con los resultados de Saadoun y Gharaibeh [27] y Wadetwar y Patil
[18] informaron que los aislados del suelo mostraron la zona máxima de inhibición contra S. aureus.
Del mismo modo, Oskay et al. [17] quien informó ese aislado mostró la zona máxima de inhibición
contra S. aureus. Pero en controversia al resultado anterior, a concentraciones de 12.5 mg / ml
(Concentración Inhibitoria Mínima) la zona máxima de inhibición se produjo para K. pneumonia,
seguido de P. aeruginosa y luego E. coli [24].

La identificación molecular de las bacterias se llevó a cabo por 16S amplificación y secuenciación de
ARNr. Una ventaja significativa de esto protocolo es que un aislado bacteriano puede ser
identificado dentro de 2-3 días que la prueba bioquímica convencional, que generalmente toma
varios semanas. Varios informes previos apoyaron que el gen 16S rRNA el análisis de secuencia fue
un método mejorado para la identificación de bacterias en comparación con los métodos
fenotípicos convencionales [28-30]. Los la secuenciación posterior y el análisis BLAST probaron que
ambos aislamientos ser Bacillus amyloliquefaciens. Este resultado proporcionó fuerte apoyo a
estudios anteriores que ya han probado especies de Bacillus como la bacteria más predominante
presente en el suelo [13,31,32]. Esto también proporciona un sustento fuerte a los estudios previos
que han demostrado que B. amyloliquefaciens es una fuente poderosa de antibiótico [33,34].
Boottanun et al. [35] ha demostrado B. amyloliquefaciens tiene la capacidad de producir diversos
antimicrobianos para producir zonas de inhibición comparativamente más grandes contra S. aureus
que es una bacteria gram positiva.

B. amyloliquefaciens ha demostrado ser una potente fuente de antibióticos contra patógenos de

plantas [37-41] y está principalmente asociado con rizosfera vegetal [42] y también proporciona un
fuerte apoyo para nuestro estudio. Además, Bacillaene producido por B. amyloliquefaciens es
encontrado para ser eficaz contra patógenos humanos como Serratiam arcescens, K. pneumonia y
S. aureus [33]. En nuestro estudio en el que

B. amyloliquefaciens ha producido la zona máxima de inhibición contra S. aureus. Del mismo modo,
B. amyloliquefaciens también produce Iturin A que es eficaz contra los patógenos fúngicos como
Rhizoctonia Solani [43]. Difficidin y Bacilysin del mismo tienen antibacteriana actividad contra
patógenos del arroz Xanthomonas oryzae [44]. SEGUNDO. amyloliquefaciens se ha usado como
agente antibacteriano contra bacterias patógenas de productos lácteos y animales veterinarios [45].
Todos estos los hallazgos proporcionan un fuerte apoyo y son la base de nuestro resultado que, B.
amyloliquefaciens sirve como la fuente potente de antibióticos.

CONCLUSION

El uso continuo de antibióticos ha resultado en una situación donde los patógenos han adquirido
resistencia contra los antibióticos. Entonces, ahora hay una necesidad urgente para el desarrollo de
la novela, antibióticos seguros y efectivos. Dado que, los productos naturales tienen una novela
estructura; permanece como una fuente principal de metabolitos secundarios. El presente estudio,
que tuvo como objetivo aislar los microbios del suelo exhibiendo actividad antibiosis, produjo B.
amyloliquefaciens como la potente fuente de antibióticos. La detección de aislados de ambas
muestras de suelo S1 y S7 obtuvieron B. amyloliquefaciens que produjeron zona máxima de
inhibición contra la prueba de patógenos humanos S. aureus y Enterococcus sp. Estos resultados
defienden que aislamientos microbianos de esta cepa particular se pueden usar comercialmente
para la producción de antibióticos después de la purificación y adecuada normalización.